專利名稱：一種培育抗逆轉基因煙草的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培育抗逆轉基因煙草的方法。
背景技術：
植物生長發(fā)育過程中的任何不適環(huán)境因素均可稱為環(huán)境脅迫，一般分為生物脅迫(如病蟲害)與非生物脅迫。后者包括水分(干旱與澇災)，溫度，鹽堿，光照，營養(yǎng)等多方面的脅迫。
環(huán)境脅迫給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的危害是世界性的，非生物脅迫，特別是干旱造成的危害尤重(Boyer JS.1982.Plant productivity and environment.Science 218443-448)，可使農(nóng)作物減產(chǎn)50％至80％。正因為如此，很多科學家都將植物非生物脅迫生物學作為研究重點，以期加速發(fā)現(xiàn)植物耐非生物脅迫的基因和分子機理，為基因工程改良農(nóng)作物耐逆性搶占制高點。
我國是農(nóng)業(yè)大國，非生物脅迫給我國農(nóng)業(yè)帶來的危害非常嚴重，其中干旱與土壤鹽堿化是限制我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的主要因素。我國可耕農(nóng)地的50％受干旱影響，即使在降水較多的華中和華南地區(qū)，由于雨量分布不均，這些地區(qū)的水稻幾乎每年在揚花的關鍵時期都受干旱的影響，直接影響產(chǎn)量，情節(jié)嚴重時甚至顆粒無收。我國北方大部分地區(qū)的降雨量偏低，加重土壤的鹽堿化，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
研究非生物脅迫生物學和分離克隆耐逆基因非常重要，全世界的植物生物學家也為此做了大量的工作，并取得很多新進展，特別在利用高等模式植物擬南芥來研究植物的耐鹽分子機理方面，使該領域的研究有了突破性的進展。專利申請?zhí)枮?00410000682.2的中國發(fā)明專利申請公開了一個擬南芥轉錄因子AtHD/START1，它與擬南芥的耐鹽性相關。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗逆轉基因煙草的方法。
本發(fā)明所提供的培育抗逆轉基因煙草的方法，是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入煙草中，篩選得到抗逆性提高的煙草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白質。
所述AtHD/START1優(yōu)選為由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質。
其中，序列表中的序列2由722個氨基酸殘基組成，自氨基末端第31位至第88位氨基酸殘基為同源盒(homeo-box)結構域，自氨基末端第236位至第457位氨基酸殘基為START結構域，在同源盒結構域和START結構域之間是亮氨酸拉鏈(自氨基末端第89位至第235位氨基酸殘基)，可能和二聚化有關，同源盒結構域主要是和DNA結合。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述同源盒結構域和START結構域之外進行取代和/或缺失和/或添加。
所述AtHD/START1基因的編碼序列優(yōu)選為序列表中的序列1。
所述植物表達載體可為現(xiàn)有的任何植物表達載體。所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子優(yōu)選為花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子或水稻肌動蛋白基因(Actin1)啟動子。如，所述AtHD/START1基因可通過植物表達載體pCB2004C導入煙草中，所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2006導入煙草中。
所述抗逆性可為抗鹽性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
所述AtHD/START1基因可用現(xiàn)有的方法構建到現(xiàn)有的植物表達載體中，可在其轉錄起始核苷酸前加上包括組成型啟動子、增強啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)育階段特異性啟動子在內的任何一種啟動子。為了便于對轉所述AtHD/START1基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(Bar基因、GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有所述AtHD/START1基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化煙草細胞或組織，并將轉化的煙草經(jīng)組織培育成植株，獲得抗逆性提高的煙草植株。
實驗證明，轉AtHD/START1基因煙草株系(轉化體)的耐旱性和耐鹽性都明顯高于對照(未轉基因煙草)株系。轉AtHD/START1基因株系的脯氨酸含量、SOD酶活性、總糖含量都明顯高于對照。脯氨酸含量和總糖含量的提高，使得植物體可以更好的調節(jié)滲透勢以保護細胞不受到干旱的脅迫，SOD是1969年McCord和Fridovich首次在牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)的。它是防御超氧陰離子自由基對細胞傷害的抗氧化酶，對于清除過氧化自由基的毒性更有著不可忽視的作用，轉化體中SOD酶活的升高表明，體內對細胞造成傷害的自由基增多，從而誘導了更多的SOD酶來清除自由基的這種傷害，轉化體中SOD酶的活性升高強度明顯大于對照，這也說明轉化體有更高的清除這種有害自由基的能力，從而保護自身的細胞少受傷害，使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害。對于這幾項指標，隨著干旱脅迫時間的延長，轉化體和對照之間的差異也越來越明顯，大量的研究認為，植物在逆境下，通過代謝反應來阻止、降低或修復由逆境造成的損傷，從而保證正常的生理活動。在植物可耐受的范圍內，逆境所造成的傷害是可逆的，當條件合適時，可以恢復正常，但如果超出植物自身修復的能力，則損傷將變成為不可逆的過程，植物會受到嚴重傷害直至死亡。脯氨酸是植物蛋白質的重要組成部分，當植物受到干旱、鹽堿等脅迫時，可作為植物的滲透劑，參與植物的滲透調節(jié)作用。另外，脯氨酸是一種高親水性物質，可防止細胞脫水，因此當植物受到水分脅迫時體內的脯氨酸會積累。植物體積累高濃度的脯氨酸，將使植物更加耐鹽。從對轉基因煙草的耐鹽性實驗中也可看出，在鹽脅迫條件下，轉化體基本可以正常生長，而對照的生長則受到非常明顯的抑制，這也和轉化體內積累了更多的脯氨酸有關。
通過氣孔的蒸騰作用失去水分是干旱耐受的一個重要決定因素，轉AtHD/START1基因株系葉片下表皮的氣孔密度和對照相比，降低了50％，氣孔密度的大幅度降低，使得植物通過蒸騰作用從葉片失去水分的效率降低，這可以大大提高植物對水分的保持能力。測定它們的光合作用指標，轉AtHD/START1基因株系的光合速率、水分利用率都大于對照株系，而蒸騰效率則低于對照株系，部分株系的這些差異都達到了顯著水平。根系的生長情況是干旱耐受的另一個重要決定因素，轉AtHD/START1基因株系根的構型同樣發(fā)生了明顯變化主根變長、側根數(shù)增加、根的生物學重量增加，說明突變體的根系更加發(fā)達，這樣可以使植株在受到干旱脅迫時能持續(xù)不斷的從土壤吸水。
此外，轉AtHD/START1基因煙草還有一個很重要的特性，即體內的K+含量比對照明顯增加，研究表明，煙草是嗜鉀作物，煙葉K+含量的增高對提高煙葉的品質有著極為重要的作用，此特性在生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟價值。


圖1為轉化體和對照PCR結果圖2為southern blot圖譜圖3a為噴除草劑一周的轉化體和對照照片圖3b為轉化體和對照的RT-PCR結果圖4a為干旱脅迫10天的轉化體和對照照片圖4b為干旱脅迫20天的轉化體和對照照片圖4c為干旱脅迫20天，復水7天的轉化體和對照照片圖4d為干旱脅迫20天，復水16天的轉化體和對照照片圖5為干旱脅迫不同時間轉化體和對照中SOD酶活性統(tǒng)計結果圖6為干旱脅迫不同時間轉化體和對照中脯氨酸含量統(tǒng)計結果圖7為干旱脅迫不同時間轉化體和對照中總糖含量統(tǒng)計結果圖8為干旱脅迫不同時間轉化體和對照中鉀離子含量統(tǒng)計結果圖9a為生長60天的轉化體和對照植株照片圖9b為生長110天的轉化體和對照植株照片圖10a為生長50天的轉化體和對照照片圖10b為移栽后不同時間的轉化體和對照每株葉片數(shù)統(tǒng)計結果圖11a為移栽不同時間轉化體和對照每株最大葉片長的統(tǒng)計結果圖11b為移栽不同時間轉化體和對照每株最大葉片寬的統(tǒng)計結果圖12為轉化體和對照果莢數(shù)統(tǒng)計結果圖13為轉化體和對照葉片下表皮氣孔比較照片圖14為轉化體和對照氣孔密度比較的統(tǒng)計結果圖15為轉化體和對照表皮細胞密度比較的統(tǒng)計結果圖16為轉化體和對照氣孔指數(shù)比較的統(tǒng)計結果圖17為轉化體和對照氣孔大小比較的統(tǒng)計結果圖18為轉化體和對照株葉片厚度比較照片圖19為對照和轉化體柵欄細胞大小比較的統(tǒng)計結果圖20為轉化體和對照光合速率比較的統(tǒng)計結果圖21為轉化體和對照蒸騰速率比較的統(tǒng)計結果圖22為轉化體和對照水分利用率比較的統(tǒng)計結果圖23為轉化體和對照氣孔導度比較的統(tǒng)計結果圖24為NaCl處理后轉化體和對照的生長情況照片圖25為NaCl處理后轉化體和對照的的葉片數(shù)統(tǒng)計結果圖26為NaCl處理后轉化體和對照的根重統(tǒng)計結果圖27為NaCl處理后轉化體和對照的根冠比統(tǒng)計結果圖28為NaCl處理后的轉化體和對照的光合速率統(tǒng)計結果的比較圖29為NaCl處理后的轉化體和對照的蒸騰速率統(tǒng)計結果的比較圖30為NaCl處理后的轉化體和對照水分利用率統(tǒng)計結果的比較圖31為NaCl處理后的轉化體和對照氣孔導度統(tǒng)計結果的比較圖32為含不同濃度NaCl的培養(yǎng)皿上轉化體和對照的萌發(fā)比較照片圖33a為100mM NaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周的轉化體和對照根長比較統(tǒng)計結果圖33b為200mM NaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周的轉化體和對照根長比較統(tǒng)計結果圖34a為pCB2006/AtHD/START1的BamHI酶切鑒定圖譜圖34b為pCB2006/AtHD/START1的EcoRI酶切鑒定圖譜圖34c為pCB2004C/AtHD/START1的BamHI酶切鑒定圖譜圖34d為pCBpCB2004C/AtHD/START1的HindIII和EcoRI雙酶切鑒定圖譜圖35為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鑒定圖譜具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、轉AtHD/START1基因煙草的培育一、轉基因表達載體的構建1、AtHD/START1的cDNA基因的獲得利用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒(Invitrogen公司，Cat.No.18080-093)從Columbia生態(tài)型擬南芥(可以從擬南芥生物資源中心ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)購得)中RT-PCR擴增得到核苷酸序列是序列表中序列1的AtHD/START1的cDNA基因，具體過程如下總量RNA的抽提采用Trizol試(INVITROGEN)，使用1微克總量RNA作為反轉錄反應的模板，d(T)25作為反轉錄的引物，每個反轉錄反應使用200單位的SUPERSCRIPT II反轉錄酶(INVITROGEN)并按照反轉錄酶產(chǎn)品使用指南進行。RT-PCR所用引物序列按照AtHD/START1基因的序列設計，其5’末端引物是5’atgagtttcgtcgtcggcgt3’，3’末端引物是5’tcaagctgtagttgaagctgt3’，PCR反應使用1微升反轉錄反應液為模板，其它完全按照Takara公司的ExTaq酶的使用指南進行，淬火溫度為56攝氏度，延伸時間為100秒，30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pMD 18-T Vector載體上，進行測序分析，測序結果表明，該PCR擴增產(chǎn)物具有序列表中序列1的核苷酸序列，是AtHD/START1的cDNA基因。
2、轉基因表達載體pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的構建(1)pCB2004C的構建pCB2004C按照如下方法構建將pCAMBIA3301(CAMBIA)用BstXI和SmaI消化，在pCAMBIA3301的BstXI和SmaI識別位點間插入由依次串聯(lián)的BstXI，SstI，DraIII(a)，AscI，AvrII，SwaI，DraIII(b)，和SmaI識別序列組成的多克隆位點片段，得到重組載體pCB2002。其中SmaI識別位點是下述兩個合成的多聚核苷酸5’AGCTCACGGGGTGGCGCGCCTAGGATTTAAATCACAAAGTGCCC3’和5’GGGCACTTTGTGATTTAAATCCTAGGCGCGCCACCCCGTGAGCTCATG3’在66℃退火60秒得到的。
將Gateway Conversion A試劑盒(Invitrogen，Gateway vector Conversion systemCat.No.11828-019)中的Conversion A通過平末端連接插入到pCB2002的SmaI和PmII識別位點之間就得到基礎載體pCB2003。
以pCAMBIA3301(CAMBIA)為模板，用引物5’GGGCACGGGGTGGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAA3’和5’GGGCACTTTGTGATTGTAAATAGTAATTGT3’PCR擴增煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子，將得到的煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子PCR產(chǎn)物用DraIII消化后，直接和用DraIII線性化后的pCB2003連接，得到質粒pCB2004。
將pCB2004使用BamHI消化后去掉氯霉素抗性基因，然后環(huán)化，得到pCB2004A。然后使用PCR引物5’-cctttggtcttctgagactgt-3’和5’-ttgagtcgtaagagactctg-3’以pSK015(Addgene Inc.質粒代號11570)為模板將4×35S增強子擴增出來，將該4×35S增強子片段使用NcoI和SacI消化后克隆至pCB2004A的NcoI和SacI之間，得到pCB2004C。
(2)pCB2006的構建以水稻的基因組DNA為模板，使用PCR引物5’-GGGCACGGGGTGTAGCTAGCATACTCGAGGTCA-3’和5’-GGGCACGTTTTGAGTAGATATCCTCGGCGTCAG-3’，PCR擴增水稻Actin 1啟動子，PCR產(chǎn)物經(jīng)DraIII消化后，與用DraIII線性化的pCB2003在T4DNA連接酶的作用下環(huán)化得到pCB2006。
(3)pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的構建將步驟1中得到的AtHD/START1基因的cDNA基因利用GatewayRBP ClonaseTMII EnzymeMix試劑盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通過GatewayTMCloning Technology重組克隆到pCB2004C或pCB2006的attR1和attR2之間，得到含有AtHD/START1基因的重組表達載體pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1。利用BamHI或EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1進行結構鑒定，結果如圖34a和34b所示，BamHI單酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小為1988bp(包括172bp Actin 1啟動子部分和1812bpAtHD/START1cDNA 5’端)片段，9757bp的pCB2006/AtHD/START1兩個BamHI位點間的載體骨架部分；EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小為2003bp的載體pCB2006/AtHD/START1兩個EcoRI位點的部分(包括878bp Actin 1啟動子部分和1125bp AtHD/START1cDNA 5’端片段)，和pCB2006/AtHD/START1兩個EcoRI位點之間的9742bp載體骨架部分。說明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2006的attR1和attR2之間。利用BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1、HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1進行結構鑒定，結果如圖34c和34d所示，BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小為3764bp的片段(包括4x35S增強子、35S啟動子和AtHD/START1cDNA的一部分)和8689bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1兩個BamHI位點之間載體骨架部分)；HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小為666bp的片段(AtHD/START1cDNA上EcoRI和HindIII位點之間的部分)，和11817bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1EcoRI和HindIII位點之間載體骨架部分)；說明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2004C的attR1和attR2之間。
