專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)激評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于應(yīng)激評(píng)估的方法，該方法目的是檢測(cè)外周組織中Perl 基因表達(dá)水平、Perl基因、由Perl基因編碼的蛋白質(zhì)PERI的任何增加， 以及Perl基因的轉(zhuǎn)錄物或PERI作為應(yīng)激檢測(cè)的標(biāo)記物的用途。
背景技術(shù)：
包括從單細(xì)胞生物體到人的所有有生命的生物體普遍地具有晝夜節(jié) 律，該晝夜節(jié)律是基于24小時(shí)周期的活體現(xiàn)象或生物學(xué)節(jié)律。它們還具有 控制該晝夜節(jié)律的基因。
在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律控制基因主要在下丘腦的視交叉上核(SCN)中 表達(dá)并在個(gè)體晝夜節(jié)律的控制中起著重要作用。在有生命的生物體中它也 在其它組織中表達(dá)，從而以與中樞相同的方式控制細(xì)胞和組織的晝夜節(jié)律。
已知晝夜節(jié)律控制基因包含Per基因(Perl、 Per2和Per3)、時(shí)鐘基因 (Clock gene)、Bmal基因(Bmal 1 、 Bmal 2和Bmal 3)、 Cry基因、Dec基因(Decl 和Dec2)、 Dbp基因、E4Bp4基因、和Rev-erb基因(Rev-erb "和Rev-erb
日本專(zhuān)利公開(kāi)第2000-275248號(hào)先于本發(fā)明，其披露了通過(guò)測(cè)量唾液中 的皮質(zhì)醇用于確定慢性應(yīng)激的方法。順便提及，本發(fā)明采用SokoloveP.G.和 Bushell W.N.( 1978)J Theor Biol. 72， 131 -160作為后面提到的其非專(zhuān)利文獻(xiàn)舉 例的參考。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述
由于將時(shí)鐘基因和應(yīng)激相聯(lián)系的分子反應(yīng)機(jī)制還不明確，所述機(jī)制不
同于確信存在于哺乳動(dòng)物中的涉及應(yīng)激反應(yīng)性的晝夜節(jié)律控制機(jī)制，因此 有必要闡明該機(jī)制。
本發(fā)明人基于他們的以下發(fā)現(xiàn)完成這項(xiàng)發(fā)明應(yīng)激伴隨外周組織內(nèi) Perl基因表達(dá)水平的增加，應(yīng)激反應(yīng)不改變外周組織中的晝夜節(jié)律，以及
達(dá)水^。、，、— ,、'、、；
前述發(fā)現(xiàn)提示了下述應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的存在。施加到個(gè)體生物體的任何 應(yīng)激導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素以循環(huán)進(jìn)入身體的每一部分。并且
而增加。也就是說(shuō)，應(yīng)激通過(guò)與例如時(shí)鐘基因表達(dá)和晝夜節(jié)律不同的機(jī)制 來(lái)增加Perl基因的表達(dá)水平。
上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于應(yīng)激評(píng)價(jià)是有用的。也就是說(shuō)，將有可能通過(guò)檢測(cè) mRNA和PER1的增加或確定其量來(lái)檢測(cè)應(yīng)激的存在或缺乏，或評(píng)價(jià)應(yīng)激的 程度，mRNA是外周組織中Perl基因的轉(zhuǎn)錄物，PER1是由Perl基因編碼 的蛋白質(zhì)。
檢測(cè)Perl基因的轉(zhuǎn)錄物可通過(guò)合成總RNA或從外周組織中提取總 RNA，以及將具有Perl堿基序歹'J(或其部分)的多核苷酸(作為檢測(cè)探針)與提 取或合成的核酸雜交來(lái)完成。并且，PER1(蛋白質(zhì))的檢測(cè)也可通過(guò)涉及特 異性結(jié)合PER1的抗-PERl抗體的抗原-抗體反應(yīng)來(lái)完成。
可從NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)得到Perl基因的堿 基序列和歸因于Perl基因的氨基酸序列的信息。例如，序列No.l顯示人 Perl基因同源物的堿基序列，而序列No.2顯示小鼠Perl基因的堿基序列。 依據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的Perl基因不僅包含各種動(dòng)物中Perl基因的同源物的 序列，還包含那些部分具有替代、缺陷、插入和添加的序列。
本發(fā)明的實(shí)施方案提供了對(duì)應(yīng)激的客觀和精確評(píng)價(jià)。


圖1A是顯示實(shí)施例1中小鼠在應(yīng)激下在一天內(nèi)如何改變其活動(dòng)的活 動(dòng)變化記錄圖1B是圖表，用圖表表示實(shí)施例1中圖IA的活動(dòng)變化記錄圖中觀察 到的小鼠的晝夜節(jié)律的平均值；圖1C是顯示實(shí)施例1中施加應(yīng)激前后》見(jiàn)察到的活動(dòng)性比率的變化的
