專利名稱：禽流感病毒標記疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領域，具體地，本發(fā)明涉及一種在NA基因的頸部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，更具體地，其為H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19。本發(fā)明還公開了制備所述H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗的方法和該標記疫苗在制備預防禽流感的疫苗和在禽流感流行病學監(jiān)測中的應用。
背景技術：
1.A型流感病毒的反向遺傳技術近年來，流感病毒分子生物學研究進展很快，主要表現(xiàn)在分子流行病學、流感病毒復制及其調控、流感病毒載體改造及應用、流感病毒治療與預防等領域。其中流感病毒復制及其調控機制是揭示流感病毒感染性與致病性機制，研究有效治療與預防措施的基礎，這一領域的進展得益于流感病毒反向遺傳操作技術的建立與應用。
Conzelmann的研究小組在1994年首次利用克隆的cDNA救獲了負鏈RNA病毒一狂犬病病毒(Schnell，et al，1994)。他們克隆了與病毒基因組互補的正鏈RNA(cRNA)序列的cDNA，將其置于T7 RNA聚合酶的啟動子和δ肝炎病毒核酶序列的控制之下，從而構建了重組質粒。在用表達T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒感染細胞后，將構建的重組質粒轉染真核細胞，再用蛋白表達質粒共轉染以提供病毒的轉錄復合體，這些都置于T7 RNA聚合酶的啟動子的控制之下。利用這種方法，研究人員相繼救獲了彈狀病毒科和正粘病毒科的其它成員(Baron，et al，1997；Clarke，et al，2000；Cassen，et al，2000)，并且很快促進了對基因組分節(jié)段RNA病毒救獲的研究。
Bridgen和Elliott在1996年利用Conzelmann研究小組的方法救獲了Bunyamwera病毒(Bridgen，et al，1996)，它的基因組由三個負鏈RNA片段所組成。這樣對于基因組不分節(jié)段病毒和分節(jié)段病毒的救獲，都已取得了成功。流感病毒則是一個例外，除了要由克隆的cDNA產生聚合酶蛋白和核蛋白，還要由它形成病毒的八個RNA片段，因此它的救獲存在著特殊的復雜性。
1999年Kawaoka的研究小組將編碼A/WSN/33(H1N1)病毒八個基因片段的cDNA置于人RNA聚合酶I啟動子和鼠RNA聚合酶I的終止子序列之間，進而救獲了流感病毒，終于克服了從克隆的cDNA救獲流感病毒的技術障礙(Neumann，et al，1999)。將所構建的質粒轉染293T細胞，細胞內的RNA聚合酶I轉錄產生了病毒的八個RNA片段。在最初的實驗中，同時轉染了9種結構蛋白的表達質粒。盡管要將這17種質粒(八種用于產生病毒RNA，九種用于表達蛋白)同時導入細胞，但是所救獲的病毒產量很高，在每微升培養(yǎng)細胞的上清液中可達1×107個感染性病毒粒子。最近的研究中該研究小組通過改進系統(tǒng)參數，僅僅利用12個質粒，包括八個RNA轉錄質粒和四個蛋白表達質粒(PB1、PB2、PA及NP)轉染細胞，獲得了超過1×108個病毒粒子。這主要是由于293T細胞的轉染效率高，使大量的細胞都獲得了全部12個質粒以起始病毒的復制。此外，RNA聚合酶I在生長細胞內廣泛存在，保證了所構建的質粒的復制。除了具有很高的效率以外，RNA聚合酶I系統(tǒng)非常簡單，僅僅需要DNA克隆和轉染技術，這在許多病毒學實驗室都能夠實現(xiàn)。在1999年Fodor等也報道了一種簡單的救獲流感病毒的方法，利用δ肝炎病毒的序列來替代RNA聚合酶I的終止子，保證了所產生的vRNA 3’端的真實性(Fodor，et al，1999)。
Hoffmann等在2000年對RNA聚合酶I系統(tǒng)進行了修飾，并將其命名為RNA聚合酶I/II系統(tǒng)(Hoffmann，et al，2000)。在這一系統(tǒng)中，編碼病毒基因片段的cDNA被反向克隆在RNA聚合酶I的啟動子和終止子序列之間，這一完整的轉錄單位又以正向取向置于RNA聚合酶II的啟動子(CMV啟動子)和多聚腺苷酸序列的控制之下，從而形成了一個雙向轉錄系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中RNA聚合酶I的轉錄產生了負鏈病毒vRNA，而RNA聚合酶II的轉錄則形成了正鏈病毒mRNA，所以由相同的模板既產生了vRNA，也產生了mRNA，從而不在需要構建蛋白表達質粒。這一系統(tǒng)的研究具有重要的意義，僅僅利用8個質粒就可以救獲出流感病毒，大大減少了所應用的質粒數量，這對于轉染效率低的細胞提高了病毒救獲的效率。在RNA聚合酶I/II系統(tǒng)中，病毒蛋白的表達和vRNA的合成由相同的cDNA模板來完成，所以這一系統(tǒng)不能救獲在一個或幾個基因片段上缺失或含有致死性突變的流感病毒，在這種情況下12質粒系統(tǒng)就更適合一些。總之這兩種以質粒為基礎的8質粒和12質粒反向遺傳操作系統(tǒng)為流感病毒的研究提供了有利的工具。
2.流感病毒反向遺傳技術的應用流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)最具吸引力、最有潛力的應用就是利用它進行疫苗生產。當前所采用的滅活疫苗可以有效的減輕流感所帶來的綜合癥，但是不能預防感染。目前在美國一種冷適應致弱的疫苗已經進入了臨床中試階段，和常規(guī)的滅活苗相比，它可以對兒童提供更好的保護，但是對于成年人而言兩種疫苗的效果差異不顯著(Maassab，et al，1999)。此外這種疫苗僅僅具有少數幾個氨基酸的取代，雖然在臨床實驗中它的表現(xiàn)型是穩(wěn)定的，但是一旦大規(guī)模的推廣應用仍不能避免發(fā)生毒力返強的危險。
利用RNA聚合酶I系統(tǒng)救獲流感病毒，可以在編碼病毒六個內部蛋白的基因上導入多個致弱突變，從而生產出流感病毒的疫苗株。利用反向遺傳操作系統(tǒng)已經生產出具有現(xiàn)在流行毒株HA和NA的重組病毒(Ozaki，et al，2004；Li et al，1999)。Subbarrao等人利用12質粒的反向遺傳操作系統(tǒng)，救獲了分子修飾致弱的H5N1/PR8重組病毒，其中含有香港1997年H5N1亞型禽流感病毒A/HK/491/97的HA和NA基因以及高滴度雞胚適應株A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6個內部基因(Subbarao，et al，2003)。該重組病毒的HA基因經過分子修飾去除了HA裂解位點的堿性氨基酸，從而失去了對雞和雞胚以及小鼠的高致病性，而且保持了高滴度雞胚生長性的特點，制備的滅活疫苗能夠對小鼠提供完全的保護。Chen等利用12質粒的反向遺傳操作系統(tǒng)，救獲了具有中國大陸H9N2亞型禽流感病毒的HA和NA基因和A/Puerto Rico/8/34(PR8)六個內部基因的重組病毒，所制備的疫苗具有良好的免疫原性，免疫后可以產生高水平的HI抗體，即使是用不同亞群的病毒A/Hong Kong/1073/99進行攻毒，仍能提供完全的免疫保護(Chen，et al，2003)。
流感病毒也是一種很有潛力的載體，利用它可以將外源基因導入哺乳動物的細胞。事實上，在依賴于輔助病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)中，流感病毒可以容納外源基因。對于幾個比較短的多肽，如HIV-1病毒gp120蛋白的v3環(huán)和gp41蛋白胞內域中高度保守的片段都可以插入在流感病毒HA片段的抗原位點上，從而誘導出對于外源片段的免疫反應(Li，et al，1993；Muster，et al，1994，1995)。為了表達全長的外源蛋白，可以將目的基因和流感病毒的基因進行物理連接，在這種方法中外源基因的轉錄和翻譯是作為流感病毒基因的一部分進行的(Garcia-Sastre et al，1994；Percy et al，1994)。另一種方法是將外源基因作為一個獨立的片段進行表達。Enami等在1991年救獲了編碼野生型的NS1蛋白，但不含有NS2蛋白的重組病毒(Enami，et al，1991)。在這一反向遺傳操作系統(tǒng)中，所采用的輔助病毒在NS1上含有溫度敏感性突變。所以病毒在不適宜的溫度下培養(yǎng)時，就需要九個基因片段才能進行有效的復制，這表明流感病毒在包裝時可以含有多于八個基因片段的基因組。為了保證目的基因在沒有選擇壓力的條件下可以在流感病毒的基因組中持續(xù)存在，可以對流感病毒基因的啟動子進行突變，從而導致目的基因的超量復制或轉錄。
將外源基因安全有效的導入受體細胞，可以由病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)來實現(xiàn)，在VLPs中并不包含有病毒的全部八種RNA。在這種反向遺傳操作系統(tǒng)中，編碼流感病毒蛋白基因和具有與流感病毒RNA結構類似的報告基因的表達有效的形成了流感病毒的病毒樣顆粒。Gomez-Puertas等在1999年和Neumann等在2000年利用這一系統(tǒng)，表達了病毒的所有結構蛋白和聚合酶蛋白及NP蛋白，同時將外源基因導入了受體細胞，在細胞中可以表達出聚合酶蛋白和NP蛋白，反過來又可以起始目的基因的復制和轉錄，從而使其有效的表達(Gomez-Puertas，et al，1999；Neumann，et al，2000)。因為在VLPs中不含有編碼病毒結構蛋白的vRNA，所以在基因導入后不會產生出新的子代病毒粒子，這就保證了該系統(tǒng)的安全性。此外，由于有15個HA亞型和9個NA亞型的流感病毒可供利用，就可以減輕對于流感病毒載體自身蛋白產生免疫抵抗的危險性，從而可以反復使用VLPs來導入外源基因。
利用RNA聚合酶I系統(tǒng)可以將目的突變導入流感病毒的基因組，這就為長期停滯不前的流感病毒生物學研究開辟了新的途徑，諸如病毒調控序列的特征，結構與功能關系，致病性和宿主細胞的親嗜性等，尤其是病毒致病力分子機制的研究。
