專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)3－o－鈍化－4’－單磷酰基脂a(3d－mla)的方法
相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)是2001年3月30日申請(qǐng)的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)No.60/280,089的非臨時(shí)申請(qǐng)，其要求U.S.臨時(shí)申請(qǐng)No.60/280,089的利益。
關(guān)于在聯(lián)邦政府資助的研究和開(kāi)發(fā)下所取得的發(fā)明之權(quán)利的聲明是不適用的發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及3-O-脫?；瘑瘟柞；珹(3D-MLA)的生物合成生產(chǎn)領(lǐng)域。更特別地，其涉及改善所期望的3D-MLA同系物的收率或者將純化3D-MLA的脂多糖(LPS)前體的成本減到最少的方法。
2.相關(guān)領(lǐng)域描述很久以前就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到腸細(xì)菌脂多糖(LPS)是免疫系統(tǒng)的有效刺激物。亞微克數(shù)量的LPS能夠引起多種反應(yīng)，包括有益的和有害的。這些反應(yīng)中的一些是有害的，其中一些可以是致命的，這一事實(shí)阻礙了LPS本身的臨床應(yīng)用。已經(jīng)觀察到負(fù)責(zé)內(nèi)毒素活性的最主要原因的LPS成分是脂A。
因此，已經(jīng)作了許多努力來(lái)減弱LPS或脂A的毒性而不減少這些化合物的免疫刺激益處。這些成果中著名的為Edgar Ribi和其同事的成果，該成果導(dǎo)致生產(chǎn)出脂A衍生物3-O-脫?；?4’-單磷酰基脂A(3D-MLA；含有3D-MLA的組合物以商品名MPL從Corixa公司(Seattle，WA)商購(gòu)可得)。3D-MLA顯示出具有與脂A基本上同樣的免疫刺激特性，但是具有較低的內(nèi)毒性(Myers等人，U.S.Pat.No.4,912,094)。Myers等人還報(bào)道了生產(chǎn)3D-MLA的方法，該方法如下。首先，將從革蘭氏陰性細(xì)菌(例如明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌(Salmonella minnesota)R595)深度粗糙突變體菌株獲得的LPS或脂A在中等強(qiáng)度的無(wú)機(jī)酸溶液(例如0.1N HCl)中回流大約30分鐘。這導(dǎo)致在脂A還原性末端葡糖胺的1位上的去磷酸化和在脂A非還原性葡糖胺的6′位上的去糖基化(decarbohydrate)。其次，將去磷酸化并去糖基化的脂A(亦稱(chēng)為單磷?；珹或MLA)進(jìn)行堿水解，例如通過(guò)將其溶解在有機(jī)溶劑如氯仿∶甲醇(CM)2∶1(v/v)中，并用pH 10.5的0.5M Na2CO3水溶液使該溶液飽和，然后快速蒸發(fā)溶劑。這導(dǎo)致選擇性地去除在脂A的3位上的β-羥基肉豆蔻酸部分，從而獲得3-O-脫?；?4’-單磷?；珹(3D-MLA)。
通過(guò)上述方法生產(chǎn)所得的3D-MLA的質(zhì)量高度依賴(lài)于從革蘭氏陰性細(xì)菌獲得的LPS的純度和組成。例如，LPS的脂A成分為含有大約5-7個(gè)脂肪酸部分的緊密相關(guān)種類(lèi)的混和物。從上面的討論中清楚的看出，在3D-MLA的形成中除去了1個(gè)脂肪酸部分，從而得到具有大約4-6個(gè)脂肪酸部分的3D-MLA。一般認(rèn)為，根據(jù)保留的或增強(qiáng)的免疫刺激益處、減低的毒性和其他所期望的特性(Qureshi和Takayama，“The Bacteria”，Vol.XI(Iglewski和Clark編)，AcademicPress，1990，pp.319-338)的組合，具有至少6個(gè)脂肪酸部分的3D-MLA是優(yōu)選的。
又例如，從革蘭氏陰性細(xì)菌中LPS進(jìn)行商業(yè)規(guī)模的提取一般包括Chen方法(Chen等人，J.Infect.Dis.128543(1973))；即用CM提取，這導(dǎo)致形成富含LPS和磷脂的CM相，從中隨后能夠純化出LPS。可是，從富含LPS和磷脂的CM相中純化LPS一般需要多重沉淀步驟來(lái)獲得對(duì)于在免疫刺激應(yīng)用中的使用(例如用作疫苗佐劑)足夠純的LPS。
因此，期望獲得方便地制備高純度LPS組合物的方法。此外，期望獲得產(chǎn)生LPS組合物的方法，該組合物含有具有增加的己?；滴锼降?D-MLA。
已知的發(fā)酵技術(shù)已用于制備含有能夠容易純化的LPS的革蘭氏陰性細(xì)菌培養(yǎng)物。這些已知的技術(shù)一般包括在穩(wěn)定期的早期收獲細(xì)菌培養(yǎng)物，這與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)準(zhǔn)則一致?？墒前l(fā)現(xiàn)根據(jù)已知條件所產(chǎn)生的LPS的?；潭仁强勺兊?。例如，明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的脂A中庚?；N類(lèi)的含量依賴(lài)于批次而可以在20％-80％之間變化(Rietschel等人，Rev.Infect.Dis.9S527(1987))。這種庚?；滴锖康目勺冃詫?dǎo)致從這些LPS批次中制備的3D-MLA中己酰基同系物含量的顯著差異。
發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養(yǎng)基中培育深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物；(b)將該培養(yǎng)物在穩(wěn)定期保持至少大約2小時(shí)；(c)從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞；和(d)從細(xì)胞中提取LPS。
該方法允許LPS的生產(chǎn)，其中該LPS可生產(chǎn)出具有相對(duì)高比例的(即至少大約20mol％)含有6個(gè)脂肪酸部分的同系物的3D-MLA。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從深度粗糙突變體細(xì)菌菌株細(xì)胞的培養(yǎng)物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個(gè)碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細(xì)胞，從而產(chǎn)生出具有減少的磷脂含量的細(xì)胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液(CM)提取具有減少的磷脂含量的細(xì)胞，從而獲得LPS的CM溶液。
