專利名稱：利用金磁微粒分離mRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用金磁微粒分離mRNA 的方法。
技術(shù)背景從組織或細(xì)胞中分離mRNA，是分子生物學(xué)、遺傳工程領(lǐng)域的一項基本 技術(shù)。典型哺乳動物一個細(xì)胞中只有大約10 pg的RNA，而mRNA則僅占 總RNA的1一5X。常用的mRNA的分離方法有(1) oligo(dT)—纖維素柱 層析法，基于oligo(dT) —纖維素親和色譜柱對PolyA+ mRNA的專一吸附， 然后經(jīng)洗脫緩沖液洗脫獲得PolyA+mRNA。 (2) oligo(dT)—纖維素液相離心 法，即用oligo(dT) —纖維素直接加人到總的RNA溶液中使PolyA+mRNA與 oligo(dT)—纖維素結(jié)合，離心收集寡聚(dT)—纖維素/mRNA復(fù)合物，再用洗 脫液分離mRNA，然后離心除去oligo(dT)—纖維素。這兩種方法的過程均比 較復(fù)雜，費時、費力。目前mRNA分離試劑盒多基于親和色譜法原理，這 些試劑盒的主要特點是用微粒狀的digo(dT)吸附劑代替纖維狀的oligo(dT) 纖維素，用旋轉(zhuǎn)柱法取代統(tǒng)的柱色譜法。應(yīng)用親和色譜法進(jìn)行mRNA分離 時，仍存在親和柱流速慢、易堵塞、mRNA產(chǎn)量低，容易發(fā)生非特異性偈連 等缺點。磁性復(fù)合微粒，以超順磁性納米微粒與有機(jī)或無機(jī)材料，通過包覆、交 聯(lián)、修飾而制備的納米級或微米級復(fù)合微粒。磁性復(fù)合微粒具有超順磁性、 較大的比表面積、良好的生物相容性、豐富的表面功能基團(tuán)及其他熒光、發(fā) 光等理化特性，因而被廣泛應(yīng)用于生物分子標(biāo)記、生物分離、生物檢測、靶向治療等領(lǐng)域。利用磁性微粒分離mRNA的研究和應(yīng)用也非?；钴S，其原理為將 oligo(dT)偶聯(lián)于磁粒上,基于mRNA的PolyA尾巴與之相配對的原理,使 mRNA結(jié)合于磁粒上，通過外加磁場將攜帶有mRNA的磁粒與體系中的鴦質(zhì) 分離，最后將mRNA從磁粒上洗脫下來。Invitrogen、 Promega等國外公司已 有相應(yīng)mRNA分離產(chǎn)品上市，但其價格昂貴，不利于一般實驗室的普遍使用。組裝型磁性復(fù)合微粒和核/殼型超順磁性復(fù)合微粒的制備方法以及結(jié)構(gòu) 組成已經(jīng)在中國專利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分別進(jìn)行了公開，但 其應(yīng)用中主要包括分子固定以及相關(guān)檢測的內(nèi)容，未涉及到對mRNA進(jìn)行 分離的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用金磁微粒作為反應(yīng)和分離的固相載體，提供一種成本低廉、 簡便、快捷的分離mRNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明為一種利用金磁微粒分離mRNA的方 法，其特殊之處在于該方法包括以下步驟1) 鏈親和素一金磁微粒的制備；1.1)取金磁微粒，以偶聯(lián)緩沖液平衡1 3次，按20 50(Hig/ (mg磁 粒)的比例加入鏈親和素，在20 4(TC的條件下充分混勻，反應(yīng)5min 2h， 用清洗緩沖液清洗，除去未結(jié)合的鏈親和素，加入保存緩沖液保存?zhèn)溆茫?) 將生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針和鏈親和素一金磁微?；旌希ㄟ^鏈 ，親和素-生物素的結(jié)合，將生物素化的oligo(dT)探針固定于磁粒表面，作為 反應(yīng)和分離的固相載體；2.1)取鏈親和素一金磁微粒，以偶聯(lián)緩沖液平衡1 3 欠，按0.5 6nmo1/ (mg磁粒)加入生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針，在20 4(TC的條件下充分混 勻，反應(yīng)5min 2h，用清洗緩沖液清洗，除去未結(jié)合的探針；2.3)加入封閉劑在20 4(TC的條件下充分混勻，反應(yīng)30 min 12 h， 封閉磁粒，然后用清洗緩沖液充分洗滌磁粒，除去未結(jié)合的封閉劑，加入保 存緩沖液保存?zhèn)溆茫?) 將RNA溶于無核糖核酸酶(RNase)的水中，在50 70°C的條件 下放置3 15min，立即加入高鹽溶液，使高鹽終濃度達(dá)到0.1 2 M，混勻 后按10 1000 pg總RNA/ (mg磁粒)加入到用雜交緩沖液平衡的固定有 oligo(dT)探針的金磁微粒中，在20 40°C的條件下放置3 15 min，使 oligo(dT)探針和mRNApolyA發(fā)生特異性雜交，磁性分離，棄上清；