3.禽流感病毒與標記疫苗禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的禽類感染和/或疾病綜合征，AIV在分類學上屬于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒屬(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)。禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒，基因組由8個單股負鏈RNA片段組成。其表面結構蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原性不同，被劃分為不同亞型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可誘導機體產生抗體介導的特異性體液免疫應答，抗HA的抗體可以通過干擾病毒與唾液酸受體的結合或者病毒囊膜與內吞體膜的融合過程從而中和病毒的感染。AIV的致病力與其表面結構蛋白HA裂解位點的氨基酸序列密切相關。低致病力AIV的HA裂解位點只有一個堿性氨基酸精氨酸(R)，這一結構決定了這些病毒感染動物后只能在呼吸系統(tǒng)內繁殖，因為只有呼吸道上皮細胞內含有一種精氨酸特異的類似胰酶的蛋白酶，可將裂解位點含單一堿性氨基酸精氨酸的HA0裂解為有活性的HA1和HA2，啟動病毒的吸附和復制周期。高致病力H5和H7亞型AIV HA裂解位點含有連續(xù)的多個堿性氨基酸殘基-RKKR-，可被體內多種細胞內廣泛存在的蛋白酶識別和裂解，因此具有廣泛的組織嗜性，一旦感染便會造成全身性擴散并導致迅速死亡。與可感染人的H1、H2、H3及H9等亞型流感病毒相比，高致病性的H5和H7亞型AIV對人類的潛在危害更為巨大，因為一旦感染人后即可能全身性擴散和迅速致死。
標記疫苗(marker vaccine)或稱之為DIVA疫苗(differentiating infected fromvaccinated animals)，就是用一種疫苗給動物免疫后，通過與之相配套的血清學檢測方法，可以將免疫動物和自然感染動物區(qū)分開來(Babiuk，et al，1999)。禽流感病毒滅活全病毒疫苗是目前世界上應用最為廣泛的疫苗，主要是因為其免疫原性強，抗原組分齊全，免疫保護時間長，但是滅活全病毒疫苗也有自身的一些缺點，尤其是影響禽流感的監(jiān)測和流行病學調查，所以只能用于禽流感暴發(fā)時的緊急免疫來減少經濟損失，而在尚無疫情發(fā)生的地方不主張免疫，因此在很大程度上限制了它的應用。正由于常規(guī)禽流感滅活疫苗的不可克服的缺點，使得開發(fā)滅活標記疫苗成為必要。
在1999-2001年意大利暴發(fā)H7N1亞型禽流感期間進行了滅活疫苗免疫來預防禽流感，但是所用的疫苗并不是同源的H7N1亞型病毒，而是用異源的巴基斯坦H7N3分離株(A/CK/Pakistan/95/H7N3)制備滅活疫苗，其目的是將其作為一種自然的標記疫苗，更準確的說是DIVA疫苗(Capua，et al，2002)。因為在疫苗中的H7亞型HA作為主要的免疫保護抗原，可以提供對H7N1亞型禽流感病毒的免疫保護，而且在疫苗中含有不同于N1亞型的N3亞型NA基因，免疫后則產生針對N3NA的抗體，而當發(fā)生H7N1亞型病毒感染時則產生N1NA抗體，借助于診斷試劑盒可以將免疫家禽和感染家禽區(qū)分開來。利用這種標記疫苗意大利有效的消滅了由H7N1亞型禽流感病毒引起的流行。但是這種策略的標記疫苗只能在病毒流行背景單一的情況下使用，如果在一個區(qū)域內病毒流行情況復雜，各種亞型禽流感病毒共存，就很難選擇出合適的作為自然標記的NA亞型，因此更好的策略是對流感病毒基因片段進行分子修飾，加入外源性的標簽，通過標簽的檢測對疫苗免疫和自然感染禽流感的家禽進行區(qū)分。

發(fā)明內容
如上所述，流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立為流感病毒疫苗研制提供了有力工具，本研究中利用這一技術，人工救獲了分子修飾致弱的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19，其HA和NA基因來源于我國分離到的第一株H5N1亞型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96，內部基因來源于高滴度雞胚適應株A/PuertoRico/8/34 (PR8)。H5N1/PR8-5B19的HA基因經過分子修飾致弱，具有低致病性禽流感病毒的HA裂解位點特征，NA基因的頸部插入了小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19作為外源標簽。該疫苗株不僅具有良好的雞胚生長特性和對雞和雞胚的低致病性，所制備的滅活疫苗可以對H5N1亞型禽流感病毒的攻擊提供完全的免疫保護，而且疫苗免疫后利用血清學方法可以區(qū)分疫苗免疫雞和自然感染雞，用于H5N1亞型禽流感病毒的防制。
因此，本發(fā)明的目的是提供以下各項1.在NA基因的頸部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其中所述鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據上述1的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其通過包括以下步驟的方法制備(1)將H5N1亞型禽流感病毒的負鏈病毒vRNA的轉錄質粒、聚合酶基因的蛋白表達質粒、HA基因轉錄質粒和插入鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的NA基因的轉錄質粒與轉染試劑混合作用；(2)將作用后的質粒和轉染試劑的混合物共轉染所述病毒復制許可的宿主細胞，培養(yǎng)轉染后的宿主細胞；(3)收獲轉染后的細胞，接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
3.根據上述2的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其中所述HA基因是人工缺失裂解位點處連續(xù)多個堿性氨基酸的突變型HA基因。
4.根據上述1的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其為H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19。
5.根據上述4的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其通過包括以下步驟的方法制備(1)將vRNA轉錄質粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS，四個聚合酶基因的蛋白表達質粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP以及分子修飾致弱的HA基因雙向轉錄質粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因雙向轉錄質粒pBD-NA-5B19與轉染試劑混合作用；(2)將作用后的質粒和轉染試劑的混合物共轉染所述病毒復制許可的宿主細胞，培養(yǎng)轉染后的宿主細胞；(3)收獲轉染后的細胞，接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株，其中優(yōu)選所述宿主細胞是293T細胞。
6.根據上述1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗在制備治療和/或預防禽流感病毒所導致的疾病的藥物中的應用。
7.根據上述1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗在禽流感流行病學監(jiān)測中的應用。
8.根據上述7的應用，其中所述禽流感流行病學監(jiān)測包括利用ELISA法檢測目標生物體內的HI抗體和5B19表位的抗體的步驟，其中所述目標生物已經被施用了所述H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
9.一種禽流感滅活疫苗，其包含根據上述1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
10.一種用于區(qū)分禽流感疫苗免疫家禽和禽流感自然感染家禽的試劑盒，其包含根據上述1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
H5N1亞型禽流感的暴發(fā)給世界養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，而且具有重要的公共衛(wèi)生學意義。疫苗免疫是防制高致病性H5N1亞型禽流感的重要技術手段，能與自然感染相區(qū)別的免疫措施對禽流感的控制和根除非常重要。本研究利用反向遺傳操作技術人工救獲了H5N1亞型重組流感病毒疫苗株H5N1/PR8-5B19，其6個內部基因來源于高滴度雞胚適應株PR8，HA和NA基因來源于我國分離的第一株H5N1亞型禽流感病毒GS/GD/1/96。通過分子修飾去除了HA基因裂解位點的多個連續(xù)堿性氨基酸，使其具備了低致病性AIV的HA基因特征，在NA基因頸部49-67位之間插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19。
H5N1/PR8-5B19疫苗株病毒接種雞胚后96小時內不致死，鼻腔和靜脈感染后對SPF雞不致病，具有高度的生物安全性。疫苗株病毒具有高度的雞胚生長特性，在接種雞胚后72小時病毒復制達到高峰，尿囊液血凝價為10.5log2。病毒在雞胚中連續(xù)傳代14次，致病力不返強，在NA基因中插入的5B19表位穩(wěn)定存在。
H5N1/PR8-5B19疫苗株具有良好的免疫原性，單次免疫后，第2周即可檢測到HI抗體，第4周時HI抗體水平達到高峰，到12周時還沒有出現(xiàn)明顯的下降；單次免疫后加強免疫一次可以明顯提高抗體水平，在高峰時HI抗體滴度可以達到11.5log2。疫苗免疫后對高致病性H5N1亞型AIV的攻擊提供完全保護，免疫雞攻毒后不發(fā)病，不死亡，不排毒。
以人工合成的5B19表位的16個氨基酸短肽作為包被抗原建立了檢測抗5B19表位抗體的間接ELISA方法。結果表明H5N1/PR8-5B19滅活疫苗單次免疫后第3周10只雞中有2只雞產生ELISA抗體，在第6周和12周時有7只雞ELISA抗體檢測陽性，而加強免疫后所有的10只雞均產生可檢測到的抗5B19抗體。