該方法提供了LPS的CM溶液，其具有減少的磷脂含量，并因此適合于進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和純化而得到3D-MLA。該方法包括相對(duì)簡(jiǎn)單和不貴的步驟。
附圖簡(jiǎn)述下面的附圖形成本說(shuō)明的一部分，并被包括在本發(fā)明之中來(lái)進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖并結(jié)合此處給出的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。


圖1顯示了在乙醇提取期間用不同溫度獲得的乙醇提取物和LPS樣品的TLC板。左邊的平板從左至右顯示了于22℃、37℃和50℃的溫度時(shí)的乙醇提取物。該平板最右邊的樣品為真正的LPS樣品。右邊的平板顯示了從各個(gè)制備物中獲得的LPS。道3、4和5中的樣品分別相應(yīng)于從經(jīng)過(guò)在22℃、37℃和50℃用乙醇預(yù)提取的細(xì)胞中獲得的LPS。在Rf～0.6的濃重的帶相應(yīng)于磷脂和脂肪酸雜質(zhì)。這些雜質(zhì)的水平通過(guò)增加乙醇提取的溫度而減少，其在于50℃預(yù)提取的樣品中是非常低的。
說(shuō)明性實(shí)施方案的描述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養(yǎng)基中培育深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物；(b)將該培養(yǎng)物在穩(wěn)定期保持至少大約2小時(shí)；(c)從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞；和(d)從細(xì)胞中提取LPS。
脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的外小葉中主要的脂類(lèi)組分。除了其他成分之外，革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖部分還含有脂A。正如已經(jīng)描述的，脂A能夠進(jìn)行去糖基化和部分去磷酸化從而生產(chǎn)單磷酰基脂A(MLA)，MLA能夠在3位選擇性地進(jìn)行脫酰基化從而產(chǎn)生3-O-脫?；?4’-單磷?；珹(3D-MLA)。
可是，通過(guò)革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的脂A一般含有許多具有相同的總的脂A結(jié)構(gòu)但在它們含有的脂肪酸部分的數(shù)量上不同的種類(lèi)。具有相同脂肪酸數(shù)量的脂A種類(lèi)的群體此處被稱(chēng)為“同系物”。通過(guò)革蘭氏陰性細(xì)菌如明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)規(guī)模培養(yǎng)可生產(chǎn)出具有4-7個(gè)脂肪酸部分的脂A同系物。因此，從例如明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595脂A中生產(chǎn)出的3D-MLA具有一般為3-6個(gè)脂肪酸部分的同系物組成(因?yàn)?D-MLA經(jīng)歷了1個(gè)脂肪酸部分的損失)。
3D-MLA(通過(guò)脂A和MLA)同系物組成中的異質(zhì)性可歸因于兩個(gè)原因(1)在脂A裝配中生物合成的可變性和(2)在加工成3D-MLA期間從脂A主鏈上脂肪酸部分的損失。雖然不想受制于理論，但是除了其他解釋之外相信是由于參與脂A生物合成最終步驟的酰基轉(zhuǎn)移酶的非完全底物特異性，所以生物合成的可變性才會(huì)發(fā)生。在一般于3D-MLA產(chǎn)生中使用的酸和堿水解期間也可能發(fā)生從脂A主鏈上脂肪酸部分的損失。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變培養(yǎng)產(chǎn)生脂A的深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的過(guò)程的參數(shù)能夠改變3D-MLA同系物組成。特別是發(fā)現(xiàn)在收獲之前將深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物在穩(wěn)定期保持至少大約5小時(shí)可導(dǎo)致如此生產(chǎn)的脂A同系物比例的改變，以致一般地至少大約20mol％的隨后從脂A生產(chǎn)出的3D-MLA含有6個(gè)脂肪酸。優(yōu)選地，至少大約50mol％的3D-MLA含有6個(gè)脂肪酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定期大約5.5小時(shí)的保持時(shí)間是特別有效的。這有別于本領(lǐng)域中已知的一般的培養(yǎng)程序，在一般的培養(yǎng)程序中收獲幾乎在培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期之后立即進(jìn)行；在已知的程序中，LPS的同系物含量是高度可變的，并導(dǎo)致具有可變己?；滴锖康?D-MLA。
“深度粗糙突變體細(xì)菌菌株”表示具有深度粗糙表型的革蘭氏陰性細(xì)菌。“深度粗糙”表型表示連接到脂A上的多糖部分只由大約2-3個(gè)2-酮-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(mannooctulonic acid)(KDO)殘基組成。優(yōu)選地，深度粗糙突變體細(xì)菌菌株選自沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬。如果深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于沙門(mén)氏菌屬，則更優(yōu)選地其屬于明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌種，更加優(yōu)選地其為明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595菌株?？梢允褂闷渌疃却植谕蛔凅w細(xì)菌菌株，除了別的以外例如奇異變形菌(Proteus mirabilis)菌株。
