專利名稱：MNSFβ基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及MNSFβ基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MNSF(單克隆非特異性抑制因子，monoclonal nonspecific suppressor factor)最初被發(fā)現(xiàn)是由小鼠T細(xì)胞雜交瘤生成的一種具有非特異性免疫抑制效應(yīng)的淋巴細(xì)胞因子(Nakamura M等，(1986)，Isolation and characterization of amonoclonal nonspecific suppressor factor(MNSF)produced by a T cell hybridoma.Journal of Immunology，1362904-2909)。而MNSFβ是MNSF的一個(gè)亞單位，也是MNSF發(fā)揮其生物學(xué)功能的最主要成分(Nakamura M等，(1996)，Ubiquitin-likemoiety of the monoclonal nonspecific suppressor factor beta is responsible for itsactivity.Journal of Immunology，156532-538)，能抑制IgG的合成分泌，以及T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖(Kondoh T等，(1999)，Ubiquitin-like polypeptide inhibits theproliferative response of T cells in vivo.Immunobiology，200140-149)。
對(duì)于母體子宮組織來說，胚胎及其后的胎兒都屬于半同種異體組織，是外源性免疫物質(zhì)，因此，在整個(gè)妊娠過程中，必須在母體免疫系統(tǒng)和胚胎/胎兒細(xì)胞之間建立一種特殊的相容性，以保證胎兒存活并正常發(fā)育。雖然這種母胎界面間的免疫耐受狀態(tài)形成的分子機(jī)制尚未完全清楚，但一些細(xì)胞因子的局部免疫抑制功能，以及Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞平衡的改變，在母-胎間免疫耐受狀態(tài)的形成過程中發(fā)揮了極為重要的作用。
由于MNSFβ是一種具有非特異性免疫抑制作用的細(xì)胞因子，因此很自然地就會(huì)想到在胚胎著床期間該基因的表達(dá)水平應(yīng)提高，從而有利于抑制母-胎間的免疫反應(yīng)。但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Nie GY，等，(2000)，Identification of monoclonalnonspecific suppressor factor beta(MNSFβ)as one of the genes differentiallyexpressed at implantation sites compared to interimplantation sits in the mouseuterus.Molecular Reproductive and Development，55351～363)，MNSFβ基因在未孕及胚胎著床前小鼠子宮組織中都有高水平的表達(dá)，且表達(dá)水平無明顯變化；但在小鼠胚胎著床期間，MNSFβ基因在著床位點(diǎn)的表達(dá)水平相對(duì)于非著床位點(diǎn)呈明顯的下調(diào)趨勢(shì)，并因此推測(cè)該基因在胚胎著床過程中不是直接發(fā)揮其免疫抑制作用，而可能是通過其表達(dá)水平的下降，促進(jìn)著床部位子宮內(nèi)膜組織中Th2細(xì)胞的增殖和IL4的合成，使得Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞平衡偏向Th2細(xì)胞，從而有助于免疫耐受狀態(tài)的形成。
綜上，目前人們對(duì)MNSFβ基因及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)胚胎著床及懷孕期間的影響作用了解甚少，且認(rèn)為其在胚胎著床過程中不是直接發(fā)揮免疫抑制作用。然而，上述的研究結(jié)果只是表面的推測(cè)，還有必要深入研究MNSFβ基因在胚胎著床及懷孕期間的作用機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種MNSFβ基因在調(diào)節(jié)胚胎著床中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的是提供MNSFβ的拮抗劑或激動(dòng)劑的用途，用于調(diào)節(jié)胚胎的著床。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種MNSFβ基因或其編碼蛋白的用途，所述的MNSFβ基因或其編碼蛋白被用作促進(jìn)胚胎著床的促進(jìn)劑。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種MNSFβ基因或其編碼蛋白的用途，所述的MNSFβ基因或其編碼蛋白被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種MNSFβ拮抗劑的用途，所述的MNSFβ拮抗劑被用作抑制胚胎著床的抑制劑。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種MNSFβ拮抗劑的用途，所述的MNSFβ拮抗劑被用于制備抑制胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物為避孕藥。