4) 加入清洗緩沖液清洗磁粒，除去雜質(zhì)；5) 加入洗脫緩沖液，洗脫mRNA;上述步驟l.l)之后還包括有步驟1.2)測定鏈親和素固定化前后在280 nm的OD值，計算鏈親和素在金 磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量。上述步驟2.1)、 2.3)之間還包括有步驟2.2)測定生物素標(biāo)記oligo(dT)探針固定化前后在260nm的OD值，計 算生物素標(biāo)記0ligo(dT)探針在鏈親和素一金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定上述步驟3)之前需對總RNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，包括電泳檢測及紫外檢上述步驟5)之后還包括步驟6):對分離后的mRNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，...包 括電泳檢測、紫外檢測及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。上述金磁微粒為核殼型金磁微?；蚪M裝型金磁微粒。上述偶聯(lián)緩沖液可以是Tris-HCl緩沖液(0.005 M 1 M， pH7.0 9.0)， 碳酸鹽緩沖液(0.005 M 1 M， pH9.0 11.0)，醋酸鹽緩沖液(0.005 M l M, pH5.6)，檸檬酸鹽緩沖液(0.005M 1 M，pH3.0 7.0)， TBS緩沖液(0.005 M 1 M， pH7.0 9.0)，STE緩沖液(0.1x 10x，pH7.0 9.0)，TE緩沖液(0.005 M l M, pH3.0 7.0)， PBS緩沖液(0.5x 10x , pH5.0 8.0)， SSC緩沖液 (0.1x 20x， pH7.0 9.0)， SSPE緩沖液(0,lx 20x， pH7.0 9.0);上述清洗緩沖液為上述偶聯(lián)緩沖液； ，上述封閉劑為含1 10%牛血清白蛋白(BSA)，賴氨酸(Lys)，乙醇胺， 小牛血清，山羊血清等動物血清的一種或多種成分的上述偶聯(lián)緩沖液；上述保存緩沖液為上述偶聯(lián)緩沖液或加入防腐劑(如0.01 0.1%的疊氮 鈉或0.01 0.1°/。的硫柳汞等)和保護(hù)劑(如0.05 1。/。BSA， 0.05 1%的動 物血清，蛋白酶抑制劑,核酸酶抑制劑等)的上述偶聯(lián)緩沖液；上述雜交緩沖液為含0.005 M 0.5 M的Tris-HCl (pH7.0 9.0)和0.03 M 1 M的NaCl的緩沖液,或10x 20x的SSC緩沖液(pH7.0 9.0);上述高鹽溶液為1 5 M的NaCl溶液；
' 上述洗脫緩沖液為0.001 M 0.1 M的TE緩沖液(pH7.0 8.0)或無核 糖核酸酶(RNase)的水。 上述步驟1)中，優(yōu)選的偶聯(lián)緩沖液是O.OlMTris-HCl (pH8.0)緩沖液； 優(yōu)選的保存緩沖液是含0.0P/oNaN3， 1% BSA的2xSTE (pH8.0)緩沖液；優(yōu)選的清洗緩沖液是2xSTE (pH8.0)緩沖液； 上述步驟2)中，優(yōu)選的偶聯(lián)緩沖液是2xSTE (pH8.0)緩沖液； , 優(yōu)選的清洗緩沖液是2xSTE (pH8.0)緩沖液；優(yōu)選的封閉劑為含3%的脫脂奶粉的0.01 MTris-HCl (pH8.0)緩沖液； 上述步驟3)中，優(yōu)選的雜交緩沖液是含0.01M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1M的NaCl 的緩沖液；優(yōu)選的高鹽溶液是3M的NaCl溶液； 上述步驟4)中，優(yōu)選的清洗緩沖液是2xSTE (pH8.0)緩沖液； 上述步驟5)中，優(yōu)選的洗脫緩沖液是DEPC (二乙基焦碳酸，用于滅活核糖核酸酶 、(RNase))處理水。