圖34a中，泳道1、2、3為BamHI單酶切pCB2006/AtHD/START1的結果，M為FermentasDNA ladder(250bp-10Kb)；圖34b中，泳道1、2、3為EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)；圖34c中，泳道1、2、3為BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)；圖34d中，泳道1、2、3為HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1的結果，M為FermentasDNA ladder(250bp-10Kb)。
二、農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化1、含有pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株的制備將-70℃保存的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1涂布在LB(含慶大霉素50ug/ml)28℃培養(yǎng)活化。然后取4-5個單菌落接種于3mlLB液體培養(yǎng)基(含慶大霉素50ug/ml)過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100的體積比接種于500ml的LB液體培養(yǎng)基(含慶大霉素50ug/ml)，250rpm，28℃，培養(yǎng)至OD600＝1.0左右。5000rmp離心收集菌體，然后用預冷的等體積的無菌去離子水重懸，重復七次，最終將菌體重懸于0.5ml的10％甘油中。取10ng的pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1質粒分別與50ul根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1感受態(tài)細胞(根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1感受態(tài)細胞按照英文影印版《擬南芥實驗手冊》.Detlef Weigel andJane Glazebrook.化學工業(yè)出版社.2004年3月第1版，第1次印刷的方法制備)混合均勻后，加入到預冷的電極杯中(0.2mm，Biorad公司)。使用Agr電擊程序(所購買的儀器自帶的電擊程序，在儀器的說明書上，說明書為MicroPulserTMElectroporationApparatus Operation Instruction and Applications Guide，Catalog Number165-2100)。電擊后加入SOC培養(yǎng)基復蘇4小時后，涂布含慶大霉素50ug/ml和卡那霉素50ug/ml的LB培養(yǎng)基，28℃，培養(yǎng)兩天。取單菌落擴增AtHD/START1基因中的片段(引物序列為5’-GCAACA TGA GAG AGC AGA TAA TA-3’和5’-TCA AGA AGC AAA TCT TTC ACA CAT T-3’)進行菌落PCR驗證。PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段條帶的pCB2004C/AtHD/START1轉化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1是含有pCB2004C/AtHD/START1的菌株，命名為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1，PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段條帶的pCB2006/AtHD/START1轉化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1是含有pCB2006/AtHD/START1的菌株，命名為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006/AtHD/START1。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鑒定結果如圖35所示，泳道1-9是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2004C/AtHD/START1的PCR結果，泳道10-16是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1/pCB2006AtHD/START1的PCR結果，均得到1091bp AtHD/START1基因片段條帶，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10Kb)。
2、煙草葉片轉化及植株再生1)煙草NC89(Nicotiana Tobaccum)種子(安徽省煙草公司)用70％乙醇浸泡30sec，去乙醇，無菌水清洗一遍，用0.1％HgCl2消毒10-15min，無菌水清洗5-6遍，播種于MS0培養(yǎng)基(不含任何激素的MS)，約6-8周后取無菌苗葉片轉化；2)分別挑取根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1/pCB2004C/AtHD/START1和C58C1/pCB2006/AtHD/START1單菌落分別接種于10ml LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期(約17hr)，4℃，5000rpm，離心10min，收集菌體，用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌體至OD600至0.8-1.0，待用；3)取煙草葉片去中脈，打孔器打成0.25cm2小葉盤，將小葉盤浸入稀釋好的農(nóng)桿菌菌液，不時搖動，共培養(yǎng)10min，并做一組葉盤不經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的陰性對照；4)共培養(yǎng)結束，無菌濾紙吸去葉盤上多余的菌液，葉面向下置于MS0培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)兩天；5)暗培養(yǎng)結束，無菌水洗滌葉盤3-5次，無菌濾紙吸去水分，轉移至MS0附加6-BA0.5mg/L+NAA 2.0mg/L+谷氨酸20mg/L+羧芐青霉素400mg/L的篩選培養(yǎng)基；6)一周后，葉盤轉移至MS0附加6BA0.5mg/L+NAA2.0mg/L+谷氨酸20mg/L+羧芐青霉素400mg/L的選擇培養(yǎng)基上進行分化，7-10天繼代一次；7)3-4周后將葉盤周圍幼芽切下，移至MS0附加20mg/L谷氨酸和20mg/L除草劑草銨膦(glufosinate ammonium)的生根培養(yǎng)基生根；8)幼苗生根并長至約3-5cm高，將培養(yǎng)瓶開蓋煉苗1-2天，洗去根部植物凝膠，種植于紙袋中，保濕生長，待幼苗完全成活，移至花盆，于溫室正常生長。
結果表明轉化后的葉盤，在選擇培養(yǎng)基上生長3-4周后，50％葉盤枯黃、死亡，30％葉盤周圍在傷口處形成愈傷組織，20％葉盤周圍直接分化出芽，將直接分化出的芽轉入含20mg/L除草劑的生根培養(yǎng)基，絕大多數(shù)芽都可以在生根培養(yǎng)基生根、生長，生根的苗(T0代轉化體)長至3-5cm高時，將培養(yǎng)瓶封口膜打開，煉苗1-3天后移栽入紙筒，以防再次移栽時對根產(chǎn)生傷害，紙筒中的苗完全成活并長大后，連紙筒一同移栽至花盆，共223株，溫室生長，常規(guī)管理至成熟收種，得到T0代轉化體的種子(T1代)。
三、轉化體的鑒定1、轉化體的PCR鑒定在除草劑中生根的煙草幼苗，移栽入溫室生長3-4周，取葉片，CTAB抽提法提取轉化體(轉pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的煙草NC89)及對照(煙草NC89)的基因組DNA，用于PCR鑒定。由于轉化體的標記基因是Bar基因，引物設計根據(jù)Bar基因兩端序列進行，上下游引物分別為P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA。
PCR反應體系(50μl體系)DNA聚合酶Ex Taq(5U/μl)0.25μl，10×Ex Taqbuffer 5μl，dNTPs(四種dNTP，每種各10mM)4μl，P1(10μM)2μl，P2(10μM)2μl，基因組DNA 2μl，ddH2O 34.75μl。
PCR反應程序先95℃5min；然后94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，共40個循環(huán)；再72℃10min；最后4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
結果如圖1所示，表明轉化體可擴增出552bp的Bar基因目的條帶，而對照未擴出相應條帶，說明AtHD/START1基因確已轉入煙草。圖1中，MMarker；WT對照；其余泳道為不同轉化單株。其中，4-6、4-12、4-17、4-23、4-30和4-27中轉入的是pCB2004C/AtHD/START1，6-40和6-41中轉入的是pCB2006/AtHD/START1。