在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選例中，所述的拮抗劑是MNSFβ的反義核酸，MNSFβ的配體，或抗MNSFβ多肽的抗體。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種MNSFβ激動(dòng)劑的用途，它被用作促進(jìn)胚胎著床的促進(jìn)劑。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種MNSFβ激動(dòng)劑的用途，它被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的藥物為輔助生育藥物。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種確定測(cè)試化合物是否是MNSFβ的拮抗劑或激動(dòng)劑的方法，它包括步驟(a)將測(cè)試化合物和MNSFβ多肽加入體外培養(yǎng)的胚胎作為測(cè)試組，并將MNSFβ多肽加入體外培養(yǎng)的胚胎作為對(duì)照組；(b)觀察測(cè)試組和對(duì)照組胚胎著床情況，如果測(cè)試組的胚胎著床數(shù)量大于對(duì)照組，則表示測(cè)試化合物是MNSFβ的激動(dòng)劑；如果測(cè)試組的胚胎著床數(shù)量小于對(duì)照組，則表示測(cè)試化合物是MNSFβ的拮抗劑。
在本發(fā)明的第八方面，提供一種藥物組合物，它含有安全有效量的MNSFβ多肽、其激動(dòng)劑或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了MNSFβ蛋白在小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)，其中1為卵細(xì)胞；2為2-細(xì)胞期胚胎；3為囊胚。(標(biāo)尺＝10μm)圖2顯示了小鼠子宮組織中Sprr2f基因表達(dá)水平的定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)，其中，A圖為熒光定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，其縱坐標(biāo)為熒光值，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，各曲線的對(duì)應(yīng)說明見表4；B圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其縱坐標(biāo)為達(dá)到閾值所經(jīng)循環(huán)數(shù)，橫坐標(biāo)為濃度。
圖3顯示了小鼠子宮組織中Ovpg1基因表達(dá)水平的定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)，其中，A圖為熒光定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，其縱坐標(biāo)為熒光值，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，各曲線的對(duì)應(yīng)說明見表5；B圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其縱坐標(biāo)為達(dá)到閾值所經(jīng)循環(huán)數(shù)，橫坐標(biāo)為濃度。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)單克隆非特異性抑制因子β(MNSFβ)蛋白是胚胎著床所必需的；并且還首次證實(shí)MNSFβ的拮抗劑(如MNSFβ的抗體或反義核酸)能特異性地抑制胚胎的著床?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
已有的研究認(rèn)為MNSFβ在胚胎著床過程中不是直接發(fā)揮免疫抑制作用的。然而，本發(fā)明人經(jīng)過詳細(xì)研究和論證，發(fā)現(xiàn)MNSFβ是胚胎著床所必需的，MNSFβ在小鼠早期妊娠過程中具有多重生物學(xué)功能(如抑制母胎界面的免疫反應(yīng))。其還能夠調(diào)節(jié)其它多種基因的表達(dá)。而抗MNSFβ抗體能夠通過增強(qiáng)母胎界面的免疫反應(yīng)，從而抑制胚胎的著床。
在本發(fā)明中，術(shù)語“MNSFβ蛋白”、“MNSFβ多肽”、“MNSFβ因子”或“單克隆非特異性抑制因子β”等可互換使用，都指具有單克隆非特異性抑制因子β氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，這些術(shù)語還包括在其他哺乳動(dòng)物(如人、狗、牛、羊、猴)中的具有同種功能的同系物或同源蛋白。
小鼠MNSFβ基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào)D26610)如SEQ ID NO1，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2。
小鼠MNSFβ蛋白分子中含有2個(gè)功能區(qū)域，第一個(gè)功能域是由70個(gè)aa殘基組成的泛素序列(ubiquitin，UBQ)(第1-70aa)；第二個(gè)功能域是由60個(gè)aa殘基組成的核糖體S30蛋白序列(Ribosomal protein S30)(第74-133aa)。
已有研究報(bào)道(Xavier R，等，(1995)，Human nonspecific suppressor factor(hNSF)cell source and effects on T and B lymphocytes.Immunology，192262-271)，從一名SLE患者的腹水中已經(jīng)分離純化到與小鼠MNSFβ蛋白同源的人hNSFβ(人非特異抑制因子β，human nonspecific suppressor factor-beta)蛋白，并經(jīng)研究證實(shí)，人hNSFβ蛋白也具有與小鼠MNSFβ類似的生物學(xué)功能，即能抑制IgG的合成，以及B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖。