上述步驟1.1)和2.1)中，優(yōu)選的反應(yīng)條件為在搖床中37。C, 180r/min的條件下反應(yīng)10min; 上述步驟2.3)中，優(yōu)選的反應(yīng)條件為在搖床中37。C, 180r/min的條件下反應(yīng)1 h; 上述步驟3)中，加入高鹽溶液的優(yōu)選的反應(yīng)條件為將總RNA樣品在65°C的條件下水 浴5min后立即加入高鹽溶液，使高鹽終濃度為0.3M。本發(fā)明利用金磁微粒作為分離mRNA的載體，同時利用生物素與親和 素具有高度的特異親和性進(jìn)行mRNA的分離，因此本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)探針固定化操作簡單方便，固定容量高，用較少金磁微粒即可完成
mRNA的分離，降低分離成本。本發(fā)明中采用的鏈親和素一金磁微粒的制備 過程快速、簡便，利用鏈親和素和生物素的特異結(jié)合將oligo(dT)探針固定于 金磁微粒表面，使探針的固定化操作更為省時、省力，而且對探針的固定化 容量高，是已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin的6 7倍，用較少的 金磁微粒即可完成mRNA的分離，降低分離成本。2) 整個mRNA分離過程無需離心和沉淀，操作快速簡捷，整個分^過 '程可在短時間內(nèi)完成。3) 洗脫體積小，可得到高純度、高濃度的mRNA，而且可根據(jù)后續(xù)實 驗要求調(diào)整洗脫體積，分離的mRNA可直接應(yīng)用于下游實驗。


圖1為本發(fā)明中的mRNA分離原理圖；圖2為本發(fā)明實施例1中金磁微粒固定鏈親和素前后的紫外吸收曲線； 圖3為本發(fā)明實施例2中鏈親和素一金磁微粒固定生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針前后的紫外吸收曲線；圖4為鏈親和素一金磁微粒和Dynabeads M-270 Streptavidin磁性#粒'對生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針固定化量的比較；圖5為本發(fā)明實施例3中經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA的電泳檢測圖； 圖6為本發(fā)明實施例3中經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA的紫外檢測圖； 圖7為本發(fā)明實施例3中經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測圖。
具體實施方式
參見圖l，本發(fā)明的具體方法流程如下 1)鏈親和素一金磁微粒的制備；1.1) 取1 mg金磁微粒，用0.01MTris-HCl (pH8.0)平衡兩次，加入5(K) ^g鏈親和素，反應(yīng)體積500 nl，在搖床中37°C, 180r/min的條件下反應(yīng)20 min，反應(yīng)完畢，用2xSTE (pH8.0)緩沖液清洗三次；1.2) 紫外-可見分光光度計測定鏈親和素固定化前后及清洗后上清液在 280nm的OD值，計算鏈親和素在金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量，加 入1 ml含0.01。/。NaN3， 1% BSA的2xSTE (pH8.0)緩沖液，在4°C的條件
下保存?zhèn)溆茫?br> 2) 將生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針和鏈親和素一金磁微?；旌?，通i^鏈 親和素一生物素的結(jié)合，將生物素化oligo(dT)探針固定于磁粒表面，作為反 應(yīng)和分離的固相載體；
2.1) 取1 mg包被鏈親和素的金磁微粒，以2xSTE (pH8.0)緩沖液平 衡三次，磁性分離后，加入3.5nmol生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針，在搖床中 37°C,180 r/min的條件下反應(yīng)10 min;
