專利名稱：用于膀胱癌檢測(cè)的尿標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥檢測(cè)。具體地，本發(fā)明涉及應(yīng)用標(biāo)記物進(jìn)行膀胱癌檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及應(yīng)用尿標(biāo)記物進(jìn)行膀胱癌檢測(cè)。而更具體地，本發(fā)明涉及應(yīng)用尿中的寡核苷酸、蛋白質(zhì)和/或抗體標(biāo)記物對(duì)膀胱癌進(jìn)行檢測(cè)、分型和分期。
背景技術(shù)：
介紹對(duì)癌癥進(jìn)行早期治療時(shí)，癌癥患者的存活率可大為提高。在膀胱癌的情況下，在疾病早期診斷出的患者的5年存活率大于90％，而與之相比在疾病晚期診斷出的患者其5年存活率約為15-30％。因此，導(dǎo)致膀胱癌早期診斷的進(jìn)展可改進(jìn)患者的預(yù)后。已建立的應(yīng)用尿標(biāo)本進(jìn)行膀胱癌檢測(cè)的方法為細(xì)胞學(xué)方法。但是，已知細(xì)胞學(xué)方法僅對(duì)約75％的浸潤性膀胱癌的檢測(cè)敏感，且僅對(duì)約25％的淺表性膀胱癌的檢測(cè)敏感(Lotan和Roehrborn，泌尿?qū)W(Urology)61，109-118(2003))。
廣義上將膀胱癌分為兩類，浸潤性和淺表性。浸潤性類型滲入到下面的組織層，而淺表類型趨向于主要以息肉樣生長于膀胱內(nèi)腔中。
對(duì)尿中特異癌標(biāo)記物進(jìn)行鑒定可提供用于癌癥早期診斷并導(dǎo)致早期治療和預(yù)后改進(jìn)的有益方法。特異癌標(biāo)記物也可提供用于監(jiān)控疾病進(jìn)程并保證所監(jiān)控的外科、放療和化療治療的功效的方法。但是，對(duì)多種主要癌癥而言，可用的標(biāo)記物的缺點(diǎn)在于敏感性和特異性不足。
目前，用于膀胱癌檢測(cè)的最可靠的方法為膀胱鏡檢查聯(lián)合以受損部位的活組織切片檢查。但是，該技術(shù)費(fèi)時(shí)、為侵入性且其敏感性僅為約90％，這意味著約10％的癌癥患者不能用這些方法得以檢測(cè)。非侵入性方法中的尿細(xì)胞學(xué)方法，可通過顯微鏡檢測(cè)片狀脫落的惡性細(xì)胞，為目前的優(yōu)選方法。盡管細(xì)胞學(xué)方法的特異性約為95％，但其對(duì)低度損傷的敏感性很低(9-25％)，非常依賴樣本質(zhì)量且受到觀測(cè)者間的高度差異的影響。
最近，已嘗試對(duì)膀胱活組織標(biāo)本中的遺傳標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。最常用的方法為微陣列分析，方法中將含有與推斷的遺傳標(biāo)記的部分互補(bǔ)的寡核苷酸的陣列，與獲自患者樣本的mRNA或cDNA樣本進(jìn)行接觸。用這些方法，一些近期的報(bào)告已鑒定出多種推測(cè)的膀胱癌標(biāo)記物。但是，陣列技術(shù)相對(duì)而言為非定量性且變異較大。
對(duì)可指示膀胱癌存在的血液或尿標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)提供了用于改進(jìn)該疾病檢測(cè)的一種潛在方法。盡管膀胱癌血液標(biāo)記物的研發(fā)進(jìn)展緩慢，但已獲得幾種尿蛋白質(zhì)標(biāo)記物。對(duì)這些標(biāo)記物的試驗(yàn)顯示出優(yōu)于細(xì)胞學(xué)方法的敏感性，但其特異性并非最佳，這是由于也通?？稍诨挤菒盒阅[瘤疾病的患者中觀測(cè)到這些標(biāo)記物的水平提高，所述非惡性腫瘤疾病包括炎癥、尿結(jié)石病和良性前列腺增生。例如，檢測(cè)特異核基質(zhì)蛋白的NMP22，其敏感性為47-87％且其特異性為58-91％。NMP22的高變異性意味著其并非為用于膀胱癌的快速、簡(jiǎn)易檢測(cè)的理想方法。
其它的尿試驗(yàn)包括基因轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR擴(kuò)增，所述基因轉(zhuǎn)錄物如來自尿樣本細(xì)胞沉淀中的端粒酶hTERT。RT-PCR試驗(yàn)提供了潛在的高敏感性，但其對(duì)已存在的RT-PCR標(biāo)記物的特異性仍然未知。
需要用于癌癥早期檢測(cè)和診斷的其它方法。本發(fā)明提供了基于癌癥標(biāo)記物，特別是基于膀胱癌標(biāo)記物的其它方法、組合物、試劑盒和設(shè)備，以助于癌癥的早期檢測(cè)和診斷。
發(fā)明概述聯(lián)合應(yīng)用微陣列分析和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，我們已經(jīng)能夠鑒定出選擇用于膀胱癌的特異遺傳標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可用于膀胱腫瘤分期的標(biāo)記物，且在其它實(shí)施方案中，我們已經(jīng)鑒定出可區(qū)分腫瘤類型的標(biāo)記物。在其它實(shí)施方案中，我們出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，兩種或多種標(biāo)記物的組合可提供用于膀胱癌檢測(cè)的高度可靠和敏感的方法。而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，我們已鑒定出在膀胱癌細(xì)胞中但不在血細(xì)胞中高度表達(dá)的標(biāo)記物。因此，在許多實(shí)施方案中，膀胱癌試驗(yàn)出乎預(yù)料地優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的試驗(yàn)。
在某些實(shí)施方案中，應(yīng)用微陣列分析來鑒定與非惡性膀胱組織相比在膀胱腫瘤組織中高度表達(dá)的基因。這些基因以及這些基因所編碼的蛋白質(zhì)，在此稱為膀胱腫瘤標(biāo)記物(BTM)。應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語BTM并不需要標(biāo)記物僅對(duì)膀胱腫瘤特異。確切地說，BTM表達(dá)的提高也可見于其它類型的腫瘤，包括惡性腫瘤。也應(yīng)當(dāng)理解BTM包括在血細(xì)胞中不高度表達(dá)的標(biāo)記物。借助于來自尿的取樣，并不存在于現(xiàn)有技術(shù)的活組織樣本中通常存在的在其它細(xì)胞類型中的表達(dá)。術(shù)語BTM也包括用于膀胱癌檢測(cè)的單獨(dú)標(biāo)記物的組合。
在其它實(shí)施方案中，提供了鑒定樣本中存在標(biāo)記物的方法，包括免疫組織化學(xué)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。qPCR方法不易于產(chǎn)生在微陣列方法中常見的假象。此類假象包括置于陣列點(diǎn)上的寡核苷酸配體的數(shù)量差異、染料與陣列點(diǎn)上已雜交寡核苷酸的不均一和非預(yù)測(cè)性結(jié)合、非特異物質(zhì)從陣列點(diǎn)上的不均一洗滌以及其它問題。
在此公開的某些基因所編碼的蛋白質(zhì)由細(xì)胞分泌、從細(xì)胞切割或在細(xì)胞死亡時(shí)從細(xì)胞中釋放。這些mRNA轉(zhuǎn)錄物及其蛋白質(zhì)具有額外的用途，如用作膀胱癌的診斷標(biāo)記物或用作監(jiān)控已確認(rèn)疾病進(jìn)程的標(biāo)記物。這些標(biāo)記物可單獨(dú)應(yīng)用或彼此聯(lián)合應(yīng)用。此外，也可將保留在細(xì)胞內(nèi)或與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的其它基因、RNA轉(zhuǎn)錄物及編碼的蛋白質(zhì)單獨(dú)或彼此聯(lián)合應(yīng)用，以作為尿標(biāo)記物。
淺表性和浸潤性膀胱癌的治療策略可有所不同。浸潤性膀胱癌需要更為緊急的外科切除，且其允許的治療選擇要少于淺表性膀胱癌。與之相反，淺表性膀胱癌可應(yīng)用膀胱腔內(nèi)化療或膀胱腔內(nèi)BCG免疫療法成功地進(jìn)行治療。
但目前，還沒有不需進(jìn)行膀胱鏡檢查即可簡(jiǎn)易且可靠地區(qū)分淺表性和浸潤性膀胱癌類別的方法。應(yīng)用如尿試驗(yàn)的非侵入性方法來區(qū)分這些類別的能力將允許臨床醫(yī)生選擇適宜的治療方案，而無需依賴昂貴、繁瑣且通?；颊卟灰捉邮艿陌螂诅R檢查。
我們已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，某些尿標(biāo)記物，特別是不在血液中高水平存在的標(biāo)記物，當(dāng)聯(lián)合或單獨(dú)應(yīng)用這些標(biāo)記物時(shí)可對(duì)膀胱癌進(jìn)行高度可靠、敏感且特異的診斷。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的描述參考其中的特定實(shí)施方案以及附圖，其中

圖1顯示的表格描述了用于qPCR分析中的樣本數(shù)和來源。
圖2顯示的表格描述了用于本發(fā)明膀胱癌的qPCR分析的標(biāo)記物和標(biāo)記物的寡核苷酸探針。
圖3顯示了應(yīng)用微陣列方法從浸潤性膀胱癌樣本中鑒定出的BTM列表。
圖4顯示了應(yīng)用微陣列方法從淺表性膀胱癌樣本中鑒定出的BTM列表。
圖5顯示了應(yīng)用定量PCR對(duì)特定BTM進(jìn)行分析的研究中獲得的結(jié)果列表。
圖6a-6af描述的柱狀圖顯示了相對(duì)頻率對(duì)Log2倍數(shù)改變數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)獲自浸潤性和淺表性膀胱腫瘤的多種腫瘤標(biāo)記物的定量PCR研究。圖6aSPAG5，浸潤性；圖6bSPAG5，淺表性；圖6cTOP2a，浸潤性；圖6dTOP2a，淺表性；圖6eCDC2，浸潤性；圖6fCDC2，淺表性；圖6gENG，浸潤性；圖6hENG，淺表性；圖6iIGFBP5，淺表性；圖6jNOV，淺表性；圖6kNRP1，浸潤性；圖61NRP1，淺表性；圖6mSEMA3F，淺表性；圖6nEGFL6，浸潤性；圖6oEGFL6，淺表性；圖6pMGP，浸潤性；圖6qSEM2，浸潤性；圖6rSEM2，淺表性；圖6sCHGA，浸潤性；和圖6tCHGA，淺表性；圖6uBIRC5，浸潤性；圖6vBIRC5，淺表性；圖6wUBE2C，浸潤性；圖6xUBE2C，淺表性；圖6yHoxA13，浸潤性；圖6zHoxA13，淺表性；圖6aaMDK，浸潤性；圖6abMDK，淺表性；圖6acThyl，浸潤性；圖6ad，Thyl，淺表性；圖6aeSMC4L1，浸潤性；6afSMC4L1，淺表性。
圖7顯示了應(yīng)用定量PCR對(duì)尿樣本的特定BTM進(jìn)行分析的研究中獲得的結(jié)果列表。
圖8描述的盒須圖(box and whisker plot)顯示了在患者和健康對(duì)照的尿中膀胱癌標(biāo)記物的相對(duì)累積量。12種BTM中的每一個(gè)的數(shù)據(jù)均成對(duì)顯示；每一對(duì)的上盒代表來自健康對(duì)照患者的尿樣本，且下盒代表來自患膀胱癌的患者尿樣本。盒定義25％、50％和75％。所有數(shù)據(jù)為相對(duì)于健康對(duì)照中位值的Log2倍數(shù)改變。點(diǎn)代表離群值。
圖9描述了從全血中提取的總RNA與來自膀胱癌組織中的RNA相比較的定量PCR分析的條形圖。
圖10描述了膀胱癌患者尿中標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄物的過度累積的中位值。分別顯示了患者和健康對(duì)照間以及患者和非惡性對(duì)照間的Log2差異。
圖11描述的盒須圖顯示了癌癥患者尿中標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄物與健康和非惡性對(duì)照相比的過表達(dá)。盒定義25％、50％和75％。所有數(shù)據(jù)相應(yīng)于健康對(duì)照中位值。點(diǎn)填充的盒相應(yīng)于健康受試者樣本。暗影填充的盒相應(yīng)于非惡性泌尿科疾病患者的樣本，且斜紋填充的盒相應(yīng)于膀胱癌患者樣本，a.H0XA13；b.IGFBP5；c.MDK；d.MGP；e NRP1；f.SEMA3F；g.SMC4L1；h.TOP2A；i.UBE2C。點(diǎn)代表離群值。
圖12a-12b描述的柱狀圖分別顯示了高于浸潤性和淺表性類型腫瘤正常表達(dá)中位值第95個(gè)百分點(diǎn)的標(biāo)記物的數(shù)目。結(jié)果基于12個(gè)標(biāo)記物的qPCR數(shù)據(jù)，并對(duì)每一腫瘤樣本分別顯示。
圖13a-13b描述的表格顯示了多種標(biāo)記物對(duì)精確區(qū)分腫瘤組織和非惡性組織的能力的影響。根據(jù)源于qPCR數(shù)據(jù)的正態(tài)分布創(chuàng)建表格。圖13a描述了多種標(biāo)記物對(duì)以95％特異性精確區(qū)分浸潤性膀胱癌組織和非惡性組織的能力的影響。圖13b描述的表格顯示了多種標(biāo)記物對(duì)以95％特異性精確區(qū)分淺表性膀胱癌組織和非惡性組織的能力的影響。