圖1D是顯示實(shí)施例1中施加應(yīng)激后直到再同步的天數(shù)的圖； 圖2A是顯示實(shí)施例2的晝夜節(jié)律周期中肝臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量如何改 變的圖2B是顯示實(shí)施例2的晝夜節(jié)律周期中心臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量如何改 變的圖2C是顯示實(shí)施例2的晝夜節(jié)律周期中腎臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量如何改 變的圖3A是顯示實(shí)施例3中肝臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖3B是顯示實(shí)施例3中心臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖3C是顯示實(shí)施例3中肺內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖3D是顯示實(shí)施例3中腎臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖4A是顯示實(shí)施例4中GRE類(lèi)似序列及其鄰近的序列的圖4B是顯示實(shí)施例4中的序列上每個(gè)啟動(dòng)子的位置的示意圖4C是顯示實(shí)施例4中熒光素酶分析的結(jié)果的圖4D是顯示當(dāng)GRE類(lèi)似序列改變時(shí)熒光素酶分析的結(jié)果的圖5A是描述實(shí)施例5中Perl基因的序列的示意圖5B是顯示用于通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)所需序列的電泳的照片，所
述半定量RT-PCR在通過(guò)實(shí)施例5中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上進(jìn)行； 圖5C是顯示在通過(guò)實(shí)施例5中ChIP方法進(jìn)行免疫沉淀之后通過(guò)定量
實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)檢測(cè)所需序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖6A是顯示用于通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)所需序列的電泳的照片，所
述半定量RT-PCR在通過(guò)實(shí)施例6中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上進(jìn)行； 圖6B是顯示在通過(guò)實(shí)施例6中ChIP方法進(jìn)行免疫沉淀之后通過(guò)定量
實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)檢測(cè)所需序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖7A是顯示實(shí)施例7中皮質(zhì)酮?jiǎng)┝亢蚉erl基因表達(dá)量之間的相關(guān)性
的圖7B是顯示實(shí)施例7中通過(guò)施用皮質(zhì)酮(IO mg/kg)謙導(dǎo)的每個(gè)時(shí)鐘基 因表達(dá)量的圖；和
圖8是顯示與本發(fā)明的實(shí)施方式相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制的示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
這個(gè)實(shí)施例的目的是通過(guò)分析由紅外線活動(dòng)記錄裝置(Biotex制造)記 錄的小鼠活動(dòng)的數(shù)據(jù)，來(lái)研究小鼠在應(yīng)激下一天內(nèi)如何改變其活動(dòng)。
通過(guò)使BALB/c系小鼠在配備有紅外線活動(dòng)記錄裝置的籠內(nèi)在黑暗中 自由活動(dòng)24小時(shí)，將小鼠的活動(dòng)記錄在活動(dòng)變化記錄圖上，此前該小鼠已 對(duì)12小時(shí)間隔的明亮和黑暗環(huán)境(前者從8點(diǎn)持續(xù)到20點(diǎn))的晝夜節(jié)律適應(yīng) 2周。在連續(xù)的兩天內(nèi)，在它的自由奔跑過(guò)程中，小鼠在指定時(shí)間被給予l 小時(shí)的應(yīng)激。順便提及，活動(dòng)變化記錄圖是顯示小鼠的連續(xù)活動(dòng)的記錄。 所得到的活動(dòng)變化記錄圖通過(guò)"卡方周期圖(periodgram)"方法進(jìn)行分析(見(jiàn) 非專(zhuān)利文獻(xiàn))。
圖1A是顯示小鼠在應(yīng)激下在一天內(nèi)如何改變其活動(dòng)的活動(dòng)變化記錄 圖。圖1頂部的數(shù)字顯示測(cè)量時(shí)間。頂部下方的黑色和灰色線分別顯示小 鼠在開(kāi)始自由奔跑之前經(jīng)歷的明亮和黑暗環(huán)境的時(shí)間。圖1中第二行和隨 后的行顯示兩天的活動(dòng)變化記錄，每一點(diǎn)代表檢測(cè)到的活動(dòng)的數(shù)量。