2.2) 反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，以2xSTE (pH8.0)緩沖液充分洗滌，測 定生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針在固定化前后以及清洗后上清液在260 nm的 OD值，計算生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針在金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定
2.3) 用含3%的脫脂奶粉的0.01M Tris-HCi (pH8.0)緩沖液在搖床中 '37°C， 180 r/min的條件下反應(yīng)1 h封閉磁粒，然后用2xSTE (pH8.0)充分 洗滌磁粒三次，加入終濃度0.1XDEPC，在搖床中37。C、 180r/min的條 件下振蕩lh后，在4X:的條件下保存?zhèn)溆谩?br> 3) 對RNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，包括電泳檢測及紫外檢測，將達(dá)到實驗標(biāo)準(zhǔn) 的RNA用于以下操作。
以下步驟適用于500 ng偶連有oligo(dT)探針的鏈親和素一金磁微粒從 100 pg總RNA中純化mRNA的實驗操作，可以按比例擴(kuò)大或縮小純化規(guī)模。
取500 pg金磁微粒于RNase-free (無核糖核酸酶)的離心管中，用含 0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的緩沖液平衡2 3次后，懸 '浮于100 ^含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的緩沖液中；將 總RNA樣品100 |ig溶于90 (il DEPC處理水中，65。C水浴后立即加入10 |il、 3 M的NaCl溶液，混勻，將處理后的總RNA溶液100 pl立即加入預(yù)處理的 金磁微粒溶液中，用移液器吹打均勻，室溫反應(yīng)5min，磁性分離，棄上清。
4) 向上步得到的金磁微粒中加入200pl2xSTE (pH8.0)緩沖液，用移 液器吹打均勻，磁性分離，棄上清。此步驟操作3次。
5) 向金磁微粒中加入100 ^的DEPC處理水或所需體積的DEPC處理 水，用移液器吹打均勻，磁性分離，上清即為純化的mRNA。
6)對分離后的mRNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，包括電泳檢測、紫外檢測，及反 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。
金磁微粒為核殼型金磁微?；蚪M裝型金磁微粒。 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明 實施例1
本實施例為本發(fā)明中鏈親和素在金磁微粒表面固定化的過程。
取1 mg金磁微粒，用0.01 MTris-HCl (pH8.0)平衡兩次，加入200 pg 鏈親和素，反應(yīng)體積500 pl。在搖床中37°C， 180 r/min的條件下反應(yīng)10 min， 反應(yīng)完畢，用2xSTE (pH8.0)緩沖液洗三次，每次500 ^1。紫外-可見分光 '光度計測定鏈親和素固定化前后及清洗后上清液在280 nm的OD值，計算 鏈親和素在金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量。加入1 ml含0.01%NaN3， P/。BSA的2xSTE (pH8.0)緩沖液，4。C保存?zhèn)溆谩?br> 金磁微粒偶聯(lián)鏈親和素前后的紫外吸收曲線如圖2所示，其中曲線1為 鏈親和素溶液的紫外吸收曲線；曲線2為和金磁微粒結(jié)合后溶液的紫外吸收 曲線；曲線3為清洗溶液的紫外吸收曲線。圖中結(jié)果表明，鏈親和素溶液在 被固定化前在280nm處具有明顯的光吸收，而固定化后及清洗后在280nm 處沒有明顯的光吸收,說明鏈親和素幾乎全部被固定在金磁微粒表面。
實施例2
' 本實施例為本發(fā)明中生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針在鏈親和素一金磁微 粒表面固定化的過程。
