專利名稱：：用于防治昆蟲和蜘蛛類動物的RNAi的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及昆蟲物種中雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)基因沉默的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及遺傳構(gòu)建體，其被設(shè)計(jì)用來表達(dá)對應(yīng)于本文首次鑒定的新靶標(biāo)的dsRNA。這些構(gòu)建體在dsRNA介導(dǎo)的有害昆蟲防治中，尤其是在防治居室昆蟲或者蜘蛛類動物例如蟑螂中，是非常有用的。
背景技術(shù)：
：有害生物防治，特別是昆蟲和/或蜘蛛類動物的防治，尤其是涉及公眾健康和衛(wèi)生(例如城市保護(hù))的居室昆蟲、外寄生物和昆蟲(比如蟑螂、跳蚤、螞蟻、白蟻、蠼螋(earwigs)、蚊、蠅和家蟋蟀)的防治是重要的領(lǐng)域。在諸如家庭、辦公室、餐館、醫(yī)院或者倉庫的一些地點(diǎn)昆蟲的存在無疑造成困擾，因?yàn)楣姷挠^念認(rèn)為昆蟲比如蟑埤或者蠅生存的地方是骯臟的和不衛(wèi)生的。這些昆蟲不但造成困擾，而且還污染食物和餐具、破壞織物和紙制品并且給它們所接觸的表面帶來污跡和令人討厭的氣味。此外，這些昆蟲作為細(xì)菌攜帶者可以引起健康風(fēng)險(xiǎn)。例如蟑埤可以傳播引起食物中毒的細(xì)菌(沙門氏菌屬(spp.)和志賀氏菌屬(57^ge//flspp.))。德國蟑螂被認(rèn)為能夠傳播引起疾病的生物體比如葡萄球菌屬(;S^fl/7Aj;/oc0ccwsspp.)、鏈球菌屬(spp.)、肝炎病毒和大腸桿菌類細(xì)菌。它們還涉及傷寒和痢疾的傳播。一些人，尤其是具有哮喘的人，對這些蟑螂產(chǎn)生的過敏原是敏感的。有多種已開發(fā)且市售的化學(xué)殺蟲劑和捕獲裝置用于對抗居室有害生物。然而，隨著這些手段功效的增加，健康風(fēng)險(xiǎn)通常也隨之增加。殺蟲劑可能污染食物，這在諸如廚房、餐館或者食物貯藏間的一些地方中幾乎是不可避免的，并且混入殺蟲劑可能引起人的健康風(fēng)險(xiǎn)。已有解決所述污染問題的方案是應(yīng)用較少毒性的殺蟲劑。然而，當(dāng)應(yīng)用較少毒性的殺蟲劑時(shí)，昆蟲隨時(shí)間變得有抗性的可能性增加。殺蟲劑通過結(jié)合某種昆蟲蛋白質(zhì)(比如例如乙酰膽堿受體)起作用，并通過使所述蛋白質(zhì)失活或者過度活化來引起有害生物物種死亡。已開發(fā)的殺蟲劑在一定濃度下是安全的，但是當(dāng)所述殺蟲劑以較高劑量或者持續(xù)長時(shí)間地?fù)饺霑r(shí)，能夠并確實(shí)影響人的健康。與農(nóng)用化學(xué)品相反，家用殺蟲劑被施用于j^藏食物或者準(zhǔn)備食物的一些地方，于是食物污染以及與人的接觸是不能避免的。一種替代化學(xué)殺蟲劑的方法是利用生物試劑。在過去的幾年中，依靠RNA干擾或者"RNAi"下調(diào)多細(xì)胞生物體內(nèi)的基因(也被稱為"基因沉默")已經(jīng)成為非常完善的技術(shù)。通常，RNAi包括使生物體與雙鏈RNA片段或者"dsRNA"(通常作為兩條退火的互補(bǔ)單鏈RNA或者作為發(fā)夾構(gòu)建體)相接觸，所述雙鏈RNA片段或者"dsRNA"包含對應(yīng)于待下調(diào)基因("靶基因，，)之(至少一部分)核苷酸序列的核苷酸序列。具體可參見國際申請WO99/32619(CarnegieInstituteofWashington)、國際申請WO99/53050(CSIRO)、國際申請WO00/010846(Devgen)和Fireetal.,Nature,Vol.391，pp.806-811,February1998。在線蟲類中，可以通過用dsRNA片段本身或者作為替代，用含有dsRNA片段的或者經(jīng)線蟲攝食后能夠表達(dá)dsRNA片段的細(xì)菌菌林喂食線蟲來實(shí)施RNAi。對于這種所謂的"經(jīng)4聶食的RNAi",具體可參見申請人的國際申請WO00/01846以及上述引用的WO99/32619，其中應(yīng)用了線蟲秀麗隱桿線蟲(C.e/^"ws)。在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多dsRNA構(gòu)建體。從DNA構(gòu)建體產(chǎn)生典型的dsRNA，其包含兩個(gè)會聚的啟動子(convergentpromoter),位于隨著dsRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)的發(fā)展，'設(shè)計(jì)了新的構(gòu)建體以改進(jìn)用于各種目的的dsRNA。為了更有效地產(chǎn)生dsRNA，開發(fā)了莖-環(huán)-莖結(jié)構(gòu)或者"發(fā)夾"。例如，如在文件WO99/53050(CSIRO)中描述的，此發(fā)夾允許從一種單一RNA轉(zhuǎn)錄物形成dsRNA。所述RNA轉(zhuǎn)錄物包括互補(bǔ)序列的正義和反義型式，其由非互補(bǔ)環(huán)結(jié)構(gòu)分開，這允許RNA轉(zhuǎn)錄物折疊回來并堿基配對構(gòu)成dsRNA的莖部分。發(fā)現(xiàn)dsRNA基因沉默在許多不同的領(lǐng)域有應(yīng)用，比如例如dsRNA介導(dǎo)的基因沉默在臨床(WO2004/001013)和植物中的應(yīng)用。在植物中，也設(shè)計(jì)了用于基因沉默的dsRNA構(gòu)建體以切割并加工成為短干擾RNA(s體A)。也已經(jīng)計(jì)劃將RNAi作為保護(hù)植物抵抗植物寄生線蟲的手段，即通過在植物中(例如，在完整植林中，或者在植物部分組織或細(xì)胞中)表達(dá)一種或多種核苷酸序列，所述核苷酸序列形成對應(yīng)于植物寄生線蟲中靶基因的dsRNA片段，所述靶基因是線蟲生長、繁殖和/或生存所必需的?？蓞⒁姳旧暾埲说膰H申請WO00/01846，美國專利6，506，559(基于WO99/32619)，以及國際申請WO01/96584、WO01/37654和WO03/052110對這些4支術(shù)的i兌明。Elbashiretal.(Nature,411，494-498，2001)已證明在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用長度為21個(gè)核苷酸的dsRNA片段(也被稱為小干擾RNA或者siRNA)實(shí)現(xiàn)有效的RNAi介導(dǎo)的基因沉默。WO03/004644概括地描述了向節(jié)肢動物遞送dsRNA，并且其通過參考并入本文。WO03/004644詳述了應(yīng)用RNAi下調(diào)黑腹果蠅("raso/7/w7"柳e/flwogfls^0的才艮告基因GUS(Clontech)和下調(diào)棉鈴蟲(凡flr附/gcm)的vATPase基因。WO01/34815描述了產(chǎn)生dsRNA的桿狀病毒表達(dá)載體以及這些載體在有害生物防治中的應(yīng)用。盡管在植物、線蟲和哺乳動物細(xì)胞的領(lǐng)域中，RNAi技術(shù)被一般性了解已經(jīng)有數(shù)年，但迄今為止對在昆蟲和/或蜘蛛類動物中應(yīng)用RNAi下調(diào)基因表達(dá)卻沒有多少了解。此外，對應(yīng)用RNAi防治有害生物物種比如涉及公眾健康和衛(wèi)生的居室昆蟲、外寄生物和昆蟲和/或蜘蛛類動物也缺乏了解。對于dsRNA介導(dǎo)的有害生物防治來說，合適的和有效的構(gòu)建體應(yīng)至少滿足以下一些要求(1)所述dsRNA必須被有害生物體攝取(2)所述dsRNA在有害生物體中必須具有良好的穩(wěn)定性(3)所述dsRNA必須在有害生物體中有效地控制其生存力、生長和/或發(fā)育和/或(4)所述dsRNA必須保證最大的安全性以及最小的環(huán)境影響。在此本發(fā)明的目的是提供滿足上述要求的dsRNA構(gòu)建體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明描述了新的不基于化合物的防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的方法?；钚猿煞质呛怂?，雙鏈RNA(dsRNA)，其可被用作殺昆蟲的和殺蜘蛛的制劑(例如在誘斜或者凝膠應(yīng)用中)。dsRNA序列匹配昆蟲必需基因(essentialgene)的一部分并通過RNA干擾(RNAi)引起昆蟲耙基因的下調(diào)。作為mRNA下調(diào)的結(jié)果，dsRNA阻止相應(yīng)昆蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)并由此引起昆蟲和/或蜘蛛類動物的死亡、生長停滯或者不育。耙標(biāo)本發(fā)明人已首次鑒定了新的RNAi耙標(biāo)，其能夠有效地防治昆蟲或者蜘蛛類有害生物群體。為避免疑義，在本文中將靶標(biāo)定義為基因，它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是昆蟲和/或蜘蛛類動物維持其正常生理和生物化學(xué)功能所必需的。對所述靶基因表達(dá)的抑制限制了昆蟲和/或蜘蛛類動物進(jìn)食、生長或者存活的能力?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐的昆蟲和/或蜘蛛類動物基因的實(shí)例包括必需基因，涉及諸如發(fā)育、代謝或者神經(jīng)傳導(dǎo)過程的基因，以及其產(chǎn)物是現(xiàn)有殺昆蟲劑和/或殺蜘蛛劑靶標(biāo)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)是細(xì)胞功能必需途徑的一部分，所述細(xì)胞功能比如轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、代謝(合成代謝或者分解代謝)、胞吞作用、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣結(jié)合、核輸入和輸出、核酸結(jié)合、信號肽酶-蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白酶體、嚢泡轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)、水分平衡、離子平衡、剪接、有絲分裂、減數(shù)分裂、染色體組構(gòu)、穩(wěn)定性或者完整性、微RNA、siRNA、翻譯后蛋白質(zhì)修飾、電子傳遞、凋亡、膜完整性和細(xì)胞粘附。