本研究首次利用以質粒為基礎的反向遺傳操作技術人工構建了H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株。滅活標記疫苗單次免疫后可以誘導高水平的HI抗體，對免疫雞提供完全的免疫保護。加強免疫后所有免疫雞血清均可檢測到針對于5B19表位的抗體。因此，H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗的應用可以區(qū)分出標記疫苗免疫雞和自然感染雞，用于H5N1高致病性禽流感的防制。


圖1.pBD載體簡圖；圖2.分子修飾致弱的HA基因雙向轉錄質粒pBD-MutHA的構建；圖3.pUC-MutHA質粒的構建和PCR鑒定；圖4.pBD-MutHA質粒PCR和酶切鑒定；圖5.pBD-MutHA載體簡圖；圖6.重組NA基因雙向轉錄質粒pBD-NA-5B19構建；圖7.pBD-NA-5B19質粒構建和PCR及酶切鑒定；圖8.pBD-NA-5B19載體簡圖；圖9.標記疫苗株神經氨酸酶活性測定；圖10.H5N1/R8-5B19病毒株的雞胚生長特性；圖11.H5N1/PR8-5B19疫苗株NA-5B19基因的遺傳穩(wěn)定性；圖12.H5N1/PR8-5B19滅活疫苗單次免疫(A)和加強免疫(B)后HI檢測；圖13.pBD載體的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)；圖14.質粒pPOLI-PB2核苷酸序列；圖15.質粒pPOLI-PB1核苷酸序列；圖16.質粒pPOLI-PA核苷酸序列；圖17.質粒pPOLI-NP核苷酸序列；
圖18.質粒pPOLI-NS核苷酸序列；圖19.質粒pPOLI-M核苷酸序列；圖20.質粒pcDNA-PB2核苷酸序列；圖21.質粒pcDNA-PB1核苷酸序列；圖22.質粒pcDNA-PA核苷酸序列；圖23.質粒pcDNA-NP核苷酸序列；圖24.質粒pBD-NA核苷酸序列(SEQ ID NO.3)；圖25.H5N1/PR8-5B19病毒分子修飾致弱HA基因MutHA(SEQ ID NO.4)；圖26.H5N1/PR8-5B19病毒分析修飾NA基因NA-5B19。
具體實施例方式
下文將參考實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權利要求具體限定。
實施例1 分子致弱的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19的生產1材料與方法1.1 病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GS/GD/1/96)(購自哈爾濱獸醫(yī)研究所)1.2 SPF雞和SPF雞胚9-11日齡SPF雞胚和4-8周齡SPF雞購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。所有SPF雞試驗均在負壓隔離器中進行。
1.3 質粒載體及轉染質粒pBD載體(圖譜見圖1)(Zejun Li，Hualan Chen，Peirong Jiao，Guohua Deng，GuobinTian，Yanbing Li，Erich Hoffmann，Robert G.Webster，Yumiko Matsuoka，and KangzhenYu.Molecular Basis of Replication of Duck H5N1 Influenza Viruses in a Mammalian MouseModel.J.Virol.7912058-12064.)由陳化蘭博士構建，將單向轉錄質粒載體pPolIsapIRib(Pleschka，S.，R.Jaskunas，O.G.Engelhardt，T.Zurcher，P.Palese，and A.Garcia-Sastre.1996.A plasmid-based reverse genetics system for influenza。A virus.J.Virol.704188-4192.)中包含聚合酶I啟動子-SapI克隆位點-鼠源核酶序列的XbaI酶切片段，反向插入pCI(Promega)質粒的XbaI位點，形成RNA聚合酶II啟動子(CMV)→病毒RNA轉錄終止信號序列Rib→流感病毒基因組cDNA(5’→3’)→人RNA聚合酶I啟動子→mRNA轉錄終止PolyA信號序列(SV40)構成的雙向轉錄表達質粒載體，利用該載體可同時轉錄出流感病毒負鏈vRNA和正鏈mRNA。
本研究中利用了經過修飾后的12質粒反向遺傳操作系統(tǒng)，其中六個內部基因的vRNA轉錄質粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS和四個聚合酶基因的蛋白表達質粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP(序列分別見后附附圖)均來自于人源流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(A/RR/8/34)，是由美國聯(lián)邦疾病控制中心的Kanta Subbarao博士惠贈(Subbarao，K.，Chen，H.，Swayne，D.，Mingay，L.，F(xiàn)odor，E.，Brownlee，G.，Xu，X.，Lu，X.，Katz，J.，Cox，N.，Matsuoka，Y.Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virusvaccine candidate generated by plasmid-based genetics.Virology 2003，305(1)192-200)。分子修飾致弱的HA基因雙向轉錄質粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因雙向轉錄質粒pBD-NA-5B19在本研究中構建，來源于我國第一株H5N1亞型禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GS/GD/1/96)，其中pBD-NA-5B19是在pBD-NA(序列見附圖)(Zejun Li，Yongping Jiang，Zhigao Bu，Guobin Tian，F(xiàn)engiu Zhao，AiqingWang.Kangzhen Yu and Hualan Chen.The NS1 gene contributes to the virulence and hostrange of H5N1 avian influenza viruses in chickens.Accepted by J.Virol.)(李澤君博士提供)基礎上構建而來。
1.4 主要試劑和儀器DNA Polymerase I Kleonw大片段，T4 DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，內切酶SapI，，XhoI，NotI，購自NEB公司，NsiI購自MBI公司(立陶宛)，EcoRI，XbaI，HindIII，BamHI，dATP，dGTP，dCTP和dTTP，r-Taq DNA聚合酶購于大連寶生物工程有限公司。RNA提取試劑Trizol LS，鼠源反轉錄酶(MLV)試劑盒，DTT，RNaseOUT和Pfx高保真DNA聚合酶，轉染試劑盒Lipofectamine 2000， 無血清培養(yǎng)基Opti-MEM購自Invitrogen公司。膠回收試劑盒與小量質?；厥赵噭┖匈徸陨虾ＨA舜生物工程有限公司。測序反應試劑盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)購自BECKMAN公司。轉染質粒提取試劑盒(Perfectprep Plasmid Mini)購自Eppendorf公司(美國)。
ELISA實驗中所用到的45％明膠和HRP標記的兔抗雞二抗購自Sigma公司，5B19多肽由上海生工生物工程有限公司合成純化，OPD(o-Phenylenediamine，鄰苯二胺)購自上海華舜生物工程有限公司。96孔酶標反應板購自Orange公司。酶標儀Model 680Microplate Reader購自BIO-RAD公司。
1.5 病毒RNA提取、反轉錄和PCRGS/GD/1/96種毒105稀釋接種9-10日齡SPF雞胚后收集24-36小時內的死胚尿囊液，進行RNA提取與反轉錄，產生病毒的cDNA(取250μl病毒尿囊液，加入750μl TrizolLS裂解液，混勻，室溫作用10分鐘，在加入200μl氯仿，混勻，室溫放置5分鐘，12000g、4℃離心15分鐘，轉移上清至新的離心管中，加500μl的異丙醇沉淀，室溫放置10分鐘。12000g離心10分鐘后棄上清，沉淀真空干燥后，重懸于DEPC處理水。RNA提取出來以后，反轉錄按鼠源反轉錄酶(MLV)試劑盒說明加入各成分(反轉錄引物序列為5’AGC AAA AGC AGG3’)，37℃反應2-3h，直接用于PCR。)。PCR是在Pfx高保真DNA聚合酶作用下進行，按試劑盒說明書加入各成分，94℃變性5min，進入以下循環(huán)，變性94℃1min，退火根據引物不同在52-65℃之間，時間為1min，延伸68℃2-3min，共35個循環(huán)，72℃延伸10min。
1.6 序列測定在PCR管中分別將PCR鑒定陽性質粒和適量ddH2O混合，96℃加熱預變性3分鐘，自然涼到室溫后加入測序引物(5pmol/μl)和DTCS Quick Start Master Mix 2μl，混勻后進行測序PCR反應，PCR反應程序為96℃20sec、50℃20sec、60℃4min，35個循環(huán)，最后保持在4℃。PCR反應完成后加入2.5ul的反應終止液(3M PH5.2的NaOAC 2ul，100mM PH8.0的EDTA 2ul，20mg/ml的Glycogen 1ul，即用即配)終止反應，然后加入30ul 95％冰乙醇沉淀DNA，混勻，4℃、12000rpm立即離心20min。小心倒掉上清后，用100-200ul 70％冰乙醇兩次洗脫殘留的鹽，4℃、12000rpm離心5min。真空抽干或室溫晾干DNA后，用30ul甲酰胺充分溶解DNA沉淀，小心加入CEQ樣品板孔內，最后加一滴石蠟油到樣品板孔內。隨即采用雙脫氧鏈終止法在BechmanCEQ8000測序儀(Bechman，America)上對克隆重組質粒進行測序，之后利用DNASTAR軟件(DNASTAR.Inc.)將得到的序列進行分析。
1.7 引物實驗中所用到的引物包括pBD-MutHA和pBD-NA-5B19雙向轉錄質粒構建過程中所用到的引物，由上海博亞生物工程有限公司合成。具體見表1。
表1 轉染質粒構建所用到的引物