圖14a-14b描述的表格顯示了標(biāo)記物的組合在95％特異性處對(duì)浸潤性移行細(xì)胞癌(TCC)敏感性，所述敏感性根據(jù)qPCR數(shù)據(jù)的正態(tài)分布進(jìn)行計(jì)算。圖14a浸潤性移行細(xì)胞癌(TCC)。圖14b淺表性TCC。
圖15描述的圖表顯示了多種標(biāo)記物對(duì)精確區(qū)分獲自膀胱癌(TCC)患者的尿樣本和獲自患非惡性泌尿科疾病的患者尿樣本的能力的影響。根據(jù)由尿qPCR分析獲得的數(shù)據(jù)的正態(tài)分布創(chuàng)建表格。
圖16描述的圖表顯示了尿中標(biāo)記物的組合以95％特異性檢測(cè)TCC的敏感性，根據(jù)尿qPCR數(shù)據(jù)的正態(tài)分布進(jìn)行計(jì)算。
圖17描述的盒須圖顯示了由淺表性和浸潤性膀胱癌患者尿提取的RNA的BTM比值。盒定義了第25、50和75個(gè)百分點(diǎn)。灰色陰影盒代表來自淺表性膀胱癌患者的樣本，且細(xì)線條盒代表來自浸潤性膀胱癌患者的樣本。a.TOP2A/HOXA13組合；b.TOP2A/IGFBP5組合；和c.TOP2A/SEMA3F組合。點(diǎn)代表離群值。
圖18描述的盒須圖顯示了不同階段膀胱癌患者尿中的BTM比值。盒定義了第25、50和75個(gè)百分點(diǎn)。點(diǎn)填充盒相應(yīng)于淺表性腫瘤患者樣本，灰色陰影盒相應(yīng)于1期浸潤性腫瘤患者樣本，且細(xì)線條盒相應(yīng)于2-3期腫瘤患者樣本a.TOP2A/HOXA13組合；b.TOP2A/IGFBP5組合；和c.TOP2A/SEMA3F組合。點(diǎn)代表離群值。
圖19描述的盒須圖顯示了從淺表性和浸潤性膀胱腫瘤中提取的RNA的BTM比值。盒定義了第25、50和75個(gè)百分點(diǎn)?；疑幱昂写頊\表性膀胱腫瘤樣本，且細(xì)線條盒代表浸潤性膀胱腫瘤樣本a.TOP2A/HOXA13組合，b.TOP2A/IGFBP5組合，和c.TOP2A/SEMA3F組合。點(diǎn)代表離群值。
圖20描述的盒須圖顯示了應(yīng)用于膀胱癌檢測(cè)的一種標(biāo)記物組合。該圖顯示了與健康和非惡性對(duì)照相比癌癥患者尿中四種標(biāo)記物組的過表達(dá)。盒定義了第25、50和75個(gè)百分點(diǎn)。所有數(shù)據(jù)與健康對(duì)照中位值相應(yīng)。點(diǎn)填充盒相應(yīng)于健康受試者的樣本?；疑幱疤畛浜邢鄳?yīng)于非惡性泌尿科疾病患者的樣本，且斜紋填充盒相應(yīng)于膀胱癌患者的樣本a.HOXA13，b.MGPc.SEMA3F和d.TOP2A。點(diǎn)代表離群值。
圖21描述的盒須圖顯示了用于確定膀胱癌組織學(xué)類型的標(biāo)記物組合。該圖顯示了淺表性和浸潤性膀胱癌患者的尿中提取的RNA的BTM比值。盒定義了第25、50和75個(gè)百分點(diǎn)?；疑幱昂写頊\表性膀胱癌患者的樣本，且細(xì)線條盒代表浸潤性膀胱癌患者的樣本a.TOP2A/SEMA3F組合，b.TOP2A/HOXA13組合。點(diǎn)代表離群值。
發(fā)明詳述定義在詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案之前，對(duì)用于此處的術(shù)語提供一些定義是有益的。
術(shù)語“標(biāo)記物”意指與一種生物現(xiàn)象的存在具有數(shù)量或質(zhì)量關(guān)聯(lián)的分子?！皹?biāo)記物”的實(shí)例包括基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、相關(guān)代謝物、副產(chǎn)物或其它鑒定分子，無論其與現(xiàn)象之下的機(jī)制直接或間接相關(guān)。
術(shù)語“敏感性”意指測(cè)試為陽性的患病個(gè)體的比例。因此，敏感性提高意指較低的假陰性測(cè)試結(jié)果。
術(shù)語“特異性“意指測(cè)試為陰性的未患病個(gè)體的比例。因此，特異性提高意指較低的假陽性測(cè)試結(jié)果。
術(shù)語“BTM”或“膀胱腫瘤標(biāo)記物”或“BTM家族成員”意指與膀胱癌關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物。術(shù)語BTM也包括單一標(biāo)記物的組合，所述組合可提高膀胱癌檢測(cè)的敏感性和特異性。在本申請(qǐng)書的一些部分中，為方便起見，術(shù)語BTM可包括UBTM(此處定義的)。BTM的非限制性實(shí)例包括在此處的圖3和4中。
可通過以下步驟鑒定出BTM從疑患膀胱癌的患者樣本組織中提取RNA，將RNA應(yīng)用到其上具多種寡核苷酸的微陣列上，允許樣本RNA與陣列上的寡核苷酸進(jìn)行雜交，然后對(duì)測(cè)定的與陣列每一個(gè)點(diǎn)結(jié)合的RNA的水平進(jìn)行定量。如果存在的標(biāo)記物的水平高于閾值，則將該標(biāo)記物作為BTM，所述閾值為應(yīng)用微陣列方法檢測(cè)的存在于正常、非惡性組織中的正常值至少約1.2倍。備選地，閾值可高于正常值約2倍，高于正常值約3倍、4倍或甚至高于正常值5倍。我們所指的“正?！笔侵复笥谡Ｈ后w的90％。在其它情況下，正?？梢庵?5％的存在水平(即對(duì)均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)約為2)，且在其它情況下，正常大于約97.5％(即SD約為3)或99％。
而在進(jìn)一步的情況下，可選擇存在于腫瘤組織但不以顯著程度存在于血液中的BTM。此處“顯著程度”是指通過qPCR檢測(cè)時(shí)腫瘤組織中的數(shù)量高于血液中存在數(shù)量的至少約5個(gè)循環(huán)。
術(shù)語“UBTM”或“尿膀胱腫瘤標(biāo)記物”或“UBTM家族成員”意指除TOP2A、MDK或BIRC5之外的尿中與膀胱癌關(guān)聯(lián)的BTM標(biāo)記物。術(shù)語UBTM也包括兩種標(biāo)記物的組合和三種標(biāo)記物的組合，所述組合提高了應(yīng)用尿樣本檢測(cè)膀胱癌的敏感性和特異性。UBTM的非限制性實(shí)例包括在此處的圖14a和14b中。
在其它情況下，可應(yīng)用微陣列方法或應(yīng)用qPCR方法鑒定尿中的UBTM，其中所述方法應(yīng)用的正向引物、反向引物和探針的選擇基于待評(píng)估的標(biāo)記物。應(yīng)用尿檢測(cè)膀胱癌的閾值可高于正常受試者尿中標(biāo)記物的水平，患膀胱癌的閾值高出約1個(gè)循環(huán)(2倍)、2個(gè)循環(huán)(4倍)、3個(gè)循環(huán)(8倍)、4個(gè)循環(huán)(16倍)、5個(gè)循環(huán)(32倍)或更多。
術(shù)語“qPCR”是指定量聚合酶鏈反應(yīng)。
術(shù)語“表達(dá)”包括由基因或基因的部分產(chǎn)生mRNA，并包括由RNA、基因或基因的部分產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)，以及包括與表達(dá)關(guān)聯(lián)的可檢測(cè)物質(zhì)的顯現(xiàn)。例如，如抗體的結(jié)合配體與基因或其它寡核苷酸、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的結(jié)合以及結(jié)合的配體的視覺顯現(xiàn)包括在術(shù)語“表達(dá)”的范圍之內(nèi)。因此，免疫印跡(如Western印跡)中點(diǎn)密度的提高包括于下述生物分子的術(shù)語“表達(dá)”之內(nèi)。
術(shù)語“表達(dá)速度”意指轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的時(shí)間依賴的數(shù)量改變。
術(shù)語“過表達(dá)”用于下述情形，即每特定時(shí)間段內(nèi)一種細(xì)胞或細(xì)胞類型中標(biāo)記物的表達(dá)速度高于另一細(xì)胞或細(xì)胞類型中標(biāo)記物的表達(dá)速度。
術(shù)語“累積”是指與正常均值相比樣本中標(biāo)記物的數(shù)量增加。我們所說的“增加的數(shù)量”意指標(biāo)記物的數(shù)量高于正常范圍的90％、95％、97.5％、99％或更多的應(yīng)用微陣列方法檢測(cè)時(shí)至少約1.2倍、2倍、3倍、4倍或5倍。應(yīng)用qPCR檢測(cè)時(shí)，“數(shù)量增加”是指標(biāo)記物的數(shù)量高于正常范圍的90％、95％、97.5％或99％的至少約1個(gè)循環(huán)(2倍)、2個(gè)循環(huán)(4倍)、3個(gè)循環(huán)(8倍)、4個(gè)循環(huán)(16倍)、5個(gè)循環(huán)(32倍)或更多。
累積包括細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物數(shù)量的增加(基于每個(gè)細(xì)胞)或可指樣本中具有特定標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)目的增加。因此，累積可意指與不以膀胱癌為特征的疾病相比，尿中標(biāo)記物的總數(shù)量的增加(基于每個(gè)體積)。累積也可反映在特定細(xì)胞類型中BTM表達(dá)速度的提高，和/或以正常表達(dá)速度表達(dá)BTM的細(xì)胞數(shù)量的提高。此外，累積也可反映由于細(xì)胞膜完整性喪失或細(xì)胞死亡和破壞而存在的游離mRNA。
本發(fā)明實(shí)施方案的描述提供了用于腫瘤檢測(cè)和評(píng)估的標(biāo)記物，所述腫瘤包括膀胱腫瘤。已發(fā)現(xiàn)多種基因和蛋白質(zhì)與膀胱腫瘤相關(guān)。對(duì)取自膀胱腫瘤患者的樣本和取自正常尿道上皮的非惡性樣本所進(jìn)行的微陣列分析得出了驚人的發(fā)現(xiàn)，即在多種膀胱腫瘤中，某些基因過表達(dá)和尿中基因產(chǎn)物累積的特定模式與疾病相關(guān)聯(lián)。最另人驚異的是，已分離出下述的標(biāo)記物，該標(biāo)記物在膀胱癌患者尿樣本中以高水平存在，但在健康個(gè)體特別是患有非惡性泌尿科疾病(包括顯示血尿)的個(gè)體中以低水平存在。因此標(biāo)記物檢測(cè)可作為腫瘤特別是膀胱腫瘤存在的指征，所述標(biāo)記物如基因產(chǎn)物(例如，如mRNA的寡核苷酸)以及由寡核苷酸翻譯的蛋白質(zhì)和肽。
可以理解，特定標(biāo)記物或標(biāo)記物組的水平可取決于產(chǎn)生的尿量與存在的標(biāo)記物數(shù)量的比值。因此，在以尿量減少為特征(例如尿體積減少)的病癥中，標(biāo)記物濃度可能提高，但并不表示患有膀胱癌。因此，在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的總尿量對(duì)標(biāo)記物數(shù)量進(jìn)行校正。備選地，可根據(jù)尿樣本中的總細(xì)胞數(shù)對(duì)標(biāo)記物濃度進(jìn)行校正，且在其它實(shí)施方案中，可根據(jù)尿中存在的總蛋白質(zhì)對(duì)標(biāo)記物濃度進(jìn)行校正。另一方面，產(chǎn)尿增加可稀釋腫瘤標(biāo)記物，并由此易于掩蓋膀胱癌的存在。此類情況可能與以下所述相關(guān)，即水?dāng)z入量增加、鹽攝入量減少、利尿劑用量增加，或抗利尿激素的產(chǎn)生或活性受到抑制。
在一些實(shí)施方案中，可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測(cè)腎臟功能。這些方法包括，舉例而言，如肌酸酐清除檢測(cè)。但應(yīng)當(dāng)理解，存在多種用于腎功能檢測(cè)的適宜方法。發(fā)現(xiàn)腎功能異常時(shí)，可應(yīng)用適宜的校正對(duì)檢測(cè)的標(biāo)記物累積進(jìn)行調(diào)整。由此，可更為準(zhǔn)確地診斷膀胱癌。
可應(yīng)用任何適宜的技術(shù)對(duì)樣本中的癌標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，且所述技術(shù)可包括但不限于，寡核苷酸探針、qPCR或針對(duì)癌標(biāo)記物的抗體。
應(yīng)當(dāng)理解，受試樣本并非限于疑患腫瘤的組織樣本。標(biāo)記物可分泌到血清中、由細(xì)胞膜脫落或與落入尿中的細(xì)胞關(guān)聯(lián)。因此，樣本可包括任何身體樣本，并包括血液、血清、腹腔洗液、腦脊液、尿和糞便標(biāo)本。
樣本中一種癌標(biāo)記物的檢測(cè)可成為受試者體內(nèi)腫瘤存在的指征。但可以理解，通過對(duì)多種癌標(biāo)記物存在與否及對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行分析，可提高診斷敏感性并降低假陽性和/或假陰性結(jié)果的頻率。因此，根據(jù)本發(fā)明的多種標(biāo)記物可用于提高癌癥的早期檢測(cè)和診斷。
癌癥檢測(cè)的總體方法下述方法為可用于癌癥(包括膀胱癌)檢測(cè)的非限定方法，所述檢測(cè)應(yīng)用BTM或UBTM家族成員進(jìn)行。