本發(fā)明鑒定的新的靶基因包括A)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，例如原肌球蛋白1(GenBankAF260897)(SEQIDNO41和42)、肌動蛋白5C(GenBankAY004248)(SEQIDNO57和58)學(xué)功能的同源或者異源蛋白質(zhì)；B)代謝酶，例如HMG輔酶A合酶(GenBankX73679)(SEQIDNO49和50)和在相同的或者不同的昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中具有相同生物學(xué)功能的同源或者異源蛋白質(zhì)；C)涉及離子/pH體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的酶，比如V-ATPase和在相同的或者不同的昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中具有相同生物學(xué)功能的同源或者異源蛋白質(zhì)；D)涉及轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制的酶，比如例如核糖體蛋白質(zhì)S4同源物(SEQIDNO1和2)核糖體蛋白質(zhì)S9同源物(SEQIDNO11和12)核糖體蛋白質(zhì)L9同源物(SEQIDN021和22)核糖體蛋白質(zhì)L19同源物(SEQIDN031和32)因此，本發(fā)明的第一方面提供核酸分子，其包含SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一的核苷酸序列，或者來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源(orthologous)核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列與SEQIDNOl、11、21和31中任一種所示的核香酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、更優(yōu)選至少約95%、甚至更優(yōu)選至少約96%、97%、98%、最優(yōu)選至少99%序列一致性。優(yōu)選的直系同源序列包含，或者如果按照本發(fā)明方法使用時(shí)將包括，來自居室昆蟲、外寄生物以及涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物的序列，例如蠅、葉螨(spidermites)、薊馬(thrips)、壁虱、家禽紅竭(redpoultrymite)、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚(silverfish)、書虱、甲蟲(beetles),蠼螋、蚊和跳蚤，但不限于此。更優(yōu)選的直系同源序列來自蟑螂(蜚嫌目(Blattodea))，比如但不限于小蠊屬(fi/fl^〃"spp.)(例如，德國小蠊(5/fl&〃flgw/wflw/cflX德國蟑螂))、大蠊屬(T^f^/flwetospp.)(例如，美洲大蠊(尸en》/"we似fl附^7'c"/ifl)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(尸ef7》/ttwe似)(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(spp.)(例如東方蜚蠊()(東方蟑螂Orientalcockroach))和蠊屬(5*，〃"Spp.)(例如褐帶蠊(S，〃fl/"W》fl//7fl)(褐帶蟑螂(brown-bandedcockroach));瑪議(議總、科(Formicoidea)),t匕:ft口但不P艮于火議屬(5V/ewo/7s/sspp.)(例長口入j曼紅火蚊(Xo/^io/7s/s/wv/"")(紅火蚊))、小家蚊屬(A&wo附w/w附spp.)(例如法老小家蚊(Mowo柳or/M柳/7/rflrflow/s)('法老蚊(PharaohAnt))、弓"^f蚊屬(C函/7owotospp.)(例如弓背議屬(C謂"mo^/sspp)(木匠蚊(CarpenterAnts))、毛議屬(/"s/msspp.)(例如黑毛議(/"s/ws)(小黑蚊(SmallBlackAnt)))、4甫道蚊屬(T^m附on'M附spp.)(例如鋪道議(T^m附w'w附cfl邵/^柳)(鋪道議(PavementAnt)))、紅議屬(Afjr附/c"spp.)(例如小紅議(Mj/c"ra6m)(紅議(RedAnt)))、蚊屬(Fo/7w/cflspp.X木議(woodants))、舉腹蚊屬(O簡fl^gfl他rspp.)(例:fto舉腹蚊(Oe柳"^^flWw//"eo/"似)(舉腹議(AcrobatAnt)))、虹臭蚊屬(7r/^柳jT附exspp.)(例如伊議(7nV/o附^r附ex/r"柳///51)(阿根廷蚊(ArgentineAnt)))、大頭蚊屬(泡,espp.)(大頭蟻(BigHeadedAnts))和蚊蜂屬(Dfl5^附w^/〃flspp.X侈d如議蜂(occ/rf^i似/z、)(蚊蜂(VelvetAnt)));白議類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚊科(Termitidae))比如但不限于暗白議屬(j柳/^/7mmspp.)(例如佛羅里達(dá)暗白蚊(J柳/^7wm/ZonV/^is/s)(4弗羅里達(dá)暗翅土白議(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白議屬(W"/CW//^7W^SSpp.)(例如黃肢散白議(_/7flV//7^S)(東方土白議(theeasternsubterraneantermite))、西方土白議(iC/cw版簡es)(西方土白議(WesternSubterraneanTermite)))、家白蚊屬(CV/;^^^"附esspp.)(例ftp家白議(CV/7"&f7wes/i^附0swms)(臺灣土白議(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白蚊屬(/""、/^r附^s1spp.)(例i口小楹白蚊(7wc/s/^f附es1柳zVior)(西方干木白議(WesternDrywoodTermite)))和新白蚊屬(A^o&r附^sspp.)(例如iVe^簡^s(森林白議(ForestTreeTermite)))。本發(fā)明的另一方面提供核酸分子，其包含以下任一所示的核苷酸序列、或者基本由其組成或由其所組成SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。SEQIDNO4、6、7、16、27、26、27、36和37中的所有序列均代表特異性引物的核苷酸序列，其被用于以選擇性和特異性方式鑒定本發(fā)明的新序列。新鑒定的基因代表德國小蠊(5/fl&〃flgW/Wfl"/Cfl)轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制的成分。通過RNAi抑制這些基因的表達(dá)或者通過RNAi抑制這些新鑒定的耙基因的表達(dá)，可以防治重要的有害生物?？深A(yù)測的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這些新的靶基因的直系同源物也代表在防治其它昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中供下調(diào)的另外靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的新核酸分子的直系同源物也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。如果蛋白質(zhì)或者核苷酸序列顯示出"顯著"水平的序列相似性或者一致性，那么它們可能是同源的。真正同源的序列是通過從共同祖先基因的趨異化而相關(guān)的。序列同源物可以是以下兩種類型(i)當(dāng)同源物存在于不同的物種，它們被稱為直系同源物。例如，小鼠和人中的a-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物(paralogue)是單一物種內(nèi)的同源基因。例如，在小鼠中a-和(5-珠蛋白基因是旁系同源物基因。在本文中，"直系同源物"是指上述兩種類型的同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述直系同源物將與SEQIDNO1、11、21、31、41、49或57中任一序列所示的核苷酸序列具有至少約40%、50%或者60%的核*酸一致性。優(yōu)選地，所述直系同源物將與SEQIDNO1、11、21、31、41、49或57中任一序列所示的核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%,更優(yōu)選至少約95%甚至更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或者99。/。的序列一致性。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明包括作為一種基因之昆蟲或者蜘蛛類動物直系同源物的靶基因，所述一種基因包含以下任一所示的核苷酸序列、或者基本由其組成或由其所組成SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。作為實(shí)例，直系同源物可以包括SEQIDNO71-200中任何序列表示的核苷酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個(gè)核芬酸的片段。在表4和5中給出了昆蟲或者蜘蛛類直系同源基因或者包含本發(fā)明序列之一的至少17個(gè)核苷酸之片段的序列的非限制性列表。表4和5的序列構(gòu)成本發(fā)明的一部分。因此，直系同源物包括表4和5列舉的任意序列、或者基本由其組成或由其所組成。根據(jù)另一方面，本發(fā)明由此包括本文描述的用于防治昆蟲和/或蜘蛛類動物侵染或者感染的任意方法，其包括使昆蟲和/或蜘蛛類動物與雙鏈RNA接觸，其中所述雙鏈RNA包括退火的互補(bǔ)鏈，其中一條鏈具有與靶基因核苷酸序列至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其包含SEQIDNO71-200所示任意序列的至少17、18、19、20或者21個(gè)核苷酸的片段，由此所述雙鏈RNA被昆蟲和/或蜘蛛類動物攝取并由此防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的生長，殺傷或者防止其侵染或者感染。