專利名稱：生物催化生產(chǎn)丙烯酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物化工技術領域，具體涉及一種生物催化生產(chǎn)丙烯酸的方法。
背景技術：
丙烯酸是一種重要有機原料，用于生產(chǎn)聚丙烯酸酯、聚丙烯酸及其鹽或與其他單體形成的共聚物等高分子材料，這些材料在合成樹脂、合成橡膠、合成纖維以及涂料、乳膠、粘合劑、鞣革、造紙、洗滌劑等領域應用廣泛。
工業(yè)化生產(chǎn)丙烯酸的方法很多，但最常用的方法主要包括(1)丙烯腈水解法，該法依賴于化學水解，在強酸的催化下丙烯腈首先水解生成丙烯酰胺，后者進一步水解為丙烯酸，此法工藝路線簡單，設備投資相對較小，缺點是污染嚴重，副產(chǎn)物酸性銨鹽處理困難。(2)丙烯氣相氧化法，丙烯在金屬催化劑作用下氧化成丙烯醛，再被氧化成丙烯酸，由于石油工業(yè)能夠大量提供廉價的丙烯，且反應中丙烯酸的收率高，該法成為目前最經(jīng)濟的生產(chǎn)丙烯酸的方法，也是大規(guī)模生產(chǎn)的首選方法，此法的生產(chǎn)能力占世界總生產(chǎn)能力的85％以上，但該方法的缺點是投資較高，需要耐高溫高壓設備，特別是由于產(chǎn)生乙酸、甲酸等雜質(zhì)給產(chǎn)物的提純帶來很多麻煩。
由于化學法通常反應條件苛刻，環(huán)境污染大，副反應多，難以滿足市場對高純度丙烯酸產(chǎn)品的需求。利用生物催化方法來生產(chǎn)有機酸其優(yōu)點是反應條件溫和，且由于生物催化劑選擇性較高，通常不產(chǎn)生不需要的雜質(zhì)。利用微生物固有的氰基水解酶催化丙烯腈水解產(chǎn)生丙烯酸銨，已有不少相關文獻報道實例，如在Appl.Microbail.Biotechnol.1990，34322-324和美國專利U.S.5135858中描述的Rhodococcus rhodochrous J1菌屬；專利WO 03066872(等同于U.S.6,670,158)中公開的Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D菌屬；美國專利U.S.6,361,981和U.S.6,162,624及U.S.5,998,180中公開的Rhodococcusrhodochrous NCIMB 40757 or NCIMB 40833菌屬；山東大學學報(自然科學版)1994，29(2)217-223中描述的Pseudomonadaceae菌屬；J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1997，1099-1104中描述的Rhodococcus sp.AJ270菌屬；Appl.Environ.Microbiol.，1976，31(6)，900-906中描述的Nocardia rhodochrous LL100-21菌屬；J.Bacteriol.，1990，172(9)，4807-4815中描述的Rhodococcus Rhodochrous K22菌屬。
這些酶轉化方法所顯示出的優(yōu)越性，為替代化學方法展示了良好前景，但上述這些公開的產(chǎn)氰基水解酶微生物中并非明顯地具有高酶活性，這些反應累積的產(chǎn)物濃度還不高，技術水平滿足不了工業(yè)化生產(chǎn)的要求，以至于還不能夠應用于工業(yè)實踐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，從而提供一種生物催化生產(chǎn)丙烯酸的方法。
本發(fā)明通過發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887(該菌株已于2003年1月20日提交位于北京市海淀區(qū)中關村北一條13號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏)而得到腈水解酶，再通過腈水解酶催化丙烯腈的水解反應而得到產(chǎn)物丙烯酸，反應式如下
本發(fā)明的生產(chǎn)丙烯酸的方法的具體實施過程如下一、制備生物催化劑腈水解酶(1)對保藏號為CGMCC No.0887的乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)菌株進行搖瓶培養(yǎng)或上發(fā)酵罐培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；搖瓶培養(yǎng)在三角瓶中裝入適量的培養(yǎng)基(10-70％)，滅菌后接入一定量的菌種(1-10％)，在20-40℃下，旋轉式搖床(100-300rpm)中培養(yǎng)30-120小時，得到發(fā)酵液，除去瓊脂備用。