2、轉化體Southern blot分析1)除草劑上生根并移栽至溫室的幼苗，完全成活后，CTAB法提取轉化體(轉pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的煙草NC89)及對照(煙草NC89)的葉片基因組DNA，根據(jù)轉入外源基因AtHD/START1序列、Bar基因序列以及質粒本身酶切位點，選擇HindIII對煙草DNA進行酶切消化，酶切完全后，用1×TAE緩沖液，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，電壓1V/cm，電泳12-14hr；電泳結束，紫外燈下拍照記錄；2)將DNA轉移尼龍膜上，轉移后的尼龍膜，裝入雜交管，加入新配制的雜交液(雜交液的組成為SDS 7％，BSA(Casein)1％，EDTA 1mM，Na2HPO4·12H2O0.25M)10-15ml，于65℃預雜交至少6hr；3)加入變性過的放射性標記探針(該探針為Bar基因)，65℃雜交16-20hr；雜交結束，含探針的雜交液倒入指定廢液缸；4)加入100ml 2×SSC+0.1％SDS，旋緊蓋子，翻轉管子幾次，洗膜，整個操作在室溫下進行，洗后的溶液倒入盛放放射性物質的廢液缸；5)加入200ml 2×SSC+0.1％SDS，于雜交爐室溫洗膜5min，其余同4)；6)加入200ml 0.2×SSC+0.1％SDS，雜交爐室溫洗膜5min，其余同5)；7)加入200ml 0.1×SSC+0.1％SDS，雜交爐室溫洗膜5min，其余同5)；8)加入200ml 65℃預熱的0.1×SSC+0.1％SDS，65℃雜交爐中洗膜10-30min，其余同5)；9)將膜置于一塑料盒，用SURVEY METER檢測放射性強度，依放射性強度的大小，邊檢測邊用65℃預熱的0.1×SSC+0.1％SDS洗，直至合適強度。
10)洗膜結束，濾紙吸干膜上多余洗液，保鮮膜包裹尼龍膜；暗室中曝光，將膜固定在有高速增感屏的壓片夾中，-80℃超低溫冰箱放射自顯影，拍照。
其中，探針按照如下方法制備①微量離心管中配制下列反應液，95℃加熱3min，迅速置于冰中冷卻，放置5min。
模板 10ng-1μg隨機引物(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自帶) 2μldH2O直到14μl。
其中，模板是以pCB2004C為模板，用P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；和P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA得到的PCR產(chǎn)物。
②加入10×Buffer(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自帶)，dNTP Mixture(四種dNTP，每種各0.2uM/μl)2.5μl，用于標記的dCTP*2(50μCi)5μl。
③加入1μl Exo-free Klenow Fragment(2U/μl)，37℃反應60-120min；④65℃加熱5min使酶失活；⑤95℃加熱3min后迅速置于冰中冷卻；⑥取反應液直接作為探針使用。
結果如圖2所示，轉化體可以雜交出條帶，對照沒有，進一步證明煙草轉化成功。圖2中，WT對照；其余泳道為不同轉化單株。
3、轉化體和對照對除草劑的抗性鑒定取PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體的種子和對照(煙草NC89)種子播種，萌發(fā)的小苗移栽入土壤，完全成活，噴施0.2％商用除草劑glufosinateammonium，噴施的量以葉面有液滴滴下為度，噴除草劑一周后，觀察轉化體和對照的生長表型，結果表明，噴施除草劑一周后，對照葉色發(fā)黃，部分葉片完全枯死，整株植株隨后很快死亡，而轉化體(T1代)葉色濃綠，生長旺盛，完全沒有受到除草劑的影響，由此可確認轉化的成功以及將除草劑作為轉化體的篩選標記是切實可行的(圖3a)。圖3a中，上面的兩盆為轉化體，下面的兩盆為對照。圖3a只是一個轉化體株46的照片，其余六個轉化體株與4-6相同。
4、AtHD/START1基因在轉化體中的表達分析取經(jīng)步驟1的PCR鑒定和步驟2的Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體得到的T1代幼苗進行步驟3的除草劑抗性鑒定，取步驟3除草劑抗性鑒定結果為陽性的T1代幼苗對應的4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7個轉化體株系的T0代幼苗和對照幼苗(煙草NC89，在圖中以WT表示)進行RT-PCR。
在轉化體和對照營養(yǎng)生長階段，取葉片用Trizol法抽提RNA，反轉錄cDNA，進行RT-PCR，以煙草actin1作內標，檢測轉入基因在轉化體內的表達情況。
(1)Trizol試劑盒提取煙草葉片RNA1)分別取50mg生長旺盛轉化體和對照葉片，加入1ml Trizol，室溫研磨，放置5min；2)4℃，12000g，離心10min，取上清，室溫放置5min；
3)上清加入200μl氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置3min；4)4℃，12000g，離心15min，取上清并加入500μl異丙醇；5)室溫放置10min，4℃，12000g，離心10min；6)棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，7500g，離心5min；7)棄上清，沉淀晾5min，10μl DEPC-H2O溶解；8)紫外分光光度計測定A260、A280，檢查RNA質量并計算濃度，備用。
(2)RT-PCR1)向管中加入RNA 3μg、Oligod(T)2550pmol、dNTP(10mM)1μl、再加入dH2O直到14μl，混勻，65℃，5min，取出置冰上至少1min；同管中加入5×FS buffer(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒自帶，該試劑盒的商品目錄號為Cat.No.18080-093)4μl、0.1M DTT 1μl、SSRTase III(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒自帶，該試劑盒的商品目錄號為Cat.No.18080-093)1μl、至總體積20μl，50℃水浴，60min，得到cDNA的第一鏈。
2)以反轉錄得到的cDNA為模板，擴增煙草actin1，兩端引物序列為P3CAGGGTTTGCTGGAGATGATGCTC；P4TGAATGCCTGCAGCTTCCATTCC；以rTaq PCR試劑盒(Takara公司)進行PCR擴增，PCR擴增體系(總體積20μl)為rTaq(U/μl)0.1μl，10×ExTaq buffer 2μl，dNTPs(四種dNTP，每種各10mM)1.6μl，P3(10μM)2μl，P4(10μM)2μl，模板1μl，dH2O 11.3μl。PCR擴增條件先95℃3min；然后94℃30sec、68℃1min，35個循環(huán)；再72℃10min；最后4℃保存。
3)調整內標，擴增AtHD/START1基因，引物序列為P5AT GAG TTT CGT CGT CGG CGT；P6TCA CTT TAG TGC ACT ATT ATC TGC T；以rTaq PCR試劑盒(Takara公司)進行PCR擴增，PCR擴增體系除將引物替換為P5和P6外，其他同actin1的PCR擴增體系；PCR擴增條件先95℃3min；然后94℃30sec、56℃30sec、72℃30sec，40個循環(huán)；再72℃10min；最后4℃保存。
結果如圖3b所示，表明轉入的AtHD/START1基因在轉化體內均有表達，但在不同的載體中表達不同4-6、4-12、4-17、4-23和4-27中轉入的是pCB2004C/AtHD/START1，由35S啟動子啟動AtHD/START1基因轉錄；而6-40和6-41中轉入的是pCB2006/AtHD/START1，由水稻actin1啟動子啟動AtHD/START1基因轉錄，從表達情況看，以35S為啟動子的載體，其表達顯然要高于以水稻actin1為啟動子的載體。
實施例2、轉AtHD/START1基因煙草的抗旱性檢測及其生理生化特性測定將經(jīng)實施例1的PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體得到的T1代幼苗進行除草劑抗性鑒定，取除草劑抗性鑒定結果為陽性的T1代(在圖中用轉化體表示)4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7個轉化體株系幼苗和對照(在圖中用WT表示)幼苗進行如下抗旱性檢測及其生理生化特性測定，每個轉化體株系和對照均20株。
T0代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代。
做抗旱性鑒定植株，在苗齡為45天時移栽，選取同樣大小花盆，花盆中花土稱重，使花土重量一致，以盡量保證生長環(huán)境條件一致性，干旱前，選取生長狀態(tài)良好并一致的轉化體及對照，充分澆透水，然后同時進行干旱脅迫處理(持續(xù)不澆水)，在干旱脅迫后不同時間進行耐旱相關生理生化指標的測定及復水后的形態(tài)觀察。
1、轉化體和對照抗旱性鑒定結果表明干旱脅迫10天時，7個株系轉化體仍在正常生長，而對照已嚴重萎蔫，(圖4a，最下面一排為WT，其余三排為不同的轉化體株系)；干旱脅迫20天后，7個株系轉化體也失水而萎蔫，但是植株的葉片仍為綠色，只是由于失水導致葉綠素被破壞而使得葉片稍有發(fā)黃，而此時對照已基本枯死(圖4b，最下面一排為WT，其余三排為不同的轉化體株系)。干旱脅迫20天后開始恢復澆水，復水7天，轉化體全部復活，對照未能復活(圖4c，最下面一排為WT，其余三排為不同的轉化體株系)，復水16天，轉化體全部復活后在繼續(xù)生長，對照全部死亡(圖4d，最下面一排為WT，其余三排為不同的轉化體株系)。
圖4a、圖4b、圖4c和圖4d只是三個轉化體株系4-6、4-27和6-41的照片，其余四個轉化體株系與4-6、4-27和6-41相同。