所述昆蟲和/或蜘蛛類動物可以包括本文描述的任何靶生物體/物種、或者基本由其組成或由其所組成。本發(fā)明所包括的相關(guān)核酸分子還可以根據(jù)與包含SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一所示核苷酸序列的核酸分子的雜交進(jìn)行定義。優(yōu)選地，雜交條件是中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。中等和高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪@些條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是非常熟悉的。例如，在42*€包含50%甲酰胺，5xSSC和1%SDS的溶液中孵育雜交反應(yīng)，或者在65r包含5xSSC和1%SDS的溶液中孵育，并在65X:用0.2xSSC和0.1%SDS清洗，代表適合的高嚴(yán)謹(jǐn)條件。本發(fā)明還提供這些新靶基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和其直系同源物。由此，本發(fā)明的第二方面提供包含SEQIDNO2、12、22或者32中任一序列所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者其直系同源蛋白質(zhì)，其具有來自其它昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的保守氨基酸序列。如上所述，還預(yù)測，所述新耙基因的直系同源物將代表在防治其它昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中可供下調(diào)的其它靼標(biāo)。因此，本發(fā)明的新蛋白質(zhì)分子的直系同源物也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述直系同源物將與SEQIDN02、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列具有至少約40%氨基酸序列一致性。優(yōu)選地，所述直系同源物將與SEQIDN02、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列具有至少約40%、50%、60%、65%、70%、80%,更優(yōu)選至少約90%,甚至更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或者95°/。氨基酸序列一致性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供編碼蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)包含SEQIDN02、12、22或者32任一序列所示的氨基酸序列。本發(fā)明此方面包括的核酸分子還包括因編碼相同蛋白質(zhì)分子而在功能上等價(jià)的核酸分子。因此，由于遺傳密碼簡并性而可能產(chǎn)生的所有核酸分子落入本發(fā)明此方面的范圍。靶生物體/物種本發(fā)明使用的"靶物種"可以是代表有害生物的任何昆蟲或者蜘蛛類動物物種。該術(shù)語還表示在任何發(fā)育階段的所述昆蟲或者蜘蛛類動物。因?yàn)槔ハx具有不生長的外骨骼，所以它們不能以恒定速率生長，而是通過周期性脫落它們的外骨骼分階段性生長。這些階段被稱為脫皮或者蛻皮。在蛻皮之間的階段被稱為"齡(instars)，，，并且根據(jù)本發(fā)明可以靶向該階段。同樣地，按照本發(fā)明也可以靶向昆蟲卵或者活體幼蟲(liveyoung)。按照本發(fā)明可以通過RNAi靶向發(fā)育周期中的所有階段(包括有翅昆蟲的變態(tài)階段)。因此，發(fā)育的各個(gè)階段比如幼蟲、蛹、若蟲等階段都可以被靶向。靶物種可以是任何昆蟲或者蜘蛛類動物，意指屬于動物界的，更具體屬于節(jié)肢動物門和昆蟲綱或者蛛形綱的任何生物體或者物種。本發(fā)明的方法可適用于對經(jīng)由RNA干擾的基因沉默敏感的和能夠從周圍環(huán)境內(nèi)化雙鏈RNA的所有昆蟲和蜘蛛類動物。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述昆蟲或者蜘蛛類動物可以屬于以下目蜱螨亞綱(Acari)、蛛形綱(Arachnida)、虱目(Anoplura)、蜚蠊目(Blattodea)、鞘翅目(Coleoptera)、彈尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、網(wǎng)翅目(Dictyoptera)、雙尾目(Diplura)、雙翅目(Diptera)、紡足目(Embioptera)、蛘蝣目(Ephemeroptera)、愛蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、異翅亞目(Heteroptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、長翅目(Mecoptera)、脈翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹節(jié)蟲目(Phasmida)、蝨毛目(Phithiraptera)、積翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、噴蟲目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、纓尾目(Thysanura)、胸咮亞目(Ste腦r勿ncha)、搶翅目(Strepsiptera)、纓翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、缺翅目(Zoraptera)和衣魚目(Zygentoma)。在本發(fā)明優(yōu)選的但非限制性的實(shí)施方案中，所述昆蟲或者蜘蛛類動物選自以下纟且(1)蜱螨亞綱螨類(mites)包括蜱亞目(Ixodida)(壁虱(ticks))(2)蛛形綱掩蛛目(Araneae)(掩蛛)和盲蛛目(Opiliones)(盲蜘蛛)，實(shí)例包括美國毒蛛(Z^ra&c似s)(黑寡婦)和隱遞斜妹(Z^xosce/es1度/wse)(棕色隱遞掩珠(BrownRecluseSpider))(3)鼠目鼠(lice)，t匕:ft口人體鼠(P^Z/cw/msAw柳flwws)(人體IUhumanbodylouse))(4)蜚蠊目(Blattodea):蟑螂包括德國蟑螂(德國小蠊)，大蠊屬蟑螂，其包括美洲蟑螂(美洲大蠊(T^n》/fl/iC"fl附enVYmfl))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(iVn》/flwCflflw^m//"s/fle))，蜚蠊屬蟑瑯，其包括東方蟑螂(東方蜚4(5/"加0n'wtofc))和蠊屬蟑螂，其包括揭?guī)?褐帶蠊Uw/^//"/卵^7fl/zm))。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(fi/flte〃flg^7WflW&fl))。(5)鞘翅目甲蟲，實(shí)例包括粉蠹科(thefamilyofPowderpostbeetle)(長蠹總科(familyofBostrichoidea));大小蠹屬(De/frffw,o肌sspp.)(黑松節(jié)油大小蠹(BlackTurpentineBeetle)，華山木>大小蠹(SouthernPineBeetle),IPS切梢小蠹(IPSEngraverBeetle));地趙甲蟲(CarpetBeetles)(圓皮蠹屬(v4w幼frmisspp.)、毛皮蠹屬(j"flgewwsspp.));老房姪蟲(OldHouseBorer)(天?？?familyofCerambycidae):北美家天牛(母/Wrw/7es6咖/ws));家具竊蠹(爿"oA/w柳戸""",m附)；擬谷盜屬(7>幼0//"附spp.)(粉甲蟲(flourbeetle));谷斑皮蠹(rragofifenwfl^Ym"r/w附)(谷斑皮蠹(KhapraBeetle));銀谷盜(Oo^e/^'/ws1sw/""膨ws/s1)(銀谷盜(ToothedGrainBeetle))等(書蠹(Bookworm))(6)革翅目蠼螋科(familyofearwigs)(7)雙翅目蚊(mosquitoes)(蚊科(Culicidae))和錄(flies)(短角亞目(Brachycera)),實(shí)例為按蚊亞科(Anophelinae)比如按蚊屬(Jo/7/^/mspp.)和庫蚊亞科(Culicinae)比:ft口j^fes/m/vws;虻科(Tabanidae)比如7i/6"wws1/7wwcfty^(馬繩(HorseFly))、刺舌錄(G7owVm柳oraY"/is附om'tows)(舌錄(tsetsefly))、污水蠅(drainflies)(毛蠓科(Psychodidae))和有瓣繩類(Calyptratae)比如舍繩(她腳d。膨幼cfl)(家蠅(Housefly))，肉蠅(fleshflies)(麻繩科(familyofSarcophagidae))等。(8)異翅亞目臭蟲類(bugs),比如溫帶臭蟲(C7膨xto"/肌力s)(臭蟲(bedbug))(9)膜翅目(Hymenoptera):黃蜂(wasps)(細(xì)腰亞目(Apocrita))，包括螞蟻(ants)(蟻總科(Formicoidea))，蜜蜂(bees)(蜜蜂總科(Apoidea)):入侵紅火蟻(紅火蟻(RedFireAnt))、小家議(Mi9wo附w"/w柳/7^flraow/s)(小黃家議(PharaohAnt))、弓背議屬(Cfl柳/70冊似sX木匠議(CarpenterAnts))、黑毛議(/"s/ws1w/ger)(d、黑、瑪議(SmallBlackAnt))、4甫道議(^/rfl附or/w附c"邵fYw附)(鋪道議(PavementAnt))、小紅議(A^柳/cflm辦ra)(紅議(RedAnt))、議屬(Fo畫V^spp.)(木議(woodants))、舉腹議(Oe廳^"他r//"/flto)(舉腹議)、伊蚊(7nVto附F廳x)(阿根廷議(ArgentineAnt))、大頭蚊屬(尸/^Vfe/e卿.)(大頭議)、議蜂(D^^/wft7/fl)(i5C蜂)等。