圖1中，"CT2"、 "CT5"、和"CT15，'分別表示晝夜節(jié)律時(shí)間的2點(diǎn)、 5點(diǎn)、和15點(diǎn)。晝夜節(jié)律時(shí)間意味著小鼠的主觀時(shí)間。由于小鼠是夜間活 動(dòng)的，如果它交替經(jīng)歷以12小時(shí)為間隔的明亮和黑暗環(huán)境，明亮環(huán)境開(kāi)始 于晝夜節(jié)律時(shí)間的0點(diǎn)。可替換地，如果明亮和黑暗環(huán)境以24小時(shí)的間隔 轉(zhuǎn)換，小鼠由于晝夜節(jié)律而開(kāi)始減少其活動(dòng)(或開(kāi)始睡覺(jué))的時(shí)間被看作O點(diǎn)。
每一活動(dòng)變化記錄有兩個(gè)黑色遮蓋的部分。它們代表^4加應(yīng)激的時(shí)間 區(qū)。即，"CT2"、 "CT5"、和"CT15"的活動(dòng)變化記錄分別顯示，在小鼠被 置于每天24小時(shí)的黑暗中后，在第20天和第21天的1-2點(diǎn)、4-5點(diǎn)、和 14-15點(diǎn)(晝夜節(jié)律時(shí)間)施加應(yīng)激。
由圖1A表明，應(yīng)激下的小鼠不改變它的晝夜節(jié)律。
圖1B是圖表，其用圖表表示從圖1A的活動(dòng)變化記錄圖中觀察到的小 鼠的晝夜節(jié)律周期的平均值?？v軸上的"時(shí)間(小時(shí))"表示小鼠的晝夜節(jié)律 周期(或小鼠主觀的一天的長(zhǎng)度)"。橫軸上的"PrS"和"Pos，，分別表示施加 應(yīng)激前的晝夜節(jié)律周期和施加應(yīng)激后的晝夜節(jié)律周期。"應(yīng)激"表示施加或 沒(méi)有施加應(yīng)激。"CT2"、 "CT5"、和"CT15"的定義如上。
圖1B表明，施加應(yīng)激前后晝夜節(jié)律周期改變非常少。
圖1C是顯示施加應(yīng)激前后觀察到的活動(dòng)性比率的變化的圖。縱軸上
的"活動(dòng)性比率(％)"表示施加應(yīng)激后3天的活動(dòng)性值被施加應(yīng)激前10天 的活動(dòng)性值除所獲得的值(％)。"應(yīng)激"表示施加或沒(méi)有施加應(yīng)激。"CT2"、 "CT5"、和"CT15，'定義如上。
圖1C表明，未施加應(yīng)激組(對(duì)照)和施加應(yīng)激組之間活動(dòng)性比率差異很小。
圖1D是顯示施加應(yīng)激后直到再同步的天數(shù)的圖。該圖是基于這樣的 實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)的目的為研究當(dāng)把小鼠交替置于以12小時(shí)為間隔(從8到20 點(diǎn)為明亮環(huán)境)的明亮環(huán)境和黑暗環(huán)境中、然后給予應(yīng)激并最終提前6小時(shí) 置于明亮環(huán)境中(從2到14點(diǎn)為明亮環(huán)境)時(shí)，需多少天使其晝夜節(jié)律再次 同步(resynchronize)。
縱軸上"直到再同步的天數(shù)，，表示當(dāng)小鼠置于明亮環(huán)境中的時(shí)間改變 后為了再同步所需的天數(shù)。"ZT2"表示在1-2點(diǎn)(授時(shí)因子時(shí)間)(Zeitgeber time)給予應(yīng)激的組。同樣地，"ZT15"表示在14-15點(diǎn)給予應(yīng)激的組。"ctrl" 表示未給予應(yīng)激的組(對(duì)照)。此處，"授時(shí)因子時(shí)間"表示定時(shí)系統(tǒng)的時(shí)間， 其中當(dāng)明亮環(huán)境和黑暗環(huán)境以12小時(shí)為間隔重復(fù)時(shí)，明亮環(huán)境開(kāi)始于0點(diǎn)。
由圖1D表明，ZT15和對(duì)照之間直到再同步的天數(shù)差異非常小，盡管 ZT2缺乏一致性。
實(shí)施例1的結(jié)果提示，施加應(yīng)激對(duì)受試個(gè)體小鼠的晝夜節(jié)律改變很少。 實(shí)施例2
這個(gè)實(shí)施例是為了研究在晝夜節(jié)律周期中當(dāng)施加應(yīng)激時(shí)，時(shí)鐘基因的 表達(dá)量如何變化。
每個(gè)小鼠在指定時(shí)間給予一小時(shí)的應(yīng)激，然后從施予應(yīng)激后12小時(shí) 開(kāi)始以4小時(shí)的間隔采集其器官(肝臟、心臟和腎臟)。所采集的器官被均質(zhì) 化以使用Promega總SV RNA分離試劑盒(來(lái)自Promega)提取總RNA。提取 的總RNA用于通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)確定mPerl 、 mPer2、和Bmall基因
的表達(dá)量。
將這樣獲得的顯示表達(dá)量隨時(shí)間的改變的數(shù)據(jù)繪圖，用于通過(guò)基于以 下公式的"余弦擬合曲線，，方法而擬合。<formula>formula see original document page 8</formula>該結(jié)果在圖2A到2C中顯示。
圖2A是顯示肝臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量在晝夜節(jié)律周期中如何改變的 圖。圖2B是顯示心臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量在晝夜節(jié)律周期中如何改變的圖。 圖2C是顯示腎臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量在晝夜節(jié)律周期中如何改變的圖。