2、轉化體抗旱性相關生理指標的測定(方法見《植物生理學實驗指南》，中國科學院上海植物生理研究所、上海市植物生理學會編?？茖W出版社。2004年)(1)SOD酶活性測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中SOD酶活性。具體方法如下1)粗酶液制備分別取每株轉化體和對照煙草幼苗葉片0.5g，加入5倍于樣品量的50mmol-LpH7.8磷酸緩沖液[含0.1mM EDTA；0.3％(0.3g/100ml)TritonX-100；4％(4g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮(pvpp，polyvinylpolyrrolidone)]，研磨后倒入離心管中，以10,500g離心20min，上清液為粗酶液。
2)酶活性測定在盛有3ml反應混合液(在54ml 14.5mM dl-甲硫氨酸中分別加入均以50mM pH7.8磷酸緩沖液配制的3μMEDTA，2.25mM NBT和60μM核黃素各2ml，溶液均在用前配制，避光放置)的試管中，加入SOD粗酶液，混合后放在試管架上，在光照培養(yǎng)架內照光10min，取出試管，迅速測定OD560值，以不加酶液的照光管為對照。
3)計算酶活性＝酶單位/樣品量＝反應被抑制％/(50％)×3ml反應混合液中加入的樣品量。
結果表明干旱脅迫2周時，轉化體SOD酶活性只比對照略有升高，升高并不明顯，未表現(xiàn)出明顯差異，干旱脅迫3周，轉化體SOD酶活性比對照高，統(tǒng)計分析結果表明，轉化體和對照之間已呈現(xiàn)顯著差異(p＜0.05)，干旱脅迫4周時，轉化體SOD酶活性和對照SOD酶活性之間也是呈現(xiàn)顯著差異(p＜0.05)(圖5)。圖5中轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系各20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
(2)游離脯氨酸的測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中脯氨酸含量。具體方法如下
1)脯氨酸提取分別取每株轉化體和對照煙草幼苗葉片0.1g，用3％(3g/100ml)磺基水楊酸溶液研磨提取，磺基水楊酸的最終體積為5ml，勻漿液轉入離心管中，沸水浴浸提10min。冷卻后，以3000rpm離心10min，取上清液待測。
2)含量測定(a)標準曲線制作在1-10μg/ml脯氨酸濃度范圍內制作標準曲線。取標準溶液各2ml，加入2ml 3％磺基水楊酸、2ml冰乙酸和4ml 2.5％(2.5g/100ml)茚三酮溶液，置沸水浴中顯色60min。冷卻后，加入4ml甲苯萃取紅色物質。靜置，取甲苯相測定520nm處的吸收值，依據(jù)脯氨酸量和相應吸收值繪制標準曲線。
(b)樣品測定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等顯色試劑，同標準曲線程序進行顯色、萃取和比色。
結果表明干旱脅迫2周時，轉化體脯氨酸含量比對照脯氨酸含量略有升高，但未表現(xiàn)出明顯差異，干旱脅迫3周時，轉化體脯氨酸含量雖然還是比對照脯氨酸含量高，但差異也不大，干旱脅迫4周時，轉化體脯氨酸含量明顯比對照脯氨酸含量高，而且這種差異達到了顯著水平(p＜0.05)(圖6)。圖6中轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系各20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。脯氨酸是表明植物體耐逆性狀高低的一個重要指標，轉化體內脯氨酸含量的升高，表明轉化體受到干旱脅迫后，體內積累了多量脯氨酸，從而提高自身對逆境的抗性。
(3)可溶性總糖的測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中總糖含量。具體方法如下1)試劑(a)葡萄糖標準液準確稱取分析純無水葡萄糖0.2000g，蒸餾水溶解并定容至200ml，使用時稀釋10倍，其濃度為100μg/ml；(b)蒽酮試劑稱取蒽酮1g溶于72％H2SO4溶液1000ml(98％濃H2SO4760ml+蒸餾水240ml)，貯于棕色瓶，冰箱保存，可用2-3周；2)標準曲線繪制取干燥潔凈的試管6支(0-5號)，依次加入葡萄糖標準溶液0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml(各管葡萄糖量依次為0、20、40、60、80、100μg)和蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分別加入蒽酮試劑5ml，搖勻后沸水中10min，取出冷卻后于620nm下比色，記錄OD620值，繪出標準曲線。
3)樣品提取分別取每株轉化體和對照煙草幼苗新鮮葉片1.0g，加入少量石英沙及去離子水研磨至勻漿，連同殘渣用去離子水定容至100ml，室溫下靜置60min(經(jīng)常搖動)，過濾棄殘渣。
4)樣品測定取干潔試管，分別加入樣液1ml和蒽酮試劑5ml，搖勻后，沸水浴10min，冷卻后620nm比色(標準曲線空白做零點)，記錄OD620值。
5)結果計算按照公式C＝AN/W計算。
其中C-樣品可溶性糖含量(μg/g葉片)；A-標準曲線查得的可溶性糖(μg)；W-樣品重量(g)；N-樣品提取液占樣品反應液的倍數(shù)。
結果表明干旱脅迫3周時，轉化體中總糖含量比對照顯著升高，差異達極顯著水平(p＜0.01)，這種升高不同于SOD酶活性的升高和脯氨酸含量的升高，在SOD酶活性升高中，轉化體和對照之間的差異只是達顯著水平(p＜0.05)，而干旱脅迫3周時，轉化體和對照之間脯氨酸含量的差異還不明顯；干旱脅迫4周時，轉化體和對照的總糖含量差別和干旱脅迫3周時差異不大，也達極顯著水平(p＜0.01)(圖7)。圖7中轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系各20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
(4)鉀離子含量測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中K+含量。具體方法如下1)樣品提取分別取每株轉化體和對照煙草幼苗新鮮葉片1.0g，加入少量石英沙及去離子水研磨至勻漿，連同殘渣一起用去離子水定容至50ml，室溫下靜置60min(經(jīng)常搖動)，慢速濾紙過濾棄去殘渣。
2)樣品測定過濾后的上清液，用火焰分光光度計測定鉀離子含量。
結果表明干旱脅迫2周時，轉化體K+含量已比對照中K+含量升高，且升高已達極顯著差異水平(p＜0.01)，干旱脅迫3周時，轉化體和對照K+含量和干旱脅迫2周時差不多，也達到極顯著差異(p＜0.01)，干旱脅迫4周時，轉化體和對照之間K+含量差異更加明顯，其差異的程度比干旱脅迫2周和3周時還要高(圖8)。圖8中轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系各20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
實施例3、轉AtHD/START1基因煙草的相關生物學性狀觀察將經(jīng)實施例1的PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體得到的T1代幼苗進行除草劑抗性鑒定，取除草劑抗性鑒定結果為陽性的T1代(在圖中用轉化體表示)4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41等7個轉化體株系幼苗和對照(在圖中用WT表示)幼苗在苗齡為45天時移栽，進行如下相關生物學性狀觀察。每個轉化體株系和對照均20株。
T0代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代。
1、開花時間、葉片大小及葉片數(shù)的觀察對移栽后的7個株系轉化體(每個株系20株)和對照(20株)進行不同時期的觀察和記錄，并測量記錄開花時間、最大葉片長、最大葉片寬及葉片數(shù)量。
(1)開花時間比較觀察轉化體和對照正常生長過程，發(fā)現(xiàn)轉化體和對照的開花時間明顯不同，正常生長50天時，對照已開始抽苔，生長至60天，對照最早的已經(jīng)開出中心花(圖9a中后面的兩盆)，而轉化體仍處于旺盛營養(yǎng)生長階段(圖9a中前面的兩盆)；生長110天后，對照大部分已結實，轉化體只有少數(shù)才開始進入花期，大部分轉化體尚未開花(圖9b，左列為轉化體，右列為對照)。從觀察結果看，轉化體中心花開花時間比對照平均晚30-40天，最長晚60天，但花期基本沒有改變。從觀察結果看，對照株普遍抽苔早，當它們已經(jīng)進入生殖生長期時，轉化體還在進行旺盛的營養(yǎng)生長，隨著移栽時間的延長，轉化體也開始抽苔，進入生殖生長。圖9a和圖9b只是一個轉化體株系4-6的照片，其余六個轉化體株系均與4-6相同。
(2)葉片數(shù)的比較觀察轉化體和對照正常生長過程，轉化體葉片數(shù)比對照多，移栽早期時，轉化體和對照都處于幼苗生長期階段，此時的葉片數(shù)看不出明顯差異，移栽50天后，已可看出轉化體和對照葉片數(shù)的差異(圖10a，左列為轉化體，右列為對照)，隨著生長時間的延長，這種差異表現(xiàn)越來越明顯(圖10b)。從圖9a可看出，生長至60天時，對照已抽苔，并開出中心花，中心花一旦開放，則葉片數(shù)將不會再增加。由于對照的抽苔時間普遍早于轉化體，因此當絕大多數(shù)對照已抽苔開花時，轉化體還在進行營養(yǎng)生長，這也就導致了轉化體的葉片數(shù)可以不斷增加，一直到它抽苔開花后，葉片數(shù)才不會再增加。從圖10b的統(tǒng)計結果也可看出這點，移栽70天時，轉化體和對照間葉片數(shù)差異還沒有明顯區(qū)別，移栽80天時，它們間的葉片數(shù)達到顯著差異(p＝0.0132)。移栽100天后，達到了極顯著差異(p＝0.0001)。移栽100天后葉片數(shù)比較結果如表1所示，表1中，WT為20株對照的統(tǒng)計結果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系，每個株系20株的統(tǒng)計結果。圖10a只是一個轉化體株系4-6的照片。圖10b中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