1.8 HA和NA轉染質粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19的構建1.8.1 雙向轉錄質粒pBD-MutHA的構建以GS/GD/1/96病毒的cDNA為模板，以兩對引物HA1-F1/HA1-R1和HA2-F1/HA2-R1分別進行PCR反應，擴增出HA1和HA2片段，目的是去除HA裂解位點的多個連續(xù)堿性氨基酸，使其獲得低致病性禽流感病毒的HA基因特征。取5ulPCR產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢查擴增結果，然后對于兩個基因片段HA1和HA2分別用小量膠回收試劑盒回收。
HA1和HA2片段回收后，對于HA1片段用BamHI和XhoI進行雙酶切，HA2片段用XhoI和Hind III酶切，并對pUC18(購自寶生物技術工程(大連)有限公司)用BamH I和Hind III進行雙酶切。然后將經過酶切的HA1，HA2兩片段和pUC18載體以3∶3∶1的比例混合，16℃，用T4 DNA連接酶作用16h，然后按常規(guī)方法轉化JM109感受態(tài)大腸桿菌，挑菌，提質粒，進行電泳，以引物HAF1/HAR1進行PCR鑒定。鑒定為陽性的質粒用小量質粒提取試劑盒提取質粒后溶于50μL的滅菌去離子水中，用于測序反應。
對于PCR鑒定陽性和測序正確的陽性質粒pUC-MutHA，以引物MutHAF1/MutHAR1進行PCR，此引物與HA基因的5’和3’末端序列完全吻合外，上游引物5’端增加兩個堿基CC，下游引物5’端增加TT。PCR產物在dCTP和dTTP存在下用T4 DNA聚合酶12℃處理30min，75℃20min使酶失活，膠回收試劑盒回收用于連接反應。
pBD載體用SapI酶在37℃下酶切作用3h，用膠回收試劑盒回收，然后在dGTP和dATP存在的條件下用DNA Polymerase I Kleonw大片段于25℃作用25min，75℃20min使酶失活，膠回收試劑盒回收，備用。
PCR產物和pBD載體處理好以后，按照1∶3-1∶6的比例混合，16℃，用T4 DNA連接酶作用16h，轉化JM109感受態(tài)細胞，挑菌，提質粒，進行電泳，以引物HAF1/HAR1進行PCR鑒定。鑒定為陽性的質粒用小量質粒提取試劑盒提取質粒后溶于50μL的滅菌去離子水中，用于測序反應。
1.8.2 含有鼠肝炎病毒(MHV)5B19表位的雙向轉錄質粒pBD-NA-5B19構建GS/GD/1/96的NA基因在頸部不存在缺失，為了構建帶有外源標簽的重組NA基因，我們將鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis virus，MHV)S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19插入NA基因頸部，以替換野生型NA基因頸部的49-67位氨基酸。5B19表位的氨基酸序列為“SPLLGCIGSTCAEDGN”，核苷酸序列為5’-AGT CCC CTG CTG GGA TGCATC GGC TCC ACC TGT GCC GAG GAC GGC AAC-3’。
以NA基因雙向轉錄質粒pBD-NA為模板，利用兩對引物NA-5B19-F1/NA-5B19-R1和NA-5B19-F2/NA-5B19-R2進行PCR，分別擴增含有部分5B19表位的核苷酸片段Fragment1和Fragment2。F1/R1的PCR產物全長應為306bp，5’端具有獨特的EcoRI位點，3’端具有獨特的NsiI位點并含有5B19表位的上游部分；F2/R2的PCR產物應為1553bp，5’端具有獨特的NsiI位點并含有5B19表位的下游部分，3’端具有獨特的NotI位點。取5ul PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢查擴增結果。
將兩個片段Fragment 1和Fragment 2的PCR產物按照膠回收(小量)試劑盒說明書操作步驟回收。Fragmentl用EcoRI和NsiI，F(xiàn)ragment 2用NsiI和NotI酶切，并對pBD-NA質粒用EcoRI和NotI進行雙酶切，然后將經過酶切的Fragment1，F(xiàn)ragment2兩片段和pBD-NA載體以3∶3∶1的比例混合，16℃，用T4 DNA連接酶作用16h，然后按常規(guī)方法轉化JM109感受態(tài)細胞，挑菌，提質粒，進行電泳，以引物Marker174U24/Marker1200L25和NAF1/NAR1進行PCR鑒定，并進行酶切鑒定。鑒定為陽性的質粒用于進行測序反應。
1.9 分子致弱的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19的救獲1.9.1 H5N1/PR8-5B19的救獲293T細胞(人胚胎腎細胞，CRL-11268，來自ATCC)先以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶中，連續(xù)傳代5代以上后傳于六孔板中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待293T細胞長至80％鋪滿時，按Lipofectamine 2000試劑盒使用說明書進行轉染。
為了人工制造H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株，利用經過修飾的12質粒反向遺傳操作系統(tǒng)。上述來源于A/PR/8/34病毒的6種單向轉錄質粒和4種蛋白表達質粒以及本研究中構建的雙向轉錄質粒pBD-MutHA和pBD-NA-5B19，每個質粒取1μg加入50μl OPTi-MEM培養(yǎng)基中充分混合均勻，同時取12μl Lipofectamine 2000轉染試劑加入250μl OPTi-MEM培養(yǎng)基中，混勻后于室溫靜置5分鐘。然后將含有轉染試劑和質粒的OPTi-MEM培養(yǎng)基混合，于室溫作用30分鐘。
待轉染試劑和質粒作用完成后，將六孔板中的細胞培養(yǎng)液吸掉，并用OPTi-MEM培養(yǎng)基洗兩次，然后每孔加入1ml的OPTi-MEM培養(yǎng)液，并將轉染試劑與質?；旌衔锛尤?93T細胞六孔板的一個孔內，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染24小時后將培養(yǎng)板中的轉染試劑換掉，然后用OPTi-MEM洗一次，以除去殘留的轉染試劑，最后加入2ml OPTi-MEM(含0.5μg/ml TPCK-Trypsin，Sigma)，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。轉染結束后將細胞吹洗下來，分散均勻后接種9-11日齡SPF雞胚，每個雞胚尿囊腔接種0.2ml轉染細胞懸液。接種后48小時收取雞胚尿囊液，以0.5％的雞紅細胞進行血凝試驗(HA)，對于有血凝價的雞胚收取尿囊液，進行病毒鑒定。
在轉染救獲H5N1/PR8-5B19病毒的同時，利用該系統(tǒng)救獲了H5N1/PR8病毒，轉染和病毒救獲過程與H5N1/PR8-5B19相同，但是所用到的NA基因雙向轉錄質粒為pBD-NA，在NA基因中不含有5B19表位。
1.9.2 H5N1/PR8-5B19病毒HA和NA基因的鑒定利用反向遺傳操作系統(tǒng)人工制造了H5N1/PR8-5B19病毒以后，需要對救獲的病毒進行鑒定，以確定所救獲病毒的HA和NA基因是否包含有所加入的分子修飾。H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒接種SPF雞胚，48h后收取雞胚尿囊液，提取病毒的RNA，然后利用流感病毒的特異性引物Uni-12(序列為5’AGC AAA AGC AGG 3’)進行反轉錄產生病毒的cDNA。利用HA和NA基因的特異性引物HAF1/HAR1和NAF1/NAR1進行PCR擴增，PCR產物經過瓊脂糖凝膠(1％)電泳鑒定后回收，然后用CEQTM DTCS-QUICK Star Kit進行PCR產物測序。
2 結果2.1 pBD-MutHA質粒構建野生型的GS/GD/1/96病毒是高致病性禽流感病毒，為了構建分子修飾致弱的疫苗株，采用PCR的方法缺失掉HA基因裂解位點的多個連續(xù)的堿性氨基酸，使其獲得低致病性禽流感病毒的HA基因特征，具體的構建策略如圖2所示。
2.1.1 pUC-MutHA質粒的構建以GS/GD/1/96病毒的cDNA為模板，利用兩對引物HA1-F1/HA1-R1和HA2-F1/HA2-R1分別進行PCR反應，擴增出HA1和HA2片段。取5ul PCR產物在1％瓊脂糖凝膠電泳上檢查擴增結果，片段HA1和HA2的大小依次分別為1078bp和752bp(見圖3)，電泳結果與預期相符。
將HA1和HA2片段回收后，對于HA1片段用BamHI和XhoI雙酶切，HA2片段用XhoI和HindIII酶切，并對pUC18用BamHI和HindIII進行雙酶切。三者酶切回收后進行連接轉化，提取質粒，以引物HAF1/HAR1進行PCR鑒定(圖3)。GS/GD/1/96的野生型HA基因全長為1778bp，經過突變以后應為1767bp，PCR電泳結果與預期一致。鑒定為陽性的質粒用小量質粒回收試劑盒提取質粒后溶于50μL的滅菌去離子水中，用于測序反應。測序結果表明，pUC-MutHA質粒中HA基因為1767bp，該質粒中插入的HA基因與野生基因不同，其HA裂解位點的氨基酸序列已由-RERRRKKR-突變?yōu)?RETR-，后者為典型的H5亞型低致病力禽流感病毒HA分子特征。而且，將靠近裂解位點的精氨酸(R)密碼子由AGA無意突變?yōu)镃GA，這樣就避免了在病毒傳代的過程中由于聚合酶蛋白的核苷酸序列復制作用(Polymerase stuttering)而重新在HA裂解位點插入新的堿性氨基酸而使毒力返強。
2.1.2 pBD-MutHA質粒構建以質粒pUC-MutHA為模板，以引物MutHAF1/MutHAR1進行PCR，擴增全長的MutHA基因。PCR產物在dCTP和dTTP存在下用T4 DNA聚合酶處理后，以膠回收試劑盒回收用于連接反應。pBD載體用SapI酶在37℃下酶切處理后用膠回收試劑盒回收，然后在dGTP和dATP存在的情況下用DNAPolymerase I Kleonw處理，膠回收試劑盒回收。PCR產物和pBD載體處理好以后，進行連接轉化，提取質粒，進行電泳，以引物HAF1/HAR1進行PCR鑒定，結果為陽性。同時進行酶切鑒定，并將酶切產物進行瓊脂糖凝膠(1％)電泳。結果，用XhoI酶切得到了1.2Kb和4.9kb的兩條帶、用XbaI酶切得到了1.5kb，0.6kb和4.0kb的條帶、用HindIII酶切時得到了線性化的6.1kb的片段，所得結果均與預期得到的pBD-MutHA的分析結果一致(圖4)。鑒定為陽性的質粒用小量質粒提取試劑盒提取質粒后溶于50μL的滅菌去離子水中，用于測序反應。測序結果表明，pBD-MutHA質粒中HA基因為1767bp(序列見附圖)，與pUC-MutHA相同，未發(fā)生突變，HA裂解位點的氨基酸序列為-RETR-，pBD-MutHA質粒簡圖見圖5。