其中，搖瓶培養(yǎng)基組成(％)包括葡萄糖1-2.0；酵母膏0.2-1；NaCl0.05-0.15；K2HPO40.05-0.3；MgSO4·7H2O0.01-0.3；尿素0.1-1，pH為7.0-7.5。
上罐發(fā)酵培養(yǎng)在種子罐中裝入適量的種子培養(yǎng)基(10-70％)，滅菌后接入一定量的菌種(1-10％)，在溫度20-40℃，攪拌轉速100-300rpm的條件下培養(yǎng)30-120小時，得到種子液，在50L-20m3的發(fā)酵罐中裝入適量的發(fā)酵培養(yǎng)基(40-70％)，實罐消毒后接入2-7％的種子液，在通氣量1∶0.2-1∶1，攪拌轉速50-400rpm，罐壓0.03-0.06MPa，溫度20-40℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)30-200小時，獲得含酶的發(fā)酵液。
其中，上罐發(fā)酵培養(yǎng)組成包括種子培養(yǎng)基組成(％)葡萄糖0.5-2.0；酵母膏0.2-1；NaCl0.05-0.15；K2HPO40.05-0.3；MgSO4·7H2O0.01-0.3；尿素0.1-1；pH7.0-7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成包括葡萄糖1.0-2.5；酵母膏0.2-1；尿素0.1-2；K2HPO40.03-0.1；KH2PO40.03-0.1；MgSO4·7H2O0.03-0.1；pH6.5-7.5。
(2)發(fā)酵液再通過離心或膜過濾系統(tǒng)進行酶細胞收集，然后制備生物催化劑；酶細胞收集發(fā)酵液在分離因素≥5000的條件下離心，棄去上清液，細胞用去離子水洗滌后再離心，收集濃縮的濕細胞液；或者發(fā)酵液用膜過濾系統(tǒng)進行膜分離過濾，并加入2倍發(fā)酵液體積的去離子水洗滌，收集濃縮的濕細胞液，其中的膜過濾系統(tǒng)可以是中空纖維膜或卷式膜或陶瓷膜或超濾膜。
制備生物催化劑收集的含酶細胞可以直接用作催化劑；或通過常規(guī)方法如硅藻土吸附等固定化后用作催化劑；或?qū)⒓毎贸Ｒ?guī)方法如超聲波等破碎后得到的細胞破碎液用作催化劑；或細胞破碎液離心除去細胞碎片后酶清液直接用作催化劑；或?qū)⒔?jīng)過提純得到的粗酶或純度更高的酶蛋白用作催化劑。
二、生物催化水解反應丙烯腈水溶液的生物催化水解反應在水或磷酸緩沖液或水-有機介質(zhì)或微水有機反應介質(zhì)中加入生物催化劑，加入底物丙烯腈后進行反應，pH控制在1.0-10.0之間，反應溫度控制在0-70℃之間，攪拌速度控制在50-500rpm之間。反應方式可以是批式反應或者連續(xù)反應，在批式反應中底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加，在任何時刻都必須保證底物的加入量不會使反應液中的底物濃度≥50％，反應時間根據(jù)反應的具體情況而定，反應結束時應保證底物濃度盡可能低，這可以通過停止加料后延長反應時間，或通過補加少量生物催化劑反應一段時間來達到這一要求，反應結束后通過離心或膜過濾系統(tǒng)分離得到反應清液；在連續(xù)反應中，底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或者流加，在任何時刻都必須保證底物的加入量不會使反應液中的底物濃度≥50％，當產(chǎn)物濃度累積達到一定值≥10％(以丙烯酸計)時，可以通過膜過濾系統(tǒng)一次性，或者分多次間歇地，或者連續(xù)地分流出反應清液，同時可一次性，或者間歇分多次地，或者連續(xù)地補加反應介質(zhì)和底物，并根據(jù)反應的情況，可一次性，或者間歇分多次地，或者連續(xù)地定量補加新的生物催化劑，以保證反應可連續(xù)進行。
具體實施例方式
為了更好地說明本發(fā)明，下面通過實施例予以進一步說明。
以下實施例中所列的百分比濃度中，除特別注明外，均為質(zhì)量體積百分比濃度。以下涉及到的原材料皆為市售得到。
酶活定義1小時內(nèi)將一微克的丙烯腈轉化為丙烯酸所需要的酶量，為一個酶活單位(U)。
實施例1、乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887的搖瓶發(fā)酵分別配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D、E，其中培養(yǎng)基組成包括A葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.1％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，尿素0.5％，pH7.2；B葡萄糖1.8％，酵母膏0.8％，NaCl0.15％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O0.2％，尿素1％，pH7.4；C葡萄糖2.0％，酵母膏1.0％，NaCl0.1％，K2HPO40.30％，MgSO4·7H2O0.01％，尿素0.2％，pH7.0；D葡萄糖1.0％，酵母膏0.2％，NaCl0.15％，K2HPO40.15％，MgSO4·7H2O0.15％，尿素0.8％，pH7.5；E葡萄糖1.2％，酵母膏0.4％，NaCl0.05％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O0.3％，尿素0.1％，pH7.1；分別將以上配制好的培養(yǎng)基以60mL一份倒入250mL的搖瓶中，120℃高壓滅菌20分鐘。