專利名稱：可放大的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)噬菌體VLP的有效發(fā)酵方法。該方法提升了VLP的產(chǎn)量，并且可放大至商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。該方法包括噬菌體重組衣殼蛋白在允許衣殼蛋白自發(fā)自裝配為VLP的條件下在細(xì)菌宿主中表達(dá)。
可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的VLP的具體例子是噬菌體的VLP，優(yōu)選RNA噬菌體的VLP。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，或基本由這些物質(zhì)組成，或由這些物質(zhì)組成。優(yōu)選地，RNA噬菌體選自a)噬菌體Qβ；b)噬菌體R17；c)噬菌體fr；d)噬菌體GA；e)噬菌體SP；f)噬菌體MS2；g)噬菌體M11；h)噬菌體MX1；i)噬菌體NL95；k)噬菌體f2；l)噬菌體PP7和m)噬菌體AP205。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，生產(chǎn)了包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的VLP，其中該外殼蛋白具有選自以下序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO5，指QβCP；(b)SEQ ID NO5和SEQID NO15的混合物(QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO16(R17衣殼蛋白)；(d)SEQ ID NO17(fr衣殼蛋白)；(e)SEQ ID NO18(GA衣殼蛋白)；(f)SEQ ID NO19(SP衣殼蛋白)；(g)SEQ ID NO19和SEQ ID NO20的混合物；(h)SEQ ID NO21(MS2衣殼蛋白)；(i)SEQ ID NO22(M11外殼蛋白)；(j)SEQ ID NO23(MX1衣殼蛋白)；(k)SEQ ID NO24(NL95衣殼蛋白)；(l)SEQ ID NO25(f2衣殼蛋白)；(m)SEQ ID NO26(PP7衣殼蛋白)；和(n)SEQ ID NO12(AP205衣殼蛋白)。
在大腸桿菌中表達(dá)時，Qβ外殼蛋白的N-末端甲硫氨酸通常被去除(Stoll，E.等人.J.Biol.Chem.252990-993(1977))。由N-末端甲硫氨酸已被去除的Qβ外殼蛋白組成的VLP，或包含N-末端甲硫氨酸被切除或仍然存在的Qβ外殼蛋白混合物的VLP也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，VLP是一種嵌合VLP，其包含或由RNA噬菌體外殼蛋白、其突變體或片段的多于一種氨基酸序列、優(yōu)選兩種氨基酸序列組成。
在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，VLP包含或由兩種不同的RNA噬菌體外殼蛋白組成，所述兩種外殼蛋白具有氨基酸序列SEQ IDNO5和SEQ ID NO15或SEQ ID NO19和SEQ ID NO20。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，生產(chǎn)的VLP包含、或基本由、或由RNA噬菌體Qβ、fr、AP205或GA的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式種，VLP是RNA噬菌體Qβ的VLP。Qβ的衣殼或病毒樣顆粒顯示出具有25nm直徑和T＝3準(zhǔn)對稱的二十面體噬菌體樣衣殼結(jié)構(gòu)。該衣殼包含衣殼蛋白的180個拷貝，它們通過二硫橋以共價五聚體和六聚體連接(Golmohammadi，R.等人.Structure4543-5554(1996))。
優(yōu)選的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，特別是根據(jù)本發(fā)明的Qβ和fr的病毒樣顆粒，在WO02/056905中公開，該公開文本在此全文引入作為參考。WO02/056905的實(shí)施例18給出了由Qβ制備VLP顆粒的詳細(xì)描述。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，VLP是RNA噬菌體AP205的VLP。AP205VLP的有裝配能力的突變體形式，包括在氨基酸5位的脯氨酸被替換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白，也可用于本發(fā)明的實(shí)踐中，并且導(dǎo)致了本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方式。WO2004/007538，特別是在實(shí)施例1和實(shí)施例2中，描述了如何獲得包含AP205外殼蛋白的VLP，由此特別描述了其表達(dá)和純化。WO2004/007538在此引入作為參考。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，VLP包含或由病毒、優(yōu)選RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中該突變外殼蛋白已經(jīng)通過取代和/或缺失而去除了至少一個賴氨酸殘基而被修飾。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的VLP包含或由病毒、優(yōu)選RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中該突變外殼蛋白已經(jīng)通過取代和/或插入而添加了至少一個賴氨酸殘基而被修飾。缺失、取代或添加至少一個賴氨酸殘基允許改變與抗原的偶聯(lián)程度。
Qβ外殼蛋白的VLP或衣殼在其表面上展示限定數(shù)量的賴氨酸殘基，其限定的拓樸學(xué)結(jié)構(gòu)為三個賴氨酸殘基指向衣殼內(nèi)部并與RNA相互作用，并且另外四個賴氨酸殘基暴露于衣殼外部。
暴露的賴氨酸殘基被精氨酸取代的Qβ突變體也包含在本發(fā)明中。優(yōu)選地，這些突變外殼蛋白包含或由選自下組的氨基酸序列組成a)Qβ-240(SEQ ID NO7，Lys13→Arg)；b)Qβ-243(SEQ ID NO8，Asn10→Lys)；c)Qβ-250(SEQ ID NO9，Lys2→Arg)；d)Qβ-251(SEQID NO10，Lys16→Arg)；和e)Qβ-259(SEQ ID NO11，Lys2→Arg，Lys16→Arg)。上述提到的Qβ突變外殼蛋白、突變的Qβ外殼蛋白VLP和衣殼的構(gòu)建、表達(dá)和純化分別描述于WO02/056905中。特別參考上述申請的實(shí)施例18。
在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組衣殼蛋白是具有SEQ IDNO12所示氨基酸序列的噬菌體AP205的衣殼蛋白或其突變體，它能夠形成VLP，例如蛋白質(zhì)AP205P5T(SEQ ID NO13)或AP205N14D(SEQ ID NO14)。
在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組衣殼蛋白由大腸桿菌RNA噬菌體Qβ的133個氨基酸的外殼蛋白C組成，該外殼蛋白C包含或優(yōu)選地由SEQ ID NO5所示的氨基酸序列組成，其中優(yōu)選地所述重組衣殼蛋白能夠通過自裝配形成VLP。
在一個實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體包含第一終止密碼子和第二終止密碼子，其中所述第一終止密碼子直接定位于所述第一核苷酸序列的3’，并且所述第二終止密碼子直接定位于所述第一終止密碼子的3’，并且其中第一或第二終止密碼子中的至少一個是TAA。例如，質(zhì)粒pTac-nSDAP205(SEQ ID NO30)包含天然存在的TAA終止密碼子作為第一終止密碼子和附加的直接位于第一終止密碼子3’的TGA終止密碼子。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼一種重組衣殼蛋白，優(yōu)選QβCP，或其突變體或片段，最優(yōu)選地是SEQ ID NO5，并且其中所述第二核苷酸序列編碼任一其他蛋白質(zhì)，優(yōu)選Qβ A1蛋白或其突變體或片段，最優(yōu)選地是SEQ ID NO15，并且其中所述第一和第二核苷酸序列被正好一個包含至少一個TAA終止密碼子的一段序列隔開。在一個實(shí)施方式中，所述TAA終止密碼子通過將天然存在的終止密碼子(優(yōu)選TGA)置換為序列TAA而產(chǎn)生?？蛇x地并且更優(yōu)選地，所述TAA終止密碼子通過將天然存在的終止密碼子(優(yōu)選TGA)置換為序列TAATGA(SEQ ID NO32)而產(chǎn)生。
例如，Qβ基因C區(qū)域?qū)?yīng)于NCBI genebank登錄號M99039(核苷酸46-1062)?；駽包含編碼133個氨基酸的Qβ外殼蛋白(SEQ IDNO5)的第一核苷酸序列和編碼329個氨基酸的通讀蛋白A1((SEQ IDNO15)的第二核苷酸序列。SEQ ID NO6的核苷酸1-399(NCBI GenBank登錄號M99039的核苷酸46-444)對應(yīng)于所述編碼133個氨基酸的QβCP的所述第一核苷酸序列，SEQ ID NO6的核苷酸400到402對應(yīng)于強(qiáng)TAA終止密碼子，并且SEQ ID NO6的403到405對應(yīng)于滲漏TGA終止密碼子，其后緊跟著是所述第二核苷酸序列(QβA1)。令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)構(gòu)建體中與A1有關(guān)的核苷酸序列的存在導(dǎo)致更高的RNA穩(wěn)定性，因此，導(dǎo)致與A1序列缺失的構(gòu)建體相比提高的QβCP和VLP的產(chǎn)量。
重組蛋白的表達(dá)可顯著降低細(xì)菌宿主的生長速率，這是由于累積的蛋白質(zhì)的毒性效應(yīng)和由蛋白質(zhì)合成引起的代謝負(fù)擔(dān)。特別地，可能會發(fā)生細(xì)胞裂解和低質(zhì)粒保持。誘導(dǎo)型啟動子提供了將發(fā)酵過程的生長期與生產(chǎn)期分開的可能性。誘導(dǎo)型啟動子在細(xì)菌宿主的生長期中被一種阻遏物分子阻遏，在生產(chǎn)期中通過將細(xì)菌宿主暴露于誘導(dǎo)環(huán)境而被誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型啟動子因此允許細(xì)菌宿主快速生長，優(yōu)選地在生長期內(nèi)以對數(shù)速率生長并到達(dá)高細(xì)胞密度。因此，誘導(dǎo)型啟動子在生產(chǎn)期結(jié)束時提供了表達(dá)產(chǎn)物的高產(chǎn)量。因此，優(yōu)選地將誘導(dǎo)型啟動子用于重組蛋白的表達(dá)。
誘導(dǎo)型啟動子的一種公知的例子是lac啟動子，其形成了lac操縱子的一部分，并可通過添加乳糖或強(qiáng)合成誘導(dǎo)物異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)到細(xì)菌宿主的生長培養(yǎng)基中而被誘導(dǎo)。Donavan等人.2000(Can.J.Microbiol 46532-541)報道了一種在lac啟動子的控制下表達(dá)單克隆抗體的改進(jìn)的方法。誘導(dǎo)型啟動子的進(jìn)一步的例子在Makrides 1996(Microbiological Reviews，p.512-538)的表1中提供。
基于誘導(dǎo)型啟動子的表達(dá)系統(tǒng)的一個典型缺陷是啟動子的“滲漏性”，意思是啟動子在生長期中被不充分地阻遏而引起重組蛋白的一定的表達(dá)率。這典型地導(dǎo)致細(xì)胞密度降低或?qū)е沦|(zhì)粒的不穩(wěn)定性，并且，結(jié)果導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)量降低。Makrides 1996(MicrobiologicalReviews，p.512-538)。傾向于不充分阻遏的啟動子的一個例子是VHb啟動子，其在高氧條件下被阻遏并且在缺氧時被誘導(dǎo)。
為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選被嚴(yán)格阻遏的啟動子。在一個實(shí)施方式中，啟動子被阻遏物lacI阻遏。所述啟動子的例子公開于Makrides1996(Microbiol.Rev.60512-538)、Goldstein和Doi 1995(Biotechnology Annual Review 1105-128)、Hannig和Makrides 1998(TIBTECH 1654-60)和Stevens 2000(Structures 8，R177-R185)中。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，啟動子被乳糖誘導(dǎo)，更優(yōu)選地選自lac、lacUV5、tac、trc、Psyn lppa、lpp-lac、T7-lac、T3-lac和T5-lac。對于本發(fā)明的目的特別優(yōu)選的是tac啟動子(SEQ ID NO2)或其突變體或變體。在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括與SEQ ID NO2具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％、優(yōu)選98％到100％、最優(yōu)選99％的序列同源性的tac啟動子的突變體或截短或缺失變體。其中所述突變的截短或缺失變體的啟動子的強(qiáng)度與SEQ ID NO2的啟動子強(qiáng)度相當(dāng)。熟練技術(shù)人員可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過比較表達(dá)研究確定給定序列的啟動子強(qiáng)度。在一個本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，驅(qū)動重組衣殼蛋白表達(dá)的啟動子包含或由SEQ ID NO2組成。Tac啟動子是lacUV5啟動子的-10區(qū)和trp啟動子的-35區(qū)的融合產(chǎn)物，并且將trp的高轉(zhuǎn)錄效率和lac啟動子的調(diào)節(jié)元件結(jié)合起來(de Boer等人.1983，PNAS 8021-25；Amann等人.1983 Gene 25167-178)。它提供了充分的高表達(dá)率和高蛋白產(chǎn)量，同時避免了在使用更強(qiáng)的啟動子例如T7啟動子時可能出現(xiàn)的不溶性的或不正確折疊的重組蛋白的形成。Trc和tic啟動子是tac啟動子的突變形式(Brosius等人.1985，The Journal of BiologicalChemistry 260(6)3539-3541)。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動子選自tic、trc和tac。
為了為本發(fā)明目的構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體，啟動子通過核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno序列，SD)與所述編碼重組衣殼蛋白的第一核苷酸序列有效連接，典型地在其3’末端包含ATG起始密碼子。適合本發(fā)明目的的Shine-Dalgarno序列是本領(lǐng)域公知的

等人.1988，DNA7(6)399-405；Ringquist等人.1992，Mol.Micr.61219-1229)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體包含SEQ ID NO4所示的

等人.1988(DNA 7(6)399-405)的SD序列。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體包含Ringquist等人.1992(Mol.Micr.61219-1229，SEQID NO3，nSD)的Shine-Dalgarno序列。令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)SEQ IDNO3特別適合于本發(fā)明，因?yàn)樗鼘?dǎo)致重組衣殼蛋白的表達(dá)水平提高和產(chǎn)量提高。SEQ ID NO3特別適合提高AP205衣殼蛋白的表達(dá)。在一個本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)構(gòu)建體包含選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的Shine-Dalgarno序列，優(yōu)選地所述Shine-Dalgarno序列是SEQ ID NO3。
轉(zhuǎn)錄終止子是表達(dá)構(gòu)建體的功能型元件。熟練技術(shù)人員將可以從廣泛的來源中選擇適當(dāng)?shù)慕K止子序列。在一個本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含一種終止子序列，其中優(yōu)選地所述終止子序列與所述第一核苷酸序列有效連接，其中進(jìn)一步優(yōu)選地，所述終止子序列是rRNB終止子序列，最優(yōu)選SEQ ID NO28。
為了質(zhì)粒選擇的目的，熟練技術(shù)人員一般利用抗生素抗性標(biāo)記基因。廣泛用于本領(lǐng)域并且適于本發(fā)明目的的抗生素抗性基因的例子是抗生素氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素抗性基因。通常優(yōu)選利用卡那霉素作為生產(chǎn)VLP的方法中的選擇試劑，因?yàn)榭敲顾嘏c可選的抗生素相比具有更低的變應(yīng)原潛力，并且利用VLP作為疫苗導(dǎo)致更低的安全性問題。而且，卡那霉素與可選的抗生素如氨芐青霉素相比提供了更好的質(zhì)粒保持。源于轉(zhuǎn)座子Tn903的卡那霉素3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO29)因此是特別有用的選擇性標(biāo)記基因。
出于成本和安全方面的原因，向培養(yǎng)基中添加抗生素通常在商業(yè)生產(chǎn)過程中是不期望的。在本發(fā)明的上下文中，選擇表達(dá)株典型且優(yōu)選地使用抗生素，優(yōu)選卡那霉素。生產(chǎn)過程中使用的培養(yǎng)基基本上沒有抗生素，特別是卡那霉素。然而，添加抗生素到用于生產(chǎn)接種物(用于生產(chǎn)培養(yǎng))的預(yù)培養(yǎng)物中可在整個過程中提高質(zhì)粒的保持(實(shí)施例10)。
熟練技術(shù)人員通過利用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合上述基因元件可產(chǎn)生包含表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)質(zhì)粒，所述構(gòu)建體對于生產(chǎn)噬菌體的VLP是有用的。對于本發(fā)明目的特別有用的表達(dá)質(zhì)粒是用于Qβ VLP生嚴(yán)的pTac-nSDQb-mut(SEQ ID NO1)和用于AP205 VLP生產(chǎn)的pTac-nSDAP205(SEQ ID NO30)。這些特定表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在實(shí)施例部分詳細(xì)描述。
通過任何本領(lǐng)域已知的方法，優(yōu)選地通過電穿孔，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)菌表達(dá)宿主中。在細(xì)胞裂解后通過SDS-PAGE根據(jù)重組衣殼蛋白的最大表達(dá)選出包含表達(dá)質(zhì)粒的宿主的個別克隆。選出的包含表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)宿主的克隆可儲存為冷凍的甘油培養(yǎng)物。
所述細(xì)菌宿主可以選自任何在細(xì)胞分裂過程中能夠復(fù)制和保持所述表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌菌株。優(yōu)選的細(xì)菌宿主是具有以下部分描述的特定特征的大腸桿菌菌株。
細(xì)菌宿主過量表達(dá)阻遏物可增強(qiáng)啟動子的阻遏。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主的所述培養(yǎng)以分批培養(yǎng)的方式在所述啟動子被lacI阻遏的條件下進(jìn)行。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，引起所述lacI在所述細(xì)菌宿主中過量表達(dá)的基因定位于質(zhì)粒上，優(yōu)選地定位于所述表達(dá)質(zhì)粒上。可選地，所述基因定位于包含在所述細(xì)菌宿主中的分離質(zhì)粒上，其中所述分離質(zhì)粒優(yōu)選地是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒?？蛇x地，并且最優(yōu)選地，所述基因定位于所述細(xì)菌宿主的染色體上。
導(dǎo)致lacI過量表達(dá)的一個例子是lacIq(Menzella等人.2003，Biotechnology and Bioengineering 82(7)809-817)，其在lacI啟動子區(qū)域的-35處有一個CG到TA的改變，引起lacI表達(dá)的提高10倍。另一個例子是lacIQ1(Glascock和Weickert 1998，Gene 223(1-2)221-231)。在生長期中增強(qiáng)的啟動子阻遏導(dǎo)致增強(qiáng)的質(zhì)粒保持和更高的細(xì)胞密度，最終導(dǎo)致提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。例如，包含lacIq基因的細(xì)菌菌株過量表達(dá)lacI阻遏物分子并且因此在生長期比包含野生型基因的菌株相比更有效地阻止重組蛋白的形成。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，導(dǎo)致所述lacI過量表達(dá)的基因是lacIQ1或lacIq，優(yōu)選lacIq。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主在其染色體上包含lacIq基因。
在一個實(shí)施方式中，所述啟動子的所述誘導(dǎo)利用誘導(dǎo)物進(jìn)行，其中所述誘導(dǎo)物優(yōu)選地選自IPTG和乳糖，最優(yōu)選地所述誘導(dǎo)物是乳糖。細(xì)菌宿主暴露于誘導(dǎo)物時，阻遏物被滅活而啟動子成為有活性的。添加強(qiáng)誘導(dǎo)物IPTG到培養(yǎng)基中導(dǎo)致重組蛋白的表達(dá)率立即上升到高水平，因?yàn)镮PTG通過擴(kuò)散直接進(jìn)入細(xì)胞并且結(jié)合并滅活活性阻遏物lacI。失活的lacI阻遏物分子從操縱子上解離下來，并且允許從啟動子開始高水平轉(zhuǎn)錄。IPTG不被細(xì)胞代謝并且轉(zhuǎn)錄以高比率持續(xù)直到其他代謝參數(shù)成為限制性的。