應(yīng)用核酸探針選擇標(biāo)記物的雜交方法這些方法包括將核酸探針與支持物結(jié)合，并在適宜條件下與源自受試樣本的RNA或cDNA雜交(Sambrook，J.，E Fritsch，E.和T Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社冷泉港(2001))。這些方法根據(jù)需要可應(yīng)用于來自腫瘤組織或體液樣本的BTM或UBTM。RNA或cDNA制備物通常標(biāo)記以熒光或放射性分子以用于檢測(cè)和定量。在一些應(yīng)用中，雜交的DNA可與分支且熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)連接以提高信號(hào)強(qiáng)度(Nolte，F(xiàn).S.，用于對(duì)臨床樣本中核酸序列進(jìn)行直接定量的分子DNA信號(hào)擴(kuò)增(Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acidsequences in clinical specimens)，臨床化學(xué)進(jìn)展(Adv.Clin.Chem)，33，201-35(1998))。通過在低鹽溶液(如0.1 x SSC，0.5％SDS)中過度洗滌移除未雜交的信號(hào)，之后通過熒光檢測(cè)或通過凝膠影像的光密度測(cè)定法對(duì)雜交的數(shù)量進(jìn)行定量。支持物可為固體，如尼龍或硝化纖維膜，或支持物可由在液體懸液中雜交的微球或小珠組成。為允許洗滌和純化，小珠可為磁性小珠(Haukanes，B-I和Kvam，C，磁性小珠在生物試驗(yàn)中的應(yīng)用(Application of magnetic beads in bioassays)，生物技術(shù)(Bio/Technology)11，60-63(1993))或可將小珠進(jìn)行熒光標(biāo)記以使其能夠應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(參見如Spiro，A.，Lowe，M.和Brown，D.，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)DNA序列進(jìn)行多重鑒定和定量的基于小珠的方法(A Bead-Based Method forMultiplexed Identification和Quantitation of DNA Sequences Using FlowCytometry)，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Env.Micro)，66，4258-4265(2000))。
雜交技術(shù)的一種變更為定量基因Plex試驗(yàn)(QuantiGene Plexassay(Genospectra，F(xiàn)remont))，該試驗(yàn)將熒光小珠支持物與分支DNA信號(hào)擴(kuò)增聯(lián)合。而有關(guān)雜交技術(shù)的另一變更為雜交為QuantikinemRNA試驗(yàn)(R&D Systems，Minneapolis)。試驗(yàn)方法為如在產(chǎn)商的使用說明書所描述的。簡(jiǎn)言之，該試驗(yàn)應(yīng)用與洋地黃毒苷(Digoxigenin)綴合連接的寡核苷酸雜交探針。通過應(yīng)用與抗洋地黃毒苷抗體偶聯(lián)的堿性磷酸酶在比色試驗(yàn)中對(duì)雜交進(jìn)行檢測(cè)。
其它方法為領(lǐng)域內(nèi)公知且無需在此進(jìn)一步描述。
定量PCR(qPCR)可應(yīng)用BTM特異引物和探針對(duì)腫瘤樣本、血清和尿樣本進(jìn)行定量PCR(qPCR)。在受控反應(yīng)中，PCR反應(yīng)中形成的產(chǎn)物量(Sambrook，J.，EFritsch，E.和T Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社冷泉港(2001))與起始模板的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。當(dāng)處于Log期且試劑即將耗盡前終止PCR反應(yīng)以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，用溴化乙錠或類似的DNA染料對(duì)其染色，并通過光密度測(cè)定法對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。備選地，可應(yīng)用對(duì)產(chǎn)物累積進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的PCR儀對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述PCR儀如AppliedBiosystems′Prism 7000或Roche Light Cycler。實(shí)時(shí)PCR可檢測(cè)合成的PCR產(chǎn)物中DNA嵌入染料(如Sybr Green)的熒光強(qiáng)度，也可檢測(cè)當(dāng)由猝滅分子分離時(shí)報(bào)告分子所釋放的熒光；DNA鏈從引物寡核苷酸延伸后，報(bào)告和猝滅分子摻入到與靶DNA分子雜交的寡核苷酸探針中。在下一個(gè)PCR循環(huán)中通過Taq聚合酶的酶活性將寡核苷酸探針進(jìn)行替代并進(jìn)行降解，并自猝滅分子釋放出報(bào)告分子。
在一些實(shí)施方案中，正向引物、反向引物和探針組分別包括SEQ IDNO1、SEQ ID NO14和SEQ ID NO27。備選的前述引物和探針組分別包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO15和SEQ ID NO28。在其它實(shí)施方案中，引物和探針組分別包括SEQ ID NO3、SEQ ID NO16和SEQ IDNO29，分別包括SEQ ID NO4、SEQ ID NO17和SEQ ID NO30，分別包括SEQ ID NO5、SEQ ID NO18和SEQ ID NO31，分別包括SEQ IDNO6、SEQ ID NO19和SEQ ID NO32，分別包括SEQ ID NO7、SEQID NO20和SEQ ID NO33，分別包括SEQ ID NO8、SEQ ID NO21和SEQ ID NO34，分別包括SEQ ID NO9、SEQ ID NO22和SEQ IDNO35，分別包括SEQ ID NO10、SEQ ID NO23和SEQ ID NO36，分別包括SEQ ID NO11、SEQ ID NO24和SEQ ID NO37，分別包括SEQID NO12、SEQ ID NO25和SEQ ID NO38以及分別包括SEQ IDNO13、SEQ ID NO26和SEQ ID NO39。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)簡(jiǎn)言之，在夾心ELISA試驗(yàn)中，將針對(duì)BTM/UBTM的多克隆或單克隆抗體結(jié)合到固相支持物上(Crowther，J.R.ELISA指南(The ELISAguidebook).Humana PressNew Jersey(2000)；Harlow，E.和Lane，D.，抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Using antibodiesa laboratory manual).Cold SpringHarbor Laboratory PressCold Spring Harbor(1999))或結(jié)合到懸浮小珠上。其它方法為領(lǐng)域內(nèi)已知且無需在此進(jìn)一步描述。單克隆抗體可源自雜交瘤或篩選自噬菌體抗體文庫(Hust M.和Dubel S.，用于體外產(chǎn)生人類抗體片段的噬菌體展示載體(Phage display vectors for the in vitro generationof human antibody fragments).分子生物學(xué)方法(Method MoI Biol).29571-96(2005))。應(yīng)用非靶蛋白質(zhì)制備物和去污劑封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。然后將捕獲抗體與含BTM/UBTM抗原的尿或組織制備物進(jìn)行孵育。洗滌混合物后，將抗體/抗原復(fù)合物與檢測(cè)靶BTM/UBTM的二級(jí)抗體孵育。二級(jí)抗體通常與熒光分子或其它報(bào)告分子綴合連接，前述分子或可在酶反應(yīng)中得以檢測(cè)或可應(yīng)用綴合以報(bào)告分子的三級(jí)抗體進(jìn)行檢測(cè)(Crowther，Id.)。備選地，在直接ELISA中，可將含BTM/UBTM的制備物與支持物或小珠結(jié)合，并應(yīng)用抗體報(bào)告分子綴合物直接對(duì)靶抗原進(jìn)行檢測(cè)(Crowther，Id.)。
用于產(chǎn)生單克隆抗體和多克隆抗血清的方法為領(lǐng)域內(nèi)公知，且無需在此多加著墨。
免疫組織化學(xué)可應(yīng)用膀胱腫瘤、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上的抗標(biāo)記物抗體對(duì)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行鑒定和定位。此類方法也可用于檢測(cè)如直腸結(jié)腸、胰腺、卵巢、黑素瘤、肝臟、食道、胃、子宮內(nèi)膜和腦。
通常，可應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中的BTM(Harlow，E.和Lane，D.，抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Using antibodiesa laboratory manual).冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory PressCold SpringHarbor)(1999))。簡(jiǎn)言之，將石蠟包埋的或冷凍OCT-包埋的組織樣本切成4-8μm的薄片并置于載玻片上，固定和滲透，然后與針對(duì)BTM的一級(jí)單克隆或多克隆抗體孵育。一級(jí)抗體可與用于直接檢測(cè)抗原的檢測(cè)分子或報(bào)告分子綴合連接，或備選地，也可應(yīng)用與報(bào)告分子或檢測(cè)分子綴合連接的二級(jí)抗體對(duì)一級(jí)抗體自身進(jìn)行檢測(cè)。洗滌以及激活任意的報(bào)告分子后，可應(yīng)用顯微鏡技術(shù)顯現(xiàn)BTM的存在。
方法也可用于對(duì)膀胱癌患者外科移除腫瘤之前和之后采取的血清或血漿中的標(biāo)記物家族成員進(jìn)行免疫檢測(cè)，方法也可用于對(duì)罹患其它癌癥的患者中的標(biāo)記物家族成員的檢測(cè)，所述其它癌癥包括但不限于，直腸結(jié)腸、胰腺、卵巢、黑素瘤、肝臟、食道、胃、子宮內(nèi)膜和腦，以及用于對(duì)來自膀胱癌患者的尿和糞便中的標(biāo)記物家族成員進(jìn)行免疫檢測(cè)。
也可應(yīng)用其它標(biāo)準(zhǔn)免疫檢測(cè)技術(shù)對(duì)組織或尿中的BTM和UBTM進(jìn)行檢測(cè)，所述技術(shù)如免疫印跡或免疫沉淀(Harlow，E.和Lane，D.，Usingantibodiesa laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor(1999))。進(jìn)行免疫印跡時(shí)，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠在變性或非變性條件下對(duì)來自組織或體液的含BTM/UBTM的蛋白質(zhì)制備物進(jìn)行電泳。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到如尼龍的膜支持物上。然后將BTM/UBTM直接或間接與單克隆或多克隆抗體進(jìn)行如已描述的用于免疫組化的反應(yīng)。備選地，在一些制備物中，可直接將蛋白質(zhì)點(diǎn)到膜上，而不需先期的電泳分離步驟?？赏ㄟ^光密度測(cè)定法對(duì)信號(hào)進(jìn)行定量。
進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，將含BTM或UBTM的可溶性制備物與抗BTM/UBTM的單克隆或多克隆抗體孵育。然后將反應(yīng)液與惰性小珠孵育，所述小珠由與A蛋白或G蛋白共價(jià)連接的瓊脂糖或聚丙烯酰胺制成。A或G蛋白小珠與抗體進(jìn)行特異反應(yīng)并形成與小珠結(jié)合的抗體-BTM/UBTM-抗原固定化復(fù)合體。洗滌步驟后，可通過免疫印跡或ELISA對(duì)結(jié)合的BTM/UBTM進(jìn)行檢測(cè)和定量。
應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析陣列或qPCR數(shù)據(jù)收集原始數(shù)據(jù)，并通過比較膀胱腫瘤基因的表達(dá)水平與非腫瘤組織的同一基因的表達(dá)對(duì)倍數(shù)改變進(jìn)行分析。提供了用于得出表達(dá)提高結(jié)論的閾值(例如，1.5倍提高、2倍提高，以及在備選實(shí)施方案中，3倍提高、4倍提高或5倍提高)。應(yīng)理解，選擇用于得出表達(dá)提高結(jié)論的其它閾值并不背離本發(fā)明的范圍。腫瘤基因表達(dá)的進(jìn)一步分析包括，將顯示表達(dá)提高的那些基因與已知膀胱腫瘤的表達(dá)譜進(jìn)行匹配以提供腫瘤診斷。