應(yīng)理解，由于鼠等哺乳動(dòng)物的MNSFβ蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA重組技術(shù)而獲得其蛋白。
一類特別優(yōu)選的蛋白是MNSFβ類似物，即在其他哺乳動(dòng)物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中MNSFβ的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)MNSFβ的序列，通過雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
如本文所用，“分離的MNSFβ蛋白或多肽”是指MNSFβ多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化MNSFβ多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括MNSFβ多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然MNSFβ因子相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“MNSFβ多肽”指具有直接或間接調(diào)節(jié)胚胎著床活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與MNSFβ因子相同功能的、SEQ IDNO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或多個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括MNSFβ因子的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與MNSFβDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗MNSFβ多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含MNSFβ多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了MNSFβ多肽的可溶性片段。通常，該片段具有MNSFβ多肽序列的至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約150個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約200個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約300個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還涉及MNSFβ多肽的類似物。這些類似物與天然MNSFβ多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的MNSFβ核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
MNSFβ多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療MNSFβ因子功能低下或喪失所致的疾病(如因胚胎著床能力低下而導(dǎo)致的不孕)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筂NSFβ因子功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組MNSFβ因子篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激MNSFβ因子功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)MNSFβDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于MNSFβ基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與MNSFβ基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制MNSFβ因子的分子，也包括那些并不影響MNSFβ因子功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的MNSFβ基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的MNSFβ基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)MNSFβ因子或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷MNSFβ功能的抗體以及不影響MNSFβ功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用MNSFβ基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與MNSFβ基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗MNSFβ的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的MNSFβ。