如以前提到的，高表達(dá)率可能導(dǎo)致不能通過自裝配形成VLP的不溶性重組蛋白的形成。利用高濃度IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)特別傾向于形成不溶性蛋白質(zhì)。因此，啟動子的誘導(dǎo)優(yōu)選地通過以低于導(dǎo)致發(fā)生最大表達(dá)率表達(dá)的濃度的濃度添加IPTG來實(shí)現(xiàn)(Kopetzki等人.1989，Mol Gen Genet 216149-155)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述啟動子的所述誘導(dǎo)利用IPTG進(jìn)行，其中培養(yǎng)基中所述IPTG的濃度為大約0.001到5mM，優(yōu)選0.001到1mM，更優(yōu)選0.005到1mM，更優(yōu)選0.005到0.5mM。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述IPTG的濃度為大約0.001mM，最優(yōu)選0.001mM。
可選地，啟動子的誘導(dǎo)通過添加乳糖而實(shí)現(xiàn)。利用乳糖誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)需要細(xì)菌宿主能夠從培養(yǎng)基中吸收乳糖，例如，通過Lac通透酶吸收乳糖，并且需要細(xì)菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。細(xì)胞依賴Lac通透酶吸收乳糖的動力學(xué)比通過擴(kuò)散吸收IPTG遵循更慢。而且，乳糖不直接與lac操縱子作用，但是被β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化為異乳糖(1-6-O-β-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖)，異乳糖是啟動子的實(shí)際上的誘導(dǎo)物。通過添加乳糖誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)是有益的，因?yàn)樗苊饬吮磉_(dá)率在添加誘導(dǎo)物后立即增加到最大值，因而降低了不溶性蛋白質(zhì)形成的風(fēng)險。
異乳糖在生產(chǎn)期被細(xì)菌宿主代謝，并且對細(xì)菌代謝貢獻(xiàn)碳和代謝能量。與用IPTG誘導(dǎo)相比這可以進(jìn)一步有助于提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。而且，乳糖誘導(dǎo)在一定程度上允許通過培養(yǎng)基中的乳糖濃度控制重組蛋白在生產(chǎn)期中的表達(dá)率。乳糖誘導(dǎo)進(jìn)一步在藥物生產(chǎn)過程中是優(yōu)選的，因?yàn)镮PTG是昂貴的并且被認(rèn)為是有毒的。它的去除需要在生產(chǎn)過程的最后進(jìn)行證明。
在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述啟動子的所述誘導(dǎo)是通過添加乳糖到所述分批培養(yǎng)物中進(jìn)行的，其中優(yōu)選地所述細(xì)菌宿主能夠從培養(yǎng)基中吸收乳糖，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述細(xì)菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。所述細(xì)菌菌株可以獲自，例如，菌株保藏機(jī)構(gòu)，如ATTC(http://www.atcc.org)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主是大腸桿菌菌株，優(yōu)選地是選自RB791、DH20、Y1088、W3110和MG1655的大腸桿菌菌株。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌宿主是大腸桿菌RB791。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述啟動子是tac啟動子或其突變體或變體，并且所述細(xì)菌宿主是進(jìn)一步包含導(dǎo)致tac啟動子的阻遏物過量表達(dá)的基因的大腸桿菌菌株，其中所述基因優(yōu)選地是lacIq。細(xì)菌宿主的培養(yǎng)基的pH可在發(fā)酵過程中控制，通過利用本領(lǐng)域公知的方法添加酸性或堿性溶液而調(diào)整。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主的培養(yǎng)和所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料在控制培養(yǎng)基的pH的條件下進(jìn)行。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述pH在5.5到8.0之間，更優(yōu)選在6.5到7.5之間，更優(yōu)選在6.7到7.0之間，最優(yōu)選地所述培養(yǎng)基的pH是6.8。所述培養(yǎng)基的pH可在過程中保持恒定，或可在過程的不同階段在上述pH范圍內(nèi)遵循某種分布。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述pH保持恒定在6.7到7.0之間的值，優(yōu)選地所述pH保持恒定在6.8。
本發(fā)明的方法包含生長期，其中所述生長期包含分批期和補(bǔ)料期，其中所述生長期和同時的所述分批期起始于所述細(xì)菌宿主的培養(yǎng)，并且其中所述補(bǔ)料期起始于用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料。
細(xì)菌細(xì)胞的氧化能力是有限的，底物的高濃度可能導(dǎo)致還原產(chǎn)物例如醋酸鹽的形成，其可能導(dǎo)致不期望的培養(yǎng)基的酸化，并導(dǎo)致細(xì)菌的生長減慢。因此，細(xì)菌宿主在具有有限量的底物的基本培養(yǎng)基上以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式生長。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主的培養(yǎng)在包含所述主碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行，其中所述培養(yǎng)基優(yōu)選地是一種基本培養(yǎng)基，優(yōu)選一種化學(xué)成分確定的基本培養(yǎng)基。最優(yōu)選地所述培養(yǎng)基是如實(shí)施例5所述的R27培養(yǎng)基。
在分批期的最后，當(dāng)包含在培養(yǎng)基中的底物幾乎被耗盡時，用包含主碳源的培養(yǎng)基(補(bǔ)料培養(yǎng)基)以與期望的細(xì)菌宿主生長速率相同的速率向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料，即，細(xì)菌宿主的生長速率被底物的補(bǔ)料速率所限制。熟練技術(shù)人員可以理解決定性的參數(shù)是底物(優(yōu)選主碳源)和其他保持生長所需的營養(yǎng)成分的實(shí)際物質(zhì)流量。由于在實(shí)踐中可以設(shè)定補(bǔ)料培養(yǎng)基的恒定組成，流速是指培養(yǎng)基的體積流量。對共補(bǔ)料培養(yǎng)基有同樣的考慮(見下面)。
因此，在一個實(shí)施方式中，用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料以一定的流速進(jìn)行，其中所述流速限制了所述細(xì)菌宿主的生長速率。
在補(bǔ)料期，如果不發(fā)生抑制，生長速率可在幾乎高達(dá)最大生長速率(μmax)的寬范圍內(nèi)自由選擇。μmax的實(shí)際值高度依賴于細(xì)菌菌株、表達(dá)構(gòu)建體和生長條件。熟練技術(shù)人員將能理解μmax的確定在啟動子被阻遏的條件下進(jìn)行。
對于給定的試驗(yàn)設(shè)置，μ可通過以下步驟由培養(yǎng)生長曲線確定將例如根據(jù)OD600或細(xì)胞濕重(CWW)確定的生物量濃度(x)對培養(yǎng)時間作圖，并基于等式x＝x0eμt確定指數(shù)生長系數(shù)μ。μmax的實(shí)際值被確定為當(dāng)不發(fā)生底物限制時，即在不通過補(bǔ)料提供附加培養(yǎng)基的情況下，指數(shù)生長的分批培養(yǎng)物在分批培養(yǎng)期開始時的生長速率μ。生長速率μ可通過計算在時間t2測量的總生物量X2的自然對數(shù)和在時間t1測量的總生物量X1的自然對數(shù)的差與時間差(t2-t1)的比值來確定μ＝(lnX2-lnX1)/(t2-t1)。
補(bǔ)料分批培養(yǎng)允許保持恒定的生長速率(μ)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，底物，優(yōu)選主碳源，在補(bǔ)料期根據(jù)生物量(x)的指數(shù)增長而補(bǔ)加。如果在補(bǔ)料期以與消耗速率相同的速率提供底物，則培養(yǎng)處于準(zhǔn)穩(wěn)定狀態(tài)，類似于在連續(xù)培養(yǎng)中的培養(yǎng)。由于生物量的形成和底物消耗是以參考底物的產(chǎn)率系數(shù)Yx/s(生物量[g]/底物[g])相互聯(lián)系，每時間單元(t)待提供的底物量(s)根據(jù)公式ds/dt＝μ/Yx/sx0toteμt計算，其中x0tot是在補(bǔ)料開始時的總生物量。
因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，利用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料以一定的流速進(jìn)行，其中所述流速以指數(shù)系數(shù)μ增長，并且其中優(yōu)選地所述指數(shù)系數(shù)μ低于μmax。因此，所述細(xì)菌宿主在補(bǔ)料期的生長速率設(shè)定為低于μmax的數(shù)值。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述指數(shù)系數(shù)μ大約為μmax的30％到70％，最優(yōu)選地大約為μmax的50％。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方式中，μ被設(shè)定為0.15到0.45h-1、更優(yōu)選0.25到0.35h-1的絕對值、最優(yōu)選地μ為0.3h-1，只要該方法的設(shè)置使這些數(shù)值小于μmax。
細(xì)菌能夠利用廣泛范圍的不同底物。對于本發(fā)明的目的，優(yōu)選的主碳源是葡萄糖和甘油，優(yōu)選甘油。雖然可以達(dá)到的表達(dá)宿主的最大比生長速率(μmax)在利用葡萄糖時比利用甘油時更高，但是甘油引起更少的醋酸鹽形成并提供每份底物更高的生物量(Yx/s)，并且最終提供更高的重組蛋白產(chǎn)量。而且，液體底物甘油的處理比固體碳源如葡萄糖更容易，固體碳源的處理需要在一個獨(dú)立的步驟中溶解。
如前面提到的，質(zhì)粒的保持，即表達(dá)質(zhì)粒在發(fā)酵過程中在細(xì)菌宿主中的保持，對于重組蛋白的最優(yōu)生產(chǎn)是關(guān)鍵的。質(zhì)粒保持的評價可通過將細(xì)菌細(xì)胞涂布在固體培養(yǎng)基上形成單個菌落，并測試各個菌落的抗生素抗性。例如，100％的質(zhì)粒保持意味著100個測試菌落中有100個包含由表達(dá)質(zhì)粒賦予的特定抗生素抗性。對于本發(fā)明的目的，在發(fā)酵過程的最后質(zhì)粒保持高于80％，優(yōu)選高于90％，更優(yōu)選高于95％，甚至更優(yōu)選高于97％，最優(yōu)選為100％。
細(xì)菌菌株的最適生長溫度是其達(dá)到最大生長速率(μmax)時的溫度。在其他的非限制性條件下，對于大多數(shù)大腸桿菌菌株，該溫度為大約37℃。然而，包含表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌菌株在最適生長溫度和沒有選擇性抗生素條件下的生長可能促進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒的損失，而當(dāng)表達(dá)菌株在較低的溫度下生長時質(zhì)粒保持通常被提高。盡管與在最適生長溫度下生長時相比，菌株在低于其最適生長溫度的溫度下生長時表達(dá)菌株的最大生長速率較低，但是由于質(zhì)粒保持提高，在較低溫度下重組蛋白的產(chǎn)量可能相同或甚至更好。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主的培養(yǎng)和/或利用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料和/或利用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述啟動子在低于所述細(xì)菌宿主的最適生長溫度的溫度下進(jìn)行。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溫度在20到37℃之間，優(yōu)選地在23到35℃之間，更優(yōu)選地在25到33℃之間，甚至更優(yōu)選地在27到32℃之間，更優(yōu)選在28到31℃之間。更優(yōu)選地所述溫度大約是30℃，最優(yōu)選地所述溫度是30℃。
本發(fā)明的方法包含生產(chǎn)期，其中所述生產(chǎn)期起始于用一種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述啟動子。所述生產(chǎn)期起始的時間點(diǎn)可基于培養(yǎng)時間和/或生長參數(shù)而確定。
在發(fā)酵過程中細(xì)菌宿主的生長可通過測定在600nm下的光密度(OD600)、細(xì)胞濕重(CWW[g/l])和細(xì)胞干重(CDW[g/l])而評價。這些參數(shù)可用于確定通過向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)啟動生產(chǎn)期的最佳時間點(diǎn)。熟練技術(shù)人員顯然知道，一方面在生產(chǎn)期起始時較高的CWW可通過延長補(bǔ)料期而獲得并且可導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)量提高，但是另一方面，過于老化的培養(yǎng)物可能表現(xiàn)出不充分的蛋白表達(dá)。因而需要對特定生產(chǎn)條件確定通過用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述啟動子而啟動的生產(chǎn)期起始的最佳時間點(diǎn)。例如，對于總體積為2升的大腸桿菌RB791中的Qβ CP表達(dá)，誘導(dǎo)開始于大約14小時之后，當(dāng)OD600達(dá)到大約40到60時。令人驚訝的是，在50升規(guī)模的同樣過程中發(fā)現(xiàn)了類似的參數(shù)，其中誘導(dǎo)也開始于大約14小時之后，當(dāng)OD600達(dá)到大約50時。
因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子進(jìn)行所述誘導(dǎo)在開始所述生長期后10小時到16小時進(jìn)行，優(yōu)選地在12小時到15小時之后，更優(yōu)選地在13小時到15小時之后，最優(yōu)選地在大約14小時之后進(jìn)行，其中優(yōu)選地在OD600達(dá)到大約40到60、優(yōu)選大約50時利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子進(jìn)行所述誘導(dǎo)。
在一個進(jìn)一步的實(shí)施方式中，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)在延長的補(bǔ)料期之后進(jìn)行，其中優(yōu)選地在開始在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主14小時到20小時之后，優(yōu)選地在15到18小時之后，更優(yōu)選地在16小時到17小時之后，最優(yōu)選地在大約16.5小時之后，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子進(jìn)行所述誘導(dǎo)，其中優(yōu)選地在OD600達(dá)到大約80到90時、優(yōu)選大約85時利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子進(jìn)行所述誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)在OD600達(dá)到數(shù)值25到60、優(yōu)選25到55、更優(yōu)選30到50、最優(yōu)選30到40時進(jìn)行。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)在OD600為35時進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，利用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)在延長的補(bǔ)料期之后，當(dāng)OD600達(dá)到值60到120、優(yōu)選70到110、更優(yōu)選80到100、最優(yōu)選80到90時進(jìn)行。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在延長的補(bǔ)料期之后，當(dāng)OD600為大約85時，優(yōu)選為85時，開始誘導(dǎo)。
利用IPTG的誘導(dǎo)在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，利用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加IPTG實(shí)現(xiàn)，其中優(yōu)選地繼續(xù)用主碳源對培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。由于IPTG不被細(xì)菌宿主代謝，可通過單次添加IPTG達(dá)到期望的濃度而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)。可選地，可通過將IPTG連續(xù)流加到培養(yǎng)物中而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過以單次添加或連續(xù)流加的方式添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，其中用主碳源向分批培養(yǎng)物中的所述補(bǔ)料以所述主碳源的恒定的或漸增的流速持續(xù)，主碳源的流速以指數(shù)增加。
利用乳糖的誘導(dǎo)如上所述，蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)可選地通過添加乳糖到培養(yǎng)基中而獲得。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，在生產(chǎn)期開始時，中斷底物的指數(shù)補(bǔ)料，并且以恒定流速向培養(yǎng)物中提供包含100到300g/l、優(yōu)選100g/l乳糖作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(乳糖補(bǔ)料培養(yǎng)基)。優(yōu)選地，乳糖的恒定流速大約等于在補(bǔ)料期最后的底物流速。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加乳糖而獲得，其中優(yōu)選地所述乳糖以連續(xù)流加方式補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中，并且優(yōu)選地，不繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。
在添加乳糖到培養(yǎng)物中后，β-半乳糖苷酶活性增加，乳糖轉(zhuǎn)化為異乳糖，異乳糖誘導(dǎo)tac啟動子，啟動了重組衣殼的表達(dá)。平行地，異乳糖進(jìn)一步被代謝并且有助于對細(xì)菌宿主的能量供應(yīng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的補(bǔ)料速率和細(xì)胞的乳糖消耗的平衡因此決定了表達(dá)率。該級聯(lián)中涉及的酶反應(yīng)允許以包涵體形成被最小化的方式控制該過程。誘導(dǎo)步驟的進(jìn)程可通過確定培養(yǎng)物中的β-半乳糖苷酶活性而監(jiān)測，例如，通過使用β-半乳糖測試試劑盒(Invitrogen，K1455-01)。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加乳糖而獲得，其中優(yōu)選地所述乳糖以連續(xù)流加方式補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中，并且其中優(yōu)選地，繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。
誘導(dǎo)物的不連續(xù)添加所述誘導(dǎo)物可通過在生產(chǎn)期開始時單次添加或通過在生產(chǎn)期中少數(shù)幾次隨后的添加而不連續(xù)地添加到培養(yǎng)物中。當(dāng)誘導(dǎo)物是IPTG時，誘導(dǎo)物的不連續(xù)添加，特別是單次添加是特別適合的，因?yàn)镮PTG不被細(xì)菌宿主所代謝。因此，典型地和優(yōu)選地，在生產(chǎn)期中替換被代謝的IPTG是不必要的。在一個實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加所述誘導(dǎo)物到培養(yǎng)基中而進(jìn)行，所述誘導(dǎo)物優(yōu)選為IPTG或乳糖，最優(yōu)選為IPTG，其中所述誘導(dǎo)物在生產(chǎn)期開始時通過單次添加馬上添加到大約其最終濃度，其中優(yōu)選地繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加IPTG到所述培養(yǎng)基中進(jìn)行，其中所述IPTG通過單次添加馬上添加到大約其最終濃度，其中優(yōu)選地，繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。可選地，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過添加所述誘導(dǎo)物到所述培養(yǎng)基中而進(jìn)行，所述誘導(dǎo)物優(yōu)選為IPTG或乳糖，最優(yōu)選為乳糖，其中所述添加在生產(chǎn)期中分幾個步驟進(jìn)行，優(yōu)選為1到5個，更優(yōu)選2到4個，最優(yōu)選3個步驟，其中優(yōu)選地繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料。
誘導(dǎo)物的連續(xù)添加(補(bǔ)料)優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)物以連續(xù)流加方式添加到培養(yǎng)基中，優(yōu)選地貫穿生產(chǎn)期之中。誘導(dǎo)物的連續(xù)添加特別適合于乳糖，因?yàn)槿樘潜患?xì)菌宿主代謝，因此在生產(chǎn)期中連續(xù)添加乳糖允許在培養(yǎng)基中保持一定的乳糖濃度，這允許啟動子的有效誘導(dǎo)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，用所述誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料而進(jìn)行，其中優(yōu)選地所述誘導(dǎo)物是IPTG或乳糖，最優(yōu)選乳糖，并且其中所述補(bǔ)料以連續(xù)流加方式進(jìn)行，其中進(jìn)一步優(yōu)選地所述補(bǔ)料在整個生產(chǎn)期之中進(jìn)行。