可以使用任何適合于培養(yǎng)深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的技術(shù)。一般地，這將包括至少一種商業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，技術(shù)包括將深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的細(xì)胞接種入相對(duì)小的(例如15L)生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)深度粗糙突變體細(xì)菌菌株直至穩(wěn)定期，隨后將15L細(xì)胞培養(yǎng)液無(wú)菌轉(zhuǎn)移到大的(例如750L)生物反應(yīng)器中。
該培養(yǎng)可以在任何已知或發(fā)現(xiàn)能夠讓深度粗糙突變體細(xì)菌菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基為M9，其為補(bǔ)充了葡萄糖和酪蛋白氨基酸的無(wú)機(jī)鹽混和物。M9的組成對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是熟知的。
將深度粗糙突變體細(xì)菌菌株在穩(wěn)定期保持至少大約5小時(shí)之后，可以從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞并從細(xì)胞中提取LPS。雖然下面描述了用于從細(xì)胞中提取LPS的優(yōu)選的技術(shù)，但是可以使用已知的技術(shù)來(lái)從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞和從細(xì)胞中提取LPS。
收獲可以通過(guò)任何已知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)物在穩(wěn)定期保持至少大約5小時(shí)之后，將生物反應(yīng)器的內(nèi)含物抽至切向過(guò)濾裝置以分離開(kāi)用過(guò)的培養(yǎng)基和細(xì)胞。
然后通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)從細(xì)胞中提取LPS。已知的技術(shù)包括Galanos方法，其包括用苯酚、氯仿和石油醚的混和物(PCP)提取LPS，隨后蒸發(fā)掉氯仿和石油醚，添加丙酮和水以沉淀LPS，和通過(guò)離心或過(guò)濾回收LPS(Galanos等人，Eur.J.Biochem.9245(1969))；和上面引用的Chen方法，其包括用氯仿和甲醇(CM)的混和物提取LPS，隨后進(jìn)行一系列的甲醇沉淀步驟。
Chen方法的改進(jìn)描述于下，其對(duì)于用于商業(yè)應(yīng)用的LPS及其衍生物的生產(chǎn)是優(yōu)選的。
不管提取技術(shù)，結(jié)果是基本上純的干燥L(fēng)PS，其可以通過(guò)順次的酸水解和堿水解進(jìn)一步進(jìn)行加工從而形成3D-MLA，Ribi(U.S.Pat.No.4,436,727)和Myers等人(U.S.Pat.No.4,912,094)教導(dǎo)了這一點(diǎn)，因此于此處引用這些文獻(xiàn)作為參考。概括這些參考文獻(xiàn)的技術(shù)為用于形成3D-MLA的優(yōu)選實(shí)施方案，將LPS與有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)凍干而生產(chǎn)出MLA。無(wú)機(jī)酸優(yōu)選地為鹽酸、硫酸或磷酸。有機(jī)酸優(yōu)選地為甲苯磺酸或三氯乙酸。反應(yīng)可以在大約90℃至大約130℃的溫度進(jìn)行足夠的時(shí)間以完全水解，通常進(jìn)行大約15分鐘至大約60分鐘。MLA可以用溶劑(優(yōu)選的為丙酮)處理以溶解脂肪酸和其他雜質(zhì)，然后除去富含雜質(zhì)的脂肪酸溶劑。
此后將MLA經(jīng)歷溫和的堿處理以選擇性地從MLA的3位上去除β-羥基肉豆蔻酸(在溫和的堿性條件下，只有在3位上的β-羥基肉豆蔻酸是不穩(wěn)定的)。溫和的堿處理可以在含水的或有機(jī)的介質(zhì)中進(jìn)行。除了別的以外，合適的有機(jī)溶劑還包括甲醇或其他醇、二甲亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷或者其混和物。也可以使用水和與水易混和的有機(jī)溶劑的聯(lián)合物。
用于進(jìn)行水解的堿優(yōu)選地選自氫氧化物、碳酸鹽、磷酸鹽或胺。除了別的以外，舉例說(shuō)明的無(wú)機(jī)堿還包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀。除了別的以外，舉例說(shuō)明的有機(jī)堿還包括烷基胺(除了別的以外，例如二乙胺和三乙胺)。
在含水的介質(zhì)中，pH一般為大約10至大約14，優(yōu)選地為大約10至大約12。水解反應(yīng)一般在大約20℃至大約80℃進(jìn)行，優(yōu)選地在大約50℃至大約60℃進(jìn)行，該反應(yīng)進(jìn)行大約10分鐘至大約48小時(shí)的時(shí)間。
用于堿水解的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)包括將MLA溶解在CM 2∶1(v/v)中，用pH 10.5的0.5M Na2CO3緩沖水溶液使該溶液飽和，然后在真空抽吸裝置(大約100mmHg)下于45-50℃快速蒸發(fā)溶劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從深度粗糙突變體細(xì)菌菌株細(xì)胞的培養(yǎng)物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個(gè)碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細(xì)胞，從而產(chǎn)生出具有減少的磷脂含量的細(xì)胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細(xì)胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液。
深度粗糙突變體細(xì)菌菌株細(xì)胞、其培養(yǎng)物和制備培養(yǎng)物的方法如上所述。優(yōu)選地，深度粗糙突變體細(xì)菌菌株選自沙門(mén)氏菌屬或埃希氏菌(Escherichia)屬。如果深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于沙門(mén)氏菌屬，則更優(yōu)選地其屬于明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌種，更加優(yōu)選地其為明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595菌株。如果深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于埃希氏菌屬，則更優(yōu)選地其屬于大腸桿菌(Escherichia coli)種，更加優(yōu)選地其為大腸桿菌D31m4菌株。