在圖2A到2C中，"mPerl"、 "mPer2，，、和"mBmall"分別表示在晝 夜節(jié)律周期中，mPerl、 mPer2、和mBmall的表達(dá)量如何改變。順便提及， 附加于每一基因名稱(chēng)的前綴"m"代表小鼠(Mus musculus)。并且，在圖2A 至2C中，"ctrl"表示未給予應(yīng)激的組(對(duì)照)，"ZT2"表示以授時(shí)因子時(shí)間 在l-2點(diǎn)給予應(yīng)激的組，和"ZT15"表示以授時(shí)因子時(shí)間在14-15點(diǎn)給予應(yīng) 激的組。橫軸上的數(shù)字代表器官被采集的時(shí)間。
圖2A到2C表明，每個(gè)時(shí)鐘基因表達(dá)量有變化，但給予應(yīng)激的組("ZT2" 和"ZT15")和未給予應(yīng)激的組("ctrl")之間在晝夜節(jié)律相移上差異很小。
因此，實(shí)施例2的結(jié)果表明，就時(shí)鐘基因表達(dá)水平而言，施加應(yīng)激導(dǎo) 致晝夜節(jié)律相位的極小改變。
這個(gè)實(shí)施例是為了研究當(dāng)施加應(yīng)激時(shí)每一器官內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量如 何改變。
每個(gè)小鼠在指定時(shí)間給予一小時(shí)的應(yīng)激，然后從施予應(yīng)激后12小時(shí) 開(kāi)始以4小時(shí)的間隔采集其器官(肝臟、心臟、肺和腎臟)。所采集的器官被 均質(zhì)化以使用Promega總SVRNA分離試劑盒(來(lái)自Promega)提取總RNA。 提取的總RNA用于通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)確定每一時(shí)鐘基因的表達(dá)量。
該結(jié)果在圖3A到3D中顯示。
圖3A是顯示肝臟內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖。圖3B是顯示心臟內(nèi)時(shí)鐘基 因表達(dá)量的圖。圖3C是顯示肺內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖。圖3D是顯示腎臟 內(nèi)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖。
在圖3A到3D中，"Perl"、 "Per2" 、 "Per3"、 "Bmall" "Npas2"、 "Cryl"、
實(shí)施例3
"Cry2"、 "Decl"、 "Dec2"、 "Dbp"和"E4bp4"分別表示每個(gè)時(shí)4中基因的 表達(dá)量。并且，黑條表示未給予應(yīng)激的對(duì)照組中時(shí)鐘基因的表達(dá)量，以及 白條表示給予應(yīng)激的組中時(shí)鐘基因的表達(dá)量。橫軸上的數(shù)字代表采集器官 的對(duì)間，縱軸上的數(shù)字表示表達(dá)量(相對(duì)值)。
由圖3A到3D表明，施加應(yīng)激引起每個(gè)器官內(nèi)Perl基因表達(dá)量的增 加，但不引起每個(gè)器官內(nèi)其它時(shí)鐘基因表達(dá)量的增加。
從上述實(shí)施例1到實(shí)施例3總結(jié)出，就個(gè)體的活動(dòng)性節(jié)律或時(shí)鐘基因 表達(dá)水平而言，不管是否施加應(yīng)激，晝夜節(jié)律保持穩(wěn)定，而Perl基因在外 周組織內(nèi)的表達(dá)水平在施加應(yīng)激后立即增加。
前述結(jié)論提示了通過(guò)使用作為指標(biāo)的Perl基因在外周組織中的表達(dá) 水平來(lái)客觀評(píng)估應(yīng)激的可能性。
并且，前述實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示， 一旦施加應(yīng)激，Perl的表達(dá)水 平通過(guò)新的轉(zhuǎn)錄控制4幾制增加，該4幾制與通過(guò)已知啟動(dòng)子(例如E-box和 CRE)的途徑、例如Bmal/時(shí)鐘-E-box途徑和CRE-CREB途徑不同。
實(shí)施例4
這個(gè)實(shí)施例是為了研究與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的Perl基因的啟動(dòng)子。
第 一步是基于基因組信息，對(duì)Per 1基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行計(jì)算機(jī)上的(in silico)序列分析。其結(jié)果表明，在所有人、大鼠和小鼠的啟動(dòng)子區(qū)域的序 列中都有四組E-box和兩組DBPE (Dbp-結(jié)合元件)，并且有兩個(gè)GRE(糖皮 質(zhì)激素反應(yīng)性元件)類(lèi)似序列(以下將稱(chēng)作"GRE類(lèi)似序列")。
順便提及，E-box不僅存在于Perl基因的啟動(dòng)子區(qū)域，還存在于Per2 和Dbp基因的啟動(dòng)子區(qū)域。此外，DBPE還存在于Per3基因的啟動(dòng)子區(qū)域。
圖4A是顯示GRE類(lèi)似序列和它的鄰近序列的圖。圖4B是顯示序列 上每個(gè)啟動(dòng)子的位置的示意圖。
圖4A和4B中，"遠(yuǎn)側(cè)GRE"和"近側(cè)GRE"分別表示兩組GRE類(lèi) 似序列的上游序列和下游序列。而且，"H"、 "R，，和"M，，分別表示人、大 鼠和小鼠的序列。加下劃線的序列是類(lèi)似GRE的序列。"Exl"和"Ex2" 分別表示外顯子1和外顯子2。