應(yīng)用BTM和UBTM監(jiān)控TCC治療的進(jìn)程除用于TCC的快速診斷和早期檢測(cè)外，在組織、血清或尿中檢測(cè)出的BTM和UBTM標(biāo)記物也可用于監(jiān)控患者對(duì)治療的反應(yīng)。在這些應(yīng)用中，開始全身的、囊泡內(nèi)或血管內(nèi)化療、放療或免疫治療后，以一定的時(shí)間間隔采取尿和/或血清樣本。標(biāo)記物累積的降低可指示出腫瘤體積的減小，并作為治療有效性的指征?？蓱?yīng)用降低速度預(yù)測(cè)用于每一患者或治療的最佳治療劑量。
評(píng)估的標(biāo)記物選自已知的人類基因。評(píng)估的基因在圖3和4中顯示。圖3和4中包括基因名稱、HUGO標(biāo)識(shí)符、MWG oligo number、NCBImRNA參考序列編號(hào)和蛋白質(zhì)參考編號(hào)。全長序列見于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/。
用于膀胱癌診斷和評(píng)估的鑒定標(biāo)記物在圖2以及本申請(qǐng)書后附的序列表中顯示。
本發(fā)明的方面因此，在某些方面中，本發(fā)明包括用于膀胱癌檢測(cè)的方法，所述方法包括檢測(cè)尿中UBTM家族成員的累積。
在其它方面中，UBTM家族成員并非顯著程度地與血液相關(guān)聯(lián)。
在額外的方面中，UBTM選自圖3或4中所示的群體。
另外，在某些方面中，通過檢測(cè)BTM或UBTM mRNA的累積實(shí)施檢測(cè)步驟。
在一些方面中，應(yīng)用微陣列實(shí)施檢測(cè)步驟。
在其它方面中，應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)或雜交方法實(shí)施檢測(cè)步驟。
在進(jìn)一步的方面中，通過檢測(cè)UBTM蛋白質(zhì)的累積實(shí)施檢測(cè)步驟。
而在進(jìn)一步的方面中，通過檢測(cè)UBTM肽的累積實(shí)施檢測(cè)步驟。
在這些方面的一些方面中，實(shí)施檢測(cè)步驟所應(yīng)用的UBTM抗體既可為多克隆抗體也可為單克隆抗體。
在額外的方面中，方法包括檢測(cè)該樣本中兩種或多種UBTM家族成員的累積。
這些額外方面的某些方面中，方法包括檢測(cè)TOP2A、MDK或BIRC5。
而進(jìn)一步的方法包括檢測(cè)選自TOP2A-HOXA13、TOP2A-IGFBP5和TOP2A-SEMA3F的一對(duì)或多對(duì)標(biāo)記物。
在本發(fā)明的其它方面中，用于膀胱癌檢測(cè)的方法包括對(duì)疑患膀胱癌患者的生物樣本中兩種或多種BTM家族成員組合的累積進(jìn)行檢測(cè)，所述BTM家族成員組合選自圖14a或14b。
在這些方面的一些方面中，生物樣本選自血液、血清、血漿、組織、尿、糞便、腦脊液和腹膜洗液。
而進(jìn)一步的方法包括BTM或UBTM特異的抗體并包括用于產(chǎn)生這些抗體的方法，所產(chǎn)生的抗體既可為多克隆抗體也可為單克隆抗體。
在這些方面的某些方面中，單克隆抗體靶向的BTM或UBTM可選自圖3或4中所示的群體。
在這些方面的另外方面中，方法進(jìn)一步包括抗另一BTM或UBTM的另一抗體。
本方面的額外方法包括用于檢測(cè)BTM的設(shè)備，包含其上具有BTM或UBTM組合的捕獲劑的基質(zhì)，所述組合選自圖14a或14b；以及包含與該基質(zhì)關(guān)聯(lián)的監(jiān)測(cè)器，該監(jiān)測(cè)器能夠檢測(cè)與該捕獲劑關(guān)聯(lián)的該BTM或UBTM組合。
在這些方面的某些方面中，捕獲劑包含寡核苷酸。
在額外的方面中，捕獲劑包含抗體。
在一些方面中，BTM或UBTM選自圖3或4中給定的群體。
本發(fā)明也包括用于癌癥檢測(cè)的試劑盒，試劑盒包含基質(zhì)、其上的至少兩種BTM或UBTM組合的捕獲劑以及使用說明書，所述組合選自圖14a或14b。
一些試劑盒包括的捕獲劑為BTM-或UBTM-特異的寡核苷酸，或BTM-特異的抗體。
在一些試劑盒中，BTM或UBTM選自圖3或4中描述的群體。
在某些試劑盒中，標(biāo)記物選自IGFBP5、MGP、SEMA3F和HOXA13。
額外的方面包括用于檢測(cè)膀胱癌存在的方法，該方法包括確定尿樣本中一種或多種標(biāo)記物的存在，所述標(biāo)記物選自BIRC2、CDC2、HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NOV、NRP1、SEMA3F、SPAG5、TOP2A，且其中該標(biāo)記物基本不存在于血液中。
本發(fā)明的其它方面包括用于區(qū)分惡性和非惡性膀胱疾病的方法，該方法包括確定測(cè)定該患者尿中一種或多種標(biāo)記物的累積，所述標(biāo)記物選自HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NRP1、SEMA3F、SMC4L1、TOP2A和UBE2C；以及測(cè)定該樣本中該標(biāo)記物與膀胱癌存在關(guān)聯(lián)的比值。
在這些方面的某些方面中，方法包括測(cè)定尿中至少第二BTM的累積。
在這些實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，第一標(biāo)記物為TOP2A且第二標(biāo)記物選自HOXA13、IGFBP5和SEMA3F。
在額外的方面中，本發(fā)明包括將標(biāo)記物累積比值與作為淺表性膀胱癌、1期浸潤性膀胱癌或2-3期浸潤性膀胱癌的指征相關(guān)聯(lián)。
而在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明包括用于確定膀胱癌治療功效的方法，方法包括將患者第一樣本中存在的一種或多種標(biāo)記物與一段時(shí)間治療后患者第二樣本中存在的一種或多種標(biāo)記物進(jìn)行比較，前述兩種樣本中的標(biāo)記物選自圖3或圖4。
如文中所述，可通過測(cè)定一種或多種腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的檢測(cè)。已出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，多種BTM或UBTM的表達(dá)提高與確診的膀胱癌的存在密切關(guān)聯(lián)。檢測(cè)到的最低顯著性相關(guān)的p值約為0.018。多數(shù)相關(guān)是顯著性的P值小于10-10。顯著性如此之高，可能并不需要檢測(cè)多于一種的BTM或UBTM的表達(dá)或累積。但是，本發(fā)明的BTM冗余應(yīng)用可提高膀胱癌檢測(cè)的可靠性。
此處提供的方法也包括高敏感性的試驗(yàn)。qPCR極端敏感，并可用于檢測(cè)樣本中極低拷貝數(shù)(例如1-100)的基因產(chǎn)物。具有如此高的敏感性，使得極早期檢測(cè)與膀胱癌相關(guān)聯(lián)的事件成為可能。
方法腫瘤收集膀胱腫瘤樣本和非惡性尿道上皮樣本收集自日本的京都大學(xué)醫(yī)院(Kyoto University Hospital，Japan)和合作的其它日本醫(yī)院所進(jìn)行的外科切除術(shù)標(biāo)本。
尿收集非惡性對(duì)照和膀胱癌患者的尿樣本獲自日本的京都大學(xué)醫(yī)院(KyotoUniversity Hospital，Japan)(圖1)。健康對(duì)照樣本獲自高加索人和日本人志愿者。
RNA提取在TriReagent∶水(3∶1)混合物中將腫瘤組織進(jìn)行均質(zhì)化，然后用氯仿提取。之后應(yīng)用RNeasyTM方法(Qiagen)從水相中純化總RNA。也從16種癌細(xì)胞系提取RNA，并將之合并以用作參考RNA。
將尿樣本與等體積的裂解緩沖液(5.64M鹽酸胍、0.5％肌氨酰、50mM乙酸鈉(pH 6.5)和1mM β-巰基乙醇；用1.5M Hepes調(diào)節(jié)pH至pH 8)混合以從尿中提取RNA。然后用Trizol和RNeasyTM方法提取總RNA。在合成cDNA之前，應(yīng)用Qiagen QIAquickTMPCR純化試劑盒進(jìn)一步純化RNA制備物。
從三個(gè)健康志愿者的血液中提取RNA，所述提取操作應(yīng)用Trizol/RNeasyTM提取經(jīng)3.6％葡聚糖沉淀從全血中富集的細(xì)胞。
微陣列玻片制備在環(huán)氧包被的載玻片(MWG Biotech)上印刷約30,000個(gè)50mer寡核苷酸(MWG Biotech)，所示操作根據(jù)產(chǎn)商的說明書應(yīng)用基因機(jī)器微陣列操作機(jī)器人進(jìn)行。
RNA的標(biāo)記和雜交應(yīng)用Superscript IITM逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)由5μg總RNA轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)中包含5-(3-氨基烯丙基)-2′脫氧尿苷-5’-三磷酸。然后在Microcon柱子中對(duì)反應(yīng)進(jìn)行去離子化，之后與Cy3或Cy5在重碳酸鹽緩沖液中室溫孵育1小時(shí)。應(yīng)用Qiaquick柱子(Qiagen)移除未摻入的染料并在SpeedVac中將樣本濃縮至15μl。然后將Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNAs與Ambion ULTRAhybTM緩沖液混合，于100℃變性2分鐘并在雜交盒中于42℃16小時(shí)雜交至微陣列玻片。然后洗滌玻片并在Axon 4000ATM掃描器中以兩種功率設(shè)置掃描玻片兩次。
癌標(biāo)記物基因的微陣列分析將來自53個(gè)膀胱腫瘤和20個(gè)非惡性(“正?！?膀胱組織樣本的RNA標(biāo)記以Cy5并以二份或三份形式雜交，同時(shí)設(shè)有Cy3標(biāo)記的參考RNA。經(jīng)歸一化后通過倍數(shù)改變和統(tǒng)計(jì)學(xué)概率評(píng)估29,718個(gè)基因中每一基因的表達(dá)變化。
歸一化方法將GenepixTM軟件檢測(cè)的熒光強(qiáng)度中位值減去局部背景強(qiáng)度進(jìn)行校正。將背景校正后強(qiáng)度小于零的點(diǎn)排除。為便于歸一化，將強(qiáng)度比和總的點(diǎn)強(qiáng)度(overall spot intensities)進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換。應(yīng)用LOCFITTM軟件包中運(yùn)行的局部回歸對(duì)染料和空間偏差進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換的強(qiáng)度比值(loggedintensity ratio)的校正。根據(jù)總的點(diǎn)強(qiáng)度和部位同時(shí)對(duì)Log轉(zhuǎn)換的強(qiáng)度比進(jìn)行回歸。局部回歸的剩余值提供了校正的log轉(zhuǎn)換的倍數(shù)改變。用于質(zhì)量控制時(shí)，根據(jù)點(diǎn)強(qiáng)度和定位對(duì)每一歸一化的微陣列的比值進(jìn)行作圖。隨后觀察圖是否存在任何假相。另外，應(yīng)用ANOVA模型檢測(cè)pin-tip偏差。將所有歸一化的結(jié)果和參數(shù)插入Postgres數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為更好比較檢測(cè)的陣列間的倍數(shù)改變，換算Log2(比值)以使每個(gè)陣列具有相同的總體標(biāo)準(zhǔn)差。該標(biāo)準(zhǔn)化過程降低了組織內(nèi)平均類型變異性。進(jìn)一步轉(zhuǎn)變Log2(比)以使每一寡核苷酸的中位值為零并利于結(jié)果的視覺觀察。然后應(yīng)用基于倍數(shù)改變的秩檢驗(yàn)(rank-test)來提高噪強(qiáng)度(noiserobustness)。該檢驗(yàn)由兩個(gè)步驟組成(i)計(jì)算陣列內(nèi)倍數(shù)改變秩(Rfc)，和ii)從腫瘤組織的(Rfc)中位值中減去正常組織的(Rfc)中位值。兩個(gè)中位值秩的差異定義了倍數(shù)改變秩的分值。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行以下額外的3個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)1)雙樣本student′s t-檢驗(yàn)，2)Wilcoxon檢驗(yàn)和3)微陣列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(SAM)。給出每一統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(秩倍數(shù)改變、t-檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)和SAM)確定的300個(gè)最顯著上調(diào)基因的每一檢驗(yàn)的秩分值(rank score)。如果一個(gè)基因出現(xiàn)在一個(gè)列表，但不在一個(gè)或多個(gè)其它列表中，則在其分值中加入權(quán)重系數(shù)500。然后將所有秩分值相加得出一個(gè)和的秩分值。