誘導(dǎo)物和主碳源的共補(bǔ)料重組蛋白的表達(dá)是一種需要能量的過程。為防止可能由細(xì)菌宿主過度消耗誘導(dǎo)物引起的產(chǎn)量損失和其導(dǎo)致的低表達(dá)率，可在生產(chǎn)期中向培養(yǎng)物中另外補(bǔ)充底物，優(yōu)選主碳源，其中誘導(dǎo)物和/或主碳源的流速是恒定的或漸增的，優(yōu)選是恒定的。當(dāng)在生產(chǎn)期中以漸增的流速向培養(yǎng)物中補(bǔ)充底物時，流速優(yōu)選地以指數(shù)速度增長。
以恒定流速共補(bǔ)料在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物和所述主碳源向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行，其中所述誘導(dǎo)物優(yōu)選是IPTG或乳糖，最優(yōu)選是乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，優(yōu)選甘油，其中所述誘導(dǎo)物，優(yōu)選乳糖和所述主碳源，優(yōu)選甘油，以一定流速向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料，其中所述流速優(yōu)選地是大約恒定的。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇所述流速以允許以與生長期最后大致相同的速率補(bǔ)加所述主碳源到所述分批培養(yǎng)物中。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)和所述主碳源(優(yōu)選甘油)包含在同一培養(yǎng)基(共補(bǔ)料培養(yǎng)基)中。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述共補(bǔ)料培養(yǎng)基以一定的流速補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中，其中所述流速優(yōu)選大約是恒定的，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地選擇所述流速以允許以與生長期最后大約相同的速率補(bǔ)加所述主碳源到所述分批培養(yǎng)物中。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)物是乳糖并且所述主碳源是甘油，其中所述乳糖和所述甘油以大約2∶1到1∶4的比例(w/w)向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，乳糖和所述主碳源，優(yōu)選甘油，以0∶1到1∶0(w/w)、優(yōu)選大約2∶1到大約1∶4(w/w)、更優(yōu)選大約1∶1到1∶3(w/w)、最優(yōu)選大約1∶3(w/w)的比例向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，乳糖和主碳源(優(yōu)選甘油)的比例是1∶1(w/w)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，乳糖和主碳源(優(yōu)選甘油)的比例是1∶3(w/w)。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述共補(bǔ)料培養(yǎng)基包含大約200g/l乳糖和大約200g/l甘油。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，共補(bǔ)料培養(yǎng)基包含大約100g/l乳糖和大約300g/l甘油。
以漸增的流速共補(bǔ)料可選地，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物和所述主碳源向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行，其中所述誘導(dǎo)物優(yōu)選是IPTG或乳糖，最優(yōu)選乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，優(yōu)選甘油，其中所述誘導(dǎo)物，優(yōu)選乳糖和所述主碳源，優(yōu)選甘油，以一定的流速向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料，其中所述流速是漸增的，其中所述流速可以線性或指數(shù)特征增加，其中優(yōu)選地選擇起始流速以允許以與生長期最后大約相同的速率將所述主碳源補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中。
進(jìn)一步可選地，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物和所述主碳源向所述分批培養(yǎng)基中共補(bǔ)料而進(jìn)行，其中所述誘導(dǎo)物優(yōu)選為IPTG或乳糖，最優(yōu)選為乳糖，并且其中所述主碳源是葡萄糖或甘油，優(yōu)選甘油，其中所述誘導(dǎo)物，優(yōu)選乳糖，以第一流速補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中，并且其中所述主碳源，優(yōu)選甘油，以第二流速補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中，其中所述第一流速是恒定的或漸增的，優(yōu)選恒定的，并且其中所述第二流速是恒定的或漸增的，優(yōu)選漸增的，其中優(yōu)選地選擇所述第二流速的起始流速，以允許以與生長期最后大約相同的速率將所述主碳源補(bǔ)加到所述分批培養(yǎng)物中。在一個非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)物是乳糖并且所述主碳源是甘油，其中所述乳糖和所述甘油以大約2∶1到1∶4(w/w)的比例向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料。
通過CDW、CWW或OD600確定的細(xì)菌宿主的生長在生產(chǎn)期過程中以低于生長期并且隨時間降低的生長速率持續(xù)。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步的實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過以漸增的流速用所述誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)和所述主碳源(優(yōu)選甘油)向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行，優(yōu)選地流速的增加適合培養(yǎng)物的實(shí)際生長速率。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)和所述主碳源(優(yōu)選甘油)包含在同一培養(yǎng)基(共補(bǔ)料培養(yǎng)基)中，其中優(yōu)選地乳糖和甘油在所述培養(yǎng)基(共補(bǔ)料培養(yǎng)基)中的比例范圍是從大約0∶1到1∶0(w/w)，優(yōu)選大約2∶1到大約1∶4(w/w)，更優(yōu)選大約1∶1到1∶3(w/w)，最優(yōu)選的比例是大約1∶3(w/w)。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，乳糖和主碳源(優(yōu)選甘油)的比例是1∶3(w/w)。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基(共補(bǔ)料培養(yǎng)基)包含大約200g/l乳糖和大約200g/l甘油。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含大約100g/l乳糖和大約300g/l甘油。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)和所述主碳源(優(yōu)選甘油)向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行，其中所述誘導(dǎo)物(優(yōu)選乳糖)和所述主碳源(優(yōu)選甘油)包含在分別的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基分開補(bǔ)加到所述培養(yǎng)物中。
在生產(chǎn)期結(jié)束時，通過離心收獲細(xì)胞。一般在誘導(dǎo)起始后大約5小時，當(dāng)最終OD600達(dá)到90到130時收獲細(xì)胞。生產(chǎn)期的進(jìn)一步延長導(dǎo)致更高的OD600和CWW值，并且因此導(dǎo)致表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。
收獲的細(xì)胞可在儲存緩沖液中懸浮，并且儲存在-80℃下，用于進(jìn)一步的處理。
在細(xì)胞裂解后通過SDS PAGE或LDS PAGE并與蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較而確定細(xì)胞的總蛋白質(zhì)含量?？扇苄缘鞍踪|(zhì)的含量通過HPLC確定。表達(dá)的衣殼蛋白的身份通過western blotting確定。裝配的VLP的濃度可通過大小排阻色譜法進(jìn)行分析(實(shí)施例18)。VLP可通過色譜方法從裂解的細(xì)胞中制備純化。
僅僅只進(jìn)行小的修改就可將本發(fā)明的方法放大為大體積。本發(fā)明包括在100毫升到6000升范圍內(nèi)的培養(yǎng)體積。優(yōu)選的培養(yǎng)體積是40到100升，最優(yōu)選地是大約50升。熟練技術(shù)人員顯然知道更大的培養(yǎng)體積特別需要更大體積的用于接種的預(yù)培養(yǎng)物。例如，預(yù)培養(yǎng)可以分兩個或多個預(yù)培養(yǎng)體積漸增的步驟進(jìn)行。為了確保在大培養(yǎng)體積中的質(zhì)粒保持，用作接種物的預(yù)培養(yǎng)物可包含一種抗生素以保持選擇壓力。熟練技術(shù)人員意識到，可通過降低達(dá)到期望的最終細(xì)胞密度所必需的代數(shù)而進(jìn)一步提高質(zhì)粒保持。因此，以高細(xì)胞密度接種預(yù)培養(yǎng)物和分批培養(yǎng)物是有利的。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，預(yù)培養(yǎng)物的起始OD600是0.1到0.4，優(yōu)選大約0.3。
在一個實(shí)施方式中，在所述培養(yǎng)步驟之前，所述方法進(jìn)一步包括將所述細(xì)菌宿主導(dǎo)入到培養(yǎng)基中的步驟，其中所述導(dǎo)入利用接種物進(jìn)行，其中所述接種物在預(yù)培養(yǎng)過程中生產(chǎn)，該預(yù)培養(yǎng)過程包括所述細(xì)菌宿主在含有抗生素(優(yōu)選卡那霉素)的培養(yǎng)基中生長的步驟。更優(yōu)選地，所述預(yù)培養(yǎng)過程包括所述細(xì)菌宿主在第一培養(yǎng)基中生長的步驟，所述第一培養(yǎng)基包含一種抗生素，優(yōu)選卡那霉素，并且用第二培養(yǎng)基稀釋含有細(xì)菌宿主的所述第一培養(yǎng)基到OD600為0.1到0.4，優(yōu)選大約0.3，其中所述第二培養(yǎng)基基本上不含抗生素，并且進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主。
而且，熟練技術(shù)人員顯然知道，本發(fā)明的發(fā)酵過程是一種需氧過程，其需要向培養(yǎng)中的細(xì)菌充分供應(yīng)氧氣。細(xì)菌宿主的氧氣需求尤其隨著細(xì)胞密度和生長速率的增加而增加。根據(jù)總體積和細(xì)菌宿主的氧氣需求，例如，可以通過攪拌和/或通過通氣提供氧氣?；蛘?，也可通過用純氧或純氧和任何其他氣體(優(yōu)選空氣)的混合物進(jìn)行通氣而提供氧氣，其中純氧指通常為技術(shù)目的可獲得的技術(shù)上純化的氣體。給細(xì)菌宿主提供氧氣的另一個可能性是通過提高發(fā)酵罐中的壓力提高培養(yǎng)基中的氧分壓。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)菌宿主的所述培養(yǎng)和/或?qū)λ龇峙囵B(yǎng)物的所述補(bǔ)料和/或利用誘導(dǎo)物對所述啟動子的所述誘導(dǎo)在一定條件下進(jìn)行，其中對所述細(xì)菌宿主供應(yīng)氧氣，優(yōu)選地通過利用空氣通氣，最優(yōu)選地通過利用空氣以恒定速率通氣，其中優(yōu)選所述氧氣的供應(yīng)貫穿整個過程中，最優(yōu)選地貫穿延遲期、生長期和生產(chǎn)期，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地監(jiān)測培養(yǎng)基中的氧分壓，并且其中可選地或另外通過用純氧通氣給細(xì)菌宿主提供氧氣，優(yōu)選地當(dāng)培養(yǎng)基中的氧分壓(pO2)低于某一閾值時。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述pO2的閾值在范圍0％到6％之間，優(yōu)選10％到50％之間，更優(yōu)選20％到45％之間，最優(yōu)選地所述閾值為大約40％。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地對于2升或更高的培養(yǎng)體積，常規(guī)應(yīng)用于氧氣供應(yīng)，優(yōu)選地通過空氣和/或純氧通氣供氧，以維持上述優(yōu)選的pO2。在放大的過程中，最優(yōu)選地在40升到100升及以上時，以所述方式進(jìn)行氧氣通氣是特別優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方式是一種表達(dá)能夠通過自裝配形成VLP的噬菌體重組衣殼蛋白或其突變體或片段的方法，所述方法包括以下步驟a)將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌宿主，其中所述表達(dá)質(zhì)粒包含一種表達(dá)構(gòu)建體，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含(i)編碼所述重組衣殼蛋白或其突變體或片段的第一核苷酸序列，和(ii)可被乳糖誘導(dǎo)的啟動子；b)在包含主碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主；其中所述培養(yǎng)以分批培養(yǎng)方式在所述啟動子被lacI阻遏的條件下進(jìn)行，其中所述細(xì)菌宿主過量表達(dá)所述lacI；c)用所述主碳源向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料；和d)用一種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述啟動子，其中繼續(xù)用所述主碳源對所述分批培養(yǎng)物進(jìn)行補(bǔ)料；其中貫穿所述過程的步驟b)到d)，向所述細(xì)菌宿主中供氧，使所述培養(yǎng)基中的pO2至少為大約10％到50％，優(yōu)選大約40％，并且其中進(jìn)一步優(yōu)選地通過用空氣、純氧或兩者的混合物、優(yōu)選用空氣和純氧的混合物通氣而提供所述氧氣。
實(shí)施例 實(shí)施例1 表達(dá)質(zhì)粒pTac-nSD-Qb-mut(SEQ ID NO1)的克隆策略 大腸桿菌RNA噬菌體Qβ的外殼蛋白編碼基因(C)從質(zhì)粒pSDQb-mut(SEQ ID NO33)中擴(kuò)增。質(zhì)粒中包含編碼133-aa Qβ外殼蛋白(CP)和329-aa通讀蛋白(A1)的基因C的序列。為防止通讀，NCBI GenBank登錄號M99030的核苷酸445-450，TGAACA(SEQ ID NO31)，被序列TAATGA(SEQ ID NO32)取代。
來自質(zhì)粒pSDQb-mut的外殼蛋白編碼基因C通過PCR擴(kuò)增。具有內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)和合成Shine-Dalgarno(SD，SEQ ID No4)序列的寡核苷酸Qb-FOR3/2(SEQ ID NO34)與Qβ CP基因的5’末端退火。寡核苷酸Qblang-REV2/2(SEQ ID NO35)包含內(nèi)部HindIII位點(diǎn)，并且作為引物與基因C的非編碼區(qū)的3’末端雜交。1054bp的擴(kuò)增PCR片段包括NCBI GenBank登錄號M99039(除了上述核苷酸改變以外)的核苷酸46-1062和合成的SD序列。PCR片段用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且將產(chǎn)生的1036bp片段插入到修飾的pKK223-3載體(Pharmacia，NCBI GenBank登錄號M77749，SEQ ID NO27)的HindIII/EcoRI限制性位點(diǎn)。在這種修飾的pKK223-3載體中，氨芐青霉素抗性基因被載體pUC4K(Pharmacia，NCBI GenBank登錄號X06404，SEQ ID NO37)的卡那霉素抗性基因取代。
載體pTac-nSDQb-mut(SEQ ID NO33)與載體pTacQb-mut在Shine-Dalgarno序列上不同。經(jīng)PCR通過由質(zhì)粒pTacQb-mut擴(kuò)增Qβ外殼蛋白編碼基因C而導(dǎo)入Shine-Dalgarno序列(nSD，SEQ ID NO3)。具有內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)和相應(yīng)合成的Shine-Dalgarno(nSD)序列的寡核苷酸nSDQb-mutEcoRIfor(SEQ ID NO36)與Qβ CP基因的5’末端退火。寡核苷酸Qblang-REV2/2(SEQ ID NO35)包含一個內(nèi)部HindIII位點(diǎn)，并且作為引物與基因C的非編碼區(qū)的3’末端雜交。1054bp擴(kuò)增的PCR片段包括NCBI GenBank登錄號M99039(除了上述核苷酸改變之外)的核苷酸46-1062和合成的nSD序列。PCR片段用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且將產(chǎn)生的1036bp片段插入到修飾的pKK223-3載體(Pharmacia，NCBI GenBank登錄號M77749，SEQ IDNO27)的HindIII/EcoRI限制性位點(diǎn)。在這種修飾的pKK223-3載體中，氨芐青霉素抗性基因被載體pUC4K(Pharmacia，NCBI GenBank登錄號X06404，SEQ ID NO37)的卡那霉素抗性基因所取代。
實(shí)施例2 表達(dá)質(zhì)粒pTac-nSD-AP205(SEQ ID NO30)的克隆策略 不動桿菌(Acinetobacter)噬菌體AP205的外殼蛋白編碼基因從質(zhì)粒pAP205-58中擴(kuò)增。該質(zhì)粒包含編碼噬菌體AP205的131個氨基酸的衣殼蛋白的外殼蛋白基因序列(相應(yīng)于NCBI GenBank登錄號AF334111的核苷酸1908-2303)。
外殼蛋白編碼基因通過PCR擴(kuò)增。具有內(nèi)部EcoRI位點(diǎn)和合成的Shine-Dalgarno(nSD)序列的寡核苷酸nSDAP238-EcoRIfor(SEQ IDNO38)與外殼蛋白基因的5’末端退火。寡核苷酸AP238HindIIIrev(SEQ ID NO39)包含內(nèi)部HindIII位點(diǎn)，并且作為引物與外殼蛋白基因的3’末端雜交。該寡核苷酸在外殼蛋白的天然存在的終止密碼子之后導(dǎo)入第二終止密碼子。438bp擴(kuò)增的PCR片段包括NCBI GenBank登錄號AF334111的核苷酸1908-2303和合成的nSD序列。PCR片段利用限制性酶HindIII/EcoRI消化，并且將得到的420bp片段插入到修飾的載體pKK223-3(Pharmacia，NCBI GenBank登錄號M77749，SEQ ID NO27)的HindIII/EcoRI限制性位點(diǎn)。在這種修飾的pKK223-3載體中，氨芐青霉素抗性基因被載體pUC4K(Pharmacia，NCBIGenBank登錄號X06404，SEQ ID NO37)的卡那霉素抗性基因所取代。
實(shí)施例3 在tac啟動子和nSD控制下的Qβ CP的表達(dá) 大腸桿菌菌株RB791用質(zhì)粒pTac-nSD-Qb-mut(SEQ ID NO1)轉(zhuǎn)化?？寺≡趽u瓶中生長。每個搖瓶中包含100ml含有卡那霉素(25μg/ml)的R40培養(yǎng)基(主培養(yǎng)基，Hypep 7455，甘油，見實(shí)施例5)，并且用過夜培養(yǎng)物接種，起始OD600為0.3。搖瓶于30℃和220rpm攪拌下培養(yǎng)4小時(OD600在4和5之間)。誘導(dǎo)用0.5％的乳糖進(jìn)行4小時。蛋白質(zhì)產(chǎn)量通過SDS-PAGE確定。顯示出強(qiáng)烈的蛋白條帶的凝膠被鑒定為Qβ CP。
實(shí)施例4 在tac啟動子和SD(與nSD對比)的控制下的AP205 CP的表達(dá) 在搖瓶中篩選出pTac-nSDAP205(SEQ ID NO30)的9個克隆和pTac-SDAP205的6個克隆。pTac-SDAP205(SEQ ID NO40)除了包含SEQ ID NO4的Shine-Dalgarno序列而不是SEQ ID NO3的Shine-Dalgarno序列之外與pTac-nSDAP205相同。每個搖瓶包含50ml含有卡那霉素(25μg/ml)的R40培養(yǎng)基(主培養(yǎng)基，Hypep 7455，甘油，見實(shí)施例5)，用過夜培養(yǎng)物接種，起始OD600為0.3(對于pTac-nSDAP205)或0.4(對于pTac-SDAP205)。搖瓶在30℃和220rpm攪拌下培養(yǎng)4小時。用0.5％乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。蛋白質(zhì)產(chǎn)量通過SDS-PAGE確定。對于所有測試克隆，源于pTac-nSDAP205的AP205CP表達(dá)顯著強(qiáng)于源于pTac-SDAP205的表達(dá)。
實(shí)施例5 培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基的組成如表1所述 表1培養(yǎng)基的組成
實(shí)施例6 在補(bǔ)料分批過程中Qβ CP的表達(dá)(2升規(guī)模) 發(fā)酵過程在生物反應(yīng)器(Applikon 5L凹底)中進(jìn)行，其配備2個盤式攪拌器(

6cm)、隔板(3×16cm)，具有pH-、pO2-和溫度控制，以及發(fā)酵軟件BioXpert Version 2.22。
將質(zhì)粒pTac-nSD-Qb-mut轉(zhuǎn)化的RB791的5μL低溫培養(yǎng)物接種到包含50ml培養(yǎng)基R40(25μg/mL卡那霉素)的100ml錐形燒瓶中，并在30℃和220RPM下培養(yǎng)14小時過夜。14小時之后OD600值達(dá)到6.0。對于分批發(fā)酵，將2升培養(yǎng)基(R40)泵入生物反應(yīng)器中。表2中列出了培養(yǎng)參數(shù)。
表2分批階段的參數(shù)設(shè)定點(diǎn)
生物反應(yīng)器用100mL接種物接種。采集2mL樣品，測量OD600，并且以14,000RPM離心。分離沉淀物和上清液，冷凍以進(jìn)一步分析。生物量濃度[g/L]使用下式計算 OD600×0.45[g×L-1×OD600-1]＝生物量[g/L]. 總蛋白質(zhì)含量中的Qbeta百分含量如下計算，假定大腸桿菌生物量中的50％為蛋白質(zhì) 生物量[g×L-1]/2＝總蛋白質(zhì)[g×L-1] Qbeta[g×L-1]/總蛋白質(zhì)[g×L-1]×100＝Qbeta/總蛋白質(zhì)[％]。