圖4B中，"E-box"、 "GRE"、和"CRE，，分別表示E-box、 GRE類(lèi)似 序列、和CRE在Perl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中存在的位置。
第二步是螢光素酶分析，以研究Perl啟動(dòng)子區(qū)域的什么部分與應(yīng)激反 應(yīng)相關(guān)。
螢光素酶是一種催化生物發(fā)光的酶蛋白。它可用于通過(guò)以下方式估計(jì) 特定基因的表達(dá)被誘導(dǎo)的水平。首先，制備重組基因，該重組基因中特定 基因的啟動(dòng)子區(qū)域與編碼熒光素酶的基因連接。第二，將重組的基因摻入 培養(yǎng)的細(xì)胞。第三，允許該基因進(jìn)行表達(dá)，這樣使熒光素酶能夠表達(dá)。第 四，測(cè)定由焚光素酶引起的生物發(fā)光的強(qiáng)度以獲得熒光素酶表達(dá)的水平。
以前述原理為基礎(chǔ)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。它包括制備數(shù)種DNA，所述DNA在 Perl啟動(dòng)子區(qū)域長(zhǎng)度上有所不同，以及當(dāng)存在地塞米松時(shí)測(cè)定Perl的表達(dá) 水平。這樣獲得的結(jié)果揭示了 Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域的什么部分與應(yīng)激反應(yīng) 相關(guān)。順便提及，地塞米松是合成的糖皮質(zhì)激素。已知當(dāng)有生命的生物體 經(jīng)歷應(yīng)激時(shí)，血液中糖皮質(zhì)激素的量增加。
實(shí)驗(yàn)的步驟概述如下。(l)第一步是制備DNA (P1F、 P1K、和P1S)， 第一個(gè)具有Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域的全長(zhǎng)，第二個(gè)和第三個(gè)具有Perl基因啟 動(dòng)子區(qū)域的部分長(zhǎng)度，上游側(cè)被切掉。如圖4B所示，P1F的截?cái)辔恢迷诰?離Perl基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上游6301個(gè)堿基處，P1K的截?cái)辔恢迷谏嫌?806 個(gè)堿基處，以及P1S的截?cái)辔恢迷谏嫌?369個(gè)堿基處。
(2) 第二步是通過(guò)將前述DNA導(dǎo)入焚光素酶發(fā)光載體pGL3 basic (來(lái)自 Promega)而制備重組載體。所得到的重組載體具有特定長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)域和 編碼熒光素酶基因的區(qū)域。
(3) 第三步是將重組載體(第二步(2)中制備)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞 中并加入地塞米松(O.l jaM)。已經(jīng)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞被分離和次代培養(yǎng)以表達(dá) 熒光素酶。次代培養(yǎng)的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)被采集和溶解。
(4) 第四步是從溶解的細(xì)胞來(lái)制備溶液和通過(guò)二重?zé)晒馑孛阜治鱿到y(tǒng) (來(lái)自Promega)測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度。從而能夠得知地塞米松誘導(dǎo)Perl基因表達(dá)的 程度。
該結(jié)果如圖4C所示。
圖4C是顯示熒光素酶分析結(jié)果的圖。橫坐標(biāo)(相對(duì)熒光素酶活性)用與 指定為100的、摻入Perl基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度相比的相 對(duì)值(％)來(lái)代表發(fā)光強(qiáng)度。
"P1F"表示源自摻入Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域全長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)
度。"P1K"表示源自摻入Perl基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上游3806個(gè)堿基的部分 長(zhǎng)度的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。"PIS"表示摻入Perl基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上游 2369個(gè)堿基的部分長(zhǎng)度的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。"載體"表示摻入空白載體 的培養(yǎng)細(xì)胞(對(duì)照)的發(fā)光強(qiáng)度。圖4C的右側(cè)部分為描述已摻入的DNA的 示意圖。"Dex"和"EtOH"分別表示包含地塞米松的樣本和包含乙醇的樣 本(對(duì)照)的發(fā)光強(qiáng)度。