第一個(gè)提取步驟可以用任何短鏈脂族醇來(lái)進(jìn)行。脂族醇可以是線性的、分枝的或環(huán)狀的。優(yōu)選地，脂族醇具有2-4個(gè)碳原子并易于和水混和。更優(yōu)選地，脂族醇為乙醇。
含有脂族醇的溶液可以含有任何比例的75wt％或更高的脂族醇。優(yōu)選地，溶液含有大約85wt％至大約95wt％的脂族醇。溶液的平衡基本上是水。作為脂族醇和溶液的水成分的不完全純或其他污染的結(jié)果，可以存在微量的其他化合物。
進(jìn)行第一個(gè)提取步驟的溫度可以是任何對(duì)于從培養(yǎng)細(xì)胞中充分提取磷脂有效的溫度。優(yōu)選地，溫度為大約35℃至大約65℃。更優(yōu)選地，溫度為大約45℃至大約55℃。
第一個(gè)提取步驟的其他參數(shù)(除了別的以外)為例如脂族醇溶液的添加速率、溶液和細(xì)胞的接觸持續(xù)時(shí)間以及攪拌或不攪拌，這些參數(shù)可由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行改變。
第一個(gè)提取步驟導(dǎo)致形成(i)富含磷脂的脂族醇溶液相和(ii)具有減少的磷脂含量的細(xì)胞。細(xì)胞膜的LPS成分基本上完全和具有減少的磷脂含量的細(xì)胞分離開(kāi)。
第二個(gè)提取步驟包括用氯仿∶甲醇(CM)的溶液提取具有減少的磷脂含量的細(xì)胞。
在第二個(gè)提取步驟中可以使用已知適合用于從細(xì)胞膜提取LPS(例如在Chen方法中)的任何比例的氯仿和甲醇。一般地，氯仿和甲醇的比例為大約2∶1至大約9∶1。具有和CM相等特性的溶劑混和物也可以用于從具有減少的磷脂含量的細(xì)胞中獲得LPS。
本方法超過(guò)Chen方法的優(yōu)點(diǎn)為在第一個(gè)提取步驟中除去了磷脂。本發(fā)明的第二個(gè)提取步驟對(duì)于具有減少的磷脂含量的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，從而導(dǎo)致形成基本上無(wú)磷脂的富含LPS的溶液，然而Chen方法的CM提取導(dǎo)致形成含有相當(dāng)高水平的磷脂的LPS溶液。產(chǎn)生相對(duì)無(wú)磷脂的LPS制備物的其他可選擇的方法如Galanos的方法(見(jiàn)上)就不那么令人期望，因?yàn)樗鼈儾贿m宜于大規(guī)模產(chǎn)生，它們使用引起健康和安全擔(dān)憂的溶劑混和物(例如苯酚∶氯仿∶石油醚)，或者兩者都有。
由于LPS溶液中磷脂的明顯缺乏，根據(jù)本方法的LPS的進(jìn)一步純化一般比Chen方法更簡(jiǎn)單和更便宜。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)將氯仿和甲醇從LPS溶液中蒸發(fā)能夠形成足夠純度的干燥L(fēng)PS剩余物。
可選擇地，可以例如通過(guò)上述的酸水解和堿水解來(lái)進(jìn)一步加工LPS，從而產(chǎn)生MLA或3D-MLA。
按照上述方法所生產(chǎn)出的3D-MLA可用于多種用途。一個(gè)優(yōu)選的用途為作為用于藥物組合物的免疫刺激劑或佐劑，該藥物組合物含有免疫原性的多核苷酸、多肽、抗體、T-細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞(APC)。免疫刺激劑或佐劑本質(zhì)上是指任何能夠提高或增強(qiáng)對(duì)于外源抗原的免疫反應(yīng)(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的)的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出的MLA或3D-MLA可以刺激的一種免疫反應(yīng)是Th1類(lèi)型的。
已經(jīng)觀察到單磷?；珹(MLA)(優(yōu)選的為3-O-脫?；瘑瘟柞；珹(3D-MLA))與鋁鹽的聯(lián)合物作為用于引起主要Th1型反應(yīng)的佐劑是有效的。高水平的Th1型細(xì)胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)針對(duì)所施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。相反地，高水平的Th2型細(xì)胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)體液的免疫反應(yīng)。在應(yīng)用含有MLA或3D-MLA的藥物組合物之后，患者將支持包括Th1和Th2型反應(yīng)的免疫反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)主要為T(mén)h1型時(shí)，Th1型細(xì)胞因子的水平將增長(zhǎng)至比Th2型細(xì)胞因子的水平更高的程度。這些細(xì)胞因子的水平可以容易地用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定法進(jìn)行評(píng)定。為了了解細(xì)胞因子的家族，可見(jiàn)Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，佐劑系統(tǒng)包括單磷?；珹(MLA)(優(yōu)選的為3D-MLA)和皂苷衍生物(如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals公司，F(xiàn)ramingham，MA)；七葉皂苷；毛地黃皂苷；或者石頭花(Gypsophila)或昆諾藜(Chenopodium quinoa)皂苷)的聯(lián)合物，例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MLA佐劑的聯(lián)合物，或者WO 96/33739中所描述的其中QS21用膽固醇淬滅的具有較少反應(yīng)原性的組合物。其他優(yōu)選的配劑含有水包油的乳狀液和生育酚。WO 95/17210中描述了另一個(gè)特別優(yōu)選的佐劑配劑，其使用水包油乳狀液中的QS21、3D-MLA和生育酚。