(10)等翅目白蟻，實(shí)例包括佛羅里達(dá)暗白蟻(J/m/^f7M^/Zof7V/謂s/s)(佛羅里達(dá)暗翅土白蟻)，東方土白蚊(黃肢散白蟻(iCV^版f7wes1_/7flv—s1))，theR.hesperus(西方土白議(WesternSubterraneanTermite))，家白蚊(CW/7toter附^s/of附owm"s1)(臺灣土白蚊)，小楹白蚊(/"c/s/tenwes附/"or)(西方干木白議)，7V^7tef7W^Scow/iejcws(森林白議)和白議科(11)鱗翅目蛾(moths),實(shí)例包括谷蛾科(Tineidae)和織蛾科(Oecophoridae)t匕:ft口衣織(7iVi^/fl6/^^〃/e〃fl)(普通衣域(CommonClothesMoth)),和螟蛾科(Pyralidae)比如紫斑谷螟(7>Yi//s/fln'"fl//s)(膳食飛蛾(MealMoth))等(12)嚙蟲目書虱(嚙蟲(Psocids))(13)隱翅目跳蚤，比如致癢蚤(尸w/ex/fT/to/w)(14)胸味亞目辨蟲(aphids)(辨科(Aphididae))(15)衣魚目衣魚(silverfish)，實(shí)例為小灶衣魚(JTi^t^M^膨s^/c")和西洋衣魚(丄e/7/s柳"s"flcc/rflr/冊)優(yōu)選的靶昆蟲或者蜘蛛類動物包括居室昆蟲、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物，作為舉例但非限制的蠅，葉螨、薊馬、壁虱，家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。更優(yōu)選的靶標(biāo)是蟑螂(蜚蠊目)比如但不限于小蠊屬(5to函spp.)(例如德國小蠊(BIatellagermanica)(德國蟑螂))、大蠊屬(Periplanetaspp.)(例如美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲蟑埤)和澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(spp.)(例如東方蜚蠊(必/"rt"of^w似/Zs)(東方蟑螂))和蠊屬(S，〃flspp.)(例如褐帶蠊(SupellaIongipalpa)(褐帶蟑螂)；螞議(蟻總辨Formicoidea))，比如但不限于火蚊屬(5Wwo戸/sspp.)(例如入侵紅火蟻(5W^io/7s/s/wv/"")(紅火蟻))、小家蟻屬(AfOMO附On.W柳Spp.)(例如法老小家議(Af"腳附0"'M柳)(法老蚊(PharaohAnt))、弓背議屬(C函/7歸tospp.)(例如弓背蚊屬(C"附/7o鼎似s1spp)(木匠議(CarpenterAnts))、毛議屬(/fls/ws1spp.)(例如黑毛議(lasiusniger)(小黑議(SmallBlackAnt)))、鋪道蟻屬(r掛fl附0由附spp.)(例如鋪道議(T^m附or/M附cfles/7/似附)(鋪道議(PavementAnt)))、紅議屬(Afj;簡/cflspp.)(例如小紅議(Afj/c"f7/6m)(紅議(RedAnt)))、議屬(T^簡/c"spp.)(木議(woodants))、舉腹議屬(O簡fl晰fls^rspp.)(例如Oe附^g"5ter//weo/fl似(AcrobatAnt))、虹臭議屬(/nV/o附F附dspp.)(例如伊議(/nV/o附j(luò)r附d)(阿根廷蟻(ArgentineAnt)))、大頭蟻屬(iVi"V/o/espp.)(大頭蟻(BigHeadedAnts))和Dflsj附M&7/flspp.(例如Dfls戸w"7/"VelvetAnt));白蟻類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蟻科(Termitidae))比如但不限于暗白蟻屬(J柳/^f7w^spp.)(例如佛羅里達(dá)暗白蚊(v4附/^r附es/ZonV/ews/s)(寸弗羅里達(dá)暗翅土白議(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白議屬(及C/c"/Z^r附^sspp.)(例ft口黃肢散白蚊(iWcw//^7fiMyZflvz》^s)(東方土白蚊(theeasternsubterraneantermite))、WWcM版簡esA邵m/s(西方土白議(WesternSubterraneanTermite)))、家白議屬(C^/^o^tmmspp.)(例如家白蚊(CVt/^W^twm/<f7wosaw"s)(臺灣土白蚊(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白議屬(/"c/5"/^f柳esspp.)(例如小楹白議(/wc/si&r柳^s附/"Of)(西方干木白議(WesternDrywoodTermite)))和新白蚊屬(7Veo&r附^sspp.)(例i口A^&r附escowwexws(森林白議(ForestTreeTermite)))。更優(yōu)選的靶標(biāo)是蟑螂。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(必/"^〃fl))。RNA構(gòu)建體"互補(bǔ)的"意思是，RNA鏈代表指定序列的RNA等價(jià)物(如果所述序列是DNA序列)或者DNA序列互補(bǔ)序列的RNA等價(jià)物。本發(fā)明涉及供RNAi介導(dǎo)下調(diào)基因表達(dá)的另外靶標(biāo)。對于本文鑒定的所有靼標(biāo)，在本發(fā)明的另一方面中提供RNA構(gòu)建體，其包括雙鏈RNA區(qū)，其中至少一條鏈包含與以下任一核苷酸序列之一部分相互補(bǔ)的核苷酸序列(i)由SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181任一序列確定的乾核酸分子；或者(ii)包含SEQIDNO41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200任一序列所示核苷酸序列的核酸分子，或者其來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列。如上所述，所述直系同源物可以與SEQIDNOl、4、6、7、11、16、17、21、26、27、31、36、37、41、43、44、49、51、52和57任一序列所示的核苷酸序列具有至少約50%核苷酸序列一致性。優(yōu)選地，所述直系同源物將與SEQIDNO1、4、6、7、11、16、17、21、26、27、31、36、37、41、43、44、49、51、52和57任一序列所示的核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、卯％,更優(yōu)選至少約95%、甚至更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或者99%序列一致性。如前述，本文在德國小蠊中鑒定的靶標(biāo)的直系同源物被認(rèn)為在其它昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中也是可行的靶標(biāo)，所述的昆蟲和/或蜘蛛類動物物種包括居室昆蟲和/或蜘蛛類動物、外寄生物以及涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲，例如蒼蠅、葉螨、薊馬、壁虱、家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、蠹蟲、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳蚤，但不限于此。最優(yōu)選的靶標(biāo)源于蟑螂，例如小蠊屬的蟑,，包括德國蟑螂(德國小蠊(5/fl&〃flg^7W鼎/cfl))，大蠊屬的蟑螂，包括美洲蟑,(美洲大蠊(iVf7》/fl"C""/wer/oiwfl))和澳洲蜂螂(澳洲大蠊(/^n》/flweto))，蜚蠊屬(Blatta)的蟑螂，包括東方蟑螂(東方蜚蠊(B/fl"fl))和蠊屬(Supella)的蟑螂，包括褐帶蟑埤(褐帶蠊(Sw/7e〃a))。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(fi/We//"gwmfl"/cfl)),其中新的耙標(biāo)已被鑒定。之前已有報(bào)導(dǎo)，約21bp的短干擾RNA(siRNA)的形成對于有效的基因沉默是理想的。然而，在本申請人的應(yīng)用中已表明，為了被某些有害生物體有效地才聶取，dsRNA的最小長度優(yōu)選為至少約80-100bp。有跡象表明，在無脊推動物中，比如自由運(yùn)動的線蟲秀麗隱桿線蟲(C.e/egflws)或者植物寄生線蟲南方才艮結(jié)線蟲(/wc^g/i/似)，這些較長片段在基因沉默中更加有效，這可能是由于這些長的dsRNA被無脊推動物更有效地?cái)z取。最近還有證據(jù)表明，與常規(guī)的21聚體siRNA相比，由平頭27聚體或者短發(fā)夾(sh)RNA(其具有29bp的莖和2-nt3，突出端)組成的合成RNA雙鏈體是RNA干擾更加有效的誘導(dǎo)物(見，Williams,NatureBiotechnologyVol23,2,Feb2005，181andKimetal，NatureBiotechnologyVol23,2,Feb2005,222-229andSiolasetal，NatureBiotechnologyVol23,2，F(xiàn)eb2005,227-231，它們以整體通過參考并入本文)。因此，基于以上鑒定的靶標(biāo)以及平頭27聚體或者具有29-bp莖和2-nt3，突出端的短發(fā)夾(sh)RNA的分子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所迷RNA構(gòu)建體具有雙鏈RNA區(qū)，其長度為至少約17bp，優(yōu)選至少約21bp，更優(yōu)選約20-1500bp,甚至更優(yōu)選約80-1000bp，最優(yōu)選約17-27bp或者約80-250bp;比如約17bp、18bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或者1500bp的雙鏈RNA區(qū)。雙鏈RNA長度的上限可以取決于i)dsRNA被昆蟲和/或蜘蛛類動物所攝取的要求和ii)dsRNA在相關(guān)細(xì)胞中被加工成指導(dǎo)RNAi的片段的要求。所選的長度還可受到RNA合成方法以及遞送RNA至細(xì)胞的方式的影響。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中待應(yīng)用的雙鏈RNA將小于10,000bp長，更優(yōu)選小于或等于1000bp,更優(yōu)選小于或等于500bp，更優(yōu)選小于或等于300bp，更優(yōu)選小于或等于100bp。用單個(gè)RNA構(gòu)建體靶向多個(gè)靶基因可以增加在有害生物防治方面的功效。