取250 pg鏈親和素一金磁微粒，以2xSTE緩沖液平衡三次，磁性分離， 加入150 pl生物素標(biāo)記的寡核苷酸(溶于2xSTE中，含862.5 pmol寡核苷 酸)，在搖床中37。C， 120r/min的條件下反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束后，磁性分 離，以2xSTE緩沖液充分洗滌，測定固定化前后以及清洗后上清液在260 nm 的OD值，計算生物素標(biāo)記寡核苷酸在金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量。
鏈親和素一金磁微粒固定生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針前后的紫外吸收 曲線如圖3所示，曲線1為生物素標(biāo)記寡核苷酸溶液的紫外吸收曲線；曲線 '2為和鏈親和素一金磁微粒結(jié)合后的剩余溶液的紫外吸收曲線；曲線3為清 洗溶液的紫外吸收曲線。圖中結(jié)果表明，生物素標(biāo)記寡核苷酸探針溶液在被
ii
固定化前在260nm處具有明顯的光吸收，而固定化后及清洗后在260nrn處 沒有明顯的光吸收，說明生物素標(biāo)記寡核苷酸探針幾乎全部被固定在鏈親和 素一金磁微粒表面；
鏈親和素一金磁微粒和已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin磁性 微粒對生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針偶聯(lián)量的比較結(jié)果如圖4所示，其中區(qū)塊 ,1為Dynabeads M-270 Streptavidin的偶聯(lián)量，區(qū)塊2為鏈親和素一金磁微粒 的偶聯(lián)量。圖中結(jié)果表明，鏈親和素一金磁微粒對生物素標(biāo)記的寡核苷酸探 針的固定化容量是已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin磁性微粒的 6 7倍。
本實施例為本發(fā)明中偶連有oligo(dT)探針的鏈親和素一金磁微粒純化 mRNA的過程。
以下步驟適用于500 偶連有oligo(dT)探針的鏈親和素一金磁微粒 (以下簡稱金磁微粒)從100 pg總RNA中純化mRNA的實驗操作，可以
.按比例擴(kuò)大或縮小純化規(guī)模。 1、金磁微粒的預(yù)處理
1.1將金磁微粒搖勻后，用移液器移取500 ^于RNase-free的離心管中， 將離心管置于磁性分離器中磁性分離2 min，在磁性分離器上用移液器移取 上清棄去；
1.2將200 pi含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的緩沖液 加入上步的金磁微粒中，輕搖重懸磁粒，磁性分離，棄上清，此步驟操作2
1.3加入100 pi含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的緩沖
液，輕搖重懸磁粒，備用； 2、 mRNA純化
2.1總RNA樣品溶于90 |nl的DEPC處理水中，放入65 。C水浴5 min; 2.2取出離心管，立即加入10pl的3M的NaCl溶液，混勻； _ 2.3將處理后的總RNA溶液100 pl立即加入步驟1.3預(yù)處理的金磁微粒 溶液中，用移液器吹打均勻，室溫反應(yīng)5min，磁性分離，棄上清。
實施例3
2.4向上步得到的金磁微粒中加入200 pl的2xSTE (pH8.0)緩沖液， 用移液器吹打均勻，磁性分離，棄上清，此步驟操作3次； . 2.5向金磁微粒中加入100 ^的DEPC處理水或所需體積的DEPC處理 水，用移液器吹打均勻，磁性分離，上清即為純化的mRNA。
經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA經(jīng)電泳檢測的結(jié)果如圖5所示，圖中可 清楚的看到一抹被純化的mRNA條帶；
經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA的紫外檢測結(jié)果如圖6所示，圖中結(jié)果 表明，被純化mRNA在260nm處具有明顯的光吸收，從100pg總RNA中 可純化獲得2 pg左右的mRNA;
經(jīng)金磁微粒純化獲得的mRNA經(jīng)RT-PCR檢測的結(jié)果如圖7所示，圖中 結(jié)果表明，以純化mRNA為摸板，經(jīng)過RT-PCR， (3-actin基因被很好的擴(kuò)增 出來，說明純化的mRNA具有良好的完整性及反轉(zhuǎn)錄活性，可直接應(yīng)用于 下游實驗。