將下面的實(shí)施例包括在內(nèi)以說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，下面的實(shí)施例中所公開(kāi)的技術(shù)代表了由發(fā)明者發(fā)現(xiàn)能夠在本發(fā)明的實(shí)施中很好地起作用的技術(shù)，因此可以認(rèn)為這些技術(shù)構(gòu)成了用于其實(shí)施的優(yōu)選模式?？墒?，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中可以作出許多改變，并且仍獲得同樣或相似的結(jié)果，但并不離開(kāi)本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1-一般方法A.培養(yǎng)基的制備細(xì)胞生長(zhǎng)在M9培養(yǎng)基上進(jìn)行，M9培養(yǎng)基可通過(guò)將無(wú)機(jī)鹽的無(wú)菌溶液、酪蛋白氨基酸和葡萄糖組合在一起來(lái)制備。M9鹽溶液一般在發(fā)酵罐中制備，其含有下列鹽2.0g/L NaCl、0.2g/L MgSO4·7H2O、3.0g/L KH2PO4、6.0g/L Na2HPO4和1.0g/L NH4Cl。然后向發(fā)酵罐中無(wú)菌地加入20％(w/v)酪蛋白氨基酸(20ml/L)和50％(w/v)葡萄糖(32ml/L)的無(wú)菌溶液，從而獲得完全的培養(yǎng)基。
B.種子生長(zhǎng)一般地，一個(gè)無(wú)菌的250ml錐形瓶中裝入50ml無(wú)菌的M9培養(yǎng)基。將一個(gè)種子瓶的明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595(大約108cfu)解凍并加入錐形瓶中，然后用紗布塞子塞住瓶口。將培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)6-8小時(shí)，直至明顯出現(xiàn)旺盛的生長(zhǎng)。
C.細(xì)胞生長(zhǎng)明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的培養(yǎng)物在裝備了2.5L玻璃容器的BioFlo III發(fā)酵罐(New Brunswich Scientific公司)中生長(zhǎng)。在一般的運(yùn)作中，容器裝入2.0L的M9鹽溶液并經(jīng)過(guò)高壓滅菌，然后無(wú)菌地加入酪蛋白氨基酸和葡萄糖的無(wú)菌溶液。發(fā)酵罐裝備有用于防沫劑(0.1％SAG-471，Witco公司)和NH4OH(30％)的給料管以及用于pH、dO2和泡沫的探針。通過(guò)NH4OH給料將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH 6.9。然后將發(fā)酵罐用全部的種子培養(yǎng)物進(jìn)行接種，并在空氣噴射(一般為2.0Lpm)和攪拌(一般為50rpm)的同時(shí)于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)于590nm測(cè)量光密度監(jiān)測(cè)培養(yǎng)的生長(zhǎng)期。通過(guò)離心或切向流過(guò)濾(tangential flow filtration)收獲細(xì)胞，并用水洗滌，然后凍干。
D.脂多糖(LPS)的提取根據(jù)經(jīng)過(guò)較小修改的Qureshi等人(1986)的程序分離出LPS。在一般的運(yùn)作中，首先將干燥的細(xì)胞在90％乙醇(v/v)中以20mg/ml的濃度于室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后通過(guò)真空過(guò)濾進(jìn)行回收。將細(xì)胞經(jīng)過(guò)第二次乙醇提取，隨后順次用丙酮和乙醚(每次15分鐘，都為40mg/ml，基于起始重量)進(jìn)行提取，然后讓結(jié)果所得的醚粉末空氣干燥過(guò)夜。其間，制備苯酚(89％)∶氯仿∶石油醚19∶45∶72(v/v/v，縮寫(xiě)為PCP)的溶液并讓其靜置過(guò)夜。將醚粉末以70mg/ml的濃度懸浮在PCP(傾去過(guò)量的水)中。將溶液攪拌30分鐘，然后離心(3000g，15分鐘，0-5℃)。將上清液部分倒入圓底燒瓶中，然后用PCP再次提取細(xì)胞沉淀。合并上清液部分，然后在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至所有的揮發(fā)性溶劑大部分被除去。然后測(cè)量剩下的體積。逐滴加入水直至明顯出現(xiàn)持續(xù)的混濁，然后在迅速攪拌的同時(shí)向苯酚溶液中加入5體積的丙酮并隨后加入1體積的乙醚(都在冰浴中冷凍)。將溶液置于冰浴中30分鐘，然后通過(guò)離心(5000g，15分鐘，0-5℃)回收沉淀出的LPS。重力過(guò)濾上清液部分以回收任何沒(méi)有剩余在沉淀中的LPS一般來(lái)說(shuō)是必需的。用最小體積的冷丙酮洗滌一次LPS，并通過(guò)離心/過(guò)濾進(jìn)行回收，然后在真空中干燥?；诔跏嫉募?xì)胞干重，一般的收率為4-5％。
E.4′-單磷?；珹(MLA)的制備將LPS以10mg/ml的濃度懸浮在水中，并于45-55℃用水浴超聲處理(bath-sonication)以幫助分散固體物質(zhì)。結(jié)果所得的溶液應(yīng)當(dāng)是輕微混濁的，但無(wú)肉眼可見(jiàn)的固體。向該溶液中加入1體積的0.2N HCl，然后將其置于沸水浴中15分鐘。在冰浴中淬滅反應(yīng)，然后用5體積(相對(duì)于起始的LPS溶液)的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取。將二相溶液渦旋振蕩，并通過(guò)低速離心(500-1000g)分離兩相。回收較低的相并在氮?dú)庵姓舭l(fā)，從而收獲粗制的MLA。
F.3-O-脫?；?4’-單磷?；珹(3D-MLA)的制備將粗制的MLA以大約1-5mg/ml的濃度溶解在氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，并將3.0ml的該溶液轉(zhuǎn)移至16×100mm的試管中。將附加的0.4ml甲醇加入試管中，然后將其置于50℃的水浴中10分鐘。通過(guò)加入40μl的0.5M KHCO3(pH 10.5)來(lái)起始反應(yīng)，并將溶液于50℃溫育20分鐘。在這段時(shí)間的最后，將試管從水浴中取出，并通過(guò)在添加2.0ml 0.1N HCl(冷凍的)之后進(jìn)行渦旋振蕩來(lái)淬滅反應(yīng)。通過(guò)下列步驟來(lái)回收3D-MLA加入1.0ml甲醇，渦旋振蕩，離心(500-1000g)，和在氮?dú)庵袑⑤^低(有機(jī))相蒸發(fā)至干。