如此，有害生物不太可能存活和獲得抗性，因?yàn)閷⒂卸喾N雙鏈RNA介導(dǎo)RNA干擾，其可能所有的同時(shí)作用或者可能以級聯(lián)方式作用。本發(fā)明的方法包括同時(shí)地或者依次向同一昆蟲和/或蜘蛛類動物提供兩種或多種不同的雙鏈RNA或者RNA構(gòu)建體，從而實(shí)現(xiàn)對多個(gè)靶基因的下調(diào)或者抑制或者實(shí)現(xiàn)對單靶基因的更有效抑制。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的RNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與本文描述的任何核苷酸序列之一部分相互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列包含與以下序列具有至少70%，優(yōu)選至少75%、80%、85%、85%、90%，更優(yōu)選至少約95。/。和甚至更優(yōu)選至少約96%、97%、98%或者99%序列一致性(i)SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任意序列所示的核酸分子的部分核苷酸序列，或者(ii)如下的核酸分子，其包含SEQIDN041、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苦酸序列，或者其來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列，其中序列一致性百分率是在相同長度上計(jì)算的。"在相同的長度上"意指當(dāng)計(jì)算序列之間一致性百分率時(shí)，所述計(jì)算是在兩個(gè)序列中對應(yīng)的核苷酸區(qū)段上進(jìn)行的?；蛘撸峁┮环N雙鏈RNA來下調(diào)多種靶基因，所述雙鏈RNA起到抗多種靶序列的作用?；蛘撸嬖诔^一拷貝的對應(yīng)于耙基因的雙鏈RNA片段可以更有效地抑制單個(gè)靶標(biāo)。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈RNA構(gòu)建體包含多個(gè)dsRNA區(qū)，各個(gè)dsRNA區(qū)的至少一條鏈包含與昆蟲和/或蜘蛛類動物靶基因的靶核苷酸序列至少一部分相互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)可以互補(bǔ)于相同的或者不同的靶基因和/或所述dsRNA區(qū)可以互補(bǔ)于來自相同或者不同昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的靶基因。因此，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的分離的雙鏈RNA或者RNA構(gòu)建體，其包含至少兩個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其中每個(gè)區(qū)的至少一條鏈包含以下核苷酸序列、或者基本由其組成或由其所組成與SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中〈壬一核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，或者與來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列至少與SEQIDNOl、11、21和31任一核苷酸序列的相關(guān)部分或者包括SEQIDN041、43、44、49、51、52和57任一序列所示核苷酸序列的核酸分子的相關(guān)部分具有至少70%、80%、85%、87.5%、90%、95%或者至少99%序列一致性。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA或者RNA構(gòu)建體包含獨(dú)立地選自下述一個(gè)或者至少兩個(gè)核香酸序列、或者基本由或者由獨(dú)立地選自下述的一個(gè)或至少兩個(gè)核苷酸序列組成SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200的任意序列，優(yōu)選SEQIDN065-70的任意序列。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，RNA構(gòu)建體包括多個(gè)dsRNA區(qū)，每個(gè)dsRNA區(qū)的至少一條鏈包含與來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的靶基因核苷酸序列一部分相互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，RNA構(gòu)建體中的dsRNA區(qū)可以與相同或者不同靶基因相互補(bǔ)；dsRNA區(qū)可以與來自相同或者不同昆蟲物種的耙標(biāo)相互補(bǔ)。dsRNA可以按照如下進(jìn)行組合a)當(dāng)對靶向單靶基因的多個(gè)dsRNA區(qū)進(jìn)行組合時(shí)，它們可以在RNA構(gòu)建體中以原始順序(即以各片段在靶基因中呈現(xiàn)的順序)組合，b)或者，可以忽略各片段的原始順序，從而將它們打亂并隨機(jī)地或者有意地以任意順序組合成RNA構(gòu)建體，c)或者，一個(gè)單片段可以在RNA構(gòu)建體中被重復(fù)幾次，例如I-IO次，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或者10次，或者d)可以以正義或者反義取向組合dsRNA區(qū)(耙向單一的或者不同的靶基因)。此外，待組合的靼基因可以選自以下一個(gè)或多個(gè)基因類別(包括其適當(dāng)?shù)乃锌赡芙M合)e)"必需"基因或者"致病性"基因，包括對于一種或多種靶昆蟲和/或蜘蛛類動物是必需的并且當(dāng)被沉默時(shí)造成致死或者嚴(yán)重(例如運(yùn)動、攝食、麻痹、飲用、生育、繁殖、生長)表型的基因。選擇強(qiáng)致死靶基因?qū)е掠辛Φ腞NAi效果。在本發(fā)明的RNA構(gòu)建體中，可以組合靶向相同或不同(非常有效)致死基因的多個(gè)dsRNA區(qū)以進(jìn)一步增加RNAi在昆蟲和/或蜘蛛類動物防治中的效能、功效或者速率。f)"弱"基因，包括在本文描述的在一種細(xì)胞途徑中具有特別感興趣功能的靶基因，而當(dāng)其被獨(dú)自沉默時(shí)導(dǎo)致弱表型效果。在本發(fā)明的RNA構(gòu)建體中，可以組合靼向單一或者不同弱基因的多個(gè)dsRNA區(qū)以獲得更強(qiáng)的RNAi效果。g)"昆蟲和/或蜘蛛類動物特異性"基因，包括如通過生物信息學(xué)同源性檢索(例如BLAST檢索)所測定的，在非有害生物體中沒有實(shí)質(zhì)同源對應(yīng)物的基因和基因部分。對昆蟲和/或蜘蛛類動物特異性耙基因或其部分的選擇導(dǎo)致物種特異性的RNAi效果，而在非靶生物體中沒有作用或者沒有實(shí)質(zhì)性(不利)作用。h)"保守基因"，包括在靶生物體和一種或多種非靶生物體之間保守(在氨基酸水平上)的基因。為降低對非靶物種的可能影響，分析這樣的有效但保守的基因，并選擇來自這些保守基因可變區(qū)的靶序列以用做RNA構(gòu)建體中dsRNA區(qū)的靶標(biāo)。在此，在核酸序列水平上評價(jià)保守性。因此，這樣的可變區(qū)，包括保守靶基因在核酸序列水平上最不保守的部i)"保守途徑，，基因，包括參與相同生物學(xué)途徑或者細(xì)胞過程的基因，或者包括在不同的昆蟲和/或蜘蛛類動物物種中具有相同功能性的基因，由此而導(dǎo)致特異的和有力的RNAi作用和更有效的害蟲防治；j)或者，本發(fā)明的RNA構(gòu)建體靶向來自不同生物途徑的多種基因，由此而導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞RNAi效果和更有效的昆蟲和/或蜘蛛類動物的防治。優(yōu)選地，所有雙鏈RNA區(qū)包含至少一條與以下任一核苷酸序列一部分相互補(bǔ)的鏈SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。然而，如果一個(gè)雙鏈RNA區(qū)包括至少一條與以下任一核苷酸序列一部分相互補(bǔ)的鏈SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200,那么其它雙鏈RNA區(qū)可以包括至少一條與來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種任意靶基因(包括已知的靶基因)一部分相互補(bǔ)的鏈。本發(fā)明還提供本文描述的任何RNA構(gòu)建體，其還包含至少一個(gè)其它的功能性序列和任選的接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過一個(gè)或多個(gè)接頭連接多個(gè)dsRNA區(qū)。在另一實(shí)施方案中，接頭存在于RNA構(gòu)建體中的一個(gè)位點(diǎn)，該位點(diǎn)將dsRNA區(qū)與感興趣的另一區(qū)分開。本發(fā)明提供對于dsRNA構(gòu)建體的不同接頭類型。"條件性自切割接頭，，是能夠在特定條件下被加工的RNA序列。適合的條件性自切割接頭的一個(gè)實(shí)例是在低pH條件下自切割的RNA序歹'J。Jayasena和Gold(ProcNatlAcadSciUSA.1997Sep30;94(20):10612-7)描述過這種RNA序列的合適實(shí)例，該文獻(xiàn)通過參考并入本文。適合的條件性自切割接頭的另一實(shí)例是在高pH條件下自切割的RNA序列。Bordaetal.(NucleicAcidsRes.2003May15;31(10):2595-600)描述過這種RNA序列的合適實(shí)例，該文獻(xiàn)通過參考并入本文。該序列源于錘頭核酶HH16的催化核心。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，在有害生物體中，可以應(yīng)用接頭分開較小的dsRNA區(qū)。有益的是，在該情形中，在特定的情況下接頭序列可以促進(jìn)長的dsRNA分成較小的dsRNA區(qū)，由此導(dǎo)致在這些情況下釋放各個(gè)dsRNA區(qū)并通過這些較小的dsRNA區(qū)產(chǎn)生更有效的基因沉默。在本發(fā)明的另一方面中，接頭被定位于RNA構(gòu)建體中的某一位點(diǎn)，其將dsRNA區(qū)與感興趣的另一序列分開，其優(yōu)選向RNA構(gòu)建體提供一些其它功能?？