標(biāo)記物組合的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為確定應(yīng)用兩種或三種標(biāo)記物組合區(qū)分腫瘤和非惡性樣本的價(jià)值，對(duì)來自腫瘤和非惡性樣本的qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行以下分析。應(yīng)用樣本均值和標(biāo)準(zhǔn)差生成非惡性樣本和腫瘤樣本的正態(tài)分布。然后確定腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)值超過非惡性分布中定義的閾值(例如，大于50％、70％、75％、80％、90％、95％或99％)的概率(即敏感性)。對(duì)于標(biāo)記物的組合，確定至少一種標(biāo)記物超過閾值的概率。
為證明分析尿樣本以及腫瘤樣本中標(biāo)記物組合的價(jià)值，也應(yīng)用TCC患者和非惡性對(duì)照的尿樣本而獲得的qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布分析，所述數(shù)據(jù)在圖1的系列2中描述。確定從TCC患者獲得的qPCR數(shù)據(jù)值超過在非惡性樣本分布中定義的閾值(例如，大于50％、70％、75％、80％、90％、95％或99％)的概率。
檢測(cè)尿中膀胱癌標(biāo)記物的方法在一些實(shí)施方案中，需要對(duì)尿樣本進(jìn)行BTM試驗(yàn)。通常，用于這些體液中寡核苷酸、蛋白質(zhì)和肽的試驗(yàn)方法為領(lǐng)域內(nèi)公知。然而，出于闡述的目的，可應(yīng)用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)尿中的BTM水平進(jìn)行定量。用于血漿或血清試驗(yàn)時(shí)，將5μl等份的適當(dāng)稀釋的樣本或系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)BTM和75μl過氧化物酶連接的抗人BTM抗體加到微滴定板的孔內(nèi)。于30℃孵育30分鐘后，用含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌孔以移除未結(jié)合的抗體。然后將結(jié)合的BTM和抗BTM抗體復(fù)合體與含H2O2的鄰苯二胺于30℃孵育15分鐘。加入1 M H2SO4終止反應(yīng)，并用微滴定板讀取器檢測(cè)492nm處的吸光值。應(yīng)當(dāng)理解，抗BTM抗體可為單克隆抗體或多克隆抗血清。
由于多種蛋白質(zhì)為(1)由細(xì)胞分泌，(2)從細(xì)胞膜分開，(3)細(xì)胞死亡時(shí)從細(xì)胞內(nèi)釋放或(4)包含于脫落細(xì)胞內(nèi)，因此可以理解，也可在尿中檢測(cè)BTM。另外，可通過檢測(cè)樣本中的BTM表達(dá)或可通過檢測(cè)樣本中的BTM累積對(duì)膀胱癌進(jìn)行診斷?，F(xiàn)有技術(shù)中的診斷方法包括膀胱鏡檢查、細(xì)胞學(xué)檢查以及檢測(cè)由這些方法提取的細(xì)胞。此類方法依賴于對(duì)尿、尿道上皮刷檢樣本或在其它情況下的膀胱壁活檢標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。這些方法的缺點(diǎn)在于幾種類型的誤差，包括取樣誤差，觀測(cè)者間的鑒定誤差，等等。
定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)時(shí)或定量PCR(qPCR)用于對(duì)PCR模板拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)或相對(duì)定量。應(yīng)用Primer Express V 2.0TM(Applied Biosystems)設(shè)計(jì)TaqmanTM探針和引物組。如果可能，將所有潛在的剪接變體均包括在生成的擴(kuò)增子中，其中的擴(kuò)增子優(yōu)選地在來自MWG-Biotech的微陣列寡核苷酸覆蓋的區(qū)域。引物和探針序列在圖2中顯示。備選地，如果靶基因?yàn)橛珊w目的擴(kuò)增子的Assay-on-DemandTM表達(dá)試驗(yàn)(Applied Biosystems)所代表，則應(yīng)用這些靶基因。在in-house設(shè)計(jì)的試驗(yàn)中，應(yīng)用SYBR green標(biāo)記方法和由參考RNA制備的 cDNA滴定引物濃度。在ABI PrismTM7000測(cè)序系統(tǒng)中以標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)觀察到解離曲線中形成單一擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)用最適引物濃度和5’FAM-3’TAMRA磷酸鹽TaqmanTM探針(Proligo)(終濃度250nM)制備625倍濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。給定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)大于0.98的試驗(yàn)用于隨后的試驗(yàn)中。
可在兩個(gè)96孔平板上進(jìn)行試驗(yàn)，每一RNA樣本代表單一的cDNA。每一平板包含參考cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線包括625倍的濃度范圍并以二次重復(fù)進(jìn)行。分析包括計(jì)算ΔCT(靶基因CT-平均參考cDNA CT)。ΔCT直接與Log2倍數(shù)改變的負(fù)值成比例。然后計(jì)算與非惡性Log2倍數(shù)改變的中位值相關(guān)的Log2倍數(shù)改變(Log2倍數(shù)改變-正常Log2倍數(shù)改變中位值)。然后將倍數(shù)改變聚簇于頻率等級(jí)內(nèi)，并以盒須點(diǎn)制圖或繪圖。
篩選膀胱惡性腫瘤的血清和尿標(biāo)記物可從陣列數(shù)據(jù)中篩選推定的血清標(biāo)記物，所述篩選基于(i)編碼的蛋白質(zhì)由細(xì)胞分泌或從胞膜分離的可能性；分泌可能性基于用TargetPTM進(jìn)行的分析(Emanuelsson等；分子生物學(xué)雜志(J.MoI.Biol.)300，1005-1006(2000))，以及基于(ii)其求和的秩分值。但是，腫瘤樣本中過表達(dá)的變化程度不僅反映出腫瘤的異質(zhì)性，也反映出腫瘤樣本污染有“正?！苯M織的程度的變化性，所述“正?！苯M織包括平滑肌、結(jié)締組織、粘膜下層細(xì)胞(參見U.S專利6,335,170)、基質(zhì)細(xì)胞和非惡性上皮細(xì)胞。在多種情形下，“正常”污染的范圍從5％到70％，其中位值約為25％。
因此，通過分析尿樣本中的BTM，我們已經(jīng)能夠減少這些“假陽性”結(jié)果，前述尿標(biāo)本并未重度污染有正常膀胱細(xì)胞。此外，與先前文獻(xiàn)中的使用微陣列方法相比，通過應(yīng)用qPCR方法，我們已經(jīng)能夠更為精確地測(cè)定尿樣本中的mRNA水平。因此，我們已經(jīng)能夠避免與其它膀胱細(xì)胞類型的主要污染，并因此避免了臨床樣本微陣列分析領(lǐng)域中一個(gè)較為棘手的問題。
通過檢測(cè)尿中標(biāo)記物的累積，且并不依賴于腫瘤中的表達(dá)速率，我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)了可用于檢測(cè)膀胱癌并確定其階段和/或其類型的多種BTM。此外，由于尿中存在血液是導(dǎo)致病人就醫(yī)并詢問膀胱癌可能性的一個(gè)主要癥狀，因此，我們所證明的BTM并不在血液中高表達(dá)使得該標(biāo)記物在診斷極具應(yīng)用價(jià)值。這些標(biāo)記物包括IGFBP5、MGP、SEMA3F和HOXA13(參見圖9)。
檢測(cè)累積優(yōu)于定義“過表達(dá)”。累積增加可反映出真正的分子生物學(xué)意義上的過表達(dá)或表達(dá)速率提高(即每單位時(shí)間的每細(xì)胞內(nèi)核不均一RNA(hnRNA)分子、mRNA分子或蛋白質(zhì)的數(shù)量增加)。但是，累積也可意指特定體積內(nèi)(如尿中)的標(biāo)記物數(shù)量增加，盡管表達(dá)速率并未提高。例如，即使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生正常數(shù)量的標(biāo)記物，觀測(cè)到樣本中此類細(xì)胞數(shù)目的增加也可作為癌癥存在的指標(biāo)。此外，累積可反映出樣本中的游離或可溶性RNA。在一些情況下，產(chǎn)生標(biāo)記物的腫瘤細(xì)胞可發(fā)生死亡并將細(xì)胞成分釋放到周圍的組織中。如果細(xì)胞成分能夠進(jìn)入尿，則可在尿中檢測(cè)出游離的標(biāo)記物RNA。這些現(xiàn)象可能特別有助于淺表性膀胱癌的診斷，此類癌癥通常很難獲得滿意的選擇性和特異性。在尿中檢測(cè)到標(biāo)記物的累積可成為淺表性膀胱癌首批指征中的一個(gè)。因此，應(yīng)用本發(fā)明的方法和設(shè)備，可對(duì)早期的膀胱癌進(jìn)行檢測(cè)。
我們也注意到，在檢測(cè)累積時(shí)，需小心校正樣本體積的變化。例如，尿中每單位體積的標(biāo)記物數(shù)量可依賴于受試者的腎功能。因此，在尿產(chǎn)生降低的情況下，尿中的細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)經(jīng)過了濃縮，由此得出較高累積檢測(cè)值(每單位體積)可能為假相。可通過獨(dú)立地檢測(cè)尿產(chǎn)量(例如，每單位時(shí)間內(nèi)的尿輸出量)和尿清除率(例如，檢測(cè)肌酸酐或BUN)來減少此類假相的產(chǎn)生。相反，在尿輸出量增加的情況下，如多尿癥，含標(biāo)記物的細(xì)胞進(jìn)行了稀釋并產(chǎn)生假相性的低累積檢測(cè)值。但是，可對(duì)利尿劑的使用、水?dāng)z入量和其它可使標(biāo)記物累積發(fā)生變異但并非與樣本中標(biāo)記物的真實(shí)累積或數(shù)量相關(guān)的其它因素進(jìn)行控制。在這些情況下，可對(duì)尿產(chǎn)生速率校正標(biāo)記物的數(shù)量。
因此，與本領(lǐng)域內(nèi)方法相比，我們的方法通過檢測(cè)尿中的BTM，能夠降低假陽性結(jié)果的發(fā)生率，表明這些方法優(yōu)于本領(lǐng)域內(nèi)方法。
尿標(biāo)記物選自以上描述的陣列數(shù)據(jù)，但并未應(yīng)用從胞膜分泌或切割的標(biāo)準(zhǔn)。因此，預(yù)期不能用于血清標(biāo)記物的胞內(nèi)和膜結(jié)合的標(biāo)記物可包括在尿標(biāo)記物之內(nèi)。
實(shí)施例于此描述的實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行示例的目的，且并非意在限定本發(fā)明的范圍。其它實(shí)施方案、方法和分析類型為分子診斷領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知，無需在此詳細(xì)描述?；谖闹羞@些教導(dǎo)的在本領(lǐng)域范圍內(nèi)的實(shí)施方案也認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
實(shí)施例1用于淺表性和浸潤性膀胱惡性腫瘤的標(biāo)記物的鑒定浸潤性和淺表性膀胱癌基因表達(dá)模式的微陣列數(shù)據(jù)系統(tǒng)的遺傳聚類分析顯示出大量的顯著差異。因此，在隨后的分析中分別對(duì)這些癌癥類型進(jìn)行分別處理。然而，高比例的基因在兩種類型的癌癥中均為過表達(dá)。圖3描述的表格顯示了用于浸潤性膀胱惡性腫瘤的標(biāo)記物的微陣列研究結(jié)果。199個(gè)浸潤性標(biāo)記物中有31個(gè)符合以上描述的血清標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)(在圖中以“S”表示)。圖4描述的表格顯示了用于淺表性膀胱惡性腫瘤的微陣列研究結(jié)果。170個(gè)淺表性標(biāo)記物中有34個(gè)符合以上用于血清標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)。圖3和4包括基因的HUGO符號(hào)(“符號(hào)”)、MWG Biotech寡核苷酸編號(hào)、NCBI mRNA參考序列號(hào)、蛋白質(zhì)參考序列號(hào)、腫瘤和非惡性基因表達(dá)間的平均倍數(shù)改變、腫瘤樣本個(gè)體表達(dá)和非惡性樣本表達(dá)中位值間的最大倍數(shù)改變、Student′s t-檢驗(yàn)的未作調(diào)整的原始結(jié)果、雙樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)的結(jié)果和求和的秩分值。