在補(bǔ)料分批模式中，其按照分批模式增加一個補(bǔ)料期。在補(bǔ)料期中，按照限定的分布向反應(yīng)器中的細(xì)胞供應(yīng)底物。補(bǔ)料分布依賴于選擇的生長速率μ、產(chǎn)率系數(shù)生物量比甘油(Yx/甘油)、體積(Vf)、補(bǔ)料中底物的濃度(cf)。底物濃度。補(bǔ)料利用下式計算 補(bǔ)料公式 mf＝(μ/Yx/s+m)Vf×Xf×eμt 泵＝(mf/cf+b)/a mf＝質(zhì)量流速[g/h] μ＝比生長速率[l/h] Yx/Glycerol＝生物物質(zhì)產(chǎn)量比甘油[g/g] m＝能量保持[g*g-1*h-1] Vf＝在補(bǔ)料開始的體積 Xf＝在補(bǔ)料開始的生物量 cf＝補(bǔ)料中的底物濃度[g/mL] a+b＝泵校準(zhǔn)公式的偏移/斜率 為了確定校準(zhǔn)參數(shù)a和b，進(jìn)行泵校準(zhǔn)。另外，具有補(bǔ)料瓶的補(bǔ)料管被鉗在補(bǔ)料泵中，泵以7％、14％和21％的泵性能運(yùn)行。記錄每次泵入的補(bǔ)料體積。在泵性能[％]與被泵入的補(bǔ)料液的關(guān)系的結(jié)果圖表中，確定斜率(a)和Y-軸(b)。對于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器中設(shè)定表3的參數(shù)。
表3生物反應(yīng)器中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)參數(shù)
在達(dá)到大約7小時的過程時間之后(分批結(jié)束)，補(bǔ)料泵自動開啟。在進(jìn)一步培養(yǎng)7小時之后，當(dāng)OD600達(dá)到55-60時，將補(bǔ)料培養(yǎng)基(用于生物物質(zhì)的繁殖)更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基R42(用于生物物質(zhì)的繁殖和誘導(dǎo))。5小時之后停止R42補(bǔ)料，通過離心收獲培養(yǎng)物。
過程參數(shù)的分析 常規(guī)分析下述過程參數(shù)。在整個過程時間中聯(lián)機(jī)測量pO2、pH、溫度和攪拌速度。脫機(jī)測量600nm的光密度。β-半乳糖苷酶活性的確定利用β-半乳糖測試試劑盒(Invitrogen，目錄號K1455-01)進(jìn)行。活性用單位每ml表示，OD600＝1.0。其定義為每分鐘每mL細(xì)菌懸浮液(OD600＝1.0)水解鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的量(以nmol表示)。累積的產(chǎn)物通過SDS-PAGE分析，確定總蛋白質(zhì)含量(可溶性和不溶性蛋白質(zhì))，并且利用HPLC分析測定可溶性部分。大腸桿菌的細(xì)胞裂解在裂解緩沖液(50mM葡萄糖，25mM tris/HCl(pH 8)，15mM EDTA(pH 8.0))中利用超聲勻漿器(Bandlin Sonoplus，HD2070)進(jìn)行。OD600為50的250μL細(xì)菌懸浮液以1400RPM離心10分鐘。沉淀物在250μL裂解緩沖液中重懸浮(渦旋)，置于室溫下5分鐘。然后，利用超聲波在10％裝置性能下裂解細(xì)胞20秒(細(xì)胞置于冰上)，然后將細(xì)胞懸浮液在14000RPM下離心10分鐘。上清液(可溶性蛋白質(zhì))通過SDS-PAGE和HPLC進(jìn)行分析。
誘導(dǎo)之前和生產(chǎn)期最后(5小時誘導(dǎo)之后)的樣品從生物反應(yīng)器中取出以通過標(biāo)準(zhǔn)化為OD5.0的SDS-PAGE分析Qβ的形成。在培養(yǎng)最后，收獲1.9升的培養(yǎng)物。離心之后，在三個獨(dú)立的反應(yīng)流程中獲得下列細(xì)胞沉淀物1)最終OD600為84194g CWW；2.)最終OD600為88200g CWW；3.)最終OD600為86201g CWW。
在反應(yīng)1和2中的質(zhì)粒保持在誘導(dǎo)開始時為100％，在收獲時為100％?；谠赟DS-PAGE上與QβCP標(biāo)準(zhǔn)的對比，產(chǎn)量大概估計為大約5g/l QβCP。HPLC分析揭示了濃度大約為6g/l QβVLP。
實(shí)施例7 碳源和細(xì)菌菌株的選擇 比較了作為碳源的葡萄糖和甘油。為了測試菌株DH20和RB791中的每一個在這些碳源上的生長表現(xiàn)，利用包含葡萄糖的培養(yǎng)基(R27)和包含甘油的培養(yǎng)基(R40)進(jìn)行了搖瓶試驗(yàn)。兩種培養(yǎng)基中都補(bǔ)充了25μg/ml的卡那霉素。每種培養(yǎng)在起始OD600為0.3時開始。通過添加0.5％乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。確定的最大比生長速率(μmax)和產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s)列于表4中。RB791在葡萄糖和甘油兩者中都生長較快。另外，獲得的產(chǎn)率系數(shù)較高。雖然葡萄糖允許更高的最大比生長速率(μmax)，但是甘油的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s)更高。
表4使用RB791和DH20在葡萄糖和甘油上的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的最大比生長速率和產(chǎn)率系數(shù)
實(shí)施例8 最適溫度的確定 研究了溫度對于產(chǎn)物形成的影響。接種了兩個搖瓶培養(yǎng)物，在30℃和220rpm下培養(yǎng)。在OD600達(dá)到5之后，用乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)物。隨后，一種培養(yǎng)物在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)，而另一種培養(yǎng)物在23℃下培養(yǎng)。SDS-PAGE的結(jié)果顯示了在誘導(dǎo)后4和5小時的表達(dá)水平在37℃誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中更高。在23℃誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中培養(yǎng)物誘導(dǎo)19小時顯示了較高的Qβ水平。
實(shí)施例9 通過乳糖和甘油共補(bǔ)料的誘導(dǎo) 配制由20％甘油和20％乳糖組成的補(bǔ)料溶液(R42)，在誘導(dǎo)開始時加于實(shí)施例6描述的發(fā)酵中。

圖1提供了貫穿整個過程時間的相關(guān)過程參數(shù)的概要。在13.5小時在OD600大約為5.5時誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后，將補(bǔ)料泵速設(shè)定為恒定的。甘油不隨補(bǔ)料而累積。乳糖累積到4g/l，然后開始減少。β-半乳糖苷酶活性上升到10U/ml，然后降低。與以前的發(fā)酵流程相比a)乳糖在誘導(dǎo)起始時單次添加，不補(bǔ)料；b)連續(xù)補(bǔ)加沒有甘油的乳糖，與流程a)和b)進(jìn)行4小時相比，活性高于7U/ml并且在2小時后達(dá)到最大活性。
實(shí)施例10 質(zhì)粒保持 下述操作條件對質(zhì)粒保持的影響在實(shí)施例6描述的過程中進(jìn)行檢測1)預(yù)培養(yǎng)物初始體積，2)在預(yù)培養(yǎng)物中的卡那霉素，3)在37℃相比30℃時的生長和/或誘導(dǎo)。結(jié)果總結(jié)在表5中。預(yù)培養(yǎng)由來自細(xì)胞儲存小瓶的5μl體積開始。小體積的接種允許預(yù)培養(yǎng)物生長過夜。用于QT0103F8的預(yù)培養(yǎng)物包含25mg/l的卡那霉素，而用于QT0103的預(yù)培養(yǎng)物不包含任何卡那霉素。這兩種發(fā)酵都在30℃下進(jìn)行，誘導(dǎo)5小時。從5小時誘導(dǎo)之前和之后的質(zhì)粒保持判斷，向預(yù)培養(yǎng)物中補(bǔ)充卡那霉素對于質(zhì)粒保持具有積極效果。在5小時誘導(dǎo)之前和之后質(zhì)粒保持為98％。相反，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)物中省略卡那霉素時，質(zhì)粒保持僅僅達(dá)到80％。對于隨后的流程，QT0203F7，預(yù)培養(yǎng)也以5μl開始，在包含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長。在生物反應(yīng)器中的發(fā)酵從一開始就在37℃下進(jìn)行。在37℃運(yùn)行對于質(zhì)粒穩(wěn)定性具有有害的影響。誘導(dǎo)之前的質(zhì)粒保持為99％，而在5小時誘導(dǎo)后降低到0％。為了測試較短的預(yù)培養(yǎng)和因此較少的代數(shù)是否在5小時誘導(dǎo)之后提高質(zhì)粒保持，一系列預(yù)培養(yǎng)從來自解凍的細(xì)胞儲存小瓶的300μl體積開始并在沒有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長。兩個發(fā)酵罐在30℃下進(jìn)行整個流程。另外兩個發(fā)酵罐首先在30℃下進(jìn)行細(xì)胞生長，然后切換到37℃進(jìn)行生產(chǎn)階段。得到的質(zhì)粒穩(wěn)定性在誘導(dǎo)之前和5小時之后都為100％。
表5根據(jù)預(yù)培養(yǎng)的代數(shù)，預(yù)培養(yǎng)中有或沒有卡那霉素，在37℃的生長和/或誘導(dǎo)的不同操作條件下在誘導(dǎo)之前或5小時之后獲得的質(zhì)粒保持力的概述
實(shí)施例11 誘導(dǎo)時間點(diǎn)的變化 在基本上如實(shí)施例6所述的過程中，指數(shù)補(bǔ)料分布編程為在生物反應(yīng)器接種后7小時開始。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，誘導(dǎo)的預(yù)定時間為14小時過程時間。為了測試誘導(dǎo)時間點(diǎn)的變化對于最終細(xì)胞密度的影響，在13.5小時誘導(dǎo)(導(dǎo)致6.5小時的指數(shù)補(bǔ)料)一種培養(yǎng)物，并且在14.5小時(導(dǎo)致7.5小時的指數(shù)補(bǔ)料)誘導(dǎo)另一種培養(yǎng)物。在常規(guī)14小時時間點(diǎn)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物作為對照(7小時的指數(shù)補(bǔ)料)。結(jié)果總結(jié)在表6中。細(xì)胞密度隨著補(bǔ)料時間的延長而增加。從可獲得的最終CWW數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸分析判斷，存在線性相關(guān)(r2＝0.92)。
表6誘導(dǎo)時間點(diǎn)的變化根據(jù)OD600和CWW對最終細(xì)胞密度的影響
實(shí)施例12 收獲時間點(diǎn)的變化 在基本上如實(shí)施例6所述的過程中的培養(yǎng)物收獲以手工進(jìn)行。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，收獲的預(yù)定時間為19小時過程時間?！笆斋@”的操作涉及手工終止生物反應(yīng)器的運(yùn)行。為測試收獲時間點(diǎn)的變化對最終細(xì)胞密度的影響，一種培養(yǎng)物在18.8小時收獲(導(dǎo)致4.8小時的誘導(dǎo))，另一種在19.5小時收獲(導(dǎo)致5.5小時的誘導(dǎo))。一種培養(yǎng)物在常規(guī)的19小時時間點(diǎn)收獲作為對照(5小時的誘導(dǎo))。結(jié)果總結(jié)在表7中。細(xì)胞密度隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加，因?yàn)榧?xì)胞在誘導(dǎo)時仍然生長。
表7收獲時間點(diǎn)的變化根據(jù)OD600和CWW對最終細(xì)胞密度的影響
實(shí)施例13 溫度的影響 在基本如實(shí)施例6所述的過程中發(fā)酵溫度的影響通過在5個不同溫度設(shè)定點(diǎn)進(jìn)行6次發(fā)酵進(jìn)行研究。結(jié)果總結(jié)在表8中。最終細(xì)胞密度對于發(fā)酵溫度是敏感的，最適溫度是30℃。
表8不同溫度設(shè)置點(diǎn)對根據(jù)OD600和CWW的最終細(xì)胞密度的結(jié)果總結(jié)
實(shí)施例14 放大的發(fā)酵(50升) 將實(shí)施例6所述的過程放大到50升體積以評價從2升工作體積生物反應(yīng)器系統(tǒng)到更大體積的放大能力。放大過程的關(guān)鍵的過程參數(shù)總結(jié)在表9中。
表9在50L生物反應(yīng)器中的過程參數(shù) *相對于預(yù)生物反應(yīng)器接種的時間 兩個預(yù)培養(yǎng)擴(kuò)增步驟是必要的。在第一步驟中，細(xì)胞如2L過程(實(shí)施例6)中所建立的那樣擴(kuò)增。在此步驟之后，將細(xì)胞分到兩個5000ml搖瓶培養(yǎng)物中，每個包含750ml培養(yǎng)基。進(jìn)一步擴(kuò)增5小時。在50L生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)按照與2L系統(tǒng)(實(shí)施例6)所述相同的時間分布進(jìn)行。在誘導(dǎo)開始時OD600是46，最終OD600是128。質(zhì)粒保持在誘導(dǎo)前是100％，在培養(yǎng)最后是98％。培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)基中QβCP蛋白的濃度利用SDS-PAGE大概估計為8g/l。該反應(yīng)器運(yùn)行的Qβ的總量估計是大約300g。
實(shí)施例15 延長的指數(shù)補(bǔ)料的效果 根據(jù)實(shí)施例6或14進(jìn)行的發(fā)酵的指數(shù)補(bǔ)料期為7小時。在此時間之后，細(xì)胞達(dá)到誘導(dǎo)的密度，其在誘導(dǎo)過程中增加到大約100到130的目標(biāo)最大OD600作為最終細(xì)胞密度。確定如實(shí)施例6和14所述、優(yōu)選如實(shí)施例14所述進(jìn)行的反應(yīng)器運(yùn)行的最終OD600、最終CWW、最終CDW、在誘導(dǎo)開始和收獲時的質(zhì)粒保持、培養(yǎng)結(jié)束時的Qβ濃度，其中指數(shù)補(bǔ)料期延長到高達(dá)11小時、優(yōu)選10小時的持續(xù)時間。
實(shí)施例16 在生產(chǎn)過程中增加補(bǔ)料的效果 實(shí)施例9證實(shí)了甘油在生產(chǎn)期不累積，表明了生產(chǎn)可以不受誘導(dǎo)培養(yǎng)基的補(bǔ)料速率的限制。在如實(shí)施例6和14所述、優(yōu)選如實(shí)施例14所述的反應(yīng)器運(yùn)行中，確定增加誘導(dǎo)培養(yǎng)基的補(bǔ)料速率對最終OD600、最終CWW、最終CDW、誘導(dǎo)開始和收獲時的質(zhì)粒保持、培養(yǎng)結(jié)束時的Qβ濃度的影響，其中在生產(chǎn)過程中提高補(bǔ)料速率。可選地或另外，補(bǔ)料培養(yǎng)基中乳糖和甘油的比例轉(zhuǎn)向更高的甘油和更低的乳糖濃度。
實(shí)施例17 QβCP的HPLC分析 QβCP利用HPLC系統(tǒng)如下測定將包含QβCP的樣品在包含10mM 1，4-二硫-DL-蘇糖醇的1x反應(yīng)緩沖液(50mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液，pH8.0)中適當(dāng)?shù)叵♂?，并?0℃下在熱混合器中溫育15分鐘。溫育之后，將樣品離心，在2℃到10℃儲存上清液直到HPLC分析。注射10到100μl的樣品。
從50℃熱平衡的C4反相柱300

，5μm，4.6×150mm，Vydac Inc.Hesperia，USA(目錄號214TP5415)上洗脫后，利用對215nm處檢測的HPLC峰面積回歸的已知Qβ標(biāo)準(zhǔn)的回歸曲線，對Qβ進(jìn)行定量。通過系統(tǒng)的流速是1ml/min，由流動相A(0.12％三氟醋酸水溶液)和流動相B(在乙腈中的0.12％的三氟醋酸)組成，流動相B具有下述梯度0到2分鐘恒定在40％，2到8分鐘線性增加到50％，8到10分鐘恒定在50％，10到10.1分鐘線性降低到40％，10.1到12分鐘恒定在40％。
實(shí)施例18 通過分析性大小排阻色譜確定Qβ VLP 通過分析性大小排阻色譜對Qβ顆粒的分析利用TskgelG5000PWXL-柱(10μm，7.8×300mm，TosoH Biosep；目錄號08023)進(jìn)行，該柱用磷酸緩沖液(20mM Na2HPO4/NaH2PO4，150mM NaCl pH 7.2)平衡。以0.8ml/min在磷酸緩沖液中進(jìn)行等度梯度洗脫20分鐘。根據(jù)對260nm下檢測的HPLC峰面積回歸的已知Qβ標(biāo)準(zhǔn)的回歸曲線確定Qβ濃度。
實(shí)施例19 延長的指數(shù)補(bǔ)料的效果 根據(jù)實(shí)施例6或14進(jìn)行的發(fā)酵的指數(shù)補(bǔ)料期是7小時。在此時間之后，細(xì)胞達(dá)到誘導(dǎo)密度，其在誘導(dǎo)過程中增加到大約100到130的目標(biāo)最大OD600作為最終細(xì)胞密度。確定如實(shí)施例6和14所述、優(yōu)選如實(shí)施例14所述進(jìn)行的反應(yīng)器運(yùn)行的最終OD600、最終CWW、誘導(dǎo)之前和收獲時的質(zhì)粒保持和培養(yǎng)結(jié)束時的Qβ濃度，其中指數(shù)補(bǔ)料期延長到高達(dá)12小時的持續(xù)時間。另外，在誘導(dǎo)補(bǔ)料中的甘油和乳糖的濃度分別改變?yōu)?00g/L和100g/L。結(jié)果總結(jié)在表10中。
表10培養(yǎng)結(jié)束時的OD600和CWW，誘導(dǎo)之前和培養(yǎng)結(jié)束時的質(zhì)粒保持，以及氧質(zhì)量流量峰值。在不同的指數(shù)補(bǔ)料持續(xù)時間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

根據(jù)LDS-PAGE分析，除了利用12小時指數(shù)補(bǔ)料的培養(yǎng)外，所有培養(yǎng)的特定的Qβ濃度是相同的。最佳的絕對Qβ產(chǎn)量和氧消耗在9.5小時的指數(shù)補(bǔ)料中發(fā)現(xiàn)。因此，優(yōu)選進(jìn)行具有9.5小時的指數(shù)補(bǔ)料期的過程。
實(shí)施例20 放大的發(fā)酵(50升) 將實(shí)施例6中描述的過程和如實(shí)施例19中所述的具有300g/l甘油和100g/l乳糖的9.5小時指數(shù)補(bǔ)料期的過程放大到50L體積，以評價從2L工作體積的生物反應(yīng)器系統(tǒng)到更大體積的放大能力。該放大的過程的關(guān)鍵過程參數(shù)總結(jié)在表11中。
表1150L規(guī)模的過程參數(shù) *相對于生物反應(yīng)器接種時間 為了在更大的反應(yīng)器中接種大約相同的細(xì)胞密度，改變預(yù)培養(yǎng)步驟是必要的。在50L生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)利用如實(shí)施例19所述對2L規(guī)模優(yōu)化的時間分布進(jìn)行。六個培養(yǎng)的最終細(xì)胞濕重是188g/L±9。在培養(yǎng)結(jié)束時的質(zhì)粒保持是97.3％±1.4。培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)基中Qβ CP蛋白的濃度通過C4反相HPLC(實(shí)施例17)確定為10.8g/L±0.3。對于一次50L的運(yùn)轉(zhuǎn)，Qβ CP的總量是540g。分析Qβ CP和Qβ VLP的大約兩倍濃縮的生物量的粗提取物(實(shí)施例18)。Qβ CP的濃度是19.1g/L±0.4(C4反相HPLC)，Qβ VLP的濃度是18.8g/L±1.1。因此，在收獲時估計發(fā)酵過程的VLP產(chǎn)率大約是9-11g/l發(fā)酵液。
序列表
<110>賽托斯生物技術(shù)公司
M·埃默林格
F·亨內(nèi)克
H·普夫倫德
M·里爾
P·斯坦納
<120>可放大的發(fā)酵方法
<130>P1049PC00
<150>EP05011416.4
<151>2005-05-26
<150>EP05106729.6
<151>2005-0721
<160>40
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒
<400>1
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 60
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt120
gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca180
ggaaacagaa ttctaaggag gaaaaaaaaa tggcaaaatt agagactgtt actttaggta240
acatcgggaa agatggaaaa caaactctgg tcctcaatcc gcgtggggta aatcccacta300
acggcgttgc ctcgctttca caagcgggtg cagttcctgc gctggagaag cgtgttaccg360
tttcggtatc tcagccttct cgcaatcgta agaactacaa ggtccaggtt aagatccaga420
acccgaccgc ttgcactgca aacggttctt gtgacccatc cgttactcgc caggcatatg480
ctgacgtgac cttttcgttc acgcagtata gtaccgatga ggaacgagct tttgttcgta540
cagagcttgc tgctctgctc gctagtcctc tgctgatcga tgctattgat cagctgaacc600
cagcgtatta atgactgctc attgccggtg gtggctcagg gtcaaaaccc gatccggtta660
ttccggatcc accgattgat ccgccgccag ggacaggtaa gtatacctgt cccttcgcaa720
tttggtccct agaggaggtt tacgagcctc ctactaagaa ccgaccgtgg cctatctata780
atgctgttga actccagcct cgcgaatttg atgttgccct caaagatctt ttgggcaata840
caaagtggcg tgattgggat tctcggctta gttataccac gttccgcggt tgccgtggca900
atggttatat tgaccttgat gcgacttatc ttgctactga tcaggctatg cgtgatcaga960
agtatgatat tcgcgagggc aagaaacctg gtgctttcgg taacattgag cgattcattt 1020
atcttaagtc gataaatgct tattgctctc ttagcgatat tgcggcctat cacgccgatg 1080
gcgtgatagt tggcttttgg cgcgatccat ccagtggtgg tgccataccg tttgacttca 1140
ctaagtttga taagactaaa tgtcctattc aagccgtgat agtcgttcct cgtgcttagt 1200
aactaaggat gaaatgcatg tctaagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca 1260
gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg 1320
gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg1380
ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa1440
cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct1500
ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga1560
gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc1620
ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct agagccacgt1680
tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat1740
aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggagtgtt atgagccata ttcaacggga1800
aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa1860
atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc1920
cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga1980
tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt2040
tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt2100
ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt2160
cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt2220
tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga2280
tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc2340
attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga2400
cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca2460
ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct2520
ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct2580
cgatgagttt ttctaaacgc gtgaccaagt ttactcatat gtactttaga ttgatttaaa2640
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa2700
aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg2760
atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc2820
gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac2880
tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca2940
ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt3000
ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc3060
ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg3120
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc3180
cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac3240
gagggagctc ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct3300
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc3360
cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt3420
tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac3480
cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg3540
cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac3600
tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta 3660
cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 3720
gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 3780
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca 3840
gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt 3900
ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt 3960
tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata 4020
ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta 4080
ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc 4140
actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag 4200
cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc 4260
agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt 4320
ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta 4380
aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt 4440
ggccaggacc caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg 4500
atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg 4560
gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg 4620
aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg 4680
cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga 4740
cgatcagcgg tccaatgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct 4800
gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga 4860
tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg 4920
ccagcaagac gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc 4980
cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga 5040
ataccgcaag cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa 5100
tgacccagag cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa 5160
gtgcggcgac gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc 5220
tcaagggcat cggtcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta 5280
gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc 5340
ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga 5400
gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa 5460
ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atccgggctt 5520
atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtat 5579
<210>2
<211>245
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>啟動子序列
<400>2
cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 60
tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat120
aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac180
aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga240
aacag245
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SD序列
<400>3
taaggaggaa aaaaaaatg19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SD序列
<400>4
aggaggtaaa aaacgatg 18
<210>5
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>5
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
130
<210>6
<211>1017
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表達(dá)構(gòu)建體
<400>6
atggcaaaat tagagactgt tactttaggt aacatcggga aagatggaaa acaaactctg 60
gtcctcaatc cgcgtggggt aaatcccact aacggcgttg cctcgctttc acaagcgggt120
gcagttcctg cgctggagaa gcgtgttacc gtttcggtat ctcagccttc tcgcaatcgt180
aagaactaca aggtccaggt taagatccag aacccgaccg cttgcactgc aaacggttct240
tgtgacccat ccgttactcg ccaggcatat gctgacgtga ccttttcgtt cacgcagtat300
agtaccgatg aggaacgagc ttttgttcgt acagagcttg ctgctctgct cgctagtcct360
ctgctgatcg atgctattga tcagctgaac ccagcgtatt aatgactgct cattgccggt420
ggtggctcag ggtcaaaacc cgatccggtt attccggatc caccgattga tccgccgcca480
gggacaggta agtatacctg tcccttcgca atttggtccc tagaggaggt ttacgagcct540
cctactaaga accgaccgtg gcctatctat aatgctgttg aactccagcc tcgcgaattt600
gatgttgccc tcaaagatct tttgggcaat acaaagtggc gtgattggga ttctcggctt660
agttatacca cgttccgcgg ttgccgtggc aatggttata ttgaccttga tgcgacttat720
cttgctactg atcaggctat gcgtgatcag aagtatgata ttcgcgaggg caagaaacct780
ggtgctttcg gtaacattga gcgattcatt tatcttaagt cgataaatgc ttattgctct840
cttagcgata ttgcggccta tcacgccgat ggcgtgatag ttggcttttg gcgcgatcca900
tccagtggtg gtgccatacc gtttgacttc actaagtttg ataagactaa atgtcctatt960
caagccgtga tagtcgttcc tcgtgcttag taactaagga tgaaatgcat gtctaag 1017
<210>7
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>7
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
1 100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>8
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>8
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>9
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體Qb
<400>9
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Il e Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>10
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>10
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>11
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>11
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>12
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌體AP205
<400>12
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
35 40 45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
50 55 60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Il e Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65 70 75 80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
85 90 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
115 120 125
Thr Thr Ala
130
<210>13
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌體AP205
<400>13
Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
35 40 45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
50 55 60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65 70 75 80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
85 90 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
115 120 125
Thr Thr Ala
130
<210>14
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌體AP205
<400>14
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asp Lys Ile
1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
35 40 45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
50 55 60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65 70 75 80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
85 90 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
115 120 125
Thr Thr Ala
130
<210>15
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌體Qbeta
<400>15
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145 150 155 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
165 170 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
180 185 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
195 200 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
210 215 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
245 250 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
260 265 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
275 280 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
290 295 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305 310 315 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
325
<210>16
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌體R17
<400>16
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met G1n Gly Leu Leu
100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
115 120 125
Tyr
<210>17
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌體fr
<400>17
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
100 105 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125
Ile Tyr
130
<210>18
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌體GA
<400>18
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
35 40 45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
50 55 60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65 70 75 80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
100 105 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
115 120 125
Tyr Ala
130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌體SP
<400>19
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1 5 10 15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210>20
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌體
<400>20
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1 5 10 15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
50 55 60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65 70 75 80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
85 90 95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
100 105 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
115 120 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
130 135 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145 150 155 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
165 170 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
180 185 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
195 200 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