冷卻后分別接種乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887到各培養(yǎng)基中，于28℃，250rpm轉速下震蕩培養(yǎng)72小時。
培養(yǎng)結束后，分別收集發(fā)酵液，取10ml，加入1mL丙烯腈(折百)，在40℃和200rpm的攪拌轉速下反應10分鐘，加入5M鹽酸溶液，終止反應，反應液以高壓液相色譜定量分析方法HPLC(島津公司LC-10A)測定丙烯酸的量，按以下公式計算酶活，結果列于表1。

C產(chǎn)物濃度，mg/mL(毫克/毫升)；V1反應液體積，mL(毫升)；V2所用發(fā)酵液體積，mL(毫升)；t反應時間，hr(小時)。
表1、搖瓶發(fā)酵液的酶活


實施例2、乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887的發(fā)酵罐發(fā)酵分別配制種子培養(yǎng)基A、B、C、D，其中培養(yǎng)基組成包括A葡萄糖2.0％，酵母膏0.5％，NaCl0.05％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.1％，尿素0.5％，pH7.2；B葡萄糖0.5％，酵母膏0.2％，NaCl0.1％，K2HPO40.25％，MgSO4·7H2O0.01％，尿素0.1％，pH7.5；C葡萄糖1.5％，酵母膏1.0％，NaCl0.15％，K2HPO40.15％，MgSO4·7H2O0.2％，尿素0.8％，pH7.0；D葡萄糖1.0％，酵母膏0.8％，NaCl0.1％，K2HPO40.3％，MgSO4·7H2O0.3％，尿素1.0％，pH7.1。
再配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成(％)包括葡萄糖1.8％；酵母膏0.5％；尿素0.5％；K2HPO40.05％；KH2PO40.05％；MgSO4·7H2O0.05％；pH7.0。
在5L種子罐中裝入種子培養(yǎng)基50％，滅菌后接入1％的菌種，在溫度30℃，攪拌轉速200rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到種子液，在50L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基60％，實罐消毒后接入8％的種子液，在通氣量1∶0.5，攪拌轉速300rpm，罐壓0.05Mpa，溫度30℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)96小時。
發(fā)酵培養(yǎng)結束后，分別收集發(fā)酵液測定酶活(測定方法同實施例1)，結果列于表2。
表2、發(fā)酵罐發(fā)酵液的酶活

實施例3、乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887的發(fā)酵罐發(fā)酵配制種子培養(yǎng)基，其組成為包括葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.1％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，尿素0.5％，pH7.2；再分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D，培養(yǎng)基組成包括A葡萄糖1.8％；酵母膏0.5％；尿素0.5％；K2HPO40.05％；KH2PO40.05％；MgSO4·7H2O0.1％；pH6.5；B葡萄糖0.5％；酵母膏0.2％；尿素0.1％；K2HPO40.03％；KH2PO40.08％；MgSO4·7H2O0.08％；pH6.8；C葡萄糖1.1％；酵母膏0.8％；尿素1.3％；K2HPO40.08％；KH2PO40.03％；MgSO4·7H2O0.05％；pH7.2；D葡萄糖2.0％；酵母膏1.0％；尿素2.0％；K2HPO40.1％；KH2PO40.1％；MgSO4·7H2O0.03％；pH7.5；在5L種子罐中裝入種子培養(yǎng)基40％，滅菌后接入1.5％的菌種，在溫度28℃，攪拌轉速250rpm的條件下培養(yǎng)40小時，得到種子液，在50L的發(fā)酵罐中分別裝入發(fā)酵培養(yǎng)基A、B、C、D各50％，實罐消毒后接入6％的種子液，在通氣量1∶0.6，攪拌轉速250rpm，罐壓0.04Mpa，溫度28℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)100小時。