浸潤性膀胱癌標(biāo)記物分析中的199個(gè)基因的平均倍數(shù)改變(腫瘤非惡性組織)位于從1.3到5.3的范圍內(nèi)，且最大倍數(shù)改變位于從2.1到60.9范圍內(nèi)。用于淺表性膀胱癌分析時(shí)，170個(gè)標(biāo)記物的過表達(dá)均值位于1.1.3到3.0之間，且最大過表達(dá)位于1.9到144之間。對(duì)于每一顯示的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)其作為癌標(biāo)記物特異性的統(tǒng)計(jì)顯著性極高。除極少數(shù)例外，studentt-檢測(cè)值均低于10-3，表明應(yīng)用這些標(biāo)記物的診斷與膀胱癌密切相關(guān)。應(yīng)當(dāng)指出由微陣列研究得出的倍數(shù)改變傾向于低估了應(yīng)用更為精確的如qPCR技術(shù)所觀測(cè)到的實(shí)際表達(dá)變化。但是，由于別處描述的原因，微陣列分析可存在一種或多種嚴(yán)重的假相的問題。因此，我們發(fā)展了基于qPCR的方法以更為精確地檢測(cè)膀胱癌的存在和分期。
實(shí)施例2qPCR分析應(yīng)用qPCR對(duì)圖3和4中顯示的基因子集的基因表達(dá)進(jìn)行更為敏感和精確的定量。應(yīng)用30個(gè)浸潤性膀胱腫瘤、25個(gè)淺表性膀胱腫瘤和18個(gè)正常尿道上皮樣本的信使RNA進(jìn)行微陣列分析鑒定出的18個(gè)基因(圖3和4)進(jìn)行分析，結(jié)果在圖5中顯示。顯示了用于浸潤性和淺表性類型膀胱癌的以下標(biāo)記物的數(shù)據(jù)，標(biāo)記物SPAG5、TOP2a、CDC2、ENG、NRP1、EGFL6、SEM2、CHGA、UBE2C、HOXA13、MDK、THYl、BIRC5和SMC4L1。與正常尿道上皮相比標(biāo)記物SEMA3F、IGFBP5和NOV僅在淺表性類型中過表達(dá)，且MGP僅在浸潤性類型中過表達(dá)；這些標(biāo)記物保持與未過表達(dá)的腫瘤樣本中的正常尿道上皮類似的表達(dá)水平。圖5包括基因名稱、基因別名、基因符號(hào)、腫瘤(T)和非惡性(N)組織間的倍數(shù)改變的中位值、腫瘤樣本個(gè)體和非惡性組織表達(dá)中位值間的最大倍數(shù)改變、和其表達(dá)水平高于非惡性樣本表達(dá)水平的95％的腫瘤樣本的百分比。
圖5中標(biāo)記物的倍數(shù)改變中位值(與非惡性組織表達(dá)中位值相比的腫瘤組織)，除CHGA之外，對(duì)于浸潤性膀胱腫瘤為2到128倍，且對(duì)于淺表性膀胱腫瘤為2到39倍。對(duì)于浸潤性腫瘤的最大倍數(shù)改變?yōu)閺?4到2526倍，且對(duì)于淺表性腫瘤為從6倍到619倍。CHGA的表達(dá)模式值得注意，這是因?yàn)樵摌?biāo)記物在一部分腫瘤(圖6s-6t)中的表達(dá)非常高，但在其它腫瘤中的表達(dá)檢測(cè)不到。其在15/25的淺表性腫瘤、15/29的浸潤性腫瘤和9/10的正常樣本中的表達(dá)檢測(cè)不到。正常樣本中的低表達(dá)排除了對(duì)腫瘤過表達(dá)水平與正常相比的比例進(jìn)行精確定量，但如果可對(duì)BTM mRNA的累積進(jìn)行檢測(cè)并定量時(shí)，可將其用作膀胱癌診斷的基礎(chǔ)。對(duì)于浸潤性腫瘤，在大于等于90％的情況下，SPAG5、TOP2A和CDC2基因的表達(dá)水平在腫瘤中高于“正常”范圍的95％。除BIRC5外，在浸潤性腫瘤中檢測(cè)的圖5中的其余基因在大于45％的樣本中的表達(dá)高于正常的95％。在淺表性腫瘤中，SPAG5、TOP2A、CDC2、ENG和NRP1基因在大于等于80％的情況下表達(dá)水平在腫瘤中高于非惡性范圍的95％。除CHGA、UBE2C和BIRC5之外，在淺表性腫瘤中檢測(cè)的圖5中的其余基因在大于40％的樣本中的表達(dá)高于正常的95％。
圖6a-6af描述的柱狀圖比較了觀測(cè)的18個(gè)基因系列中每一個(gè)基因的表達(dá)頻率(垂直軸)和該基因表達(dá)的Log2倍數(shù)改變(水平軸)，圖中所述表達(dá)即包括正常組織(開放條)也包括淺表性或浸潤性腫瘤組織(黑條)。我們驚異地發(fā)現(xiàn)，這18個(gè)基因中的每一個(gè)在正常和腫瘤組織間的頻率分布基本分離。例如，圖6c描述了浸潤性腫瘤中TOP2a表達(dá)的結(jié)果。僅觀測(cè)到兩個(gè)腫瘤樣本其表達(dá)水平位于正常范圍內(nèi)。
應(yīng)用qPCR以從相同體積的尿中提取的總RNA為材料測(cè)定了病人和對(duì)照者尿中18個(gè)BTM的累積(圖1樣本系列1)，所述BTM為SPAG5、TOP2A、CDC2、ENG、IGFBP5、NOV、NRP1、SEMA3F、EGFL6、MGP、SEM2、CHGA、UBE2C、HOXA13、MDK、THYl、BIRC5和SMC4L1。顯示有17個(gè)BTM在患者尿樣本中的累積高于對(duì)照尿樣本，而EGFL6除外(圖7)。17個(gè)BTM的倍數(shù)差異中位值位于從2倍到265倍之間。單一患者樣本與對(duì)照的中位值水平的最大差異位于從26倍到＞10,000倍。
圖8以盒須圖顯示了13個(gè)BTM的BTM轉(zhuǎn)錄物累積差異，且以對(duì)照樣本的表達(dá)中位值進(jìn)行歸一化。圖8顯示尿中的MDK、SEMA3F和TOP2A在癌癥患者和對(duì)照者之間不存在交疊。另外，IGFBP5、HOXA13、MGP、NRP1、SMC4L1、SPAG4和UBE2C轉(zhuǎn)錄物的高水平累積幾乎總是與膀胱癌相關(guān)聯(lián)。圖8中描述的其余BTM(BIRC5，NOV和CDC2)在膀胱癌患者尿中的表達(dá)高于正常對(duì)照樣本至少約3倍。
血尿是引起患者注意并檢測(cè)是否存在膀胱癌的主要臨床癥狀(即尿中存在肉眼可見或顯微鏡下可見的血液)。血液通常為肉眼可見，或可應(yīng)用尿“插入條(dipsticks)”化學(xué)檢測(cè)血紅蛋白。僅有分別約15％和4％的宏觀可見和顯微可見血尿的病例與膀胱癌有關(guān)。因此，膀胱癌測(cè)試需具有高特異性，重要的是全血中標(biāo)記物的表達(dá)水平很低，或在一些情況下表達(dá)水平檢測(cè)不到。因此，為提高對(duì)高特異性標(biāo)記物的鑒定，應(yīng)用qPCR以血液RNA為材料測(cè)定了圖8中14個(gè)標(biāo)記物中12個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)。應(yīng)用從血液和膀胱腫瘤組織中提取的5μg總RNA和圖2中顯示的引物和探針進(jìn)行qPCR。圖9顯示了每一標(biāo)記物高出背景的循環(huán)數(shù)。標(biāo)記物MGP、IGFBP5、SEMA3F和HoxA13的轉(zhuǎn)錄物不可在血液中檢測(cè)出，但標(biāo)記物SMC4L1和UBE2c在血液中特別表達(dá)。我們注意到，顯示PCR循環(huán)數(shù)的數(shù)據(jù)，為固有的Log2繪圖，因此1個(gè)循環(huán)數(shù)的增加表示信號(hào)的雙倍提高。因此，評(píng)價(jià)腫瘤組織和血液中存在的標(biāo)記物間的差異時(shí)，兩(2)個(gè)循環(huán)的差異表示4倍的表達(dá)差異。同樣，5個(gè)循環(huán)的差異(例如對(duì)TOP2A而言)表明表達(dá)為25或32倍的表達(dá)差異。已檢測(cè)到其它如TOP2A和MDK標(biāo)記物可在血液中表達(dá)，但由于血液中表達(dá)和膀胱腫瘤表達(dá)間存在巨大差異，因此仍可將它們視為合理的標(biāo)記物。
為進(jìn)一步檢測(cè)全血和膀胱腫瘤中標(biāo)記物表達(dá)間的差異，并改進(jìn)對(duì)膀胱癌尿標(biāo)記物的篩選，應(yīng)用另外的20個(gè)患者、13個(gè)正常對(duì)照和26個(gè)非惡性對(duì)照(圖1樣本系列2)的尿RNA對(duì)選擇的9個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行進(jìn)一步的分析。非惡性對(duì)照包括有下述20個(gè)樣本，即通過細(xì)胞學(xué)檢查或可在其尿中檢出潛血或白血細(xì)胞。所有9個(gè)標(biāo)記物均在對(duì)照和癌癥患者樣本間顯示出差異，癌癥患者樣本的Log2過表達(dá)中位值與健康樣本和非惡性樣本相比分別為從5.4到10.4和從4.0到10.1(圖10)。圖11中顯示了闡明該數(shù)據(jù)的盒須圖。
如由血液qPCR數(shù)據(jù)所預(yù)測(cè)的，與健康對(duì)照相比，標(biāo)記物UBE2C和SMC4L1在非惡性對(duì)照尿中顯示出明顯的累積增加。與健康對(duì)照尿樣本相比，非惡性樣本的尿樣本中NRP1也顯著提高，并在癌癥患者樣本和非惡性患者樣本間顯示出明顯交疊，TOP2A和MDK也顯示出提高，但由于它們?cè)赥CC細(xì)胞中的表達(dá)極高，并因此在非惡性患者尿樣本和癌癥患者樣本間維持了明顯的差異。相反，與健康對(duì)照樣本相比，HOXA13、IGFBP5、SEMA3F和MGP僅在非惡性尿樣本中顯示出輕度的提高。
總體而言，6個(gè)標(biāo)記物(SEMA3F、HOXA13、MDK、IGFBP5、MGP和TOP2A)在癌癥患者樣本和非惡性對(duì)照間顯示出最小的交疊。剩余的3個(gè)標(biāo)記物(NRP1、UBE2C、SMC4L1)在非惡性對(duì)照子集中顯示出顯著的提高并與癌癥患者樣本交疊。與健康對(duì)照相比RNA標(biāo)記物在非惡性對(duì)照尿中的累積增加，與這些標(biāo)記物在造血和內(nèi)皮細(xì)胞源細(xì)胞中的表達(dá)一致，前述兩種細(xì)胞存在于非惡性疾病患者的尿中。因此，與不考慮血液中標(biāo)記物表達(dá)的現(xiàn)有本領(lǐng)域方法相比，應(yīng)用尿樣本通過分別的標(biāo)記物進(jìn)行膀胱癌診斷可顯示出敏感性和特異性的提高。該結(jié)果對(duì)基于現(xiàn)有技術(shù)的診斷方法而言，可為完全未預(yù)料的。
數(shù)據(jù)顯示了令人驚異的發(fā)現(xiàn)，將尿標(biāo)記物用于膀胱癌時(shí)顯示出高度敏感性和特異性，而僅應(yīng)用腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)的微陣列分析則不能進(jìn)行精確預(yù)測(cè)。需要將造血和/或內(nèi)皮來源的細(xì)胞中假定標(biāo)記物的表達(dá)考慮在內(nèi)。可通過一些方法實(shí)現(xiàn)(i)血液RNA的qPCR分析，(ii)表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析(例如，血液和血管/內(nèi)皮細(xì)胞RNA的EST文庫)和/或(iii)從未分級(jí)尿中提取的RNA進(jìn)行qPCR分析。
敏感性和特異性根據(jù)此處公開和分析的兩個(gè)系列的樣本，用于膀胱癌檢測(cè)的敏感性超過95％。包括非惡性疾病患者樣本的系列2中的特異性也超過95％。
實(shí)施例3多種標(biāo)記物在膀胱癌檢測(cè)中的用途圖12a-12b描述的柱狀圖顯示了與正常樣本相比的腫瘤樣本個(gè)體中其表達(dá)顯著提高(″過表達(dá)″)的基因的數(shù)目。柱狀圖由圖5中顯示的首批的12個(gè)標(biāo)記物獲得的qPCR數(shù)據(jù)。30個(gè)浸潤性腫瘤的PCR分析中，其中的27個(gè)(90％)至少有4個(gè)基因過表達(dá)超過95個(gè)百分點(diǎn)(圖12a)。25個(gè)淺表性腫瘤的分析中，其中的23個(gè)(92％)至少有4個(gè)基因過表達(dá)超過95個(gè)百分點(diǎn)(圖12b)。這些發(fā)現(xiàn)表明，與正常組織相比有多個(gè)基因過表達(dá)的情況下，癌癥檢測(cè)的可靠性可大為提高，并使得癌癥診斷更為確切。但在一些情況下，單一標(biāo)記物基因的表達(dá)提高足以診斷癌癥。
應(yīng)用標(biāo)記物組合成功區(qū)分腫瘤和非腫瘤樣本的可靠性進(jìn)一步在圖13中描述的統(tǒng)計(jì)分析中說明。該分析比較了腫瘤和非惡性樣本qPCR基因表達(dá)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。qPCR數(shù)據(jù)已在圖5中進(jìn)行總結(jié)。該分析顯示了增加用于區(qū)分腫瘤和非惡性樣本的標(biāo)記物數(shù)目對(duì)檢測(cè)敏感性(具有固定95％特異性)的影響。盡管18種標(biāo)記物中僅有少數(shù)當(dāng)單獨(dú)用于該分析時(shí)其敏感性高于90、95或99％，但兩種或三種標(biāo)記物的組合可獲得圖14a和14b中兩種或三種標(biāo)記物的大量組合才可達(dá)到的高敏感性。
圖14a和14b顯示了用于檢測(cè)浸潤性和淺表性移行細(xì)胞癌(TCC)的特異標(biāo)記物和標(biāo)記物組合的敏感性，前述檢測(cè)具有固定的95％特異性。僅顯示了敏感性＞90％的組合。圖14a中顯示的15種標(biāo)記物中，單獨(dú)應(yīng)用TOP2A，SPAG5和CDC2檢測(cè)浸潤性膀胱癌的敏感性約為95％。顯示的其它標(biāo)記物當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)其敏感性較低。
但是，兩種上述標(biāo)記物的組合可顯著提高浸潤性膀胱癌檢測(cè)的敏感性(圖13a和圖14a)。發(fā)現(xiàn)在105個(gè)兩種標(biāo)記物組合中，有13個(gè)組合在應(yīng)用時(shí)其敏感性高于95％。實(shí)際上，應(yīng)用兩種標(biāo)記物時(shí)，在105個(gè)標(biāo)記物組合中有42個(gè)組合的最低敏感性達(dá)到90％。