本發(fā)明中的抗體作為MNSFβ的拮抗劑，還可用于抑制胚胎著床，從而用于避孕。給予適當(dāng)劑量的抗體可以阻斷MNSFβ的產(chǎn)生或活性。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與MNSFβ發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。例如，能與MNSFβ結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、陰道內(nèi)或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明MNSFβ多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的MNSFβ蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
MNSFβ的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于MNSFβ的無表達(dá)或異常/無活性的MNSFβ的表達(dá)所致的胚胎著床水平低下。反義核苷酸可以抑制胚胎著床，從而用于避孕。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)MNSFβ水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，包括放射免疫測(cè)定等方法。試驗(yàn)中所檢測(cè)的MNSFβ水平，可以用作解釋MNSFβ因子在不孕等疾病中的重要性和用于診斷。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在MNSFβ因子的方法是利用MNSFβ因子的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與MNSFβ因子特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在MNSFβ因子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次發(fā)現(xiàn)MNSFβ蛋白是胚胎著床所必需的，否定了已有研究認(rèn)為MNSFβ不是直接發(fā)揮免疫抑制作用的論點(diǎn)。
(2)首次證實(shí)MNSFβ的拮抗劑(如MNSFβ的抗體或反義核酸)能特異性地抑制胚胎的著床。
(3)發(fā)現(xiàn)MNSFβ在小鼠早期妊娠過程中具有多重生物學(xué)功能，其還能夠調(diào)節(jié)其它多種妊娠相關(guān)基因的表達(dá)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1小鼠卵細(xì)胞及著床前的早期胚胎中有MNSFβ蛋白的表達(dá)本發(fā)明人對(duì)卵細(xì)胞、2-細(xì)胞期胚胎和囊胚進(jìn)行了免疫熒光分析。結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)在卵細(xì)胞(1)、2-細(xì)胞期胚胎(2)和囊胚(3)中均檢測(cè)到MNSFβ蛋白的陽性信號(hào)。
由于曝光系數(shù)固定，所以信號(hào)的強(qiáng)弱從一定程度上可反映出待測(cè)蛋白的表達(dá)量，因此根據(jù)熒光強(qiáng)度推測(cè)，MNSFβ蛋白在早期胚胎中的表達(dá)量可能隨孕期而提高。
實(shí)施例2抗體封閉實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗MNSFβ抗體能特異性抑制小鼠胚胎的著床在本實(shí)施例中，用常規(guī)的PCR方法獲得MNSFβ的完全的ORF編碼序列，然后插入pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)(購自Amersham Pharmacia Biotech公司)，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2/MNSFβ。用該質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)GST-MNSFβ融合蛋白；然后用牛凝血酶處理純化的GST-MNSFβ融合蛋白，分離出重組MNSFβ蛋白，并將其作為免疫原，以福氏佐劑為免疫刺激劑，按常規(guī)方法免疫家兔，制備得到高滴度的兔抗MNSFβ血清；再通過Protein A Sepharose CL-4B柱層析，從抗血清中分離出具有生物活性的重組MNSFβ(rMNSFβ)，以及能有效中和MNSFβ生物活性的兔抗MNSFβ-IgG。
用上述類似的常規(guī)方法，本發(fā)明人還構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pVL 1392/MNSFβ(昆蟲桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1392購自Invitrogen公司)，與線性化核型多角體病毒(AcNPV)DNA(購自Invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，鑒定并收集含重組MNSFβ蛋白(rMNSFβ)的Sf9昆蟲細(xì)胞(購自Invitrogen公司)條件培液(rMNSFβ+Sf9條件培液)。本發(fā)明人利用LPS能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞合成分泌IgG，而MNSFβ具有抑制該效應(yīng)的生物活性這一特征，根據(jù)Nakamura描述的方法(見Nakamura M等，J.Immunol.，156532，1996)，通過生物測(cè)定，證實(shí)昆蟲細(xì)胞表達(dá)的rMNSFβ蛋白具有天然MNSFβ的生物活性，而兔抗MNSFβ-IgG能有效中和rMNSFβ的生物活性，說明所制備的rMNSFβ和兔抗MNSFβ抗體適用于抗體封閉實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)中，將同一批孕第1天的ICR小鼠隨機(jī)分為10組，每個(gè)子宮角的注射溶液分別為第I組30μL生理鹽水；第II組含300μg正兔血清-IgG的30μL生理鹽水；第III組含300μg兔抗GST-IgG的30μL生理鹽水；第IV組含500μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理鹽水；第V組含300μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理鹽水；第VI組含100μg兔抗MNSFβ-IgG的30μL生理鹽水；第VII組含500μL rMNSFβ+Sf9條件培液凍干粉劑的30μL生理鹽水；第VIII組含500μL Sf9條件培液凍干粉劑的30μL生理鹽水；第IX組含100μg兔抗MNSFβ-IgG和500μL rMNSFβ+Sf9條件培液凍干粉劑的30μL生理鹽水；第X組含100μg兔抗MNSFβ-IgG和500μL Sf9條件培液凍干粉劑的30μL生理鹽水。