2.2 pBD-NA-5B19質粒構建為了構建H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株，以PCR方法將MHV S2糖蛋白5B19表位的16個氨基酸插入NA基因頸部，以此作為外源標簽，具體的構建策略如圖6所示。以pBD-NA為模板，利用兩對引物NA-5B19-F1/NA-5B19-R1和NA-5B19-F2/NA-5B19-R2進行PCR，分別擴增含有部分5B19表位的核苷酸片段Fragment1和Fragment2。F1/R1的PCR產物全長應為306bp，F(xiàn)2/R2的PCR產物應為1553bp。取5ul PCR產物在進行電泳檢測，結果片段Fragment1和Fragment2的大小依次分別為0.3kb和1.5kb左右(見圖7)，與預期相符。兩片段回收后，F(xiàn)ragment1用EcoRI和NsiI，F(xiàn)ragment2用NsiI和NotI酶切，并對pBD-NA質粒用EcoRI和NotI進行雙酶切，將三者進行連接轉化，提取質粒，以引物NAF1/NAR1和Marker174U24/Marker1200L25進行PCR鑒定和酶切鑒定。結果，用BamHI酶切時得到了0.8Kb和5.0kb的兩條帶、用XbaI酶切得到了1.8kb和4.0kb的條帶、用NsiI酶切時得到了線性化的5.8kb的片段，所得結果均與預期得到的pBD-NA-5B19的分析結果一致(見圖7)，pBD-NA-5B19質粒簡圖見圖8(NA-5B19序列見附圖)。
2.3 H5N1/PR8-5B19的救獲和病毒鑒定12種質粒共同轉染293T細胞后24小時后換液，每孔補加200μl OPTI-MEM(含0.5μg/ml TPCK-Trypsin)，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。然后將轉染細胞懸液接種SPF雞胚，48小時后測定尿囊液的血凝活性。對于有血凝價的尿囊液以104稀釋后，接種SPF雞胚，48小時后收取尿囊液，提取病毒RNA，進行RT-PCR，對HA和NA基因進行序列測定，以鑒定救獲病毒的HA和NA基因中是否包含所加入的分子修飾。序列分析結果表明HA基因全長為1767bp，在HA裂解位點的氨基酸組成為-RETR-，為低致病力禽流感病毒的HA基因特征；NA基因全長為1446bp，在NA基因頸部以16個氨基酸的5B19表位替代了野生型NA基因的20個氨基酸序列，因此產生的NA基因比野生型基因少了4個氨基酸，均與預期的疫苗株病毒一致。
實施例2 H5N1/PR8-5B19疫苗株的生物學特性1.材料和方法1.1 H5N1/PR8-5B19疫苗株對雞的致病性在靜脈接種致病指數(IVPI)測定試驗中，選取2組10只6周齡SPF雞，每只雞靜脈接種0.2ml 1∶10倍稀釋的H5N1/PR8-5B19或H5N1/PR8病毒尿囊液，接種后10天內觀察發(fā)病和死亡情況，計算IVPI。
在鼻腔感染試驗中，選取2組10只6周齡SPF雞，每只雞以鼻腔途徑接種0.1ml106EID50的H5N1/PR8-5B19或H5N1/PR8病毒尿囊液。感染后1，3，5，7，9天采集喉拭子和泄殖腔拭子進行病毒分離，并觀察發(fā)病情況。感染后21天，采集血清測定血凝抑制(HI)抗體。
1.2標記疫苗株NA神經氨酸酶活性測定流感病毒的NA具有神經氨酸酶活性，作用于胎球蛋白底物，可以釋放出唾液酸，亞砷酸鹽可以終止這一酶活性。硫代巴比妥酸與游離的唾液酸以一定比例結合產生粉紅色。為了驗證插入外源表位以后對H5N1/PR8-5B19病毒的神經氨酸酶活性有無影響，利用神經氨酸酶試驗進行檢測。具體的操作步驟如下1.以PBS將H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒稀釋成107.0EID50/0.1ml的病毒劑量，在此基礎上，以0.5log10(1∶3.16)倍進行倍比稀釋，分別為原液，10-0.5，10-1，10-1.5，10-2，10-2.5，10-3，10-3.5稀釋。
2.病毒樣品50μl各個稀釋度的病毒+50μlPBS+100μl胎球蛋白；陰性對照100μlPBS+100μl胎球蛋白。樣品加好后，搖動試管，封好管口，37℃水浴16-18小時。
3.水浴后，室溫冷卻2分鐘，每管中加0.1ml過碘酸鹽溶液。震蕩試管，室溫放置20分鐘。
4.每管加1.0ml亞砷酸鹽溶液，液體呈棕色，劇烈振蕩至棕色消失，管內液體變?yōu)榘咨?br> 5.每管加2.5ml硫代巴比妥酸溶液，劇烈振蕩，快速置于試管架上沸水浴15分鐘。硫代巴比妥酸與游離的唾液酸以一定比例結合變成粉紅色。
6.冰浴冷卻試管，冷卻后離開水浴，加入warrenoff溶液5ml，蓋好管口，擰緊，200rpm離心10分鐘，小心吸取上層的丁醇相到比色杯中，在分光光度計測定549nm處的OD值。在測病毒樣品之前，以胎球蛋白陰性對照組做空白對照。
7.通過繪制NA活性曲線來判斷NA活性，橫坐標為病毒稀釋度，縱坐標為549nm處的OD值。
1.3 H5N1/PR8-5B19疫苗株的雞胚生長特性為了測定H5N1/PR8-5B19疫苗株的雞胚生長特性，選擇H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒，以每個雞胚103EID50的劑量接種9-11日齡雞胚。雞胚接種后分別在18，24，30，36，42，48，54，60，72和96小時各取10個雞胚。將每組10個雞胚尿囊液以同等比例混合后，測定尿囊液血凝價，然后繪制病毒生長曲線，觀察病毒的生長特性。
1.4 H5N1/PR8-5B19疫苗株中HA和NA的遺傳穩(wěn)定性H5N1/PR8-5B19疫苗株的HA基因經過分子修飾致弱，NA基因經過修飾插入了外源表位5B19，為了驗證經過修飾后的HA和NA基因的遺傳穩(wěn)定性，將H5N1/PR8-5B19疫苗株在SPF雞胚上進行14次傳代。為了驗證插入的5B19表位在NA基因中能否穩(wěn)定存在，是否會因為病毒傳代而發(fā)生丟失，分別選取第1，5，10，12，14代的病毒尿囊液，利用Trisol LS試劑提取病毒的RNA，以流感病毒的特異性引物Uni-12進行反轉錄產生病毒的cDNA。然后利用NA-5B19基因的特異性引物進行PCR擴增，引物序列為Marker 174U24/Marker 1200L25，然后進行電泳檢測。
2.結果2.1 H5N1/PR8-5B19疫苗株對雞的致病性以滅菌PBS將H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒尿囊液做1∶10倍稀釋后，分別測定對于6周齡SPF雞的靜脈接種致病指數(IVPI)，結果這兩株人工救獲的病毒對雞均為低致病性毒株，在感染后10天內沒有出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，也沒有死亡，IVPI為0。采集感染后21天血清，以血凝抑制試驗檢測HI抗體，結果表明所有10只雞HI抗體水平都在7-9log2之間，表明病毒在雞體內進行了復制。
H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒尿囊液分別以106EID50的病毒劑量鼻腔感染6周齡SPF雞，在感染后14天內試驗雞無異常，不發(fā)病，不死亡，采取感染后1，3，5，7，9天的喉拭子和泄殖腔拭子進行病毒分離，結果均為陰性。感染后21天，采集血清測定血凝抑制(HI)抗體，結果在每種病毒感染的10只雞中只有2只雞檢測到很低水平的HI抗體(＜3log2)。分析表明兩株病毒在鼻腔感染后不能在雞的呼吸道內復制，個別雞所產生的低水平的HI抗體是由接種病毒本身作為抗原刺激機體產生的。
2.2 標記疫苗株H5N1/PR8-5B19神經氨酸酶(NA)活性測定為了確定在NA基因頸部插入外源性的5B19表位后是否會降低H5N1/PR8-5B19疫苗株NA的神經氨酸酶活性，將H5N1/PR8和H5N1/PR8-5B19病毒稀釋至含有相同的病毒感染劑量后進行梯度稀釋檢測神經氨酸酶活性，如圖9所示。
H5N1/PR8和H5N1/PR8-5B19兩病毒的遺傳背景相同，只是在H5N1/PR8-5B19的NA基因頸部插入了外源性的MHV的5B19表位，從圖9可以看出，H5N1/PR8-5B19病毒的神經氨酸酶活性明顯低于H5N1/PR8。例如病毒稀釋度在1.5log10時，H5N1/PR8的549nm的OD值仍為1.31，而H5N1/PR8-5B19則已經降低到0.097。
2.4.3 H5N1/PR8-5B19疫苗株的雞胚生長特性H5N1/PR8-5B19病毒的神經氨酸酶活性因為在NA基因頸部插入了5B19表位而降低，為確定是否會因此而影響病毒的生長特性，進行病毒的雞胚增殖試驗。選取H5N1/PR8-5B19和H5N1/PR8病毒，分別以尿囊腔途徑接種9-11日齡雞胚，每個雞胚接種103EID50的病毒劑量。雞胚接種后分別在18，24，30，36，42，48，54，60，72和96小時各取10個雞胚，將每組10個雞胚尿囊液以同等比例混合后，測定尿囊液血凝價，繪制病毒生長曲線，結果見圖10。
H5N1/PR8-5B19以及H5N1/PR8病毒在接種雞胚后96小時內均不致死，表明兩株病毒對雞胚均為低致病性毒株。如圖10所示，H5N1/PR8在接種雞胚后18小時尿囊液沒有檢測到血凝活性，在接種后24小時尿囊液則出現(xiàn)血凝性，HA價為2log2，此后隨著病毒在雞胚中的復制，尿囊液的血凝價迅速提高，在接種雞胚后72小時生長滴度為最高，達到11 log2，在96小時尿囊液血凝價稍有下降，但仍然在10.5 log2。H5N1/PR8-5B19在接種雞胚后18小時尿囊液也沒有血凝活性，在24小時尿囊液血凝價為1 log2，隨后尿囊液的血凝價迅速提高，也在接種雞胚后72小時達到生長高峰，尿囊液血凝價為10.5log2。從總體上看，H5N1/PR8病毒在雞胚中的生長滴度要高于H5N1/PR8-5B19，但是兩者之間并不存在顯著差異。結果表明雖然H5N1/PR8-5B19 NA基因中插入了外源性的5B19表位，導致病毒的神經氨酸酶活性降低，但是標記疫苗株病毒仍然具有良好的雞胚生長特性。