梢圆⑷隦NA構(gòu)建體的(感興趣的)其它功能性序列的非限制性實(shí)例有例如(i)促進(jìn)大規(guī)模產(chǎn)生dsRNA構(gòu)建體的其它序列；(ii)增加/降低dsRNA穩(wěn)定性的其它序列；(iii)結(jié)合組合物中的蛋白質(zhì)或者其它分子以促進(jìn)被有害生物物種攝取的其它序列；(iv)作為適配子(aptamer)并結(jié)合有害生物物種消化道中受體或者分子以促進(jìn)被所述有i生物物種攝取、內(nèi)吞和/或轉(zhuǎn)胞吞(transcytosis)的其它序列；(v)催化dsRNA區(qū)加工的其它序列。才艮據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，有害生物物種具有腸(gut)系統(tǒng)，比如例如昆蟲和/或蜘蛛類動物，并且接頭在昆蟲和/或蜘蛛類動物的腸中是自切割的。腸中的pH可在極酸性到極堿性的范圍內(nèi)變化?；蛘?，接頭在內(nèi)體中是自切割的。這在本發(fā)明的構(gòu)建體由有害生物生物體通過內(nèi)吞或者轉(zhuǎn)胞吞攝取，并由此在有害生物物種的內(nèi)體中被區(qū)室化時(shí)可以是有益的。內(nèi)體可具有低pH環(huán)境，由此導(dǎo)致接頭切割。當(dāng)本發(fā)明dsRNA構(gòu)建體被用于通過細(xì)胞壁中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞時(shí)，例如當(dāng)穿越昆蟲和/或蜘蛛類有害生物體的細(xì)胞壁時(shí)，上述在疏水條件中自切割的接頭尤其可用于這樣的RNA構(gòu)建體中。內(nèi)含子也可被用作接頭。本文使用的"內(nèi)含子，，可以是信使RNA的任何非編碼RNA序列。對于本發(fā)明構(gòu)建體尤其適合的內(nèi)含子序列(1)是富含U的(35-45%);(2)具有平均100bp長度(在約50至500bp之間變化)，其堿基對可以是隨機(jī)選擇的或者可以基于已知的內(nèi)含子序列；(3)5'端起點(diǎn)具有-AG:GT-或者-CG:GT-和/或(4)在它們的3，端具有-AG:GC-或者-AG:AA-。約1個(gè)堿基對至約10,000個(gè)堿基對的非互補(bǔ)RNA序列也可4皮用作接頭。如上所述，本發(fā)明的dsRNA區(qū)可以只對應(yīng)靶基因的一部分，只要其互補(bǔ)性能夠?qū)崿F(xiàn)RNAi，從而有效地防治昆蟲和/或蜘蛛類動物即可。知道相關(guān)靶基因的全長序列對于本發(fā)明來說不是必需的，只要所用的包含dsRNA區(qū)的構(gòu)建體能夠下調(diào)靶基因即可。例如，可以應(yīng)用基于來自昆蟲和/或蜘蛛類動物的部分基因序列(比如EST)的dsRNA片段，只要所述部分序列是SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71to79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-47、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200所述序列之一的直系同源物即可。才艮據(jù)所用dsRNA片段的長度確定序列同源性或者互補(bǔ)性的程度。此外，在本發(fā)明中還可以應(yīng)用在一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上不同于(例如通過缺失、插入或者取代)包含SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中所述序列的核酸分子的dsRNA片段，只要所得的dsRNA片段仍能下調(diào)乾基因即可。優(yōu)選地，RNA構(gòu)建體中的dsRNA片段與包含如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列、或者來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列的任一靶核酸分子的核苷酸序列之相應(yīng)部分具有互補(bǔ)性，或者同源性水平為至少約70%核苷酸序列一致性，優(yōu)選至少約80%序列一致性，甚至更優(yōu)選至少約85%或者87.5%序列一致性，仍更優(yōu)選約90%序列一致性，仍更優(yōu)選至少約95%序列一致性，最優(yōu)選至少約96%、97%、98%或者99%序列一致性。確定序列一致性的方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)方法，包括應(yīng)用Blast軟件和GAP分析(GCG程序)的方法。dsRNA的至少一條鏈與靶基因的高水平序列一致性(互補(bǔ)性)對于介導(dǎo)有效的RNAi以及由此的有害生物防治是必需的。然而，相對于哺乳動物的直系同源物序列，本發(fā)明的dsRNA區(qū)選擇性的針對有害生物靶序列是同樣有益的。在必需防治有害生物的環(huán)境中，比如廚房，其是存放食物的地方并且在其中人和其它哺乳動物可以接觸到被設(shè)計(jì)用來防治有害生物的組合物，這在本發(fā)明中是尤其有意義的。相對于化學(xué)試劑，選擇性生物試劑是優(yōu)選的，因?yàn)樗龌瘜W(xué)試劑對于有害生物物種和哺乳動物可能具有同樣的毒性。此外，對于生物學(xué)試劑比如本發(fā)明的RNA構(gòu)建體來說，其優(yōu)點(diǎn)包括所述分子將隨著時(shí)間發(fā)生生物降解并且因此對人類使用者而言其比化學(xué)試劑(比如已知的殺蟲劑)將具有更少環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，RNA構(gòu)建體中的雙鏈RNA的至少一條鏈包含與SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示核酸分子的核苷酸序列一部分相互補(bǔ)的或者與來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列一部分相互補(bǔ)的核苷酸序列，并且其與來自哺乳動物物種的相應(yīng)(直系同源)核苷酸序列具有小于約5%、小于約10%、小于約12.5%、小于約15%、小于約20%、小于約30%、小于約40%的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在21個(gè)連續(xù)核苷酸上與哺乳動物序列沒有序列一致性。在另一實(shí)施方案中，在24個(gè)連續(xù)核苷酸上與來自哺乳動物物種的相應(yīng)核苷酸序列具有小于約10%或者小于約12.5%序列一致性。優(yōu)選地，所述哺乳動物物種是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA構(gòu)建體中的雙鏈RNA的至少一條鏈包含互補(bǔ)于SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所的^苷酸序列」部分的核4酸序列，其包含7壬何下述核酸分子中至)17個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少18個(gè)核苷酸、19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、60個(gè)核苷酸、70個(gè)核苷酸、80個(gè)核苷酸、90個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、150個(gè)核苷酸、200個(gè)核香酸、250個(gè)核苷酸、300個(gè)核苷酸、350個(gè)核香酸、400個(gè)核苷酸、450個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、550個(gè)核苷酸、600個(gè)核苷酸、650個(gè)核苷酸、700個(gè)核苷酸、900個(gè)核苷酸、1000個(gè)核苷酸、1100個(gè)核普酸、1200個(gè)核苷酸或者1300個(gè)核苷酸，所述核酸分子含有SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供這樣的RNA構(gòu)建體，其還包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含任何下述核酸分子的至少約17個(gè)核普酸、優(yōu)選至少約18個(gè)核苦酸、19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、23個(gè)核普酸、24個(gè)核苷酸、25個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核普酸、50個(gè)核苷酸、60個(gè)核苷酸、70個(gè)核普酸、80個(gè)核苷酸、90個(gè)核苷酸、100個(gè)核苦酸、150個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、250個(gè)核苷酸、300個(gè)核苷酸、350個(gè)核苷酸、400個(gè)核苦酸、450個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、550個(gè)核苦酸、600個(gè)核苦酸、650個(gè)核苷酸、700個(gè)核苷酸、卯0個(gè)核苷酸、1000個(gè)核苷酸、1100個(gè)核苷酸、1200個(gè)核苷酸或者約1300個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任意序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。DNA、表達(dá)構(gòu)建體和宿主細(xì)胞在另一方面中，本發(fā)明還提供DNA構(gòu)建體，其包含本發(fā)明新靶標(biāo)的核苷酸序列，代表性序列如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200。本發(fā)明還涉及DNA構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明RNA構(gòu)建體的區(qū)域。再一方面中，本發(fā)明還提供表達(dá)構(gòu)建體，其包括本發(fā)明的任意DNA構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體是這樣的，其能夠在合適的條件下提供(通過轉(zhuǎn)錄)包含上面提及的dsRNA區(qū)的RNA構(gòu)建體。