210 215 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225 230 235 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
245 250 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
260 265 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
325
<210>21
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌體MS2
<400>21
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
85 90 95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
100 105 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125
Ile Tyr
130
<210>22
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌體M11
<400>22
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
130
<210>23
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌體MX1
<400>23
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1 5 10 15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
130
<210>24
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌體NL95
<400>24
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1 5 10 15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
165 170 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala LysAsp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
180 185 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
195 200 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
210 215 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225 230 235 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
245 250 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
260 265 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
325 330
<210>25
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌體f2
<400>25
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
115 120 125
Tyr
<210>26
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌體PP7
<400>26
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
50 55 60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65 70 75 80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
85 90 95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
100 105 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
115 120 125
<210>27
<211>4586
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克降載體
<400>27
ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60
attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa120
aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac180
ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt240
gcagtcgata agctccggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc300
acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc360
cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg420
ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc480
ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgaccg540
atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc600
gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg660
ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg720
cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc780
aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac840
gtcttgctgg cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct900
tccggcggca tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac960
catcagggac agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcactgga 1020
ccgctgatcg tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg 1080
attgtaggcg ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc 1140
cgggccacct cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa 1200
gaattggagc caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga 1260
acatatccat cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg 1320
ggtcctggcc acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc 1380
ggggttgcct tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact 1440
gctgctgcaa aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt ttccgtgttt 1500
cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg 1560
caggatgctg ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt 1620
gaccctgagt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac 1680
aacgttccag taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc 1740
gtttcatcgg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc cttacacgga ggcatcaagt 1800
gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac 1860
gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct 1920
tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 1980
aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 2040
gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 2100
gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 2160
attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2220
taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 2280
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 2340
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 2400
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 2460
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 2520
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 2580
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg2640
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc2700
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca2760
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag2820
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct2880
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc2940
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga3000
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca3060
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat3120
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac3180
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt3240
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt3300
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag3360
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct3420
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt3480
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc3540
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt3600
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg3660
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg3720
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct3780
tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc3840
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt3900
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt3960
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg4020
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat4080
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaaa gagtttgtag4140
aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta atttgatgcc tggcagttta4200
tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc gcaacgttca aatccgctcc4260
cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc4320
ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg gcagttccct actctcgcat4380
ggggagaccc cacactacca tcggcgctac ggcgtttcac ttctgagttc ggcatggggt4440
caggtgggac caccgcgcta ctgccgccag gcaaattctg ttttatcaga ccgcttctgc4500
gttctgattt aatctgtatc aggctgaaaa tcttctctca tccgccaaaa cagaagcttg4560
gctgcaggtc gacggatccc cgggaa 4586
<210>28
<211>425
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>終止序列
<400>28
ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 60
cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 120
gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag 180
agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc 240
gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg 300
atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg 360
ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa 420
ctctt 425
<210>29
<211>816
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗性基因
<400>29
ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60
accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120
taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180
tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240
tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300
gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360
cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420
atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480
ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540
atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600
tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660
caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720
attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780
cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcat816
<210>30
<211>4963
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒
<400>30
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 60
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt 120
gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 180
ggaaacagaa ttctaaggag gaaaaaaaaa tggcaaataa gccaatgcaa ccgatcacat 240
ctacagcaaa taaaattgtg tggtcggatc caactcgttt atcaactaca ttttcagcaa 300
gtctgttacg ccaacgtgtt aaagttggta tagccgaact gaataatgtt tcaggtcaat360
atgtatctgt ttataagcgt cctgcaccta aaccggaagg ttgtgcagat gcctgtgtca420
ttatgccgaa tgaaaaccaa tccattcgca cagtgatttc agggtcagcc gaaaacttgg480
ctaccttaaa agcagaatgg gaaactcaca aacgtaacgt tgacacactc ttcgcgagcg540
gcaacgccgg tttgggtttc cttgacccta ctgcggctat cgtatcgtct gatactactg600
cttaatgaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa660
atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt720
cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg780
gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga840
aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa900
atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac960
gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 1020
ttgcgtttct acaaactctt ttgtttattt ttctagagcc acgttgtgtc tcaaaatctc 1080
tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac 1140
ataaacagta atacaaggag tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc ttgctcgagg 1200
ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat 1260
gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg 1320
tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta 1380
aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat 1440
gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt attagaagaa 1500
tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat 1560
tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg 1620
caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc 1680
tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca 1740
gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata 1800
ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta 1860
tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt 1920
attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 1980
acgcgtgacc aagtttactc atatgtactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 2040
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 2100
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 2160
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 2220