發(fā)酵培養(yǎng)結束后，分別收集發(fā)酵液測定酶活(測定方法同實施例1)，結果列于表3。
表3、發(fā)酵罐發(fā)酵液的酶活

實施例4、發(fā)酵液離心或膜過濾分別取實施例2和3得到的發(fā)酵液2L，用低溫高速離心，在6℃和15000rpm轉速下冷凍離心15分鐘、中空纖維膜過濾(流量180mL/min，壓力0.8Kg/cm2)、卷式膜過濾(流量180mL/min，壓力16Kg/cm2)、陶瓷膜過濾(流量180mL/min，壓力4Kg/cm2)或平板超濾膜(Ultra-fllo)過濾(流量180mL/min，壓力3Kg/cm2)。然后分別用4L去離子水洗滌細胞，收集濃縮細胞液，取適量濃縮細胞液用去離子水稀釋恢復至原發(fā)酵液體積，測定酶活(測定方法同實施例1)，結果列于表4。
表4、處理后發(fā)酵液的酶活


實施例5、生物催化劑的制備取實施例2得到的發(fā)酵液，按實施例4的中空纖維膜過濾方法，洗滌濃縮4倍，得到的濃縮細胞按下列方法進一步處理，得到不同形式的具有腈水解酶活性的生物催化劑①、取濃縮細胞與3.2％的海藻酸鈉混合均勻后，注入到0.2M的CaCl2溶液中進行凝膠化包埋，制得固定化細胞。
②、取濃縮細胞用超聲波細胞破碎器將細胞破碎，條件800W、溫度8℃，每次破碎體積100mL，累計超聲時間1小時，得到細胞破碎液。
③、?、诘募毎扑橐河?5000g、6℃下離心，收集上清液，得到無細胞酶液。
④、取③的上清液，分別經(jīng)過10％、20％、30％、40％、50％、60％和70％的硫酸銨溶液的鹽析，收集20-50％飽和度下的沉淀組份，置于pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液中透析24小時，然后再在純水中透析24小時，得到粗酶液，經(jīng)過冷凍真空干燥后即得到粗酶粉。
⑤、取④的粗酶粉用經(jīng)過pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液預平衡過的DEAE-Sephadex柱處理，分別用含0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M和0.6M氯化鉀的pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液洗脫，收集具有腈水解酶活性的組份，于純水中充分透析脫鹽，即得純度相對較高的酶溶液，經(jīng)過冷凍真空干燥后即得到酶粉。
用去離子水將以上各種不同形式的生物催化劑恢復至初始發(fā)酵液體積，測定酶活(測定方法同實施例1)，結果列于表5。
表5、不同形式生物催化劑的酶活

實施例6、細胞破碎液的催化活性取實施例5得到的細胞破碎液，用去離子水將細胞破碎液恢復至初始發(fā)酵液體積，分別取50mL，各加入2％(v/v)底物丙烯腈按體積50mL計，即按每50mL已恢復至初始發(fā)酵液體積的前述溶液中加入1mL丙烯腈(折百)，于不同溫度，200rpm的相同轉速下反應，反應0.5小時，以高壓液相色譜(HPLC)定量分析方法(島津公司LC-10A，下同)測定反應液中底物丙烯腈和產(chǎn)物丙烯酸的量，然后以反應液體積為50mL計算底物和產(chǎn)物的摩爾濃度，結果列于表6。
表6、細胞破碎液的催化活性

實施例7、酶粉的催化活性取實施例5得到的酶粉，分別取10mg，用不同pH的緩沖液恢復至初始發(fā)酵液體積，取20mL，加入2％(v/v)的底物丙烯腈按體積20mL計，即按每20mL已恢復至初始發(fā)酵液體積的前述溶液中加入0.4mL丙烯腈(折百)，于30℃和200rpm條件下反應，反應20min，HPLC色譜分析反應結果(同實施例6，以反應液體積為20mL計算底物和產(chǎn)物的摩爾濃度)，結果列于表7。
表7、酶粉的催化活性

實施例8、濃縮細胞液的催化活性取實施例4得到的濃縮細胞液，用去離子水將細胞液恢復至初始發(fā)酵液體積，分別取50mL，加入不同量的底物丙烯腈按體積50mL計，即按每50mL已恢復至初始發(fā)酵液體積的前述溶液中分別加入0.05mL、0.25mL、0.5mL、2.5mL、5mL、15mL、20mL和25mL的丙烯腈(折百)，這樣按體積50mL計算的底物濃度(v/v)分別為0.1％、0.5％、1％、5％、10％、30％、40％和50％，于30℃水浴溫度和200rpm攪拌轉速條件下反應，反應0.5小時，HPLC色譜分析反應結果(同實施例6，以反應液體積為50mL計算底物和產(chǎn)物的摩爾濃度)，列于表8。