所有受試動(dòng)物都是在孕第3天上午注射，并于孕第8天上午處死，對(duì)每個(gè)子宮角的胚胎數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。其中，第IX組和第X組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射前，先將注射溶液置于35℃下孵育1小時(shí)，以便抗原、抗體之間先發(fā)生中和反應(yīng)。
結(jié)果見表1，表明正兔血清-IgG對(duì)小鼠胚胎著床無影響；與正兔血清-IgG相比，兔抗GST-IgG對(duì)小鼠胚胎的著床也沒有影響；而兔抗MNSFβ-IgG則顯示出對(duì)小鼠胚胎著床的抑制作用，而且這種抑制作用隨著兔抗MNSFβ-IgG劑量的增加而加強(qiáng)，存在明顯的劑量效應(yīng)；重組MNSFβ蛋白雖然不影響胚胎的著床，但將兔抗MNSFβ-IgG與重組MNSFβ溫育后，則兔抗MNSFβ-IgG不再顯示出對(duì)胚胎著床的抑制作用，即兔抗MNSFβ-IgG對(duì)胚胎的抑制作用可以被rMNSFβ中和，說明這種抑制作用是抗MNSFβ抗體特異的。這一結(jié)果表明，抗MNSFβ抗體對(duì)胚胎的著床具有特異性的抑制作用，而具有生物活性的rMNSFβ卻對(duì)胚胎的著床沒有抑制作用。
因此，子宮組織合成分泌的MNSFβ蛋白是胚胎著床所必需的，著床位點(diǎn)MNSFβ基因表達(dá)水平的下降只是由于基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜細(xì)胞而造成的，而非著床位點(diǎn)子宮組織合成分泌的MNSFβ蛋白，以及胚胎組織合成分泌的MNSFβ蛋白是直接發(fā)揮其免疫抑制功能，從而在母-胎間免疫耐受狀態(tài)的形成過程中發(fā)揮重要作用。
表1 抗MNSFβ抗體對(duì)小鼠胚胎著床的抑制作用

a注射前置于35℃下溫育1hr。
b用t-檢驗(yàn)方法計(jì)算P值時(shí)，與第II組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
實(shí)施例3 cDNA芯片技術(shù)分析抗MNSFβ抗體抑制胚胎著床的分子機(jī)制為了進(jìn)一步深入了解MNSFβ基因在妊娠過程中的生物學(xué)功能，本發(fā)明人應(yīng)用cDNA芯片技術(shù)，使用Affymetrix MOUSE 430A基因表達(dá)譜芯片，對(duì)經(jīng)抗MNSFβ抗體處理的和未經(jīng)抗MNSFβ抗體處理的這樣一對(duì)子宮組織之間，在基因表達(dá)上的差異進(jìn)行了分析，結(jié)果采用Affymetrix基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描，并用微列陣分析軟件Microarray Suite5.0(Affymetrix公司)讀取和處理數(shù)據(jù)，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為“Change”為I或MI、Ratio＞或＝1、“實(shí)驗(yàn)組”Detection為“P”的定為上調(diào)基因；“Change”為D或MD、Ratio＜或＝-1、“對(duì)照組”Detection為“P”的定為下調(diào)基因表2；并應(yīng)用定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)對(duì)其部分分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。隨機(jī)選取了SPRR2f(小脯氨酸富集蛋白2F，small proline-rich protein2F)、DCK(脫氧胞苷激酶，deoxycytidine kinase)、INHBB(抑制素βB，inhibin betaB)、ISP1(著床絲氨酸蛋白酶1，implantation serine proteinase 1)、OVPG1(oviductal糖蛋白1，oviductal glycoprotein 1)和NPR2等6個(gè)cDNA芯片技術(shù)篩選到的差異基因?yàn)榇郎y(cè)基因，以β-肌動(dòng)蛋白為管家基因，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各待測(cè)基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由儀器生成。每個(gè)待測(cè)基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此待測(cè)基因的校正后相對(duì)含量(表3，圖2，圖3)。