金磁微粒是指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面 包覆單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復(fù)合微粒，也指以磁性納米粒子或 磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的 磁性復(fù)合微粒。所述磁性納米粒子包括Fe304、 Y-Fe203等鐵的氧化物粒子， 單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子；磁性 納米粒子的聚集體是指經(jīng)修飾后形成的Fe304、 Y - Fe203等鐵的氧化物粒子 聚集體，經(jīng)修飾后形成的單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子聚集體，或經(jīng)修飾后形成的 .Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
權(quán)利要求
1、一種利用金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)鏈親和素-金磁微粒的制備；1.1)取金磁微粒，以偶聯(lián)緩沖液平衡1～3次，按20～500μg/(mg磁粒)的比例加入鏈親和素，在20～40℃的條件下充分混勻，反應(yīng)5min～2h，用清洗緩沖液清洗，除去未結(jié)合的鏈親和素，加入保存緩沖液保存?zhèn)溆茫?)將生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針和鏈親和素-金磁微粒混合，通過鏈親和素-生物素的結(jié)合，將生物素化的oligo(dT)探針固定于磁粒表面，作為反應(yīng)和分離的固相載體；2.1)取鏈親和素-金磁微粒，以偶聯(lián)緩沖液平衡1～3次，按0.5～6nmol/(mg磁粒)加入生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針，在20～40℃的條件下充分混勻，反應(yīng)5min～2h，用清洗緩沖液清洗，除去未結(jié)合的oligo(dT)探針；2.3)加入封閉劑在20～40℃的條件下充分混勻，反應(yīng)30min～12h，封閉磁粒，然后用清洗緩沖液充分洗滌磁粒，除去未結(jié)合的封閉劑，加入保存緩沖液保存?zhèn)溆茫?)將RNA溶于無核糖核酸酶的水中，在50～70℃的條件下放置3～15min，立即加入高鹽溶液，使鹽終濃度達(dá)到0.1～2M，混勻后按10～1000μg總RNA/(mg磁粒)加入到用雜交緩沖液平衡的固定有oligo(dT)探針的金磁微粒中，在20～40℃的條件下放置3～15min，使oligo(dT)探針和mRNA polyA發(fā)生特異性雜交，磁性分離，棄上清；4)加入清洗緩沖液清洗磁粒，除去雜質(zhì)；5)加入洗脫緩沖液，洗脫mRNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于 所述步驟l.l)之后還包括有步驟1.2) 測定鏈親和素固定化前后在280 nm的OD值，計算鏈親和素在金 !^微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于 所述步驟2.1)、 2.3)之間還包括有步驟2.2)測定生物素標(biāo)記oligo(dT)探針固定化前后在260nm的OD值，計 算生物素標(biāo)記oligo(dT)探針在金磁微粒表面的偶聯(lián)效率及固定化量。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于 所述步驟3)之前需對總RNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，包括電泳檢測及紫外檢測。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于所 述步驟5)之后還包括步驟6):對分離后的mRNA進(jìn)行質(zhì)控實驗，包括電泳 檢測、紫外檢測及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一權(quán)利要求所述的金磁微粒分離mRNA的方 法，其特征在于所述金磁微粒為核殼型金磁微?；蚪M裝型金磁微粒。