實(shí)施例2-分析方法A.MLA和相關(guān)樣品的薄層層析法(TLC)所有的TLC分析用覆蓋有Silica Gel 60(E Merck)的5×10cm平板來(lái)進(jìn)行。樣品一般以10mg/ml的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)溶液應(yīng)用于TLC平板，在操作時(shí)通過(guò)用毛細(xì)吸管將3μl溶液(30μg樣品)以小點(diǎn)的方式列成5mm的線來(lái)進(jìn)行應(yīng)用。用含有氯仿/甲醇/水/氫氧化銨50∶31∶6∶2(v/v)的溶劑系統(tǒng)來(lái)展開(kāi)平板。展開(kāi)的平板上的條帶通過(guò)下列步驟來(lái)顯現(xiàn)噴灑10％(w/v)磷鉬酸的乙醇溶液，隨后于150-160℃進(jìn)行焦化。在一些情況下，點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度可通過(guò)于520nm的掃描波長(zhǎng)用Shimadzu CS9000U Dual Wavelength FlyingSpot Scanner(Shimadzu公司)進(jìn)行掃描光密度分析法來(lái)定量。
B.MLA/3D-MLA的高效液相色譜法(HPLC)分析首先將需要分析的樣品轉(zhuǎn)變成游離酸形式，這是通過(guò)用2ml的0.1N HCl洗滌3-5mg樣品于5ml氯仿∶甲醇(2∶1v/v)中所形成的溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將二相系統(tǒng)渦旋振蕩，離心，然后將較低(有機(jī))相轉(zhuǎn)移至試管中并在氮?dú)饬髦姓舭l(fā)。然后將剩余物通過(guò)用重氮甲烷處理進(jìn)行甲基化。簡(jiǎn)要地說(shuō)，重氮甲烷的醚溶液通過(guò)下列步驟來(lái)制備將60-100mg1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG，Aldrich)置于2英錢(qián)的小瓶中，每毫克MNNG加入60μl乙醚，然后每毫克MNNG加入9μl的5N NaOH，同時(shí)于＜-10℃攪拌溶液。在反應(yīng)完全之后，通過(guò)下列步驟將檸檬黃色的醚相干燥將其轉(zhuǎn)移到含有幾顆NaOH的第二個(gè)小瓶中，然后將其渦旋振蕩，這都在＜-10℃進(jìn)行。將經(jīng)酸洗滌的樣品溶解在1ml氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，并置于＜-10℃的浴中，然后在攪拌的同時(shí)逐滴加入重氮甲烷溶液直至暗黃色的色調(diào)持續(xù)出現(xiàn)。然后將溶劑在氮?dú)饬髦杏诃h(huán)境溫度蒸發(fā)，并進(jìn)一步在真空中干燥至少30分鐘。
色譜分析在C18反相柱(Nova-Pak，4μm的顆粒直徑，8mm×10cm[Waters])上進(jìn)行。將甲基化的樣品以100μg/ml的濃度溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，并通過(guò)0.45μm的PTFE注射器過(guò)濾器。一般使用20-25μl的注射體積，隨后以2ml/分鐘的流速用20-80％異丙醇的乙腈溶液的線性梯度洗脫60分鐘，同時(shí)在210nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
C.LPS同系物含量的HPLC分析LPS傾向于為高度異質(zhì)的物質(zhì)，這是由于下列部分中的可變性1)O-抗原和核心區(qū)域中糖殘基的數(shù)量；2)在核心區(qū)域中和在脂A中的磷酸酯上的極性取代；和3)連接到脂A主鏈上的脂肪酸的數(shù)量和位置。正是該后面的可變性來(lái)源對(duì)于3D-MLA(MPL)的同系物含量具有影響。LPS水解成MLA和3D-MLA消除了O-抗原和核心區(qū)域中的可變性，可是由于O-聯(lián)接的脂肪酸不可控的損失其也引入了附加的異質(zhì)性。這妨礙了準(zhǔn)確獲知完整的LPS中的酰基化模式。作為避開(kāi)這一點(diǎn)的辦法，開(kāi)發(fā)出了一種方法，即在不會(huì)導(dǎo)致O-聯(lián)接的脂肪酸損失的溫和條件下去除磷酸酯和核心區(qū)域。然后可以用HPLC分析結(jié)果所得的去磷酸化脂A(零磷?；珹，或ZPL)，從而獲得親本LPS中?；Ｊ降臏?zhǔn)確反映。
該方法一般按照下述進(jìn)行。將0.5-5.0mg的LPS樣品于27℃在200μl濃縮的氫氟酸中水解3-4小時(shí)。該反應(yīng)必須在緊緊蓋住的特氟隆管中并在有良好通風(fēng)的通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。通過(guò)在氮?dú)饬髦杏诃h(huán)境溫度蒸發(fā)來(lái)除去HF，然后將水解產(chǎn)物溶解在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中并轉(zhuǎn)移到16×100mm的玻璃試管中，隨后在氮?dú)饬髦姓舭l(fā)溶劑。使用水浴超聲處理將剩余物懸浮在1.0ml 0.1％三乙胺中，加入1.0ml 40mMNaOAc，然后將試管懸浮在沸水浴中30-45分鐘。通過(guò)在冰浴中冷卻來(lái)淬滅反應(yīng)，并通過(guò)用5ml氯仿∶甲醇2∶1(v/v)提取來(lái)回收Z(yǔ)PL。將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至小的螺口瓶中，然后在氮?dú)庵姓舭l(fā)溶劑。ZPL通過(guò)加入200μl的10mg/ml鹽酸O-(3，5-二硝基芐基)羥胺(RegisTechnologies公司)的吡啶溶液進(jìn)行衍生化，緊緊蓋住小瓶，然后于60℃溫育3小時(shí)。在氮?dú)庵姓舭l(fā)除去吡啶，剩余物進(jìn)一步在真空中干燥＞30分鐘。然后將剩余物懸浮在500μl氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，并上載至0.5-1.0ml已經(jīng)在同樣的溶劑中預(yù)平衡的Accell-QMA(乙酸鹽形式；Waters)床上。用總共5.0ml的氯仿∶甲醇2∶1(v/v)以分成幾個(gè)小部分的方式漂洗柱，并收集洗脫液至16×100mm的試管中。向洗脫液中加入2.0ml的0.1N HCl，將二相系統(tǒng)渦旋振蕩，于500-1000g簡(jiǎn)短離心，然后將較低(有機(jī))相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)試管中并在氮?dú)庵姓舭l(fā)。將剩余物溶解在100-300μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，然后通過(guò)0.45μm的PTFE注射器過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)漂洗過(guò)濾器兩次，并將濾液在氮?dú)庵姓舭l(fā)。濾液最后溶解在50-150μl氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中，并轉(zhuǎn)移至自動(dòng)注射器小瓶中以用于HPLC分析。HPLC條件如下C18反相柱(例如Waters)；10μl注射體積；20-80％異丙醇的乙腈溶液的線性梯度，經(jīng)過(guò)60分鐘，流速為2ml/分鐘；于254nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