表1不同轉化株系移栽后100天葉片數(shù)

(3)葉片大小的比較觀察轉化體和對照的正常生長過程，移栽早期轉化體最大葉片長和最大葉片寬都比對照要大，但隨著生長時間延長，這種差異逐漸減小，到生長后期，對照的最大葉片長和最大葉片寬都比轉化體要大，葉長差異達到了顯著水平(p＜0.05)(圖11a和11b)。圖11a和11b中轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系各20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
2、果莢數(shù)的比較植株生長進入開花期后，觀察并記錄轉化體和對照開花情況，結果莢后，記錄轉化體和對照果莢數(shù)。
表2不同轉化株系果莢數(shù)

結果表明生長110天后，對照大部分已結實，轉化體只有少數(shù)才開始進入花期。在轉化體和對照開花時發(fā)現(xiàn)，它們的花朵數(shù)量有較明顯差別，因此果莢成熟后對轉化體和對照的果莢數(shù)做了統(tǒng)計，確認它們的果莢數(shù)量確實存在明顯差異(圖12，表2)，且這種差異達到了極顯著水平(p＝0.0045)。表2中，WT為20株對照的統(tǒng)計結果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系，每個株系20株的統(tǒng)計結果。圖12中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
3、葉片氣孔密度、表皮細胞密度、氣孔大小以及葉片氣孔指數(shù)的比較選取生長狀態(tài)一致的轉化體和對照，選取同樣葉位的相同部位，尖頭鑷子撕取葉片下表皮，并用小排刷刷去表皮上粘附的葉肉細胞，做成水封片，顯微鏡下觀察記錄每一視野中氣孔數(shù)和表皮細胞數(shù)，每個葉片觀察記錄50個視野，再根據(jù)測微尺計算每個視野的面積，計算葉片氣孔密度(個/mm2)、葉片表皮細胞密度(個/mm2)。
在計算出轉化體和對照的氣孔密度和表皮細胞密度之后，根據(jù)下述公式計算各自的氣孔指數(shù)(氣孔指數(shù)＝[氣孔數(shù)/(氣孔數(shù)+表皮細胞數(shù))])。
在上述觀察記錄氣孔數(shù)量的同時，用測微尺測量每一氣孔長度、寬度，氣孔長度以氣孔縱軸最長處計算，氣孔寬度以垂直于縱軸最寬處計算。
圖13中a和b分別為對照和轉化體葉片下表皮氣孔的200倍光鏡照片，圖13中c和d分別為對照和轉化體葉片下表皮氣孔的400倍光鏡照片，僅從200倍和400倍的光鏡照片可以看出，對照和轉化體不僅氣孔數(shù)量存在很大差異，而且氣孔大小也存在明顯差別，與此同時，仔細觀察照片可以看出，轉化體葉片下表皮，在氣孔數(shù)量減少、氣孔變大的同時，表皮細胞也明顯變大，轉化體和對照葉片下表皮氣孔密度、表皮細胞密度、氣孔指數(shù)和氣孔大小統(tǒng)計結果表明，它們之間差異都達到極顯著水平(p＜0.01)(圖14、15、16、17和表3)。
表3不同轉化株系氣孔密度、表皮細胞密度及氣孔指數(shù)

表3中，WT為20株對照的統(tǒng)計結果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系，每個株系20株的統(tǒng)計結果。圖13只是一個轉化體株系4-6的照片。圖14-17中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、640和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
4、葉片厚度的比較選取生長狀態(tài)一致的轉化體和對照，并選取同樣葉位的相同部位，徒手切片，切片做成水封片，顯微鏡下觀察，觀察的同時用測微尺測量葉肉細胞長和寬。
結果表明轉化體和對照葉片在厚度上同樣存在明顯差異，為清楚是由于葉片葉肉細胞層數(shù)增多還是由于葉肉細胞變大而導致了葉片的加厚，對葉片做徒手切片進行觀察，圖18中a和b分別為對照和轉化體葉片徒手切片橫切面的100倍光鏡照片，圖18中c和d分別為對照和轉化體葉片徒手切片橫切面的200倍光鏡照片，從照片可以明顯看出，轉化體和對照的葉肉細胞層數(shù)都沒有發(fā)生變化，仍然是一層柵欄細胞，2-3層海綿細胞，但轉化體的柵欄細胞的大小卻發(fā)生了顯著改變，和對照相比，其柵欄細胞變長、變寬，通過對柵欄細胞的測量(圖19)發(fā)現(xiàn)，柵欄細胞的長和寬在轉化體和對照之間都達到了極顯著的差異水平(p＜0.01)，正是由于柵欄細胞大小的改變，從而導致了葉片厚度的變化，而這種葉片厚度的改變也是轉化體可以對干旱增加抵抗的一個重要原因。圖18只是一個轉化體株系4-6的照片，其余六個轉化體株系均與4-6相同。圖19中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
5、轉化體和對照光合指標測定選取生長狀態(tài)一致的轉化體和對照，測定相同葉位光合速率(μmol CO2/m2s)、蒸騰速率(μmolH2O/m2s)、水分利用率(mg/g)、氣孔導度(mmol/m2s)，測定時，7個轉化體株系和對照每種測定20株，統(tǒng)計測定結果。所用儀器為PB0402光合蒸騰儀。
表4不同轉化株系光合指標

在植物營養(yǎng)生長階段，用光合測定儀對各植株進行光合指標的測定。從測定的光合指標結果來看，轉化體的光合速率、水分利用率均比對照要高(圖20、圖21和表4)，但并未達到顯著差異的水平；而對照的蒸騰速率和氣孔導度則都比轉化體要高(圖22、圖23和表4)，但也未達顯著差異水平。表4中，WT為20株對照的統(tǒng)計結果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系，每個株系20株的統(tǒng)計結果。
圖20-23中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
實施例4、轉AtHD/START1基因煙草的耐鹽性檢測及其生理生化特性測定將經(jīng)實施例1的PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體得到的T1代幼苗進行除草劑抗性鑒定，取除草劑抗性鑒定結果為陽性的7個轉化體株系(4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41)的T0代轉化體種子，進行如下耐鹽性檢測。
1、水培觀察轉化體和對照幼苗期耐鹽性及光合指標測定1)T0代轉化體種子和對照分別用70％乙醇浸洗30sec，無菌水清洗一遍；2)50％bleach消毒15min，無菌水清洗5-6遍；3)滅菌后的種子播種在MS0含20mg/L除草劑glufosinate ammonium培養(yǎng)皿中萌發(fā)，萌發(fā)長出四片真葉時移栽入土壤中，于溫室繼續(xù)生長；4)長至6-8片真葉時，選取生長狀態(tài)一致、大小一致的苗進行水培培養(yǎng)；
5)在大的周轉箱中，倒入10L Hoagland營養(yǎng)液，取和周轉箱內徑大小匹配的泡沫板，泡沫板上等距離打孔備用；其中，Hoagland營養(yǎng)液組成如下(a)大量元素 每升培養(yǎng)液中加入的毫升數(shù)KH2PO41M 1KNO31M 5Ca(NO3)21M 5MgSO41M 2(b)微量元素 每升培養(yǎng)液中加入的克數(shù)H3BO32.86MnCl2·4H2O1.81ZnSO4·7H2O0.22CuSO4·5H2O0.08H2MoO4·H2O 0.02(c)每升培養(yǎng)液中加入1mL濃度為10mM的Fe-EDTA溶液(即乙二胺四乙酸鐵鹽溶液)。
6)小心將苗挖出，洗去附著的土壤，插入泡沫板孔中，懸浮于培養(yǎng)液，溫室生長；7)水培一天后，在培養(yǎng)液中加入NaCl，使培養(yǎng)液中NaCl的終濃度為50mM，繼續(xù)培養(yǎng)5天，5天后，再加入NaCl，使培養(yǎng)液中NaCl的終濃度為100mM，再繼續(xù)培養(yǎng)5天，如此一直使NaCl濃度增加到150mM；選取生長一致的煙草幼苗進行水培，水培苗成活后(只需一天恢復即可)，進行不同濃度NaCl脅迫處理，脅迫處理前轉化體和對照生長基本沒有差別，幼苗大小及生長狀態(tài)基本一致(圖24中a)；加入NaCl使水培液中NaCl終濃度達50mM繼續(xù)生長3天，轉化體和對照開始表現(xiàn)生長差異，轉化體生長基本未受影響，而對照生長速度則變得比較緩慢(圖24中b)，此時只是從苗的大小上可看出差別，而從葉色上還看不出明顯區(qū)別；50mMNaCl處理5天后，NaCl濃度增加到100mM繼續(xù)處理5天，可以非常明顯看出轉化體和對照間差異加大，轉化體依然生長正常，葉色濃綠(圖24中d)，而對照生長明顯緩慢，葉片數(shù)也較轉化體少，葉色發(fā)黃，部分心葉葉形發(fā)生歧變(圖24中h)，NaCl濃度增加到150mM再繼續(xù)處理6天，轉化體和對照還在繼續(xù)生長，但轉化體明顯好于對照(圖24中e)，這說明轉化體對一定濃度NaCl的確有耐受性，由于隨著培養(yǎng)時間的延長，水培箱已無法容納越來越大的苗，所以實驗終止，未觀察生殖生長階段的耐鹽性狀。
