專利名稱：一種檢測雞脂肪性狀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測雞脂肪性狀的方法，特別是涉及一種利用PGC-1α基因的單核苷酸多態(tài)性檢測雞脂肪性狀的方法。
背景技術(shù)：
伴隨著肉雞業(yè)的興起，肉雞育種技術(shù)和生產(chǎn)規(guī)模不斷發(fā)展，使肉雞生產(chǎn)性能得到了很大程度地提高。但是，育種過程中對肉雞生長速度的過度追求也帶來了兩大負(fù)面影響，即雞體內(nèi)脂肪沉積過多和肉品質(zhì)下降。脂肪沉積過多，主要體現(xiàn)在腹脂沉積上，這不僅降低飼料轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益，同時也影響到肉質(zhì)風(fēng)味并可造成環(huán)境污染。因此，控制脂肪在雞體內(nèi)的過多蓄積、改善胴體品質(zhì)是我國和世界家禽業(yè)亟需解決的重大問題，選育低脂肉雞品系是當(dāng)今世界范圍內(nèi)肉雞育種的奮斗目標(biāo)之一。然而由于雞的腹脂性狀難以進(jìn)行活體測量，傳統(tǒng)的選育手段效率低下。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，從分子生物學(xué)的角度去研究脂肪代謝的候選基因和相關(guān)分子遺傳標(biāo)記，通過標(biāo)記輔助選擇或直接基因型選擇，可以在較短時間內(nèi)高效地解決這一育種難題。
過氧化物酶增殖激活受體γ輔激活因子α(peroxisomeproliferators-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)是1998年首先從小鼠棕色脂肪組織cDNA文庫克隆得到的一個核受體輔激活因子，主要在富含線粒體的組織如心臟、棕色脂肪、骨骼肌、肝臟、大腦等能量需求高的部位表達(dá)。諸多研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α廣泛調(diào)節(jié)能量生成和利用過程，不僅可以誘導(dǎo)線粒體增殖、呼吸及適應(yīng)性產(chǎn)熱，也與糖尿病、運動過程中的能量代謝、肥胖等密切相關(guān)，還在脂肪酸氧化、肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運、骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)變、軟骨形成以及肝糖異生等過程中起到重要作用。此外，PGC-1α顯示出極強(qiáng)的RNA后加工能力，參與一些核受體以及多種轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。Ueda等(Ueda等，Possible role foravPGC-1α in the control of expression of fiber type，along with avUCP andavANT mRNAs in the skeletal muscles of cold-expressed chickens.FEBS Letters，57911-17，2005)已經(jīng)成功地克隆了雞的PGC-1α基因，其cDNA全長為2388bp，包括13個外顯子，共編碼796個氨基酸殘基(GenBank登錄號AB170013)。鑒于其在脂肪細(xì)胞分化、脂肪酸氧化以及骨骼肌纖維類型決定過程中的關(guān)鍵作用，PGC-1α基因現(xiàn)已成為研究脂肪代謝和肌肉生長發(fā)育的候選基因。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。這種變異可能是轉(zhuǎn)換(C→T，在其互補(bǔ)鏈上則為G→A)，也可能是顛換(C→A，G→T，C→G，A→T)。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。
SNP檢測方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等，也采用根據(jù)DNA列陣的微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用雞過氧化物酶增殖激活受體γ輔激活因子α(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)基因的單核苷酸多態(tài)性檢測雞脂肪性狀的方法。
本發(fā)明所提供的檢測雞脂肪性狀的方法，是檢測待測雞的PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基為A還是G。
如果待測雞的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；如果雞的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位堿基為A時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為AG。
上述基因型中，GG基因型雞的脂肪性狀(腹脂重、腹脂率)顯著高于AA基因型和AG基因型。GG基因型雞的腹脂重比AA、AG基因型雞分別高15.97g和13.96g，腹脂率分別高0.87％和0.76％，差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，而其它生長相關(guān)性狀(如生長速度)及屠體性狀(包括胸肌重、腿肌重、肝臟重、心臟重)在不同的基因型間沒有顯著差異(P＞0.05)。
所述用于檢測雞脂肪性狀的PGC-1α基因的單核苷酸多態(tài)性位點位于該基因的第5外顯子，即PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位堿基，該堿基的變化導(dǎo)致PGC-1α蛋白序列自氨基(N)端第216位氨基酸殘基產(chǎn)生Asp和Asn之間的變化。
所述檢測方法可為常規(guī)的PCR-SSCP法、DNA測序等方法。
其中，PCR擴(kuò)增待測雞的包含PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基的核苷酸序列所用的引物對可為序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
所述檢測方法中的PCR反應(yīng)體系可為雞基因組DNA 100ng，10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.0μL，dNTPs 200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μL。PCR反應(yīng)條件可為先95℃變性5min；然后94℃變性20s，69℃退火20s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