實(shí)施例3-來(lái)自不同時(shí)間收獲的培養(yǎng)物中的MLA/3D-MLA的同系物組成的比較用下列參數(shù)進(jìn)行一系列發(fā)酵罐的運(yùn)行2.0L M9培養(yǎng)基(起始pH6.84-6.87)，2Lpm的空氣流量，于50rpm進(jìn)行攪拌，37℃，無(wú)pH控制。通過(guò)于590nm測(cè)量光密度監(jiān)測(cè)培養(yǎng)，并在獲得所期望的生長(zhǎng)階段時(shí)終止培養(yǎng)。按照上述方法處理和提取細(xì)胞以獲得LPS樣品，然后將該樣品水解成MLA和3D-MLA，并用HPLC進(jìn)行分析(見(jiàn)實(shí)施例1和2)。結(jié)果概括在表1中。
表1.來(lái)自不同年齡收獲的細(xì)胞中的MLA和3D-MLA的同系物組成
這些數(shù)據(jù)表明明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的培養(yǎng)物在穩(wěn)定期期間改變了它們的LPS的酰基化模式，結(jié)果導(dǎo)致源自該LPS的MLA中3-O-脫酰基化己?；由细；N類(lèi)的全部含量的增加，并順次引起從該MLA制備的3D-MLA中3-O-脫?；乎；N類(lèi)的含量增加。
實(shí)施例4-來(lái)自不同時(shí)間收獲的培養(yǎng)物中的LPS的同系物組成的比較用下列參數(shù)進(jìn)行一系列發(fā)酵罐的運(yùn)行2.0L M9培養(yǎng)基(起始pH6.84-6.87)，2Lpm的空氣流量，于225rpm進(jìn)行攪拌，37℃，無(wú)pH控制。通過(guò)于590nm測(cè)量光密度監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)階段。按照實(shí)施例1中描述的方法處理和提取細(xì)胞以獲得LPS樣品。按照實(shí)施例2中描述的方法將LPS樣品水解成ZPL并用HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果概括在表2中。
表2.來(lái)自不同年齡收獲的細(xì)胞中的LPS的同系物組成
在來(lái)自穩(wěn)定期早期細(xì)胞的LPS中沒(méi)有檢測(cè)到3-O-脫?；乎；煞?運(yùn)行A)。因此，從該LPS制備的3D-MLA中己?；滴锏奈ㄒ粊?lái)源為庚酰基化的物質(zhì)(24％)。相反地，來(lái)自在穩(wěn)定期晚期收獲的細(xì)胞的LPS含有庚?；?-O-脫?；乎；N類(lèi)(分別為19％和17％)。這些種類(lèi)都對(duì)于從該LPS制備的3D-MLA(MPL)中的己酰基含量有所貢獻(xiàn)。想不到的是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在某些條件下產(chǎn)生3-O-脫酰基化己?；鵏PS種類(lèi)。
實(shí)施例5-預(yù)提取溫度對(duì)于明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595 LPS的純度的影響明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的細(xì)胞用與實(shí)施例1中概述的基本上相同的條件在80L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific)中生長(zhǎng)。細(xì)胞通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行濃縮而不是離心，所得的漿狀物含有51.5mg干細(xì)胞質(zhì)量/ml。制備三種溶液，在這些溶液中150ml細(xì)胞懸浮液的等分試樣各與600ml乙醇混和。將乙醇溶液于22℃、37℃和50℃攪拌1小時(shí)，并過(guò)濾。將細(xì)胞在相同條件(除了使用95％乙醇之外)下進(jìn)行第二次乙醇提取。通過(guò)抽吸過(guò)濾回收細(xì)胞，然后于50℃在氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取過(guò)夜。將溶液過(guò)濾，然后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，從而得到LPS制備物。將于各個(gè)溫度所獲得的第一和第二次乙醇提取濾液的樣品以及從預(yù)提取的細(xì)胞中獲得的LPS根據(jù)實(shí)施例2中的方法用薄層層析法進(jìn)行分析。TLC板的圖象顯示在圖1中。
圖1顯示了在乙醇提取期間用不同溫度獲得的乙醇提取物和LPS樣品的TLC板。左邊的平板從左至右顯示了于22℃、37℃和50℃的溫度時(shí)的乙醇提取物。該平板最右邊的樣品為真正的LPS樣品。右邊的平板顯示了從各個(gè)制備物中獲得的LPS。道3、4和5中的樣品分別相應(yīng)于從經(jīng)過(guò)在22℃、37℃和50℃用乙醇預(yù)提取的細(xì)胞中獲得的LPS。在Rf～0.6的濃重的帶相應(yīng)于磷脂和脂肪酸雜質(zhì)。這些雜質(zhì)的水平通過(guò)增加乙醇提取的溫度而減少，其在于50℃預(yù)提取的樣品中是非常低的。
從圖1的TLC板中可以明顯地看出在升高的溫度下用乙醇進(jìn)行預(yù)提取對(duì)于去除雜質(zhì)是有效的，否則這些雜質(zhì)會(huì)被氯仿∶甲醇4∶1(v/v)共提取。于50℃的預(yù)提取導(dǎo)致形成基本上無(wú)這些雜質(zhì)的LPS。
實(shí)施例6-有和沒(méi)有經(jīng)過(guò)乙醇提取而獲得的LPS的比較三批明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595的細(xì)胞用與實(shí)施例1中概述的基本上相同的條件在750L發(fā)酵罐(B.Braun)中生長(zhǎng)。通過(guò)切向流過(guò)濾收獲細(xì)胞，從每批中獲得細(xì)胞懸浮液的樣品并凍干。細(xì)胞塊經(jīng)過(guò)兩次1小時(shí)的于50℃用90％乙醇進(jìn)行的預(yù)提取。在兩次提取之間用切向流過(guò)濾回收細(xì)胞。然后細(xì)胞在回流的同時(shí)用氯仿∶甲醇4∶1(v/v)提取過(guò)夜。通過(guò)切向流過(guò)濾回收提取物并蒸發(fā)至干。將凍干的細(xì)胞樣品在回流的氯仿∶甲醇4∶1(v/v)中提取過(guò)夜，然后將溶液過(guò)濾并將濾液蒸發(fā)至干。有和沒(méi)有經(jīng)過(guò)乙醇預(yù)提取而獲得的LPS樣品基本上按照實(shí)施例2中描述的方法用TLC進(jìn)行分析。于大約Rf＝0.01-0.90掃描TLC板，并對(duì)于每個(gè)樣品計(jì)算出LPS區(qū)域(Rf＝0.01-0.20)中的強(qiáng)度與總強(qiáng)度的比率。結(jié)果給出在表3中。