圖24中，a、50mM NaCl處理前的生長情況；b、50mM NaCl處理3天；c、NaCl脅迫處理開始時的根(右為轉化體，左為對照)；d、50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天；e、50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天，150mM NaCl處理6天；f、50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天，150mM NaCl處理6天的根(右為轉化體的根，左為對照的根)；g、50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天，150mM NaCl處理6天的根(右為轉化體的根，左為對照的根)；h、50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天后葉片的生長狀況(右兩片為轉化體，左三片為對照)；a、b、d、e均是上排為轉化體，下排為對照。圖24只是一個轉化體株系4-6的照片，其余六個轉化體株系的幼苗期耐鹽性均與4-6相同。
轉化體對NaCl的耐受性除了造成生長中苗的大小產(chǎn)生差異外，對轉化體和對照葉片數(shù)也產(chǎn)生了影響，用NaCl處理后，轉化體可以正常生長，而對照的生長變得比較緩慢，這種差異在葉片數(shù)量方面也得到體現(xiàn)(圖25)，此外，NaCl處理也影響了轉化體和對照的根系發(fā)育，如圖24中c所示，水培開始時候，轉化體和對照根系相對一致，基本沒有差異，用不同濃度NaCl處理后，轉化體側根明顯增多，而對照根系表現(xiàn)出發(fā)育不良，側根較少(圖24中f、圖24中g)，對根系的稱重表明，這種差異達到了顯著水平(p＜0.05)(圖26)，正是由于這種根系發(fā)育的差異才導致了全株發(fā)育受阻，對根冠比的統(tǒng)計結果也表明，轉化體的根冠比比對照株要高(圖27)，但差異未達顯著水平。圖25-27中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
選取生長一致的煙草幼苗進行水培，水培苗成活后(只需一天恢復即可)，進行不同濃度NaCl脅迫處理50mM NaCl處理5天，100mM NaCl處理5天，150mM NaCl處理6天，用光合測定儀對各植株進行光合指標的測定。從表5和圖28-31的光合指標測定結果看，轉化體的光合速率、水分利用率均比對照要高，并且這種差異比在正常條件下的差異明顯要大，正常生長條件下，光合速率在轉化體和對照間的差異p值在0.6602(圖20)，而NaCl脅迫后，p值在0.2889(圖28)，正常生長條件下的水分利用率在轉化體和對照間的差異p值在0.6008(圖22)，而NaCl脅迫后，p值在0.2085(圖30)，蒸騰速率和氣孔導度在正常生長和鹽脅迫條件下的差異變化不大(圖21、23、29、31)。
表5 NaCl處理后不同轉化株系光合指標

圖28-31中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。表5中，WT為20株對照的統(tǒng)計結果，4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果。
2、轉化體和對照對鹽萌發(fā)敏感性的觀察1)煙草種子滅菌步驟同步驟1；2)將滅菌后的種子點播在MS0附加不同濃度NaCl的培養(yǎng)基板上，NaCl濃度梯度為0mM、50mM、100mM、150mM和200mM，點播時，同一培養(yǎng)皿一半點播轉化體，一半點播對照，于植物生長室光照培養(yǎng)或于植物生長室光照豎直培養(yǎng)；將T0代轉化體和對照種子播種在含不同濃度NaCl的培養(yǎng)板上，2周后觀察結果，表明在0mM NaCl培養(yǎng)板上轉化體和對照子葉展開，部分單株已萌發(fā)出兩片真葉，根系都可以正常生長，全株生長正常(圖32中a)；而在100mM NaCl板上，轉化體種子全部萌發(fā)，絕大多數(shù)轉化體子葉展開，根也正常長出，但生長速度比在0mM NaCl板上的生長速度要慢，因此整株幼苗比在0mM板上的幼苗小，而對照在100mM板上大多數(shù)僅僅是伸出了胚根，只極少數(shù)長出子葉，且子葉小于轉化體的子葉，全株生長受到明顯抑制(圖32中b)。將轉化體和對照的種子點播在不同濃度NaCl培養(yǎng)板上進行豎直培養(yǎng)，觀察根系的生長情況時，NaCl濃度對轉化體和對照的影響也很明顯，低濃度NaCl對轉化體的根影響較小，轉化體根系基本可以正常生長，但對對照根的生長卻生產(chǎn)了較明顯的抑制作用(圖32中c)，而在高濃度NaCl培養(yǎng)板上，雖然轉化體的根生長也受到抑制，但對對照的抑制作用更加明顯圖32中d)，高濃度NaCl板上，對照幾乎無法生長，僅僅只能萌生出胚根；對根長的統(tǒng)計結果表明，無論是在低濃度NaCl(100mM)培養(yǎng)板上還是在高濃度(200mM)NaCl培養(yǎng)板上，轉化體和對照根長之間的差異都達到了極顯著水平(圖33a和圖33b)。
圖32中，a、0mMNaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周(上為對照，下為轉化體)；b、含100mM NaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周(上為對照，下為轉化體)；c、含100mM NaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周的根系(右為轉化體，左為對照)；d、含200mM NaCl培養(yǎng)板上萌發(fā)2周的根系(右為轉化體，左為對照)。圖32只是一個轉化體株系4-6的照片，其余六個轉化體株系的幼苗期耐鹽性均與4-6相同。圖33a和33b中，轉化體為4-6、4-12、4-17、4-23、4-27、6-40和6-41為7個轉化體株系、每個株系20株的統(tǒng)計結果，對照是20株的統(tǒng)計結果。
序列表<160>2<210>1<211>2169<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgagtttcg tcgtcggcgt cggcggaagt ggtagtggaa gcggcggaga cggtggtggt60agtcatcatc acgacggctc tgaaactgat aggaagaaga aacgttacca tcgtcacacc120gctcaacaga ttcaacgcct tgaatcgagt ttcaaggagt gtcctcatcc agatgagaaa180cagaggaacc agcttagcag agaattgggt ttggctccaa gacaaatcaa gttctggttt240cagaacagaa gaactcagct taaggctcaa catgagagag cagataatag tgcactaaag300gcagagaatg ataaaattcg ttgcgaaaac attgctatta gagaagctct caagcatgct360atatgtccta actgtggagg tcctcctgtt agtgaagatc cttactttga tgaacaaaag420cttcggattg aaaatgcaca ccttagagaa gagcttgaaa gaatgtctac cattgcatca480aagtacatgg gaagaccgat atcgcaactc tctacgctac atccaatgca catctcaccg540ttggatttgt caatgactag tttaactggt tgtggacctt ttggtcatgg tccttcactc600gattttgatc ttcttccagg aagttctatg gctgttggtc ctaataataa tctgcaatct660cagcctaact tggctatatc agacatggat aagcctatta tgaccggcat tgctttgact720gcaatggaag aattgctcag gcttcttcag acaaatgaac ctctatggac aagaacagat780ggctgcagag acattctcaa tcttggtagc tatgagaatg ttttcccaag atcaagtaac840cgagggaaga accagaactt tcgagtcgaa gcatcaaggt cttctggtat tgtcttcatg900aatgctatgg cacttgtcga catgttcatg gattgtgtca agtggacaga actctttccc960tctatcattg cagcttctaa aacacttgca gtgatttctt caggaatggg aggtacccat1020gagggtgcat tgcatttgtt gtatgaagaa atggaagtgc tttcgccttt agtagcaaca1080cgcgaattct gcgagctacg ctattgtcaa cagactgaac aaggaagctg gatagttgta1140aacgtctcat atgatcttcc tcagtttgtt tctcactctc agtcctatag atttccatct1200ggatgcttga ttcaggatat gcccaatgga tattccaagg ttacttgggt tgaacatatt1260gaaactgaag aaaaagaact ggttcatgag ctatacagag agattattca cagagggatt1320gcttttgggg ctgatcgttg ggttaccact ctccagagaa tgtgtgaaag atttgcttct1380ctatcggtac cagcgtcttc atctcgtgat ctcggtggag tgattctatc accggaaggg1440aagagaagca tgatgagact tgctcagagg atgatcagca actactgttt aagtgtcagc1500agatccaaca acacacgctc aaccgttgtt tcggaactga acgaagttgg aatccgtgtg1560actgcacata agagccctga accaaacggc acagtcctat gtgcagccac cactttctgg1620cttcccaatt ctcctcaaaa tgtcttcaat ttcctcaaag acgaaagaac ccgtcctcag1680