圖4C表明，地塞米松導(dǎo)致"P1K"樣本的高發(fā)光強(qiáng)度和"PIS"樣本 一定的發(fā)光強(qiáng)度。
考慮到"P1K"樣本中使用的啟動(dòng)子序列具有兩個(gè)GRE類(lèi)似序列，以 及"PIS"樣本中使用的啟動(dòng)子序列具有一個(gè)GRE類(lèi)似序列的事實(shí)，該實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果提示，計(jì)算機(jī)分析中發(fā)現(xiàn)的GRE類(lèi)似序列可能與Perl基因的應(yīng)激 反應(yīng)有關(guān)。
進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究當(dāng)在計(jì)算機(jī)分析中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)GRE類(lèi)似序列 中的兩個(gè)或任一個(gè)上實(shí)施突變時(shí)，是否以與圖4C所示相同的方式誘導(dǎo)表達(dá)。 首先，如下制備四個(gè)DNA樣本
Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域在其全長(zhǎng)上保持完好的DNA(P1F); P1F的GRE 類(lèi)似序列在其上游發(fā)生突變的DNA(PlFdM); P1F的GRE類(lèi)似序列在其下 游發(fā)生突變的DNA (PIFpM);和兩個(gè)GRE類(lèi)似序列都發(fā)生突變的DNA (PlFd/pM)。每個(gè)DNA樣本以與如上所述相同的方式摻入熒光素酶發(fā)光載 體。將該載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)，隨后給予該培養(yǎng)細(xì)胞0.1 的地塞米松。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，將傳代培養(yǎng)的細(xì)胞采集和溶解。用二重?zé)晒?素酶分析系統(tǒng)(來(lái)自Promega)檢測(cè)所得溶液的發(fā)光強(qiáng)度。該實(shí)驗(yàn)揭示了地塞 米松誘導(dǎo)Perl基因表達(dá)的程度。 該結(jié)果如圖4D所示。 "P1F"表示摻入Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域全長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。 "PIFdM"表示摻入P1F的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，所述PIF具有在其上游 發(fā)生突變的GRE類(lèi)似序列。"PIFpM"表示摻入P1F的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng) 度，所述P1F具有在其下游發(fā)生突變的GRE類(lèi)似序列。"PlFd/pM"表示摻 入P1F的培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，所迷P1F具有其上游和其下游都發(fā)生突變 的GRE類(lèi)似序列。
圖4D表明，包含地塞米松的PlFpM樣本產(chǎn)生高發(fā)光強(qiáng)度，而PIFdM
樣本產(chǎn)生較低的發(fā)光強(qiáng)度。這個(gè)結(jié)果提示，存在于Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)
的GRE類(lèi)似序列，特別是存在于其下游的GRE類(lèi)似序列，與應(yīng)激反應(yīng)密切 相關(guān)。
實(shí)施例5
這個(gè)實(shí)施例的目的是使用ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)方法研究Perl基因的 GRE類(lèi)似序列在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)是否結(jié)合至糖皮質(zhì)激素受體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)GR)。
首先，用地塞米松處理NIH3T3細(xì)胞以誘導(dǎo)mPerl基因的表達(dá)。細(xì)胞 被給予甲醛以固定蛋白質(zhì)和染色質(zhì)DNA的結(jié)合。使用超聲波處理使染色質(zhì) DNA成為碎片，將得到的碎片與抗GR抗體進(jìn)行免疫沉淀?；厥盏玫降某?淀(作為抗GR抗體、GR、和與GR結(jié)合的染色質(zhì)DNA的復(fù)合物)。加熱回 收的沉淀以去除DNA-蛋白的交聯(lián)。通過(guò)PCR擴(kuò)增所需序列，并用電泳鑒 別PCR產(chǎn)物。
圖5A是描述Perl基因序列的示意圖。
圖5A中置于"dGRE"和"pGRE"上方的三角標(biāo)記代表對(duì)應(yīng)于用于 PCR的引物的序列區(qū)域。換言之，引物被如此設(shè)計(jì)以特異性擴(kuò)增兩個(gè)GRE 類(lèi)似序列附近的區(qū)域。
圖5B是顯示通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)所需序列的電泳的照片，該半定 量RT-PCR在由ChIP方法得到的免疫沉淀物上進(jìn)行。