用于表達(dá)dsRNA的遺傳構(gòu)建體在本領(lǐng)域中是眾所周知的可參考例如在WO99/32619;WO00/01846和WO01/88121(Devgen);WO00/44914和WO01/70949以及上面已提及的現(xiàn)有技術(shù)中描述的構(gòu)建體。如在其中所提及的，這樣的構(gòu)建體可以是DNA或者RNA(并優(yōu)選為DNA)并且可以是適合的表達(dá)載體(比如適于在細(xì)菌中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的表達(dá)載體)或者另外的表達(dá)系統(tǒng)的形式。例如，構(gòu)建體可以存在于(例如通過轉(zhuǎn)化)用于在細(xì)菌中生產(chǎn)或者用于轉(zhuǎn)化昆蟲和/或蜘蛛類動物的適合的細(xì)菌或者病毒系統(tǒng)中，并且含有遺傳構(gòu)建體的這些和其它宿主細(xì)胞構(gòu)成本發(fā)明另一方面。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體除包含編碼dsRNA片段自身的序列以外，通常還將包含合適的調(diào)節(jié)元件(比如啟動子、終止子和增強(qiáng)子)和這些遺傳構(gòu)建體本身已知的其它元件；并且可以例如表達(dá)dsRNA區(qū)為兩個(gè)分開的互補(bǔ)RNA鏈，它們雜交形成預(yù)期的dsRNA區(qū)，或者可以以包含兩個(gè)互補(bǔ)鏈的單RNA形式表達(dá)dsRNA區(qū)，所述的兩個(gè)互補(bǔ)鏈自我雜交形成"莖-環(huán)"或者"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有預(yù)期的dsRNA區(qū)。所有這樣的構(gòu)建體可以適合在本發(fā)明中應(yīng)用，這并不作為對所用構(gòu)建體類型的特別限制，只要所述構(gòu)建體適于表達(dá)能在昆蟲和/和蜘蛛類有害生物中介導(dǎo)有效RNAi的dsRNA即可。還可以以本身已知的方式構(gòu)建所述構(gòu)建體自身，有關(guān)其的參考文獻(xiàn)還可以參見上述的現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)，以及標(biāo)準(zhǔn)手冊比如Sambrooketal,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2nd.ed.),Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)和F.Ausubeletal,eds.，"Currentprotocolsinmolecularbiology"，GreenPublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。dsRNA區(qū)優(yōu)選在細(xì)菌宿主中在組成型或者誘導(dǎo)型啟動子(例如，通過特定化合物誘導(dǎo)的、通過對細(xì)菌的破壞等誘導(dǎo)的啟動子)控制下表達(dá)。組成型和誘導(dǎo)型啟動子可以是非特異性的或者特異性的(例如，針對細(xì)菌生命周期的特定部分)。在細(xì)菌宿主細(xì)胞被用作生物殺蟲劑之前，可能需要被滅活。這可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來實(shí)施，比如例如通過加熱或者通過苯酚或者甲醛處理?；蛘?，可以利用滅活病毒，比如經(jīng)適當(dāng)改良的桿狀病毒，從而向昆蟲和/或蜘蛛類有害生物遞送本發(fā)明的dsRNA區(qū)。所述表達(dá)構(gòu)建體還可以包含對于核酸序列或者遺傳構(gòu)建體而言所有本身已知的其它元件，比如啟動子或者其它控制元件、終止子、翻譯或者轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、整合因子、信號序列、選擇標(biāo)記等，優(yōu)選適于在細(xì)菌細(xì)胞中應(yīng)用。編碼構(gòu)建體的這些其它元件的序列還可以分離自合適的生物學(xué)來源，或者通過合成提供。合適啟動子的一些具體的但非限制性的實(shí)例包括但不限于來自RNAPolI、RNAPolII、RNAPolIII、T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或者SP6RNA聚合酶的啟動子，并且所述啟動子和其它調(diào)節(jié)元件還參見上面引用的現(xiàn)有技術(shù)，比如例如WO00/01846。本發(fā)明還提供能指導(dǎo)單鏈RNA表達(dá)的細(xì)菌啟動子，所述單鏈RNA—經(jīng)表達(dá)就可以形成含環(huán)的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)并利用其雙鏈RNA區(qū)。用于將構(gòu)建體引入細(xì)菌或者病毒宿主的轉(zhuǎn)化技術(shù)的具體的但非限制的實(shí)例包括轉(zhuǎn)化、電穿孔、轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明由此提供表達(dá)構(gòu)建體，其包含(a)編碼如本文所述RNA構(gòu)建體的核酸；(b)能夠驅(qū)動(a)所述核酸表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。可以將表達(dá)構(gòu)建體插入質(zhì)?；蛘咻d體，所述質(zhì)?；蜉d體可以是市售的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)構(gòu)建體是細(xì)菌表達(dá)載體，其適于轉(zhuǎn)化入細(xì)菌并且適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞中維持和表達(dá)本發(fā)明的RNA構(gòu)建體。有關(guān)質(zhì)粒和載體參見在本申請人的WO01/01846中的有關(guān)描述，其以整體通過參考并入本文。可以應(yīng)用能夠感染昆蟲物種的病毒細(xì)胞(比如在WO01/34815中描述的病毒，其以整體通過參考并入本文)作為替代。本文所用的術(shù)語"調(diào)控序列"應(yīng)在廣泛的范疇內(nèi)理解，其是指能夠驅(qū)動和/或調(diào)節(jié)與其連接和/或可操作性連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，調(diào)控序列在細(xì)菌或者病毒中是可操作的；優(yōu)選地，所述調(diào)控序列是源于細(xì)菌序列。術(shù)語"調(diào)控序列，'包括啟動子或者能夠活化或者增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或者器官中表達(dá)的序列。任選地，在表達(dá)構(gòu)建體中還可以摻入一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止序列"包括在轉(zhuǎn)錄單位末端的調(diào)控序列，其發(fā)出對初始轉(zhuǎn)錄物3，端進(jìn)行加工和多聚腺苷酸化以及終止轉(zhuǎn)錄的信號。在表達(dá)構(gòu)建體中可以摻入另外的調(diào)節(jié)元件，比如轉(zhuǎn)錄或者翻譯增強(qiáng)子。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體還可以包含對于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制必需的復(fù)制起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)施例是，當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體必須作為細(xì)胞中附加體遺傳元件(例如，質(zhì)?；蛘哒沉７肿?在細(xì)菌細(xì)胞中維持時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl起點(diǎn)和colEl起點(diǎn)。表達(dá)構(gòu)建體可以任選地包含選擇標(biāo)記基因。如本文使用的，術(shù)語"選擇標(biāo)記基因，，包括任何基因，其賦予細(xì)胞一定表型，該表型在所述細(xì)胞中表達(dá)以促進(jìn)對用本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定和/或選擇。合適的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括抗氨千青霉素(Amp"")、四環(huán)素(tetracydine)(Tcr)、卡那霉素(Kanr)、膦絲菌素(phosphinothricin)和氯霉素(CAT)的抗性基因。其它適合的標(biāo)記基因提供代謝性狀，例如manA。還可以應(yīng)用可^L標(biāo)記基因以及包括例如p-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、熒光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)。因此，如上所述，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，但可以是例如病毒?？梢岳锰禺愋愿腥纠ハx和/或蜘蛛類動物的病毒(比如桿狀病毒)。這確保對于哺乳動物，尤其是人的安全性，因?yàn)樗霾《緦⒉粫腥静溉閯游?，因此不需要的RNAi作用將不會發(fā)生。在可能與人或者其它哺乳動物接觸的環(huán)境中(比如上述的廚房)使用時(shí)，在應(yīng)用所述細(xì)菌細(xì)胞或者病毒作為遞送劑用于介導(dǎo)昆蟲有害生物中的RNAi之前，應(yīng)優(yōu)選是滅活的。通過許多手段可以實(shí)現(xiàn)滅活，比如例如通過加熱處理、苯酚或者甲醛處理。本發(fā)明還提供產(chǎn)生本發(fā)明RNA構(gòu)建體的方法。該方法包括以下步驟在允許所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生所述RNA構(gòu)建體的條件下a.將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或者本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體與無細(xì)胞組分接觸；或者b.