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Lys Tyr Met Gly Arg Pro IIe Ser Gln Leu Ser Thr Leu His Pro Met165 170 175His Ile Ser Pro Leu Asp Leu Ser Met Thr Ser Leu Thr Gly Cys Gly180 185 190Pro Phe Gly His Gly Pro Ser Leu Asp Phe Asp Leu Leu Pro Gly Ser195 200 205Ser Met Ala Val Gly Pro Asn Asn Asn Leu Gln Ser Gln Pro Asn Leu210 215 220Ala Ile Ser Asp Met Asp Lys Pro Ile Met Thr Gly Ile Ala Leu Thr225 230 235 240Ala Met Glu Glu Leu Leu Arg Leu Leu Gln Thr Asn Glu Pro Leu Trp245 250 255Thr Arg Thr Asp Gly Cys Arg Asp Ile Leu Asn Leu Gly Ser Tyr Glu260 265 270Asn Val Phe Pro Arg Ser Ser Asn Arg Gly Lys Asn Gln Asn Phe Arg275 280 285Val Glu Ala Ser Arg Ser Ser Gly Ile Val Phe Met Asn Ala Met Ala290 295 300Leu Val Asp Met Phe Met Asp Cys Val Lys Trp Thr Glu Leu Phe Pro305 310 315 320Ser Ile Ile Ala Ala Ser Lys Thr Leu Ala Val Ile Ser Ser Gly Met325 330 335Gly Gly Thr His Glu Gly Ala Leu His Leu Leu Tyr Glu Glu Met Glu340 345 350Val Leu Ser Pro Leu Val Ala Thr Arg Glu Phe Cys Glu Leu Arg Tyr355 360 365Cys Gln Gln Thr Glu Gln Gly Ser Trp Ile Val Val Asn Val Ser Tyr370 375 380Asp Leu Pro Gln Phe Val Ser His Ser Gln Ser Tyr Arg Phe Pro Ser385 390 395 400Gly Cys Leu Ile Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr Ser Lys Val Thr Trp405 410 415Val Glu His Ile Glu Thr Glu Glu Lys Glu Leu Val His Glu Leu Tyr420 425 430Arg Glu Ile Ile His Arg Gly Ile Ala Phe Gly Ala Asp Arg Trp Val435 440 445Thr Thr Leu Gln Arg Met Cys Glu Arg Phe Ala Ser Leu Ser Val Pro
450 455 460Ala Ser Ser Ser Arg Asp Leu Gly Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Gly465 470 475 480Lys Arg Ser Met Met Arg Leu Ala Gln Arg Met Ile Ser Asn Tyr Cys485 490 495Leu Ser Val Ser Arg Ser Asn Asn Thr Arg Ser Thr Val Val Ser Glu500 505 510Leu Asn Glu Val Gly Ile Arg Val Thr Ala His Lys Ser Pro Glu Pro515 520 525Asn Gly Thr Val Leu Cys Ala Ala Thr Thr Phe Trp Leu Pro Asn Ser530 535 540Pro Gln Asn Val Phe Asn Phe Leu Lys Asp Glu Arg Thr Arg Pro Gln545 550 555 560Trp Asp Val Leu Ser Asn Gly Asn Ala Val Gln Glu Val Ala His Ile565 570 575Ser Asn Gly Ser His Pro Gly Asn Cys Ile Ser Val Leu Arg Gly Ser580 585 590Asn Ala Thr His Ser Asn Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr595 600 605Asp Ser Ser Gly Ala Phe Val Val Tyr Ser Pro Val Asp Leu Ala Ala610 615 620Leu Asn Ile Ala Met Ser Gly Glu Asp Pro Ser Tyr Ile Pro Leu Leu625 630 635 640Ser Ser Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Gly Asn Gly Ser Asn Ser Glu645 650 655Gln Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Gly Arg Ala Ser Ala Ser Gly Ser660 665 670Leu Ile Thr Val Gly Phe Gln Ile Met Val Ser Asn Leu Pro Thr Ala675 680 685Lys Leu Asn Met Glu Ser Val Glu Thr Val Asn Asn Leu Ile Gly Thr690 695 700Thr Val His Gln Ile Lys Thr Ala Leu Ser Gly Pro Thr Ala Ser Thr705 710 715 720Thr Ala
權利要求
1.一種培育抗逆轉基因煙草的方法，是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入煙草中，篩選得到抗逆性提高的煙草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因的編碼序列是序列表中的序列1。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2004C導入煙草中。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表達載體pCB2004C的attR1和attR2之間。
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子是水稻actin1啟動子。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2006導入煙草中。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表達載體pCB2006的attR1和attR2之間。
9.根據(jù)權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗鹽性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
10.根據(jù)權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述煙草為煙草NC89。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育抗逆轉基因煙草的方法。該方法是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入煙草中，篩選得到抗逆性提高的煙草；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白質。轉AtHD/START1基因煙草株系(轉化體)的耐旱性和耐鹽性都明顯高于對照(未轉基因煙草)株系。
文檔編號C12N15/29GK1948478SQ20061011432
公開日2007年4月18日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權日2006年11月6日
發(fā)明者向成斌, 陳曦 申請人:中國科學技術大學