表8、濃縮細胞液的催化活性

實施例9、酶粉的催化活性取實施例5得到的酶粉，用不反應介質(zhì)恢復至初始發(fā)酵液體積，取50mL，分別加入2％(v/v)底物丙烯腈按體積50mL計，即按每50mL已恢復至初始發(fā)酵液體積的前述溶液中加入1mL丙烯腈(折百)，于30℃水浴溫度和200rpm攪拌轉速條件下反應，反應0.5小時，HPLC色譜分析反應結果(同實施例6，以反應液體積為50mL計算底物和產(chǎn)物的摩爾濃度)，結果列于表9。
表9、酶粉的催化活性


實施例10、濃縮細胞液的催化活性取實施例4得到的濃縮細胞液，用去離子水將細胞液恢復至初始發(fā)酵液體積，取1.5L于2L的三口反應瓶中，加入0.5％的丙烯腈按體積1.5L計，即按每1.5L已恢復至初始發(fā)酵液體積的前述溶液中加入7.5克丙烯腈(折百)，于28℃水浴溫度和150rpm攪拌轉速條件下反應，間歇加入底物，即通過HPLC色譜跟蹤分析，當?shù)孜餄舛鹊陀?.1％時，按0.5％的量以前述方式加入底物；反應68小時，底物累計加入次數(shù)為55次，共加入412.5g，約825mL，反應后HPLC色譜分析反應結果(同實施例6，以反應液體積為1.5L計算底物和產(chǎn)物的摩爾濃度)，底物丙烯腈殘留濃度＜0.05％，反應轉化率＞99.0％，終產(chǎn)物濃度3.13M，丙烯酸產(chǎn)率98.0％。
實施例11、濃縮細胞液的催化活性取實施例4得到的濃縮細胞液，用去離子水將細胞液恢復至初始發(fā)酵液體積，取2.0L于3L的三口反應瓶中，用蠕動泵泵入丙烯腈，流加速率約4-6mL/min，于30℃水浴溫度和200rpm攪拌轉速條件下反應，HPLC色譜跟蹤分析，根據(jù)底物濃度的高低調(diào)節(jié)流加速率，保證底物濃度在≤0.5％即按每2.0L的反應液中丙烯腈(折百)的量小于等于10克，下同，當產(chǎn)物累積濃度達到3.0M左右時，停止加料，繼續(xù)反應使底物消耗完，當?shù)孜餁埩魸舛龋?.05％時終止反應，整個反應過程時間56小時，反應后HPLC色譜分析反應結果(同實施例6，以反應液體積為2.0L計算產(chǎn)物的摩爾濃度)，轉化率＞99.0％，終產(chǎn)物濃度3.47M，丙烯酸產(chǎn)率＞98.0％。
實施例12、工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)配制種子培養(yǎng)基，其組成葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.1％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，尿素0.5％，pH7.2。
再配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成(％)葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.1％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，尿素0.5％，pH7.2。
在5L種子罐中裝入種子培養(yǎng)基50％，滅菌后接入1％的菌種，在溫度30℃，攪拌轉速200rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到種子液，在50L3的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基60％，實罐消毒后接入8％的種子液，在通氣量1∶0.5，攪拌轉速300rpm，罐壓0.05Mpa，溫度30℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)96小時。
發(fā)酵培養(yǎng)結束后，分別收集發(fā)酵液，用平板超濾膜過濾，兩倍去離子水洗滌，收集濃縮細胞，去離子水稀釋至原體積，然后向帶有膜分離器的10L的反應器中加入細胞液6L，夾套水浴溫度30℃，攪拌轉速300rpm，用蠕動泵泵入丙烯腈溶液，流加速率約12-18mL/min，HPLC色譜跟蹤分析，根據(jù)底物濃度的高低調(diào)節(jié)流加速率，保證底物濃度在0.5％左右(以反應液體積6L計)，當產(chǎn)物累積濃度達到約15％(以反應液體積6L計)左右時，停止加料，繼續(xù)反應一段時間使底物消耗完，當?shù)孜餄舛龋?.05％時，通過膜過濾系統(tǒng)濾出反應清液，然后向反應器補加去離子水，重新流加底物，繼續(xù)反應，并根據(jù)反應情況隨時補加濃縮細胞，如此連續(xù)反應不斷得到含產(chǎn)物丙烯酸的反應清液。