本發(fā)明提供了一種利用PGC-1α基因的單核苷酸多態(tài)性檢測雞脂肪性狀的方法。實驗證明可以利用PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位堿基的多態(tài)性，并根據(jù)基因型對雞的腹脂性狀進(jìn)行選擇，剔除不利等位基因(GG)。用本發(fā)明的方法對雞的腹脂進(jìn)行選擇，可以使每只雞的腹脂量減少約15g，使得飼料轉(zhuǎn)化率大大提高，從而獲得可觀的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明為肉雞育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個更加高效準(zhǔn)確、簡便易行的分子遺傳標(biāo)記，為雞的腹脂性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段。用該遺傳標(biāo)記對肉雞的脂肪性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可有效地緩解實際生產(chǎn)中的脂肪問題，提高經(jīng)濟(jì)效益，并為加速改善肉雞脂肪性狀的分子育種奠定了基礎(chǔ)，將加快育種進(jìn)程。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準(zhǔn)確度高，并可實現(xiàn)自動化的直接檢測。此外，可根據(jù)本方明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，用于選擇攜帶有利等位基因(AA)的個體，為雞的育種工作提供便利。本發(fā)明將在雞的育種中發(fā)揮巨大作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為PCR-SSCP方法檢測PGC-1α基因SNP基因型的結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有引物合成及序列測定工作均由北京華大中生基因有限公司完成。
實施例1、PCR-SSCP檢測方法的建立及多態(tài)性位點的確定1、PCR擴(kuò)增選擇2個蛋雞品種(白來航蛋雞和農(nóng)大3號節(jié)糧小型蛋雞)，一個肉雞品種(白洛克)和三個中國地方品種(東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、絲羽烏骨雞和北京油雞)為實驗材料，根據(jù)雞PGC-1α基因的cDNA序列(GenBank登錄號AB170013)設(shè)計引物，序列如下F(正向引物)5’-GACTGAGAATTCGTGGAGCA-3’(序列表中SEQ ID NO1)R(反向引物)5’-ACCTTCCCTCCAAAACCAAC-3’(序列表中SEQ ID NO2)分別以上述5個雞種的基因組DNA為模板，在引物F和R的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20μl PCR反應(yīng)體系為雞基因組DNA 100ng，10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.0μL，dNTPs200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μL。PCR反應(yīng)條件為先95℃變性5min；然后94℃變性20s，69℃退火20s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后于-20℃保存。
2、SSCP分析取步驟1的PCR產(chǎn)物各1.5μl，分別與7μl上樣緩沖液(98％甲酰胺，0.09％溴酚蘭，0.09％二甲苯氰，2％甘油，0.1mol/L EDTA)混合，置于PCR儀上98℃變性10min，迅速置冰上冷卻10min，再進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(12-14h，電壓8V/cm)，銀染顯色，根據(jù)染色結(jié)果分析基因型。結(jié)果如圖1所示，上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有兩種帶型，表明擴(kuò)增序列存在多態(tài)性位點(SNP)，基因純合個體經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生單一條帶，基因雜合個體經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生兩條帶。
3、克隆測序及序列分析根據(jù)SSCP分析結(jié)果，將不同基因型純合個體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”并參照試劑盒說明書回收并純化，再將回收的DNA片段與載體pGEM-T(Promega公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，測序。結(jié)果兩種基因純合子個體的擴(kuò)增片段分別具有序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的核苷酸序列，長度均為253bp。對兩序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果兩序列存在一個堿基的差異(G/A)，該多態(tài)性位點(命名位6646A)位于序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4自5’端第101位，即PGC-1α基因的cDNA自5’端第646位堿基。如果待測雞的G646A為G時，其純合體的基因型為GG；如果雞的G646A為A時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為AG。
實施例2、檢測分子標(biāo)記在不同雞群中的多態(tài)性分布情況對2個蛋雞品種(白來航蛋雞和農(nóng)大3號節(jié)糧小型蛋雞)，一個肉雞品種(白洛克)和三個中國地方品種(東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、絲羽烏骨雞和北京油雞)用與實施例1相同的方法檢測PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基的G/A多態(tài)性，檢測結(jié)果如表1所示。在所檢測的雞種中，白洛克肉雞中占優(yōu)勢的G等位基因的基因頻率為0.67，而白來航蛋雞中占優(yōu)勢的A等位基因的基因頻率為0.82，而在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、絲羽烏骨雞和北京油雞中G等位基因和A等位基因的頻率接近。x2適合性檢驗分析結(jié)果表明這些群體中的基因型分布情況均處于平衡狀態(tài)(P＞0.05)，說明在進(jìn)化過程中基因頻率沒有受到選擇的影響，所得出的結(jié)果是可信的。
表1PGC-1α基因G646A多態(tài)性在不同雞種中的分布情況