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 2280
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 2340
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 2400
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 2460
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 2520
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 2580
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gctcccaggg2640
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga2700
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt2760
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct2820
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga2880
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt2940
ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc3000
tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg3060
ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg3120
catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac3180
cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg3240
attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta3300
atgtctggct tctgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg3360
atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga3420
ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg3480
gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc3540
agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc3600
agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac3660
ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc3720
ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc3780
ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc3840
tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc3900
aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag3960
tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca4020
tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc4080
caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccaat4140
gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc4200
atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag4260
aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc4320
cagcgcgtcg gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc4380
gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag4440
gccgatcatc gtcgcgctcc agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc4500
cggcacctgt cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt4560
catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg4620
acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt4680
gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc4740
cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc4800
ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc4860
ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatccgg gcttatcgac tgcacggtgc 4920
accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg tat 4963
<210>31
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>終止密碼子
<400>31
tgaaca 6
<210>32
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>終止密碼子
<400>32
taatga 6
<210>33
<211>4525
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒
<400>33
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cagacatgca tttcatcctt420
agttactaag cacgaggaac gactatcacg gcttgaatag gacatttagt cttatcaaac480
ttagtgaagt caaacggtat ggcaccacca ctggatggat cgcgccaaaa gccaactatc540
acgccatcgg cgtgataggc cgcaatatcg ctaagagagc aataagcatt tatcgactta600
agataaatga atcgctcaat gttaccgaaa gcaccaggtt tcttgccctc gcgaatatca660
tacttctgat cacgcatagc ctgatcagta gcaagataag tcgcatcaag gtcaatataa720
ccattgccac ggcaaccgcg gaacgtggta taactaagcc gagaatccca atcacgccac780
tttgtattgc ccaaaagatc tttgagggca acatcaaatt cgcgaggctg gagttcaaca840
gcattataga taggccacgg tcggttctta gtaggaggct cgtaaacctc ctctagggac900
caaattgcga agggacaggt atacttacct gtccctggcg gcggatcaat cggtggatcc960
ggaataaccg gatcgggttt tgaccctgag ccaccaccgg caatgagcag tcattaatac 1020
gctgggttca gctgatcaat agcatcgatc agcagaggac tagcgagcag agcagcaagc 1080
tctgtacgaa caaaagctcg ttcctcatcg gtactatact gcgtgaacga aaaggtcacg 1140
tcagcatatg cctggcgagt aacggatggg tcacaagaac cgtttgcagt gcaagcggtc1200
gggttctgga tcttaacctg gaccttgtag ttcttacgat tgcgagaagg ctgagatacc1260
gaaacggtaa cacgcttctc cagcgcagga actgcacccg cttgtgaaag cgaggcaacg1320
ccgttagtgg gatttacccc acgcggattg aggaccagag tttgttttcc atctttcccg1380
atgttaccta aagtaacagt ctctaatttt gccatcgttt tttacctcct tctagagtca1440
ttatggtttt gccatacatc agtatggtgt agcagcactt attataatct ttattgcctc1500
ttaaaactta atccacatca aaactcaaat acttttaacc ccagcgtcct gtaagctctg1560
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct1620
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac1680
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga1740
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat1800
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac1860
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct1920
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg1980
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg2040
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt2100
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg2160
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac2220
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga2280
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt2340
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt2400
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga2460
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc2520
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct2580
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata2640
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca2700
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga2760
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga2820
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg2880
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga2940
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt3000
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct3060
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtgggg ggggggggcg3120
ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc3180
atccagccag aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt3240
ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat3300
ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc3360
agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg3420
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 3480
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 3540
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 3600
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 3660
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 3720
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 3780
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 3840
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 3900
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 3960
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 4020
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 4080
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 4140
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 4200
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt 4260
attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca 4320
acgtggcttt cccccccccc ccattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 4380
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 4440
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 4500
aggcgtatca cgaggccctt tcgtc4525
<210>34
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>34
gcgcgcgaat tcaggaggta aaaaacgatg gcaaaattag agactgttac tttagg 56
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>35
gcatgcaagc ttagacatgc atttcatcct tag 33
<210>36
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>36
gcgcgcgaat tctaaggagg aaaaaaaaat ggcaaaatta gagactgtta ctttagg 57
<210>37
<211>3914
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆載體
<400>37
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccccggatcc gtcgacctgc420
aggggggggg gggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc480
ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt540
gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc600
gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg660
ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat720
tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata780
ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat840
aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct900
attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact960
gaatccggtg agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag 1020
ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 1080
gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa 1140
tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat 1200
tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca 1260
tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt 1320
agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 1380
aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 1440
ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 1500
ctcgagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 1560
taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag 1620
agattttgag acacaacgtg gctttccccc ccccccctgc aggtcgacgg atccggggaa 1680
ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 1740
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 1800
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 1860
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 1920
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 1980
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2040
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2100
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2160
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2220
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2280
gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2340
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2400
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2460
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2520
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2580
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2640
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2700
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 2760
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2820
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 2880
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 2940
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3000
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3060
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3120
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3180
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3240
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3300
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3360
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3420