本發(fā)明人通過cDNA芯片技術(shù)，共篩選出在兩種組織間存在表達(dá)差異的144個(gè)已知基因，有一部分基因是與生殖活動(dòng)相關(guān)的，比如SPRR2F(小脯氨酸富集蛋白2F，small proline-rich protein 2F)等基因與配子細(xì)胞的發(fā)生和動(dòng)情周期相關(guān)；SGK(絲氨酸/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的激酶，serum/glucocorticoid regulated kinase)等基因與胚胎發(fā)育有關(guān)；而ISP1等基因則直接與胚胎著床過程相關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SGK、SPRR2F等這些經(jīng)抗MNSFβ抗體處理后表達(dá)水平上調(diào)的基因，在正常圍著床期小鼠子宮組織中的表達(dá)水平應(yīng)是下調(diào)的；而ISP1等一些經(jīng)抗MNSFβ抗體處理后表達(dá)水平下調(diào)的基因，在正常圍著床期小鼠子宮組織中的表達(dá)水平應(yīng)是上調(diào)的；這與抗MNSFβ抗體能抑制胚胎著床的現(xiàn)象是一致的。但這些基因在生殖過程中的生物學(xué)功能是不同的，提示MNSFβ基因在小鼠早期妊娠過程中具有多重生物學(xué)功能。
除了上述這些與生殖過程相關(guān)的基因外，還有一系列基因是參與調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)的，包括與抗原遞呈和T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的PSMA6(α6型proteasome亞基，proteasome subunit，alpha type 6)等基因，與免疫細(xì)胞活化相關(guān)的DCK等基因，與淋巴細(xì)胞增殖分化相關(guān)的VAV3(vav3癌基因，vav 3 oncogene)等基因，以及與補(bǔ)體系統(tǒng)活化相關(guān)的CFI(補(bǔ)體成份因子1，complementcomponent factor I)等基因。同樣，根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，DCK等基因表達(dá)水平的提高和VAV3等基因表達(dá)水平的降低將會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，因此，增強(qiáng)母胎界面的免疫反應(yīng)是抗MNSFβ抗體抑制胚胎著床的一個(gè)作用途徑。
除了增強(qiáng)母胎界面免疫反應(yīng)這一途徑，抗MNSFβ抗體還通過影響細(xì)胞間的粘附、細(xì)胞的侵潤性、細(xì)胞代謝/胚胎發(fā)育等其它途徑抑制胚胎著床。例如TFPI(組織因子旁路抑制子，tissue factor pathway inhibitor)等基因表達(dá)水平的上調(diào)會(huì)降低細(xì)胞的侵潤性，INHBB等基因表達(dá)水平的提高則會(huì)抑制胚胎的發(fā)育；而MELA(黑色素瘤抗原，melanoma antigen)等基因表達(dá)水平的下調(diào)可減弱細(xì)胞間的粘附，SLC14A2(溶質(zhì)傳遞體家族14(尿素轉(zhuǎn)運(yùn)子)，成員2；solute carrierfamily 14(urea transporter)，member 2)等基因表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常。因此，本發(fā)明人可以確定，MNSFβ基因不僅通過直接發(fā)揮其免疫抑制功能而在母胎界面免疫耐受狀態(tài)的形成過程中起重要作用，而且通過該基因在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤性和胚胎組織發(fā)育方面的潛在功能而在早期妊娠過程中發(fā)揮多重作用。
通過分析本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在144個(gè)篩選到的已知基因中，有近30個(gè)基因在不同的腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。胚胎組織細(xì)胞高度增殖和分化的特性及其作為半異體組織對(duì)正常組織的侵潤性都與腫瘤組織相似，因此，進(jìn)一步深入分析MNSFβ基因在胚胎著床及胎兒發(fā)育中的作用和分子機(jī)制，還有助于了解腫瘤組織發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。
表3 各待測(cè)基因在兩種組織中表達(dá)量的定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定結(jié)果1、實(shí)時(shí)定量測(cè)量值

2、內(nèi)參校正后列表

表4 Sprr2f基因定量檢測(cè)數(shù)據(jù)表

表5 Ovgp1基因定量檢測(cè)數(shù)據(jù)表 實(shí)施例4篩選MNSFβ的拮抗劑按實(shí)施例2所述方法，將以下兩組物質(zhì)(替換反義核酸和轉(zhuǎn)染劑)施用于懷孕小鼠，然后觀察對(duì)胚胎著床的體內(nèi)抑制作用(a)候選物質(zhì)+MNSFβ因子；(b)MNSFβ因子。
如果組(a)的胚胎著床率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于組(b)的胚胎著床率，則表明該候選物質(zhì)是MNSFβ的拮抗劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所<120>MNSFβ基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用<130>059724<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>506<212>DNA<213>Mus musculus<400>1ctctttcttg actccatctt cgcggtagca gcagcggcgt ccgcgggcta gtagccaaca 60tgcagctctt tgtccgcgcc