圖5B中，"IP: cc-GR"表示用抗-GR抗體免疫沉淀后通過(guò)半定量 RT-PCR檢測(cè)到的所需序列。"IP: ct-正常兔IgG"表示用兔IgG從免疫沉淀 反應(yīng)中檢測(cè)到的序列(對(duì)照)。此外，"輸入"表示不經(jīng)免疫沉淀反應(yīng)通過(guò)半 定量RT-PCR檢測(cè)到的所需序列(對(duì)照)。最下行中的"ChIP引物"表示用于 半定量RT-PCR的引物序列或已被擴(kuò)增的所需序列。"dGRE"和"pGRE" 分別表示擴(kuò)增的來(lái)自存在于Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)兩個(gè)GRE類(lèi)似序列的上 游序列和下游序列。"mPer2"表示作為對(duì)照的擴(kuò)增的mPer2基因。"Ohr" 表示當(dāng)未用地塞米松處理時(shí)立即加入曱醛獲得的結(jié)果。"lhr(Dex)"表示當(dāng) 用地塞米松處理1小時(shí)后加入甲醛獲得的結(jié)果。"lhr(EtOH)"表示當(dāng)用乙醇 (用作對(duì)照)處理1小時(shí)后加入甲醛獲得的結(jié)杲。
圖5C是顯示在通過(guò)ChIP方法進(jìn)行免疫沉淀之后通過(guò)定量實(shí)時(shí) RT-PCR檢測(cè)所需序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。
縱座標(biāo)上的"％ l命入"代表PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增的所需DNA的量。其它 符號(hào)與圖5B中的那些相同。
由圖5B顯示，在地塞米松處理和隨后借助抗a-GR抗體進(jìn)行免疫沉 淀反應(yīng)后，當(dāng)表示為"dGRE"和"pGRE"的序列通過(guò)PCR擴(kuò)增時(shí)，檢測(cè) 到所需區(qū)帶(見(jiàn)圖5B上部的電泳照片)。
由圖5C顯示如果在地塞米松處理和隨后借助抗cc-GR抗體進(jìn)行免疫 沉淀反應(yīng)后進(jìn)行PCR， PCR極大地?cái)U(kuò)增了包含表示為"dGRE"和"pGRE" 的序列的DNA。
這個(gè)結(jié)果提示，糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合至來(lái)自Perl基因的啟動(dòng)子區(qū) 域的兩個(gè)GRE類(lèi)似序列。
實(shí)施例6
除了用從經(jīng)歷過(guò)應(yīng)激的小鼠采集的肝臟代替NIH3T3細(xì)胞外，重復(fù)與 實(shí)施例5相同的步驟。
從已經(jīng)歷1小時(shí)應(yīng)激然后休息1小時(shí)的小鼠采集肝臟。采集的肝臟通 過(guò)與實(shí)施例5中相同的方式處理以產(chǎn)生具有所需基因序列的PCR產(chǎn)物。
圖6A是顯示通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)所需序列的電泳的照片，該半 定量RT-PCR在通過(guò)ChIP方法得到的免疫沉淀物上進(jìn)行。圖6A中的符號(hào) 與圖5B中的那些相同。
圖6B是顯示在通過(guò)ChIP方法進(jìn)行免疫沉淀之后通過(guò)定量實(shí)時(shí) RT-PCR檢測(cè)所需序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。圖6B中的符號(hào)與圖5C中的那些相 同。
由圖6A和6B顯示即使在小鼠實(shí)際上經(jīng)歷應(yīng)激的情況下，糖皮質(zhì)激素 受體(GR)也與來(lái)自Perl基因的啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)GRE類(lèi)似序列結(jié)合。
從圖6A和6B所示的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GR更多地與存在于Perl啟動(dòng)子區(qū)域 內(nèi)的兩個(gè)GRE類(lèi)似序列的上游部分結(jié)合。
實(shí)施例7
這個(gè)實(shí)施例目的是研究給予了皮質(zhì)酮的小鼠中Perl的表達(dá)量。 給予小鼠指定量的皮質(zhì)酮，1小時(shí)后其肝臟被取出。所采集的肝臟被 均質(zhì)化以通過(guò)與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR,并測(cè)定時(shí)鐘基
因的表達(dá)量。
圖7A是顯示皮質(zhì)酮?jiǎng)┝亢蚉erl基因表達(dá)量之間的相關(guān)性的圖。 橫坐標(biāo)代表每lkg小鼠重量的皮質(zhì)酮?jiǎng)┝?mg/kg)。 "PBS"表示對(duì)照，
其被給予磷酸鹽緩沖溶液以代替皮質(zhì)酮。縱座標(biāo)上的"謙導(dǎo)倍數(shù)"代表Perl
基因的表達(dá)量(用相對(duì)值表示，以PBS的值為1)。
由圖7A顯示，Perl基因的表達(dá)量隨皮質(zhì)酮?jiǎng)┝康脑黾佣黾印?br> 圖7B是顯示通過(guò)施予皮質(zhì)酮(10mg/kg)誘導(dǎo)的每個(gè)時(shí)鐘基因表達(dá)量的圖。
橫坐標(biāo)代表每個(gè)時(shí)鐘基因?？v坐標(biāo)上的"誘導(dǎo)倍數(shù)"代表用相對(duì)值表 示的每個(gè)時(shí)鐘基因的表達(dá)量，以PBS的值為1。