表3.來(lái)自有和沒(méi)有用乙醇預(yù)提取的細(xì)胞的LPS純度
注1LPS區(qū)域中總強(qiáng)度的百分?jǐn)?shù)＝[(Rf＝0.01-0.20中的強(qiáng)度)/(Rf＝0.01-0.90中的強(qiáng)度)]×100表3中的結(jié)果證明，在于50℃用90％乙醇預(yù)提取明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595細(xì)胞之后獲得的LPS顯著比從沒(méi)有預(yù)提取的細(xì)胞中獲得的材料更純。
此處公開(kāi)和要求的所有方法可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行和實(shí)行，而不需要不適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)用優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是可以對(duì)此處描述的方法的步驟或步驟順序施行改變而不會(huì)離開(kāi)本發(fā)明的理念、精神和范圍。更明確地，明顯的是可以用某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的試劑替代此處描述的試劑，而同時(shí)可獲得相同或相似的結(jié)果。所有這些對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的類(lèi)似替代和修改可認(rèn)為處于附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和理念之中。
權(quán)利要求
1.從深度粗糙突變體細(xì)菌菌株細(xì)胞的培養(yǎng)物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1-4個(gè)碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細(xì)胞，從而產(chǎn)生出具有減少的磷脂含量的細(xì)胞；(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細(xì)胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液。
2.權(quán)利要求1的方法，其中深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于沙門(mén)氏菌屬或埃希氏菌屬。
3.權(quán)利要求2的方法，其中沙門(mén)氏菌屬的深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌種。
4.權(quán)利要求3的方法，其中明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌種的深度粗糙突變體細(xì)菌菌株為明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌R595菌株。
5.權(quán)利要求2的方法，其中埃希氏菌屬的深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于大腸桿菌種。
6.權(quán)利要求5的方法，其中大腸桿菌種的深度粗糙突變體細(xì)菌菌株屬于大腸桿菌D31m4菌株。
7.權(quán)利要求1的方法，其中脂族醇具有2-4個(gè)碳原子。
8.權(quán)利要求7的方法，其中脂族醇為乙醇。
9.權(quán)利要求1的方法，其中含有脂族醇的溶液含有大約85wt％至大約95wt％的脂族醇。
10.權(quán)利要求1的方法，其中用脂族醇的提取在大約35℃至大約65℃的溫度進(jìn)行。
11.權(quán)利要求10的方法，其中溫度為大約45℃至大約55℃。
12.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包含從LPS溶液中蒸發(fā)氯仿和甲醇，從而獲得干燥的LPS剩余物。
13.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包含將干燥的LPS剩余物經(jīng)過(guò)順次的酸水解和堿水解從而形成3D-MLA。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法形成的LPS。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法形成的3D-MLA。
全文摘要
此處公開(kāi)了生產(chǎn)脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)在培養(yǎng)基中培育深度粗糙突變體細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物；(b)將該培養(yǎng)物在穩(wěn)定期保持至少大約5小時(shí)；(c)從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞；和(d)從細(xì)胞中提取LPS。該方法允許LPS的生產(chǎn)，其中該LPS可用于生產(chǎn)具有至少大約20mol％己?；滴锘鶊F(tuán)的3－O－脫?；瘑瘟柞；珹(3D－MLA)。此處還公開(kāi)了從深度粗糙突變體細(xì)菌菌株細(xì)胞的培養(yǎng)物中提取脂多糖(LPS)的方法，其包括(a)用基本上由至少大約75wt％的具有1－4個(gè)碳原子的脂族醇和平衡水所組成的溶液提取細(xì)胞，從而產(chǎn)生出具有減少的磷脂含量的細(xì)胞；和(b)用含有氯仿和甲醇的溶液提取具有減少的磷脂含量的細(xì)胞，從而獲得LPS的氯仿和甲醇溶液(CM)。該方法提供了LPS的CM溶液，其具有減少的磷脂含量，并通過(guò)相對(duì)簡(jiǎn)單和不貴的加工步驟來(lái)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1928107SQ20061015364
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月30日
發(fā)明者K·R·米爾斯, D·S·斯尼德 申請(qǐng)人:利里克薩有限公司