實施例3、分子標(biāo)記與脂肪性狀的相關(guān)性分析為確定PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基(G646A)的G/A多態(tài)性與雞表型差異是否相關(guān)，現(xiàn)以白洛克×絲羽烏骨雞的F2代群體(332只)為試驗材料，用與實例1相同的方法進(jìn)行多態(tài)性檢測，并分析了雞PGC-1α基因G646A不同基因型與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)關(guān)系。采用SAS統(tǒng)計分析軟件GLM程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，基因型、正反交和批次為固定效應(yīng)，對屠體性狀而言，屠宰時體重作為協(xié)方差引入模型中進(jìn)行統(tǒng)計分析。
結(jié)果在所檢測的332只F2個體中，AA基因型有109個，AB基因型有176個，GG基因型47個。不同基因型與生產(chǎn)性狀間的統(tǒng)計分析結(jié)果如表2所示，PGC-1α基因G646A基因型不同時，脂肪性狀存在極顯著的差異(P＜0.01)，其中具有GG基因型雞的腹脂重較AA、AG基因型雞的分別高15.97g和13.96g，腹脂率分別高0.87％和0.76％，差異達(dá)到極顯著的水平(P＜0.01)，而其它生長相關(guān)性狀(生長速度)及屠體性狀(胸肌重、腿肌重、肝臟重、心臟重)在不同的基因型間沒有顯著差異(P＞0.05)。用該方法對雞的脂肪性狀進(jìn)行選擇時可以使腹脂重降低約15g，且既不影響其生長速度，也不影響其它屠體性狀，同時又能提高飼料轉(zhuǎn)化率，大大提高經(jīng)濟(jì)效益。
表2PGC-1α基因G646A不同基因型與生長、屠體性狀的相關(guān)性分析統(tǒng)計表


注以上數(shù)值為最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。
序列表<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gactgagaat tcgtggagca20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2accttccctc caaaaccaac20<210>3<211>253<212>DNA<213>雞(Gallus domestiaus)<400>3
gactgagaat tcgtggagca ataaagcgaa gagcatttgt caacaacaaa agccacaaag60acgtccctgc tctgaacttc tcaaatatct gactacgaac gatgaccctc ctcagaccaa120accagcagag aacaggaaca gcagcaaaga gaaatgcacc tccaaaagga agccccatct180gcagtctcag acaaatcacc tgcaaggtag gtgtgggagc acagaacatc ctgttggttt240tggaggggaa ggt 253<210>4<211>253<212>DNA<213>雞(Gallus domestiaus)<400>4gactgagaat tcgtggagca ataaagcgaa gagcatttgt caacaacaaa agccacaaag60acgtccctgc tctgaacttc tcaaatatct gactacgaac aatgaccctc ctcagaccaa120accagcagag aacaggaaca gcagcaaaga gaaatgcacc tccaaaagga agccccatct180gcagtctcag acaaatcacc tgcaaggtag gtgtgggagc acagaacatc ctgttggttt240tggaggggaa ggt 25權(quán)利要求
1.一種檢測雞脂肪性狀的方法，是檢測雞PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基為A還是G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；所述雞的PGC-1α基因cDNA序列的自5’端第646位堿基為A時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為AG；所述GG基因型雞的脂肪性狀高于AA、AG基因型雞，腹脂重比AA、AG基因型雞分別高15.97g和13.96g，腹脂率分別高0.87％和0.76％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測方法為PCR-SSCP法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增待測雞的包含PGC-1α基因cDNA自5’端第646位堿基的核苷酸序列所用的引物對為序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為雞基因組DNA 100ng，10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.0μL，dNTPs 200μmol/L，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.6U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先95℃5min；然后94℃20s，69℃ 20s，72℃ 45s，共35個循環(huán)；最后72℃ 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測雞脂肪性狀的方法。該方法是檢測雞的PGC－1α基因cDNA自5’端第646位堿基為A還是G。本發(fā)明為肉雞育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供一個更加高效準(zhǔn)確、簡便易行的分子遺傳標(biāo)記，為雞的腹脂性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段。用該遺傳標(biāo)記對肉雞的脂肪性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可有效地緩解實際生產(chǎn)中的脂肪問題，提高經(jīng)濟(jì)效益，并為加速改善肉雞脂肪性狀的分子育種奠定了基礎(chǔ)，將加快育種進(jìn)程。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準(zhǔn)確度高，并可實現(xiàn)自動化的直接檢測。本發(fā)明將在雞的育種中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號C12Q1/68GK1900316SQ20061008880
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月18日
發(fā)明者楊寧, 吳桂琴 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)