caggaactac acaccctcga ggtgaccgga caggagacgg120tcgcccagat caaagatcat gtggcctccc tggaaggcat tgcccccgaa gatcaagtcg180tgcttctggc aggctcgccg ctggaggatg aggccaccct aggccagtgt ggcgtagagg240ccctgaccac tctggaagta gcaggccgca tgctgggagg taaagttcac ggttccctgg300ctcgggctgg aaaagtgaga ggtcagactc ccaaggtggc caaacaggaa aagaagaaga360agaagacagg ccgggccaag aggcgaatgc agtacaaccg gcgctttgtc aatgttgtgc420ccacctttgg gaagaagaag ggccccaatg ccaattccta agtcctattg ccaccctgcc480atgctaataa agccactgtg tccaga 506<210>2<211>133<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Met Gln Leu Phe Val Arg Ala Gln Glu Leu His Thr Leu Glu Val Thr1 5 10 15Gly Gln Glu Thr Val Ala Gln Ile Lys Asp His Val Ala Ser Leu Glu20 25 30
Gly Ile Ala Pro Glu Asp Gln Val Val Leu Leu Ala Gly Ser Pro Leu35 40 45Glu Asp Glu Ala Thr Leu Gly Gln Cys Gly Val Glu Ala Leu Thr Thr50 55 60Leu Glu Val Ala Gly Arg Met Leu Gly Gly Lys Val His Gly Ser Leu65 70 75 80Ala Arg Ala Gly Lys Val Arg Gly Gln Thr Pro Lys Val Ala Lys Gln85 90 95Glu Lys Lys Lys Lys Lys Thr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Met Gln Tyr100 105 110Asn Arg Arg Phe Val Asn Val Val Pro Thr Phe Gly Lys Lys Lys Gly115 120 125Pro Asn Ala Asn Ser130
權(quán)利要求
1.一種MNSFβ基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，所述的MNSFβ基因或其編碼蛋白被用作促進(jìn)胚胎著床的促進(jìn)劑。
2.一種MNSFβ基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，所述的MNSFβ基因或其編碼蛋白被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
3.一種MNSFβ拮抗劑的用途，其特征在于，所述的MNSFβ拮抗劑被用作抑制胚胎著床的抑制劑。
4.一種MNSFβ拮抗劑的用途，其特征在于，所述的MNSFβ拮抗劑被用于制備抑制胚胎著床的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物為避孕藥。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑是MNSFβ的反義核酸、MNSFβ的配體、或抗MNSFβ多肽的抗體。
7.一種MNSFβ激動(dòng)劑的用途，其特征在于，它被用作促進(jìn)胚胎著床的促進(jìn)劑。
8.一種MNSFβ激動(dòng)劑的用途，其特征在于，它被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
9.一種確定測(cè)試化合物是否是MNSFβ的拮抗劑或激動(dòng)劑的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將測(cè)試化合物和MNSFβ多肽加入體外培養(yǎng)的胚胎作為測(cè)試組，并將MNSFβ多肽加入體外培養(yǎng)的胚胎作為對(duì)照組；(b)觀察測(cè)試組和對(duì)照組胚胎著床情況，如果測(cè)試組的胚胎著床數(shù)量大于對(duì)照組，則表示測(cè)試化合物是MNSFβ的激動(dòng)劑；如果測(cè)試組的胚胎著床數(shù)量小于對(duì)照組，則表示測(cè)試化合物是MNSFβ的拮抗劑。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的MNSFβ多肽、其激動(dòng)劑或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MNSFβ基因或其編碼蛋白在調(diào)節(jié)胚胎著床中的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了MNSFβ的拮抗劑或激動(dòng)劑的用途，用于調(diào)節(jié)胚胎的著床。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)MNSFβ蛋白是胚胎著床所必需的，并且證實(shí)MNSFβ的拮抗劑(如MNSFβ的特異性抗體或反義核酸)能特異性地抑制胚胎的著床。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101028522SQ200610024320
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者王健, 申慶祥, 黃哲平 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所