2.4.4 H5N1/PR8-5B19疫苗株的遺傳穩(wěn)定性H5N1/PR8-5B19疫苗株的HA基因經過分子修飾致弱具有了低致病性禽流感病毒的HA基因裂解位點的特征，NA基因經過修飾插入了外源表位5B19，為了驗證在HA和NA基因中加入的分子修飾能否隨著病毒的傳代而穩(wěn)定存在，將H5N1/PR8-5B19疫苗株在SPF雞胚上進行連續(xù)14次傳代。在傳代過程中H5N1/PR8-5B19病毒株對雞胚始終不致死，表明HA基因的低致病力特征得到保持，沒有出現(xiàn)毒力返強的現(xiàn)象，表明該疫苗株具有高度的生物安全性。
為了驗證插入的5B19表位在NA基因中能否穩(wěn)定存在，是否會因為病毒傳代而發(fā)生丟失，分別選取第1，5，10，12，14代的病毒尿囊液，提取病毒RNA，進行RT-PCR，以NA-5B19基因的特異性引物Marker 174U24/Marker 1200L25進行PCR擴增。電泳結果如圖11所示，結果得到了長約1kb的條帶，與預期大小1051bp一致。陰性對照選擇H5N1/PR8的病毒尿囊液，PCR沒有擴增出目的大小的片段。結果表明，所插入的5B19表位能夠在H5N1/PR8-5B19病毒中穩(wěn)定存在，可以作為穩(wěn)定的外源表位標簽用于標記疫苗的生產。
實施例3 一種能夠區(qū)分H5N1/PR8-5B19標記疫苗免疫血清和非標記疫苗免疫血清或自然感染雞血清的ELISA檢測方法的初步建立1.材料與方法1.1 ELISA操作程序為了能夠利用血清學方法區(qū)分標記疫苗免疫雞和非標記疫苗免疫雞或自然感染H5N1亞型禽流感病毒的雞，建立了一種間接法的多肽酶聯(lián)免疫吸附實驗方法，具體步驟如下1.抗原包被人工合成鼠肝炎病毒5B19表位的16個氨基酸(“SPLLGCIGSTCAEDGN”)作為包被用抗原。多肽合成后，溶解于雙蒸水中，用pH9.2的碳酸鹽緩沖液將多肽稀釋成一定濃度。在酶標板的每孔內加入100μl多肽包被液，于4℃冰箱中包被16-24小時。
2.封閉抗原包被后，將酶標板中的包被液棄掉，以PBST洗液清洗三次。然后每孔加入5％的明膠100μl封閉樣品孔，于37℃濕盒中封閉2小時。
3.加入一抗血清酶標板封閉后，棄掉封閉液，用PBST洗液洗滌三次。將一抗血清以PBST做一定倍數稀釋后，每孔加入100μl，于37℃濕盒中作用90分鐘。
4.加入酶標二抗一抗血清作用結束后將其棄掉，以PBST洗液洗滌三次。然后以PBST(Phosphate Buffered Saline/Tween)將辣根過氧化物酶標記的兔抗雞抗體做1∶5000倍稀釋，每孔加入100μl，于37℃濕盒中作用90分鐘。
5.加入底物顯色二抗作用結束后將其棄掉，以PBST洗液洗滌三次。然后每孔加入100μl配制好的OPD底物。于37℃濕盒中顯色10至15分鐘。
6.終止反應顯色結束后，每孔加入50μl 2M的H28O4終止液終止反應。
7.測定光密度OD值顯色反應終止后利用酶標儀測定490nm的OD值。
1.2 抗原包被濃度和血清稀釋度試驗用包被緩沖液將人工合成的5B19多肽稀釋成2μg/100μl，1μg/100μl，0.5μg/100μl，0.25μg/100μl四個不同濃度，包被酶標反應板，每孔100μl，每個滴度兩孔，4℃過夜。用PBST將H5N1/PR8-5B19標記疫苗免疫雞血清和自然感染H5N1亞型禽流感病毒的耐過雞血清分別做1∶50，1∶100，和1∶200，1∶400倍稀釋，組成方陣?？乖煌瓿珊螅梅忾]液于37℃封閉2小時，洗滌后，加入不同稀釋度的一抗血清，37℃作用1.5小時后洗滌，然后每孔加入100μl 1∶5000稀釋的酶標二抗按照上述ELISA程序進行。同時設定不加血清對照組，以同樣的程序測定。
1.3 判定標準試驗抗原和血清稀釋度確定以后，按照所確定的方法對50份H5N1禽流感病毒試驗感染耐過雞血清和H5N1亞型非標記疫苗免疫血清進行ELISA測定，對結果進行統(tǒng)計分析。
2.結果2.5.1 抗原包被濃度和血清稀釋度的確定表2抗原最適包被濃度和血清最適稀釋度的確定

5B19多肽抗原以2-0.25μg/100μl包被反應板，血清從1∶50到1∶400倍比稀釋，酶標二抗1∶5000倍稀釋，從方陣試驗結果(表2)看，隨著血清稀釋倍數的增加和抗原包被濃度的降低，血清的OD值隨之降低，當血清稀釋度在1∶100，多肽包被濃度在1μg/100μl時，陽性血清OD值接近于1.0，陰性血清OD值＜0.2，并且陽性和陰性血清的比值(P/N)值為最高，因此此時多肽及陽性血清的稀釋度為最佳工作條件。據此，確定多肽抗原的包被濃度為1μg/100μl，血清的最佳稀釋度為1∶100。
2.5.2 判定標準的確定選取50份H5N1亞型禽流感病毒非標記疫苗免疫血清和H5N1亞型禽流感病毒實驗感染后的耐過雞血清，按照所建立的方法進行ELISA檢測，結果表明50份血清的OD值在0.123至0.267之間，樣品平均值和標準差分別為X＝0.188，SD＝0.036，得到置信區(qū)間上限X+3SD＝0.298≈0.30，將0.30作為非標記疫苗免疫雞或自然感染雞血清OD值的上限，根據統(tǒng)計學原理，當血清樣品OD值＞X+3SD時，可以在99.9％的水平上判定為陽性。因此我們得出間接ELISA判定標準，即待測樣品的OD值大于0.30為陽性，小于或等于0.30則為陰性。
實施例4 H5N1/PR8-5B19疫苗免疫試驗1.材料與方法1.1 滅活疫苗的制備將H5N1/PR8-5B19病毒尿囊液稀釋后，以尿囊腔途徑接種9-11日齡雞胚，每個雞胚接種103EID50的病毒劑量，接種后繼續(xù)孵化48小時后收取雞胚尿囊液，測定血凝價在9-11log2之間。經過1000rpm/min低速離心后去除組織和細胞碎片，取上清以0.25％的比例加入福爾馬林于4℃滅活72小時。為了驗證滅活效果，取滅活后的尿囊液接種雞胚，每個雞胚接種0.1ml，于37℃培養(yǎng)48小時后檢測接種雞胚的尿囊液血凝性，結果表明滅活后所接種雞胚尿囊液HA檢測均為陰性，說明已經滅活完全。滅活以后按照93∶7∶150(尿囊液∶吐溫∶礦物油)的比例混合，利用渦流混合器反復攪拌以達到充分乳化的目的，直至以注射器滴出時在水面上不散開為止，至此疫苗即制備完成。
1.2 疫苗免疫后HI抗體和5B19表位ELISA抗體的檢測為了確定H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗的免疫原性，以及能否通過多肽ELISA檢測方法區(qū)分出標記疫苗免疫雞和非標記疫苗免疫雞以及自然感染H5N1亞型禽流感病毒的雞，進行SPF雞的疫苗免疫試驗。將4周齡SPF雞隨機分為2組，每組10只。第一組用H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗免疫，每只雞0.4ml，經腿部分兩點肌肉注射。第二組用，H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗免疫，每只雞0.4ml，免疫兩周后，以同樣的途徑和劑量加強免疫一次。免疫后每周采集免疫血清，直至免疫后的12周，檢測HI抗體水平，同時以ELISA方法檢測免疫后3周，6周和12周針對于5B19表位的ELISA抗體。
1.3 H5N1/PR8-5B19滅活疫苗對SPF雞的免疫保護試驗為了評價H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗的免疫保護效果，選取10只4周齡SPF雞肌肉注射0.4ml滅活疫苗，同時設立10只非免疫SPF雞對照。免疫后三周，采集血清，測定HI抗體，然后以106EID50劑量的H5N1強毒GS/GD/1/96經鼻腔途徑進行攻擊，攻毒后觀察發(fā)病和死亡情況，以確定疫苗的免疫保護效果，并采集攻毒后3天的喉頭拭子和泄殖腔拭子，對于在3天內死亡的雞則采集死亡當天的拭子，棉拭子采集后在9-11日齡雞胚中進行病毒滴定。
2.結果標記疫苗免疫后HI抗體和5B19表位ELISA抗體的檢測2.1 HI抗體檢測如圖12所示，H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗以0.4ml單次免疫后，10只SPF雞免疫后一周均未檢測到HI抗體，免疫后2周所有雞均可檢測到HI抗體，HI抗體水平在免疫后4周達到高峰，為8log2左右，當檢測到免疫后的12周時HI抗體水平沒有出現(xiàn)明顯的下降，仍在7.5log2以上。第二組試驗雞免疫后第一周也沒有檢測到HI抗體，免疫后兩周時抗體水平達到5log2左右，然后以同樣的劑量加強免疫，繼續(xù)檢測到免疫后的12周，抗體水平在第一次免疫后的5周達到高峰，可以達到11.5log2，然后在高峰持續(xù)很長時間，當檢測到12周時所有雞的HI抗體水平仍然在10log2左右。上述實驗結果表明H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗具有良好的免疫原性，可以誘導產生高水平的HI抗體。
2.2 針對于5B19表位的ELISA抗體檢測表3單次免疫和加強免疫后ELISA抗體檢測

以所建立的多肽ELISA方法對單次免疫和加強免疫后3，6，和12周的免疫雞血清中針對于5B19表位的抗體進行檢測，結果如表3所示。單次免疫后3周10實驗雞只有兩只雞產生了ELISA抗體，免疫后6周和12周則有7只雞產生了ELISA抗體，到最后仍有3只雞沒有檢測到抗體。在第一次免疫后2周加強免疫的試驗組，在免疫后3周(以第一次免疫計算)有4只雞產生ELISA抗體，在免疫后的6周和12周所有的10只雞都產生了針對于5B19表位的抗體。此外和HI抗體比較，針對于5B19表位的ELISA抗體出現(xiàn)的更晚一些，在免疫后3周只有個別雞產生抗體。
2.3 標記疫苗免疫保護試驗以H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗免疫10只4周齡SPF雞，每只雞肌肉注射0.4ml滅活疫苗，同時設立10只非免疫SPF雞對照。免疫后三周，采集血清，測定HI抗體，結果H5N1/PR8-5B19滅活標記疫苗免疫三周后HI抗體可以達到8log2以上，對照組均為HI抗體陰性。然后以106EID50劑量的H5N1強毒GS/GD/1/96經鼻腔途徑進行攻擊，標記疫苗免疫雞攻毒后未出現(xiàn)任何臨床癥狀，也沒有死亡，攻毒后三天喉頭拭子和泄殖腔拭子均未分離到病毒，而對照組10只雞在攻毒后6天內全部死亡，喉頭拭子和泄殖腔拭子均分離到很高滴度的病毒。實驗結果說明標記疫苗對免疫雞提供了完全保護(表4)。
表4H5N1/PR8-5B19滅活疫苗對SPF雞的免疫保護