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3480
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3540
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3600
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3660
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3720
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 3780
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 3840
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 3900
gaggcccttt cgtc3914
<210>38
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>38
gcgcgcgaat tctaaggagg aaaaaaaaat ggcaaataag ccaatgcaac cgatcac 57
<210>39
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>39
gcatgcaagc ttcattaagc agtagtatca gacgatacga tagc 44
<210>40
<211>4962
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表達(dá)構(gòu)建體
<400>40
ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 60
gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt120
gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca180
ggaaacagaa ttcaggaggt aaaaaacgat ggcaaataag ccaatgcaac cgatcacatc240
tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta tcaactacat tttcagcaag300
tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg aataatgttt caggtcaata360
tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt tgtgcagatg cctgtgtcat420
tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca gggtcagccg aaaacttggc480
taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt gacacactct tcgcgagcgg540
caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc gtatcgtctg atactactgc600
ttaatgaagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa660
tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc720
ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg780
tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa840
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa900
tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg960
cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt 1020
tgcgtttcta caaactcttt tgtttatttt tctagagcca cgttgtgtct caaaatctct 1080
gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca 1140
taaacagtaa tacaaggagt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct tgctcgaggc 1200
cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg 1260
tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt 1320
ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa 1380
actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg 1440
atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta ttagaagaat 1500
atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt 1560
cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc 1620
aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct1680
ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca ccggattcag1740
tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag1800
gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat1860
ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta1920
ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaaa1980
cgcgtgacca agtttactca tatgtacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta2040
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt2100
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt2160
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt2220
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc2280
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg2340
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg2400
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt2460
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac2520
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg2580
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag ctcccagggg2640
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat2700
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt2760
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg2820
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa2880
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc2940
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct3000
ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc3060
tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc3120
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc3180
gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga3240
ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa3300
tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga3360
tgcctccgtg taagggggat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag3420
gatgctcacg atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg3480
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gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca3600
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tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc3780
tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat catgcgcacc cgtggccagg acccaacgct3840
gcccgagatg cgccgcgtgc ggctgctgga gatggcggac gcgatggata tgttctgcca3900
agggttggtt tgcgcattca cagttctccg caagaattga ttggctccaa ttcttggagt3960
ggtgaatccg ttagcgaggt gccgccggct tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat4020
gcaccgcgac gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgcctac aatccatgcc4080
aacccgttcc atgtgctcgc cgaggcggca taaatcgccg tgacgatcag cggtccaatg4140
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tctacctgcc tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc ggaagcgaga4260
agaatcataa tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa gacgtagccc4320
agcgcgtcgg ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg4380
ggaccagtga cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg4440
ccgatcatcg tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc4500
ggcacctgtc ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc4560
atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga4620
cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg4680
agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc4740
acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc4800
cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg4860
gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatccggg cttatcgact gcacggtgca4920
ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt at 496權(quán)利要求
1.一種表達(dá)能夠通過自裝配形成VLP的噬菌體重組衣殼蛋白或其突變體或片段的方法，所述方法包括以下步驟
a)將一種表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌宿主中，其中所述表達(dá)質(zhì)粒包含一種表達(dá)構(gòu)建體，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含(i)編碼所述重組衣殼蛋白或其突變體或片段的第一核苷酸序列，和(ii)可被乳糖誘導(dǎo)的啟動子；
b)在包含主碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌宿主；其中所述培養(yǎng)以分批培養(yǎng)方式在所述啟動子被lacI阻遏的條件下進(jìn)行，其中所述細(xì)菌宿主過量表達(dá)所述lacI；
c)用所述主碳源向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料；和
d)利用一種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述啟動子，其中繼續(xù)用所述主碳源向所述分批培養(yǎng)物中補(bǔ)料。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述噬菌體是RNA噬菌體。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述噬菌體選自
a.)噬菌體Qβ；
b.)噬菌體AP205；
c.)噬菌體fr；
d.)噬菌體GA；
e.)噬菌體SP；
f.)噬菌體MS2；
g.)噬菌體M11；
h.)噬菌體MX1；
i.)噬菌體NL95；
j.)噬菌體f2；
k.)噬菌體PP7；和
l.)噬菌體R17。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述RNA噬菌體是Qβ。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述重組衣殼蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO5。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含第一終止密碼子和第二終止密碼子，其中所述第一終止密碼子直接定位于所述第一核苷酸序列的3’，并且其中第二終止密碼子直接定位于所述第一終止密碼子的3’，并且其中所述第一或第二終止密碼子的至少一個是TAA。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列編碼QβCP，或其突變體或片段，并且其中所述第二核苷酸序列編碼QβA1蛋白或其突變體或片段，并且其中所述第一和第二核苷酸序列通過正好一個包含至少一個TAA終止密碼子的一段序列而隔開。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含核苷酸序列SEQID NO6或由核苷酸序列SEQ ID NO6組成。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ IDNO1或優(yōu)選地由核苷酸序列SEQ ID NO1組成。
10.權(quán)利要求4的方法，其中所述第一核苷酸序列編碼噬菌體的突變外殼蛋白。
11.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中所述啟動子選自
a.)tac啟動子；
b.)trc啟動子；
c.)tic啟動子；
d.)lac啟動子；
e.)lacUV5啟動子；
f.)Psyn啟動子；
g.)lppa啟動子；
h.)lpp-lac啟動子；
i.)T7-lac啟動子；
j.)T3-lac啟動子；
k.)T5-lac啟動子；和
l.)與SEQ ID NO2具有至少50％序列同源性的啟動子。
12.權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)的方法，其中所述啟動子包含核苷酸序列SEQ ID NO2。
13.權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的方法，其中所述主碳源是甘油。
14.權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的方法，其中所述分批培養(yǎng)物的所述補(bǔ)料以一定的流速進(jìn)行，其中所述流速以指數(shù)系數(shù)μ增長，并且其中優(yōu)選地所述指數(shù)系數(shù)μ低于μmax。
15.權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的方法，其中所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物和所述主碳源以恒定的流速向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行。
16.權(quán)利要求1到14的任一方法，其中所述啟動子的所述誘導(dǎo)通過用所述誘導(dǎo)物和所述主碳源以漸增的流速向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料而進(jìn)行。
17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的方法，其中所述誘導(dǎo)物是乳糖，并且其中優(yōu)選地所述乳糖和所述主碳源以大約2∶1到1∶4(w/w)的比例共補(bǔ)料到所述分批培養(yǎng)物中。
18.權(quán)利要求1到16任一項(xiàng)的方法，其中所述誘導(dǎo)物是IPTG，并且其中優(yōu)選地所述IPTG在所述培養(yǎng)基中的濃度是0.001到5mM。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述IPTG在所述培養(yǎng)基中的濃度是大約0.01mM。
20.權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)的方法，其中所述lacI被所述細(xì)菌宿主過量表達(dá)，其中所述過量表達(dá)由lacIq或lacQl引起，優(yōu)選地由lacIq引起。
21.權(quán)利要求1到20任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌宿主在其染色體上包含lacIq基因。
22.權(quán)利要求1到21任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌宿主在質(zhì)粒上包含lacIq基因。
23.權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的方法，其中所述誘導(dǎo)物是乳糖，并且其中所述細(xì)菌宿主包含β-半乳糖苷酶活性。
24.權(quán)利要求1到23任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)和所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料和所述啟動子的所述誘導(dǎo)在比所述細(xì)菌宿主的最適生長溫度低的溫度下進(jìn)行。
25.權(quán)利要求9的方法，其中
a)所述主碳源是甘油；
b)所述分批培養(yǎng)物的所述補(bǔ)料以一定的流速進(jìn)行，其中所述流速以指數(shù)系數(shù)μ增長，并且其中優(yōu)選地所述指數(shù)系數(shù)μ低于μmax；
c)所述誘導(dǎo)物是乳糖；
d)并且所述乳糖和所述主碳源以2∶1到1∶4(w/w)、優(yōu)選1∶1到1∶3(w/w)、最優(yōu)選1∶3(w/w)的比例向所述分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料；
e)所述細(xì)菌宿主是大腸桿菌RB791；并且
f)所述培養(yǎng)和所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料和所述啟動子的所述誘導(dǎo)在大約30℃的溫度下進(jìn)行。
26.權(quán)利要求1的方法，其中
a)所述表達(dá)質(zhì)粒包含或優(yōu)選地由核苷酸序列SEQ ID NO30組成；
b)所述主碳源是甘油；
c)所述分批培養(yǎng)物的所述補(bǔ)料以一定的流速進(jìn)行，其中所述流速以指數(shù)系數(shù)μ增長，并且其中優(yōu)選地所述指數(shù)系數(shù)μ低于μmax；
d)所述誘導(dǎo)物是乳糖；
e)所述乳糖和所述主碳源以2∶1到1∶4(w/w)、優(yōu)選1∶1到1∶3(w/w)、最優(yōu)選1∶3(w/w)的比例向分批培養(yǎng)物中共補(bǔ)料；
f)所述細(xì)菌宿主是大腸桿菌RB791；并且
g)所述培養(yǎng)和所述分批培養(yǎng)物的補(bǔ)料和所述啟動子的所述誘導(dǎo)在大約30℃的溫度下進(jìn)行。
27.權(quán)利要求1到26任一的方法，其中貫穿所述方法的步驟b)到d)，以至少大約40％的培養(yǎng)基中的pO2為所述細(xì)菌宿主供應(yīng)氧。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種表達(dá)通過自裝配形成VLP的噬菌體衣殼蛋白的高效的發(fā)酵方法，其中該方法可放大至商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模，并且其中控制衣殼蛋白的表達(dá)速率以獲得提高的可溶性衣殼蛋白的產(chǎn)量。這可通過將補(bǔ)料分批培養(yǎng)和乳糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)與特定過程參數(shù)相結(jié)合而獲得，所述參數(shù)提供在生長期中提高的啟動子阻遏和貫穿該過程的高質(zhì)粒保持。
文檔編號C12N7/02GK101213294SQ200680023620
公開日2008年7月2日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日
發(fā)明者M·埃默林格, F·亨內(nèi)克, H·普夫倫德, M·里爾, P·斯坦納 申請人:賽托斯生物技術(shù)公司