用于淺表性膀胱癌(圖13b和圖14b)時(shí)，發(fā)現(xiàn)任何單一標(biāo)記物的敏感性均未能超過90％，但是，136個(gè)雙標(biāo)記物組合中的11個(gè)組合達(dá)到了該閾值。22個(gè)三標(biāo)記物組合的敏感性達(dá)到＞95％。
應(yīng)用標(biāo)記物組合也可顯著提高應(yīng)用尿樣本檢測(cè)膀胱癌的敏感性。圖15和16顯示了應(yīng)用尿qPCR數(shù)據(jù)時(shí)單一標(biāo)記物和標(biāo)記物組合的檢測(cè)敏感性。
如圖16中所示，盡管僅IGFBP5的敏感性＞95％，但雙標(biāo)記物組合和37個(gè)三標(biāo)記物組合達(dá)到該閾值。
實(shí)施例4淺表性和浸潤性膀胱癌患者中轉(zhuǎn)錄物累積的差異從圖5中可以看出，以下幾種BTM在浸潤性膀胱癌和淺表性膀胱癌中的表達(dá)存在差異，包括SEMA3F、HOXA13、TOP2A和SPAG5。為對(duì)此觀察作以延伸，進(jìn)一步比較了浸潤性和淺表性膀胱癌患者尿中這些轉(zhuǎn)錄物的累積。
從來自圖1中描述的患者的等體積尿中提取RNA，并通過qPCR檢測(cè)BTM累積。然后將特異BTM組合的累積表述為比值。BTM組合由下述BTM組成，一種BTM在浸潤性膀胱腫瘤中的過表達(dá)高于淺表性膀胱腫瘤，且一種BTM在淺表性腫瘤中的過表達(dá)高于浸潤性腫瘤。
圖17顯示了對(duì)20個(gè)淺表性和14個(gè)浸潤性TCC患者的尿樣本進(jìn)行的三個(gè)標(biāo)記物組合的分析。顯示的三個(gè)組合為(i)TOP2A和HOXA13，(ii)TOP2A和IGFBP5和(iii)TOP2A和SEMA3F。可以看出這些標(biāo)記物組合可將淺表性和浸潤性TCC患者的尿標(biāo)本區(qū)分開來。在淺表性和浸潤性類型的TCC間的表達(dá)顯示出差異的圖5中的其它標(biāo)記物，也能夠用于尿樣本分析來確定TCC類型。
此外，圖18顯示可應(yīng)用包括TOP2A的雙標(biāo)記物組合將浸潤性膀胱癌區(qū)分為1期-2期和3期的腫瘤。
這些觀測(cè)顯示測(cè)定尿中幾種BTM轉(zhuǎn)錄物的累積可對(duì)浸潤性和淺表性類型的膀胱癌進(jìn)行區(qū)分。此外，應(yīng)用qPCR測(cè)定膀胱癌患者尿樣本的BTM比值來區(qū)分浸潤性和淺表性類型的能力優(yōu)于應(yīng)用腫瘤RNA所進(jìn)行的同樣分析。圖19對(duì)此進(jìn)行了說明，所顯示的盒須圖用于(i)TOP2A和HOXA13，(ii)TOP2A和IGFBP5和(iii)TOP2A和SEMA3F，應(yīng)用來自約23個(gè)淺表性和28個(gè)浸潤性膀胱腫瘤RNA制備物的qPCR數(shù)據(jù)；盡管這些BTM比值仍可允許對(duì)淺表性和浸潤性類型膀胱癌進(jìn)行區(qū)分，但在淺表性和浸潤性比值間存在較大交疊。該發(fā)現(xiàn)可能反映了腫瘤RNA制備物污染有如肌肉和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類型，所述細(xì)胞具有不同于惡性細(xì)胞的BTM比值。備選地，該發(fā)現(xiàn)也可反映出脫落到尿中的惡性細(xì)胞的BTM表達(dá)與保留在腫瘤體的那些細(xì)胞的BTM表達(dá)具有較大的差異。無論何種原因?qū)е铝怂^測(cè)的結(jié)果，我們的結(jié)論是，檢測(cè)尿中BTM累積明顯優(yōu)于常規(guī)的組織樣本微陣列分析。
實(shí)施例5膀胱腫瘤標(biāo)記物的抗體在額外的方面中，本發(fā)明包括生成抗BTM抗體。應(yīng)用此處描述的方法，可應(yīng)用微陣列和/或qPCR方法鑒定出新型BTM。一旦鑒定出推定的標(biāo)記物，可生產(chǎn)足夠數(shù)量的標(biāo)記物以適于引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些情況下，可應(yīng)用全長BTM，而在其它情況下，BTM的肽片段足以作為免疫原。可將免疫原注射到適宜的宿主內(nèi)(例如，小鼠、兔等)，且如果需要，可注射佐劑以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，所述佐劑如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。應(yīng)當(dāng)理解，抗體的制備為免疫學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)且不需在此進(jìn)一步描述。最終，可產(chǎn)生針對(duì)用此處描述的方法鑒定出的BTM或UBTM的抗體。
而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可制備對(duì)抗此處描述的腫瘤標(biāo)記物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)核心的抗體，或制備抗BTM獨(dú)特型寡核苷酸序列的抗體。盡管某些蛋白質(zhì)可糖基化，但糖基化模式可存在差異，這因此可導(dǎo)致對(duì)缺乏通常糖基化模式的BTM形式的錯(cuò)誤檢測(cè)。因此，在本發(fā)明的某些方面中，BTM免疫原可包括去糖基化BTM或去糖基化BTM的片段?？蓱?yīng)用領(lǐng)域內(nèi)已知的一種或多種糖苷酶進(jìn)行去糖基化反應(yīng)。備選地，可在糖基化反應(yīng)缺陷細(xì)胞系中表達(dá)BTM cDNA，所述細(xì)胞系如原核細(xì)胞系，包括大腸桿菌等。
可制備載體以使其含有編碼BTM的寡核苷酸。多種此類載體可基于領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)載體?？蓱?yīng)用載體轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系以產(chǎn)生BTM生產(chǎn)細(xì)胞系，該細(xì)胞系可產(chǎn)生所需數(shù)量的BTM用以產(chǎn)生特定抗體或其它制劑，所述抗體或制劑用于BTM檢測(cè)或用于對(duì)研發(fā)的BTM或UBTM試驗(yàn)進(jìn)行歸一化。
實(shí)施例6試劑盒基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，可構(gòu)想并產(chǎn)生幾種類型的試驗(yàn)試劑盒。首先，可制備具有預(yù)包被有檢測(cè)分子(或“捕獲劑”)的檢測(cè)裝置的試劑盒。在用于檢測(cè)BTM mRNA的實(shí)施方案中，此類裝置可包含下述基質(zhì)(例如，玻璃、硅、石英、金屬等)，該基質(zhì)上結(jié)合有可與待檢測(cè)mRNA雜交的作為捕獲劑的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可通過mRNA(標(biāo)記以cy3、cy5、放射性標(biāo)記物或其它標(biāo)記物)與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的直接檢測(cè)。在其它實(shí)施方案中，mRNA的檢測(cè)可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)，首先制備與目的mRNA互補(bǔ)的DNA(cDNA)。然后將標(biāo)記的cDNA與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交并進(jìn)行檢測(cè)。
無論應(yīng)用何種檢測(cè)方法，均需要將受試BTM的表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的表達(dá)進(jìn)行比較。例如，可根據(jù)總細(xì)胞DNA、組成型表達(dá)的RNA(如核糖體RNA)的表達(dá)或其它相對(duì)恒定的標(biāo)記物對(duì)RNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在檢測(cè)體液(如尿)中的BTM的實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)品可為文中所示的由未患惡性疾病的受試者獲得的等體積尿。
試劑盒中也可應(yīng)用抗體作為捕獲劑。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)(如多孔平板)可含有與其連附的特異BTM或UBTM捕獲劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包含封閉劑。封閉劑可用于減少非特異結(jié)合。例如，可應(yīng)用不合BTM寡核苷酸的任何方便來源的過量DNA來減少非特異寡核苷酸的結(jié)合，所述DNA如鮭魚精DNA?？蓱?yīng)用過量的如血清白蛋白的封閉蛋白質(zhì)減少非特異抗體結(jié)合。可以理解，用于檢測(cè)寡核苷酸和蛋白質(zhì)的多種方法為領(lǐng)域內(nèi)公知，且可應(yīng)用可特異檢測(cè)BTM關(guān)聯(lián)分子的任何策略并視為本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在依賴抗體檢測(cè)的實(shí)施方案中，可在每細(xì)胞基礎(chǔ)上或在總細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)、體液體積、組織質(zhì)量(重量)的基礎(chǔ)上表達(dá)BTM蛋白質(zhì)或肽。另外，血清中的BTM可基于相對(duì)高含量的如白蛋白的血清蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。
除基質(zhì)外，試驗(yàn)試劑盒可包含捕獲劑(如探針)、洗液(例如，SSC、其它鹽類、緩沖液、去污劑等)，以及包含檢測(cè)部分(例如，cy3、cy5、放射性標(biāo)記物等)。試劑盒也可包括使用說明書和包裝。
實(shí)施例7用于膀胱癌I檢測(cè)的BTM組合在一系列實(shí)施方案中，可將用于測(cè)試BTM HOXA13、MGP、SEMA3F和TOP2A的試劑單獨(dú)或以組合形式加入到試劑盒內(nèi)，以用于測(cè)試未分級(jí)尿或尿細(xì)胞沉淀并實(shí)現(xiàn)膀胱癌的檢測(cè)。這些BTM在癌癥患者和對(duì)照中的累積范圍在圖20中顯示。從已診斷有膀胱癌并需要監(jiān)控疾病進(jìn)程或治療反應(yīng)的患者或顯現(xiàn)泌尿科癥狀或無癥狀的個(gè)體中收集尿樣本，所述泌尿科癥狀包括宏觀可見或顯微可見的血尿。應(yīng)用試劑盒測(cè)試患者或個(gè)體的未分級(jí)尿中的BTM時(shí)，需采取約2ml的尿用于試驗(yàn)。對(duì)于應(yīng)用尿沉淀的試驗(yàn)，需收集＞20ml的尿。
適宜的試劑盒包括(i)用于使用和解釋結(jié)果的說明書，(ii)用于穩(wěn)定和純化未分級(jí)尿或尿沉淀中的RNA的試劑，(iii)用于cDNA合成的試劑，包括dNTPs和逆轉(zhuǎn)錄酶，和(iv)用于對(duì)BTM cDNA進(jìn)行定量的試劑。在一種形式中，這些試劑將用于定量PCR，且包括特異的跨外顯子寡核苷酸引物、標(biāo)記以檢測(cè)探針的第三寡核苷酸、Taq聚合酶和PCR所需的其它緩沖液、鹽和dNTPs。試劑盒也可應(yīng)用其它方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物，如BTM RNA與標(biāo)記探針的直接雜交或分支DNA技術(shù)；(v)用于檢測(cè)源自高轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄物以用作質(zhì)量對(duì)照檢測(cè)的寡核苷酸和探針，所述基因如β-肌動(dòng)蛋白；和(vi)BTM靶序列的定量樣本，所述定量樣本用作內(nèi)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)以及健康和非惡性對(duì)照中BTM轉(zhuǎn)錄物累積的上限參考?？蓪⑸舷薅x為對(duì)照范圍的第95個(gè)或第99個(gè)百分點(diǎn)，但也可應(yīng)用其它界限。特別地，用于淺表性膀胱癌診斷時(shí)，適宜的閾值為超過約50％，在其它情況下為超過約60％、70％或80％。
因此，應(yīng)用本發(fā)明的方法，可以優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)方法的敏感性和特異性對(duì)膀胱癌以及膀胱癌的階段和類型進(jìn)行檢測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用常規(guī)方法(如肌酸酐檢測(cè))對(duì)腎功能進(jìn)行測(cè)定。在這些實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，可通過檢測(cè)腎功能(例如，尿樣本的尿體積、細(xì)胞體積、細(xì)胞數(shù)或總細(xì)胞蛋白質(zhì))對(duì)標(biāo)記物累積進(jìn)行校正.