H5N1亞型高致病性禽流感病毒流行范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重危害，尤其是2003年底始于韓國席卷整個東南亞地區(qū)的H5N1亞型禽流感大流行更是給養(yǎng)禽業(yè)帶來了災難性的打擊。野生鳥類和鴨，鵝等水禽是流感病毒的自然宿主，流感病毒在這些宿主體內穩(wěn)定進化，并且進一步傳播給家禽(Chin，et al，2002；Webster，et al，2002)。本實驗室的研究表明H5N1亞型禽流感病毒可以在健康鴨子體內存在而不出現(xiàn)任何臨床癥狀(Chen，et al，2004)，這使得從根本上消滅禽流感病毒似乎是不可能的。因此，除了加強流行病學監(jiān)測和生物安全措施，疫苗免疫是是防制禽流感發(fā)生的主動措施和關鍵環(huán)節(jié)。
目前，在全世界范圍內，全病毒滅活油乳劑疫苗是應用最為廣泛的禽流感疫苗(Subbarao，et al，2003)。滅活疫苗安全性好，抗原組分齊全，免疫原性強，可以給免疫雞群提供良好的免疫保護。油苗的使用有效的控制了1995年墨西哥HPAI疫情的擴散和進一步蔓延(Garcia，et al，1998)。在我國，H9N2和H5N1亞型滅活疫苗也得到了廣泛的應用，為禽流感疫情的控制起到了積極作用。理想的滅活疫苗種毒株應該具備以下4方面的條件第一、良好的抗原針對性，即疫苗株病毒應該具有和流行病毒相一致的抗原性；第二、高度生物安全性，疫苗株病毒對雞和其它動物以及人不應具有致病性；第三、高度雞胚生長適應性，疫苗株應該在雞胚上有效復制，所制備的疫苗抗原含量高，可以確保免疫效果。第四、疫苗的應用不會干擾禽流感的疫情調查和流行病學監(jiān)測。
我國分離到的H5N1亞型禽流感病毒均為高致病性毒株，而且部分毒株已經獲得對哺乳動物的高致病性(Chen，et al，2004)，接種雞胚后，可以很快的致死雞胚，病毒在雞胚內很難復制達到較高的滴度，因此將其做為疫苗株既無法保證疫苗的生物安全性，也不能確保疫苗株的有效抗原量和免疫效果。從國外引進的弱毒疫苗株雖然不存在這樣的缺點，但是又缺乏和我國流行毒株一致的抗原性，所以從國外引進的標準疫苗株也不適用于作為生產防制我國禽流感疫苗的理想毒株。
因此，為了構建既具有高度的雞胚生長適應性，生物安全性和良好抗原針對性，又不會干擾流行病學監(jiān)測的H5N1亞型禽流感病毒滅活疫苗株，本研究中人工救獲了H5N1亞型重組流感病毒株H5N1/PR8-5B19，其六個內部基因來源于高滴度雞胚適應株A/Puerto Rico/8/34(PR8)(H1N1)，HA和NA基因來源于我國分離的第一株H5N1亞型禽流感病毒GS/GD/1/96。通過分子修飾去除了HA基因裂解位點的多個連續(xù)的堿性氨基酸，使其具備了低致病性禽流感病毒的HA基因特征。在NA基因的頸部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19。H5N1/PR8-5B19作為標記疫苗和一種多肽酶聯(lián)免疫吸附實驗方法結合起來可以區(qū)分標記疫苗免疫雞和自然感染雞。其理論依據是1.A/PR/8/34是最常用的內部基因供體株，借以提高重組疫苗株的生長特性目前世界上應用的人流感病毒疫苗株是三價流感病毒滅活疫苗，包括H1N1，H3N2亞型A型流感病毒，以及B型流感病毒(Subbarao，et al，2003)。其中所包括的H1N1和H3N2流感病毒都是6+2重排流感病毒，也就是具有流行毒株的兩個表面基因HA和NA，另外六個內部基因PB2，PB1，PA，NP，M，和NS則是由高滴度雞胚適應株A/PR/8/34提供。這樣所構建的重組流感病毒既具有流行毒株的主要免疫原性基因HA和NA，和流行毒株具有相一致的抗原匹配性，能夠最大限度的提供對流行毒株的免疫保護。另一方面，A/PR/8/34是多次傳代后的雞胚生長適應株，在雞胚生長后不致死，具備良好疫苗株生長滴度高的特點。A/PR/8/34的高雞胚生長特性主要是由M基因決定的(Kilbourne，et al，1969)。
2.GS/GD/1/96病毒具有和我國現(xiàn)有H5N1亞型禽流感病毒良好的抗原一致性對我國1996年以來不同時期，不同地域，不同宿主分離的大量H5亞型高致病性禽流感病毒進行了系統(tǒng)的抗原性分析，證實所有毒株在起主要免疫保護作用的HA基因上沒有發(fā)生明顯變異，與我國最早分離的鵝源GS/GD/1/96病毒株抗原性基本一致(田國彬等，2004)。
3.流感病毒HA基因是分子修飾致弱的主要靶基因H5N1亞型禽流感病毒對雞呈高致病力，對雞胚呈高致死性(Shortridge，et al，1998；Suarez，et al，1998；Subbarao，et al，1998)。9-11日齡雞胚中培養(yǎng)的病毒尿囊液是流感病毒疫苗生產的最主要方式。盡管可以通過提高雞胚的孵化溫度，延長孵化時間來提高其在雞胚上的生長性能，H5N1亞型禽流感病毒在雞胚上的生長滴度很難得到提高，不利于疫苗生產(Takada，et al，1999)。HA基因裂解位點具有多個連續(xù)的堿性氨基酸是禽流感病毒具有高致病性的重要決定因素和必要條件(Steinhauer，et al，1999；Taubenberger，1998)，低致病力AIV的HA裂解位點只有一個堿性氨基酸-精氨酸(R)，高致病力AIV的HA裂解位點含有連續(xù)多個堿性氨基酸。HA裂解位點的多個堿性氨基酸提高了高致病性禽流感病毒的組織嗜性，可以在機體的多個重要器官復制，因此導致感染雞的全身性和致死性疾病(Senne et al，1996)。因此疫苗設計的一個重要策略就是通過突變的方法去除HA基因裂解位點的多個堿性氨基酸，使其具有低致病力禽流感病毒的HA基因特征，所產生的流感病毒疫苗株則成為對雞胚無致死性的低致病力毒株。根據此種策略，美國學者相繼構建了1997香港H5N1亞型人流感病毒HA基因分子修飾致弱的冷適應重組病毒和雞胚高滴度適應重組病毒(Subbarao，et al，2003；Li，et al，1999)。在本研究中，將GS/GD/1/96HA基因裂解位點的RERRRKKR-突變?yōu)?RETR-，缺失了4個堿性氨基酸，并把一個賴氨酸(K)突變?yōu)樘K氨酸(T)，將靠近裂解位點的精氨酸密碼子AGA無意突變?yōu)镃GA，以避免由于聚合酶的核苷酸序列復制作用而重新在裂解位點處插入多個堿性氨基酸。這種情況見于1995年墨西哥的高致病性H5N2亞型禽流感病毒，在最初的流行中只有低致病性病毒，但隨著流行則出現(xiàn)了HPAI，經過分析，是由于在裂解位點的HA基因的RNA序列形成了發(fā)卡結構，聚合酶蛋白將核苷酸序列AAAGAA復制后插入到RNA的發(fā)卡結構而增加了兩個額外的堿性氨基酸賴氨酸(K)和精氨酸(R)，而使之突變?yōu)榫哂懈咧虏⌒郧萘鞲胁《?Garcia，et al，1996)。
4.流感病毒的NA基因是進行分子修飾構建標記疫苗株的理想基因近年來，標記疫苗在獸醫(yī)領域廣泛用于病毒性傳染病的消滅計劃，越來越得到重視。標記疫苗設計的常用策略就是通過修飾刪除疫苗株病毒中的非必需但是具有免疫原性的抗原基因。與之相配套的檢測方法的基礎就是標記疫苗免疫的動物血清中檢測不到針對于缺失抗原的抗體，而自然感染的動物血清中則含有缺失抗原的抗體，因此就可以把標記疫苗免疫的動物和自然感染的動物區(qū)分開來。這種策略已經在很多病毒疫苗的設計中得到了應用，諸如偽狂犬病病毒，牛瘟病毒，典型豬瘟病毒等(van Oirschot，et al，1996；Walsh，et al，2000；van Gennip，et al，2002；Widjojoatmodjo，et al，2000)。其中作為選擇標記的缺失抗原的重要標準就是在感染動物中該抗原能夠產生快速和持續(xù)時間長的抗體反應，而在標記疫苗免疫的動物血清中則不能檢測到針對該抗原的抗體反應。
上述策略對于流感病毒標記疫苗的設計似乎是不適用的。因為在流感病毒中HA基因是主要的免疫原性基因，是誘導保護性免疫的主要抗原成分，如果將其缺失所產生的疫苗株將隨之失去相應的免疫保護作用。對于流感病毒標記疫苗設計的一個可供選擇的方法就是將流感病毒某一基因的一部分用無關病毒的表位進行替代。流感病毒的NA基因具有這樣的優(yōu)勢，可以用外源表位替換NA基因的一部分非必須區(qū)。
5.流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)是構建良好流感病毒疫苗株的有效方法利用以質粒為基礎的反向遺傳操作系統(tǒng)是對流感病毒基因組進行修飾構建具有所需要特征疫苗株的最佳方法和有效途徑。利用這一技術，可以把一個良好疫苗株所應有的特性集于一身。所救獲的流感病毒疫苗株具有A/PR/8/34病毒的六個內部基因，和H5N1病毒株GS/GD/1/96的HA和NA基因。該疫苗株既具有高滴度雞胚生長性，又具有對雞的低致病性，對雞胚的不致死性，以及在NA基因插入了外源表位標簽可以作為標記疫苗的特性，因此也就具備了一個良好疫苗株所應該具備的各種條件。
H5N1/PR8-5B19疫苗株病毒接種后96小時內不致死雞胚，雖然在NA基因頸部插入了外源性的表位明顯降低了NA的神經氨酸酶活性，但這并沒有影響病毒在雞胚中的復制，在感染雞胚后72小時尿囊液的血凝價可以達到10.5lo2，鼻腔感染和靜脈感染后對雞不致病，病毒在雞胚傳代過程中沒有出現(xiàn)毒力返強，表明HA基因的分子修飾穩(wěn)定存在，而且在病毒傳代過程中插入NA基因頸部的MHV病毒5B19表位沒有發(fā)生缺失，作為外源性的標簽得以穩(wěn)定傳代，因此保證了其作為分子修飾致弱的標記疫苗株的各種條件。
H5N1/PR8-5B19滅活疫苗免疫后，第二周即可檢測到HI抗體，單次免疫后4周，HI抗體水平達到高峰，到免疫后的12周還沒有出現(xiàn)明顯的下降；單次免疫后加強免疫一次可以明顯提高免疫所產生的HI抗體水平，在高峰時HI抗體滴度可以達到11.5log2，并且可以在高峰期持續(xù)很長時間，這些表明H5N1/PR8-5B19滅活疫苗具有良好的免疫原性。疫苗免疫后對高致病性H5N1亞型禽流感病毒的攻擊提供完全保護，免疫雞攻毒后不發(fā)病，不死亡，而且在喉拭子和泄殖腔拭子中均未分離到病毒，保證了其作為疫苗應用的有效性。
為了區(qū)分免疫動物和感染動物，更為重要的是檢測針對于標記疫苗株5B19表位的ELISA抗體。5B19表位是鼠肝炎病毒S2糖蛋白中的優(yōu)勢B細胞表位，該表位具有很強的免疫原性(Koolen，et al，1990；Luytjes，et al，1987，1989；Talbot，et al，1984)，并且用于雞新城疫病毒標記疫苗的研究(Mebatsion，et al，2002)。