由圖7B顯示，施予皮質(zhì)酮在時(shí)鐘基因中僅增加Perl基因的表達(dá)量。 換言之，這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，施加應(yīng)激所引起的Perl基因的表達(dá)受與晝 夜節(jié)律調(diào)節(jié)完全不同的機(jī)制誘導(dǎo)。
上述實(shí)施例1到實(shí)施例7中實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了如圖8中所示的應(yīng)激反應(yīng) 性機(jī)制的存在。
由圖8顯示，在Perl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中不僅存在E-box和CRE，還 存在GRE類(lèi)似序列。
一旦施加應(yīng)激，糖皮質(zhì)激素就從腎上腺皮質(zhì)分泌并輸送至整個(gè)身體。 然后，糖皮質(zhì)激素結(jié)合至存在于外周組織中的GR。所得到的產(chǎn)物結(jié)合至 Perl基因啟動(dòng)子區(qū)域中存在的GRE類(lèi)似序列。這是誘導(dǎo)Perl基因表達(dá)的機(jī) 制。
順便提及，E-box和CRE的序列與應(yīng)激反應(yīng)性機(jī)制無(wú)關(guān)。因此，它們 不誘導(dǎo)具有其它序列的其它時(shí)鐘基因的表達(dá)。因此，即使施加應(yīng)激，晝夜 節(jié)律(或內(nèi)部身體鐘(internal body clock))改變極小。
依據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案用于評(píng)價(jià)應(yīng)激的方法可通過(guò)使用與已知的應(yīng)激 反應(yīng)性機(jī)制完全不同的新機(jī)制來(lái)檢測(cè)應(yīng)激。關(guān)于本發(fā)明實(shí)施方案的基因轉(zhuǎn) 錄物和蛋白質(zhì)可用作應(yīng)激檢測(cè)的標(biāo)記物。此外，關(guān)于本發(fā)明實(shí)施方案的多 核苷酸和抗體可應(yīng)用于DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、以及應(yīng)激評(píng)價(jià)試劑盒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)設(shè)計(jì)要求和其它因素，可以進(jìn)行各種 改良、組合、再組合和改變，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求或其等效物的范圍 內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)激評(píng)價(jià)方法，其被設(shè)計(jì)為檢測(cè)Per1基因表達(dá)水平的任何增加。
2. 如權(quán)利要求1中所限定的應(yīng)激評(píng)價(jià)方法，其被設(shè)計(jì)為檢測(cè)外周組織中 表達(dá)水平的任何增加。
3. 在施加應(yīng)激時(shí)表達(dá)水平增加的Perl基因。
4. 如權(quán)利要求3中所限定的Perl基因，其在外周組織中表達(dá)水平增加。
5. 如權(quán)利要求3中所限定的Perl基因，其依賴于糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性元件 而增力口。
6. 具有權(quán)利要求3中所限定的Perl基因的堿基序列或其部分的多核芬甘酸。
7. 權(quán)利要求3中所限定的Perl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為應(yīng)激檢測(cè)標(biāo)記物的 用途。
8. PER1，其為由權(quán)利要求3中所限定的Perl基因編碼的蛋白質(zhì)。
9. 特異性結(jié)合權(quán)利要求8中所限定的PER1的抗-PER1抗體。
10. 權(quán)利要求8中所限定的PER1作為應(yīng)激檢測(cè)標(biāo)記物的用途。
全文摘要
基于以下發(fā)現(xiàn)闡明了聯(lián)系時(shí)鐘基因與應(yīng)激的分子反應(yīng)機(jī)制應(yīng)激伴隨外周組織中Per1基因表達(dá)水平的增加，應(yīng)激反應(yīng)不改變外周組織的晝夜節(jié)律，以及Per1基因依賴存在于其啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性元件而增加其表達(dá)水平。這個(gè)發(fā)現(xiàn)被用于應(yīng)激評(píng)價(jià)。即，通過(guò)檢測(cè)和確定外周組織中Per1基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA)的增加(Per1基因編碼的蛋白的增加)，可評(píng)價(jià)應(yīng)激的存在或缺乏或程度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101165192SQ20061006414
公開(kāi)日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者中畑泰和, 內(nèi)匠透, 山本拓郎, 相馬溫彥 申請(qǐng)人:索尼株式會(huì)社