用于涉及qPCR的試驗(yàn)時(shí)，如果受試樣本中的BTM累積高于上限多于一個(gè)PCR循環(huán)，則將超過預(yù)定上限的受試樣本標(biāo)定為陽性。對(duì)于其它檢測(cè)方法，將高于正常上限(例如，第90個(gè)、95個(gè)或97.5個(gè)百分點(diǎn))大于兩倍的結(jié)果標(biāo)定為陽性。
實(shí)施例8用于膀胱癌II檢測(cè)的BTM組合在另一系列實(shí)施方案中，尿中TOP2A/SEMA3F和TOP2A/HOXA13中的一個(gè)或兩個(gè)標(biāo)記物組合的累積可用于提供診斷膀胱癌患者中存在的膀胱癌組織學(xué)類型的有力預(yù)測(cè)，所述膀胱癌的診斷應(yīng)用任何類型的尿或血液試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。因此，對(duì)膀胱癌類型進(jìn)行診斷時(shí)，可不需要膀胱鏡檢查和組織學(xué)檢查。
用于測(cè)試這些比值的試劑盒包含實(shí)施例7中描述的組分(i)到(iv)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)qPCR方法對(duì)BTM累積進(jìn)行定量后，計(jì)算TOP2A/SEMA3F和TOP2A/HOXA13比值。淺表性和浸潤性膀胱癌患者尿中的這些比值范圍在圖21中顯示。應(yīng)用qPCR試驗(yàn)，TOP2A和SEMA3F間的差異小于5個(gè)循環(huán)，同時(shí)SEMA3F為最高豐度的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，可預(yù)測(cè)為浸潤性膀胱癌，且差異大于5個(gè)循環(huán)時(shí)可預(yù)測(cè)為淺表性膀胱癌。應(yīng)用TOP2A和HOXA13時(shí)，差異小于8個(gè)循環(huán)，同時(shí)HOXA13為最高豐度的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，可預(yù)測(cè)為浸潤性膀胱癌，且差異大于8個(gè)循環(huán)時(shí)可預(yù)測(cè)為淺表性膀胱癌。
實(shí)施例9應(yīng)用BTM評(píng)估膀胱癌進(jìn)程為評(píng)估膀胱腫瘤的進(jìn)程，通過膀胱壁活檢獲得組織樣本，或通過隨時(shí)間收集膀胱癌患者的尿樣本。對(duì)不同時(shí)間采取的樣本中BTM、UBTM或其組合的累積進(jìn)行評(píng)估。BTM或UBTM分別的或組合的累積增加為膀胱癌進(jìn)程的指征。
實(shí)施例10應(yīng)用BTM評(píng)估膀胱癌的治療為評(píng)估膀胱腫瘤的治療效果，在治療開始前采取組織和/或尿樣本。測(cè)定一種或多種BTM或UBTM的基線水平，所述水平表述為多種BTM和UBTM彼此間的比值。起始治療，且治療可包括領(lǐng)域內(nèi)已知的任何治療，包括適于疾病類型和階段的外科、放射治療或化學(xué)治療。治療過程中，采取組織和/或尿樣本并分析BTM和/或UBTM的存在及存在數(shù)量。測(cè)定多種BTM和UBTM比值，并將結(jié)果與以下所述進(jìn)行比較(1)病人治療前的基線水平，或(2)由未患膀胱癌個(gè)體的群體獲得的正常值。參考引入在此申請(qǐng)書中引用的所有出版物和專利均全部在此加入作為參考。本申請(qǐng)書包括核苷酸和/或蛋白質(zhì)序列。計(jì)算機(jī)可讀格式的序列表及含序列表的磁盤也包括于本發(fā)明之內(nèi)并在此全部加入作為參考。
工業(yè)適用性用于檢測(cè)BTM和UBTM家族成員的方法，包括應(yīng)用微陣列和/或?qū)崟r(shí)PCR方法檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和肽。本發(fā)明的組合物和方法可用于疾病診斷、療效評(píng)價(jià)，以及用于生產(chǎn)適于測(cè)定BTM家族成員或UBTM家族成員的表達(dá)的試劑或試驗(yàn)試劑盒。
序列表<110>環(huán)太平洋生物技術(shù)有限公司<120>用于膀胱癌檢測(cè)的尿標(biāo)記物<130>PEBL-01012W00<150>NZ534289<151>2004-07-23<150>NZ539,219<151>2005-04-4<150>US 60/692619<151>2005-06-20<160>39<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人<400>1aattcagagg ccttctgaag ga22<210>2<211>20<212>DNA<213>人<400>2ccgcccagac acctacattg 20<210>3<211>16<212>DNA<213>人<400>3gccgccgcgg aataat 16<210>4<211>23
<212>DNA<213>人<400>4gcaggtgtca gcaagtatga tca 23<210>5<211>22<212>DNA<213>人<400>5aattgtgacc gcaaaggatt ct22<210>6<211>16<212>DNA<213>人<400>6cggaccccag caacca 16<210>7<211>22<212>DNA<213>人<400>7ggagtgtgtt gaccagcaag ac22<210>8<211>25<212>DNA<213>人<400>8cctgtcattt acgctgtctt tacct 25<210>9<211>18<212>DNA<213>人<400>9tgctctcctg ggtggcag 18
<210>10<211>23<212>DNA<213>人<400>10ttcatatccc ctcagcagag atg 23<210>11<211>19<212>DNA<213>人<400>11ctcgaggtgt acgcgctgt 19<210>12<211>21<212>DNA<213>人<400>12tacaaggaga tccggaaagg c 21<210>13<211>19<212>DNA<213>人<400>13tgaacctggc catcagcat 19<210>14<211>22<212>DNA<213>人<400>14tctgctgaac cagctcttct tg 22<210>15<211>26<212>DNA
<213>人<400>15ccctatagtt aatgccaaca tcttca 26<210>16<211>26<212>DNA<213>人<400>16accttctcca attttctcta ttttgg 26<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17atgttgaggc agtgcacctt t21<210>18<211>18<212>DNA<213>人<400>18cagcagatgc cacgcttg18<210>19<211>23<212>DNA<213>小鼠<400>19ccccatcgaa cacacagtta tct 23<210>20<211>23<212>DNA<213>人<400>20cgtcagcttg ggaatagatg aag 23
<210>21<211>23<212>DNA<213>人<400>21gcgaatatca gccatggagt aga 23<210>22<211>21<212>DNA<213>人<400>22tagtgacaga ccccaggctg a 21<210>23<211>21<212>DNA<213>人<400>23ttgagctcgt ggacaggctt a 21<210>24<211>18<212>DNA<213>人<400>24gcccgttgaa aacctccc 18<210>25<211>19<212>DNA<213>人<400>25caggcttccc agctccatc 19<210>26<211>21<212>DNA<213>人
<400>26cgttaggctg gtcaccttct g21<210>27<211>25<212>DNA<213>人<400>27acccaactgg tagggcttca tgcca25<210>28<211>30<212>DNA<213>人<400>28ttctgtggaa ttagtgaccc agcaaatgtg 30<210>29<211>31<212>DNA<213>人<400>29agccgggatc taccataccc attgactaac t 31<210>30<211>27<212>DNA<213>人<400>30aatgaggcgg tggtcaatat cctgtcg 27<210>31<211>27<212>DNA<213>人<400>31aagagaaagc agtgcaaacc ttcccgt 27
<210>32<211>22<212>DNA<213>人<400>32tggcatc tgc acggcggtag ag 22<210>33<211>27<212>DNA<213>人<400>33cccattcagg atcacacagg agatggc 27<210>34<211>22<212>DNA<213>人<400>34ctctggctcc gtgttccgag gc 22<210>35<211>20<212>DNA<213>人<400>35acgcggccag tgcaaggcat 20<210>36<211>32<212>DNA<213>人<400>36agagctaaag tccaagagag gatccgagaa cg32<210>37<211>23<212>DNA<213>人
<400>37caccgtcagt gccgtgttcc agg23<210>38<211>24<212>DNA<213>人<400>38agagtcggtc ggaggctctg gctg 24<210>39<211>27<212>DNA<213>人<400>39tgctaacagt cttgcaggtc tcccgag2權(quán)利要求
1.用于膀胱癌檢測(cè)的方法，其包括檢測(cè)尿中UBTM家族成員的累積。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述UBTM家族成員并不以顯著程度與血液相關(guān)聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中UBTM選自圖3或圖4中所示的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟通過檢測(cè)BTM或UBTM mRNA的累積而實(shí)施。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)應(yīng)用微陣列實(shí)施。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)通過應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)或雜交方法而實(shí)施。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟通過檢測(cè)UBTM蛋白質(zhì)的累積而實(shí)施。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述檢測(cè)步驟通過檢測(cè)UBTM肽的累積而實(shí)施。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟通過應(yīng)用UBTM抗體而實(shí)施。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中方法包括檢測(cè)所述樣本中兩種或多種UBTM家族成員的累積。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其還包括檢測(cè)TOP2A、MDK或BIRC5。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其還包括檢測(cè)選自TOP2A-HOXA13、TOP2A-IGFBP5和TOP2A-SEMA3F的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物對(duì)。
15.檢測(cè)膀胱癌的方法，其包括從疑患膀胱癌患者的生物樣本中檢測(cè)選自圖14a或14b的兩種或多種BTM家族成員的組合的累積。
16.權(quán)利要求15的方法，其中生物樣本為來自組織或尿。
17.BTM或UBTM特異的抗體。
18.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體為多克隆抗體。
19.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
20.權(quán)利要求17到19中任意一項(xiàng)所述的抗體，其中BTM或UBTM選自圖3或圖4中所示的組。
21.抗體混合物，其包含權(quán)利要求17的抗體；和針對(duì)另一BTM或UBTM的另一抗體。
22.用于檢測(cè)BTM的裝置，其包含其上具有BTM或UBTM組合的捕獲劑的基質(zhì)，所述組合選自圖14a或14b；以及與所述基質(zhì)相聯(lián)的檢測(cè)器，該檢測(cè)器能夠檢測(cè)與所述捕獲劑關(guān)聯(lián)的所述BTM或UBTM組合。
23.權(quán)利要求22的裝置，其中至少一種所述捕獲劑包含寡核苷酸。
24.權(quán)利要求22的裝置，其中至少一種所述捕獲劑包含抗體。
25.權(quán)利要求22的裝置，其中所述BTM或UBTM選自圖3或4所示的組。
26.用于癌癥檢測(cè)的試劑盒，其包含基質(zhì)；其上的至少兩種BTM或UBTM的組合的捕獲劑，所述組合選自圖14a或14b；和使用說明書。
27.權(quán)利要求26的試劑盒，其中至少一種所述捕獲劑為BTM-或UBTM-特異的寡核苷酸。
28.權(quán)利要求26的試劑盒，其中至少一種所述捕獲劑為BTM特異的抗體。
29.權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述BTM或UBTM選自圖3或圖4所示的組。
30.用于檢測(cè)膀胱癌存在的方法，其包括測(cè)定尿樣本中一種或多種標(biāo)記物的存在，所述標(biāo)記物選自BIRC2、CDC2、HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NOV、NRP1、SEMA3F、SPAG5、TOP2A，且其中所述標(biāo)記物基本不存在于血液中。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述標(biāo)記物選自IGFBP5、MGP、SEMA3F和HOXA13。
32.用于區(qū)分惡性和非惡性膀胱疾病的方法，其包括確定所述患者尿中一種或多種標(biāo)記物的累積，所述標(biāo)記物選自HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NRP1、SEMA3F、SMC4L1、TOP2A和UBE2C；和確定所述樣本中所述標(biāo)記物的比值，該比值與膀胱癌的存在相關(guān)聯(lián)。
33.權(quán)利要求30的方法，其還包括測(cè)定尿中至少第二種BTM的累積。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述第一標(biāo)記物為TOP2A和所述第二標(biāo)記物選自HOXA13、IGFBP5和SEMA3F。
35.權(quán)利要求33的方法，其還包括將所述標(biāo)記物累積的比值與指示淺表性膀胱癌、浸潤性1期膀胱癌或浸潤性2-3期膀胱癌相關(guān)聯(lián)的步驟。
36.用于確定膀胱癌治療效果的方法，其包括將患者第一樣本中選自圖3或圖4的一種或多種標(biāo)記物的存在與一段時(shí)間治療后的患者第二樣本中選自圖3或圖4的一種或多種所述標(biāo)記物的存在進(jìn)行比較。
全文摘要
腫瘤的早期診斷是決定患腫瘤的患者的存活率的一個(gè)主要因素，所述腫瘤包括膀胱腫瘤。BTM或UBTM家族成員可在膀胱腫瘤組織和其它腫瘤組織中高度或持續(xù)地累積，和/或可在患者尿中累積，且因此可用作膀胱癌和其它類型癌癥的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，BTM或UBTM可在尿中累積，對(duì)UBTM家族成員進(jìn)行檢測(cè)可作為一種有效的診斷方法。在一些實(shí)施方案中，定量PCR方法優(yōu)于微陣列方法。在其它實(shí)施方案中，對(duì)多種BTM或UBTM進(jìn)行檢測(cè)和定量可提高膀胱癌檢測(cè)的敏感性和特異性，且因此提供了用于確定膀胱癌階段和類型的方法。試劑盒提供了實(shí)施本發(fā)明方法的簡(jiǎn)易、便捷的途徑。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101027412SQ200580031939
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日
發(fā)明者P·J·吉爾福德, N·J·克爾, R·波洛克 申請(qǐng)人:環(huán)太平洋生物技術(shù)有限公司