人工合成MHV 5B19表位的16個氨基酸，將其作為抗原包被ELISA板，以間接法進行ELISA實驗，檢測免疫雞血清中針對于該表位的ELISA抗體。在對陰性血清樣品進行檢測確定ELISA檢測方法的判定標準實驗中，50份陰性雞血清的ELISA檢測OD值在0.123-0.267之間，陰性值稍高?？赡艿脑蚴?，5B19抗原表位16個氨基酸中兩端的氨基酸具有非特異性，因此能夠和陰性血清中的某些成分發(fā)生非特異性結合，進一步的改進方法是只合成該表位中起核心作用的10個氨基酸“LLGCIGSTCA”，或者利用原核表達系統(tǒng)表達該表位后包被反應板進行ELISA，以此進一步優(yōu)化ELISA檢測方法。盡管如此，利用所建立的ELISA方法，可以有效區(qū)分標記疫苗免疫雞和自然感染雞或非標記疫苗免疫雞。結果表明，在標記疫苗單次免疫后的第3周有部分雞產生ELISA抗體，在第6周和12周10只雞中有7只雞ELISA抗體檢測陽性，其它3只雞沒有出現(xiàn)ELISA抗體，而且與疫苗免疫后所產生的HI抗體比較，ELISA抗體出現(xiàn)的更晚一些。究其原因可能是在疫苗株的構建中，將5B19表位插入了NA基因頸部，這一部位處于NA分子龐大的頭部的掩蓋之下，因此使得插入的表位不容易被免疫系統(tǒng)所識別。但是，當在單次免疫后以同樣的途徑和劑量加強免疫一次，在免疫后3周時4只雞產生抗體，當在6周和12周檢測時，所有的10只雞均檢測到抗體。因此對于標記疫苗的應用應該確定合理的免疫程序，并進一步確定免疫持續(xù)期，最佳免疫劑量等。此外，借助反向遺傳操作系統(tǒng)這一對流感病毒基因組進行修飾的有利工具，可以通過進一步的探索，對于流感病毒的HA和NA基因進行分子修飾，優(yōu)化外源表位插入位點，構建既不顯著影響流感病毒的復制和HA及NA的免疫保護作用，也能夠產生很強的針對外源表位抗體反應的流感病毒標記疫苗株。
結論1.利用反向遺傳操作系統(tǒng)人工構建了一株低致病力的、高度雞胚適應的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19。病毒多次傳代后毒力不返強，且其分子標記5B19序列可穩(wěn)定遺傳。
2.以人工合成的含有5B19序列的短肽為抗原，建立了抗5B19表位抗體的ELISA檢測方法。
3.H5N1/PR8-5B19滅活疫苗一次免疫SPF雞后可以誘導產生高水平的HI抗體，對H5N1亞型高致病力禽流感病毒的攻擊提供完全保護，即免疫雞不發(fā)病，不死亡，不排毒。以常規(guī)免疫劑量于初免后2周加強免疫一次，所有雞只均能產生可檢測到的抗5B19抗體。因此可以H5N1/PR8-5B19為疫苗株研制可與自然感染相鑒別的標記疫苗，用于H5N1亞型禽流感的防制。
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序列表<110>中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>禽流感病毒標記疫苗及其制備方法和應用<130>IB064088<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>1Ser Pro Leu Leu Gly Cys Ile Gly Ser Thr Cys Ala Glu Asp Gly Asn1 5 10 15<210>2<211>4550<212>DNA<213>質粒序列<400>2ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc60aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg120gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc180gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat240agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc300ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga360cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg420gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac480caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt540caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc600cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc660tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat720tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc780gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa840actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac900tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta960aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcctc gagaattcac gcgtggtacc1020tctagagtcc cattcgccat taccgagggg acggtcccct cggaatgttg cccagccggc1080gccagcgagg aggctgggac catgccggcc agaagagcca gatctggagc tgctggtgca1140gcaataaagg gagtcgggac gatggtaatg gaactaattc ggatgataaa gcgaggcatt1200
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1.在NA基因的頸部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其中所述鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其通過包括以下步驟的方法制備(1)將H5N1亞型禽流感病毒的負鏈病毒vRNA的轉錄質粒、聚合酶基因的蛋白表達質粒、HA基因轉錄質粒和插入鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的NA基因的轉錄質粒與轉染試劑混合作用；(2)將作用后的質粒和轉染試劑的混合物共轉染所述病毒復制許可的宿主細胞，培養(yǎng)轉染后的宿主細胞；(3)收獲轉染后的細胞，接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株。
3.根據權利要求2的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其中所述HA基因是人工缺失裂解位點處連續(xù)多個堿性氨基酸的突變型HA基因。
4.根據權利要求1的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其為H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8-5B19。
5.根據權利要求4的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，其通過包括以下步驟的方法制備(1)將vRNA轉錄質粒pPOLI-PB2，pPOLI-PB1，pPOLI-PA，pPOLI-NP，pPOLI-M和pPOLI-NS，四個聚合酶基因的蛋白表達質粒pcDNA-PB2，pcDNA-PB1，pcDNA-PA和pcDNA-NP以及分子修飾致弱的HA基因雙向轉錄質粒pBD-MutHA和插入外源表位的NA基因雙向轉錄質粒pBD-NA-5B19與轉染試劑混合作用；(2)將作用后的質粒和轉染試劑的混合物共轉染所述病毒復制許可的宿主細胞，培養(yǎng)轉染后的宿主細胞；(3)收獲轉染后的細胞，接種雞胚尿囊腔救獲重組病毒株，其中優(yōu)選所述宿主細胞是293T細胞。
6.根據權利要求1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗在制備治療和/或預防禽流感病毒所導致的疾病的藥物中的應用。
7.根據權利要求1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗在禽流感流行病學監(jiān)測中的應用。
8.根據權利要求7的應用，其中所述禽流感流行病學監(jiān)測包括利用ELISA法檢測目標生物體內的HI抗體和5B19表位的抗體的步驟，其中所述目標生物已經被施用了所述H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
9.一種禽流感滅活疫苗，其包含根據權利要求1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
10.一種用于區(qū)分禽流感疫苗免疫家禽和禽流感自然感染家禽的試劑盒，其包含根據權利要求1-5中任何一項的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在NA基因的頸部插入了鼠肝炎病毒S2糖蛋白的優(yōu)勢B細胞表位5B19的H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗，更具體地，其為H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗株H5N1/PR8－5B19。本發(fā)明還公開了制備所述H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗的方法和該標記疫苗在制備預防禽流感的疫苗和在禽流感流行病學監(jiān)測中的應用。
文檔編號C12N15/44GK1970081SQ200610114408
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月9日 優(yōu)先權日2006年11月9日
發(fā)明者陳化蘭, 田國彬, 姜永萍, 步志高, 于康震 申請人:中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所