本發(fā)明采用生物催化的方法生產(chǎn)丙烯酸，利用腈水解酶將丙烯腈轉化為相應的酸，其操作過程簡單、反應條件溫和、環(huán)境污染小、可工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。
本發(fā)明與現(xiàn)有的方法相比，具有明顯的特點和進步產(chǎn)酶菌株為從自然源篩選得到的新菌株，現(xiàn)鑒定為乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)，其保藏號為CGMCC No.0887，經(jīng)過長期的育種工作，發(fā)酵液酶活力已達10萬U/mL；在催化劑生產(chǎn)中引入膜分離技術，使生產(chǎn)可以連續(xù)化進行；反應選擇性好、原料利用率高、對環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低；產(chǎn)物累積濃度高，可工業(yè)化實施生產(chǎn)。
權利要求
1.一種生物催化生產(chǎn)丙烯酸的方法，包括通過腈水解酶來催化丙烯腈的水解反應而得到丙烯酸，其特征在于，所述的腈水解酶是通過發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacteriumcasei)CGMCC No.0887而得到的。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該乳酪短桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下種子培養(yǎng)基組成葡萄糖0.5-2.0wt％，酵母膏0.2-1wt％，NaCl0.05-0.15wt％，K2HPO40.05-0.3wt％，MgSO4·7H2O0.01-0.3wt％，尿素0.1-1，pH7.0-7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1.0-2.5wt％，酵母膏0.2-1wt％，尿素0.1-2wt％，K2HPO40.03-0.1wt％，KH2PO40.03-0.1wt％，MgSO4·7H2O0.03-0.1wt％，pH6.5-7.5；發(fā)酵條件通氣量1∶0.2-1∶1，攪拌轉速50-400rpm，罐壓0.03-0.06MPa，溫度20-40℃，時間30-200小時。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腈水解酶是將發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液通過離心或膜過濾系統(tǒng)進行酶細胞收集而得到的。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的膜過濾系統(tǒng)包括但不限于中空纖維膜或卷式膜或陶瓷膜或超濾膜。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水解反應的反應介質(zhì)包括但不限于水或緩沖液或水-有機介質(zhì)或微水有機介質(zhì)。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的反應介質(zhì)中的緩沖液包括但不限于磷酸緩沖液，有機介質(zhì)包括但不限于甲醇或正己烷或乙醇或丙酮。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水解反應的條件如下溫度為0-70℃，pH為1-10，底物丙烯腈濃度控制在0-50wt％。
8.一種用于生物催化生產(chǎn)丙烯酸的乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)，其特征在于保藏號為CGMCC No.0887。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化生產(chǎn)丙烯酸的方法。本方法以丙烯腈為起始原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)CGMCC No.0887而得到的具有腈水解活性的微生物酶為催化劑，在一定條件下水解反應，得到產(chǎn)物丙烯酸。本方法具有反應條件溫和、工藝路線簡單、污染小、可連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的顯著特點。
文檔編號C12R1/13GK101082052SQ20061002712
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權日2006年5月30日
發(fā)明者薛建萍, 羅積杏, 李還寶, 朱健, 唐璐敏, 沈寅初 申請人:上海市農(nóng)藥研究所, 薛建萍, 沈寅初