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于-所述偶聯(lián)緩沖液可以是0.005 M 1 M， pH7.0 9.0的Tris-HCl緩沖液，0.005 M 1M， pH9.0 11.0的碳酸鹽緩沖液，0.005 M 1M， pH5.6的醋酸鹽緩 沖液，0.005 M 1 M，pH3.0 7.0的檸檬酸鹽緩沖液，0.005 M 1 M，pH7.0 9.0的TBS緩沖液，0.1x 10x， pH7.0 9.0的STE緩沖液，0.005 M 1M， pH3.0 7.0的TE緩沖液，0.5x 10x ， pH5.0 8.0的PBS緩沖液，0.1x 20x, pH7.0 9.0的SSC緩沖液，0.1x 20x， pH7.0 9.0的SSPE緩沖液;所述清洗緩沖液為上述偶聯(lián)緩沖液；所述封閉劑為含1 10%牛血清白蛋白，賴氨酸，乙醇胺，小牛血清，-山羊血清等動物血清的一種或多種成分的上述偶聯(lián)緩沖液；所述保存緩沖液為上述偶聯(lián)緩沖液或加入防腐劑0.01 0.1%的疊氮鈉 或0.01 0.1°/。的硫柳汞和保護(hù)劑0.05 1% BSA， 0.05 1%的動物血清，蛋 白酶抑制劑，核糖核酸酶抑制劑的上述偶聯(lián)緩沖液；所述雜交緩沖液為含0.005 M 0.5 M、 pH7.0 9.0的Tris-HCl和0.03 M 1 M的NaCl緩沖液或10x 20x， pH7.0 9.0的SSC緩沖液；所述高鹽 溶液為1 5M的NaCl溶液；所述洗脫緩沖液為0.001 M 0.1 M， pH7.0 8.0的TE緩沖液或無核糖 核酸酶的水。 -
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于 所述步驟1)中，優(yōu)選的偶聯(lián)緩沖液是0.01 M， pH8.0的Tris-HCl緩沖液； 優(yōu)選的保存緩沖液是含0.01。/。NaN3， 1Q/。BSA的pH8.0的2xSTE緩沖液；優(yōu)選的清洗緩沖液是pH8.0的2xSTE緩沖液； 所述步驟2)中，優(yōu)選的偶聯(lián)緩沖液是pH8.0的2xSTE緩沖液； 優(yōu)選的清洗緩沖液是pH8.0的2xSTE緩沖液；優(yōu)選的封閉劑為含3%的脫脂奶粉的pH8.0的0.01 MTris-HCl緩沖液； 所述步驟3)中，優(yōu)選的雜交緩沖液是含O.Ol M、 pH8.0的Tris-HCl和0.1 M的NaCl緩沖液；優(yōu)選的高鹽溶液是3M的JSfaCl溶液； 所述步驟4)中，優(yōu)選的清洗緩沖液是pH8.0的2xSTE緩沖液； 所述步驟5)中，優(yōu)選的洗脫緩沖液是DEPC處理水。
9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的金磁微粒分離mRNA的方法，其特征在于 所述步驟1.1)和2.1)中，優(yōu)選的反應(yīng)條件為在搖床中37°C， 180r/min反應(yīng)10min; 所述步驟2.3)中，優(yōu)選的反應(yīng)條件為在搖床中37。C，180r/min反應(yīng)lh; 所述步驟3)中，加入高鹽溶液的優(yōu)選的反應(yīng)條件為將總RNA樣品在65°C的條件下水 浴5min后立即加入高鹽溶液，使高鹽終濃度為0.3M。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用金磁微粒分離mRNA的方法。其技術(shù)解決方案為該方法包括以下步驟1)鏈親和素-金磁微粒的制備；2)將生物素標(biāo)記的oligo(dT)探針和鏈親和素-金磁微?；旌?，通過鏈親和素-生物素的結(jié)合，將生物素化的oligo(dT)探針固定于磁粒表面，作為反應(yīng)和分離的固相載體；3)使oligo(dT)探針和mRNA polyA發(fā)生特異性雜交，磁性分離，棄上清；4)加入清洗緩沖液清洗磁粒，除去雜質(zhì)；5)加入洗脫緩沖液，洗脫mRNA。本發(fā)明具有成本低廉、簡便、分離快捷的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/10GK101165183SQ20061010475
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者桉 于, 崔亞麗, 張戰(zhàn)鳳, 超 陳 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司