向細(xì)胞施用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或者本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。由此，本發(fā)明提供體外方法，其中提供用于轉(zhuǎn)錄的必需組分。這些組分對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是非常熟悉的并且許多體外表達(dá)試劑盒可從市場上獲得?；蛘?，可以在宿主細(xì)胞中驅(qū)動所述表達(dá)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，但可以是例如病毒。此外，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以被用作產(chǎn)生本發(fā)明dsRNA分子和RNA構(gòu)建體的來源。例如，可以在合適條件下(例如在37X:或這42X:)培養(yǎng)包含本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體(如以上所述)的細(xì)菌宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生有效量的本發(fā)明RNA構(gòu)建體。大規(guī)模的細(xì)菌發(fā)酵和收集方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且可以被商業(yè)化利用。在許多合適的介質(zhì)中可以實(shí)施細(xì)菌培養(yǎng)，比如例如LB肉湯，任選地補(bǔ)充合適的抗生素，比如氨爺青霉素、羧節(jié)青霉素或者氯霉素，其中利用抗生素抗性宿主菌株。生成的細(xì)菌培養(yǎng)物由此大量產(chǎn)生本發(fā)明的RNA構(gòu)建體。所述細(xì)菌自身可以被配制為如本文所述的合適殺蟲組合物，或者可以被用作本發(fā)明RNA構(gòu)建體的直接(食物)來源，用以被靼昆蟲或者蜘蛛類動物攝取(例如攝食)。相似地，在一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述，通過使細(xì)菌破裂或者滅活細(xì)菌，所述細(xì)菌可以,皮用作dsRNA的來源。例如，可以應(yīng)用任何合適的手段破裂或者裂解細(xì)胞，比如例如通過滲透壓沖擊(osmoticshock)，并且在本發(fā)明的組合物中利用細(xì)菌的裂解物或者其它合適的細(xì)胞組分或者提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以適當(dāng)?shù)丶兓?xì)菌提取物或者裂解物以留下含有基本上純的RNA構(gòu)建體的提取物。優(yōu)選地，從含最終dsRNA的提取物中去除基本所有的細(xì)菌組分，隨后可以將所述最終dsRNA配制成本發(fā)明的任一組合物。適合的純化步驟在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且可以包括，作為舉例但非限制性的，適合的過濾步驟，例如根據(jù)電荷或者分子量的分離。還可以應(yīng)用適合的雜交反應(yīng)來純化感興趣的dsRNA分子。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將RNA構(gòu)建體純化至基本純，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括選擇性沉淀、柱色鐠、免疫純化方法及其它技術(shù)(見，例如，Sc叩es,ProteinPurification:PrinciplesandPractice(1982);Ausubeletal"見上述；和Sambrooketal"見上述)。RNA和DNA構(gòu)建體(包括雙鏈RNA分子)將通常摻入天然堿基。然而，本發(fā)明的范圍包括變體。因此，"RNA"和"DNA"的范圍涵蓋合成的類似物，包括公知的糖基修飾的堿基，其能夠堿基配對和介導(dǎo)RNAi或者能夠分別被轉(zhuǎn)錄從而以天然核酸類似物的形式產(chǎn)生RNA。例如，本發(fā)明涵蓋摻入非天然的、經(jīng)化學(xué)修飾的或者衍生的堿基的核酸類似物或者具有修飾主鏈的核酸類似物。這同樣地適用于可以被摻入本發(fā)明構(gòu)建體的接頭。具體地，術(shù)語"雙鏈RNA"或者"dsRNA"將被解釋為涵蓋了包含非天然堿基的dsRNA。包含非天然堿基或者具有化學(xué)修飾主鏈的雙鏈RNA可以提供有關(guān)增加或者降低dsRNA構(gòu)建體穩(wěn)定性的額外優(yōu)點(diǎn)。殺蟲組合物仍在另一方面中，本發(fā)明涉及殺蟲組合物，其包括本發(fā)明的RNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體和/或本發(fā)明的宿主細(xì)胞以及合適的載體、賦形劑或者稀釋劑。根據(jù)一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物為適合于昆蟲和/或蜘蛛類動物攝食的形式。所述組合物可以是適合向昆蟲和/或蜘蛛類動物施用的任何物理形式。所述組合物可以是例如固體形式(比如粉末、顆?；蛘哒T斜)、液體形式(比如噴霧)或者凝膠形式。所述組合物可以包含另外一些組分，其用來在長時(shí)間保存所述組合物的期間穩(wěn)定dsRNA和/或控制dsRNA降解。所述組合物還可包含另外一些組分，其增強(qiáng)或者促進(jìn)腸(intestianl)細(xì)胞或者腸(gut)細(xì)胞對dsRNA的攝取。這些可以包括例如常規(guī)促進(jìn)細(xì)胞攝入RNA的化學(xué)劑，例如lipofectamine等。本發(fā)明預(yù)期，可以提供本發(fā)明的"組合物"作為"套裝試劑盒"，其包括在一個(gè)容器中的雙鏈RNA和在另外容器中的適用于含RNA的實(shí)體(比如RNA構(gòu)建體、DNA構(gòu)建體、表達(dá)構(gòu)建體或者宿主細(xì)胞)的稀釋劑或者載體。本發(fā)明還涉及提供單獨(dú)的雙鏈RNA，而沒有其它任何組分。在這些實(shí)施方案中，可以以濃縮形式(比如濃縮水溶液)提供dsRNA。它甚至可以以冷凍形式或者凍干(freezed-dried)或者凍干(lyophilised)形式提供。對于長期保存來說，后者可更加穩(wěn)定并且可以;應(yīng)用之前即刻解凍和/或用適合的稀釋劑重構(gòu)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述組合物可以是能夠施用于基質(zhì)從而保護(hù)所述基質(zhì)免受昆蟲和/或蜘蛛類動物感染的涂料、糊劑或者粉劑。在此實(shí)施方案中，可以應(yīng)用所述組合物保護(hù)易受昆蟲和/或蜘蛛類動物感染或者造成損害的任何基質(zhì)或者物質(zhì)，例如食物和其它易腐物質(zhì)以及基質(zhì)比如木材。對于此實(shí)施方案優(yōu)選的靶昆蟲和/或蜘蛛類動物物種包括但不限于本文較早前定義的本發(fā)明有害生物(見"靶生物體/物種")，即居室昆蟲和/或蜘蛛類動物、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲，比如作為舉例但非限制的蠅、葉螨、薊馬、壁虱，家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。最優(yōu)選的耙物種是蟑螂，例如小蠊屬蟑螂，包括德國蟑螂(德國小蠊)，大蠊屬蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊)和澳洲蟑螂(澳洲大蠊)，蜚蠊屬蟑埤，包括東方蟑螂(東方蜚蠊)和蠊屬蟑螂，包括褐帶蟑螂(褐帶蠊)。最優(yōu)選的乾標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(別flte〃fl^fTMfl"/c"))。在此實(shí)施方案中，所述組合物將包括含有至少一種雙鏈RNA的實(shí)體(例如上述的RNA構(gòu)建體)，其中雙鏈RNA區(qū)包括退火的互補(bǔ)鏈，其至少一條鏈具有對應(yīng)于待防治昆蟲和/或蜘蛛類動物靶基因的靶核苷酸序列的核苷酸序列，以及適于預(yù)期應(yīng)用的至少一種載體、稀釋劑或者賦形劑。賦形劑的特性和組合物的物質(zhì)形式可根據(jù)預(yù)期處置基質(zhì)的特性而改變。例如，所述組合物可以是刷或者噴于或者印于待處置物質(zhì)或者基質(zhì)的液體，或者施用于待處置物質(zhì)或者基質(zhì)的涂料或者粉劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是附著于適合表面上的涂料形式，并且最終由與所述涂料接觸的昆蟲和/或蜘蛛類動物所攝取。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是誘飾形式。設(shè)計(jì)用該誘斜引誘昆蟲和/或蜘蛛類動物與所述組合物接觸。一旦與其發(fā)生接觸，所述組合物接著被昆蟲和/或蜘蛛類動物通過例如攝食而內(nèi)化并介導(dǎo)RNAi,由此殺傷昆蟲和/或蜘蛛類動物。所述誘斜可以包含食物，比如基于蛋白質(zhì)的食物，例如魚伺料。還可以應(yīng)用硼酸作為誘辨。所述的誘辨可以取決于靶向的物種。例如，德國小蠊將食用它們可獲得的幾乎任何食物。還可以應(yīng)用引誘劑。引誘劑可以是信息素，比如例如雄性或者雌性信息素。作為實(shí)例，所述信息素參見"InsectPheremonesandtheiruseinPestManagement"(Howseetal,ChapmanandHall,1998)，并且可在本發(fā)明中應(yīng)用。所述引誘劑的作用在于引誘昆蟲和/或蜘蛛類動物至誘餅，并且可以靼向于特定的昆蟲和/或蜘蛛類動物或者可以吸引整個(gè)范圍的昆蟲。所述誘辨可以是任何合適的形式，比如固體、糊劑、顆?；蛘叻蹌┬问?。還可以通過昆蟲和/或蜘蛛類動物將誘辨運(yùn)回群體。隨后所述誘飾可以作為群體其它成員的食物來源，由此提供對大量昆蟲和/或蜘蛛類動物以及潛在的對整個(gè)昆蟲和/或蜘蛛類有害生物群體的有效防治。這是與應(yīng)用本發(fā)明雙鏈RNA有關(guān)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)镽NAi介導(dǎo)效應(yīng)對有害生物的延遲作用允許將誘飾運(yùn)回群體，因此在使其接觸到昆蟲和/或蜘蛛類動物方面發(fā)揮最大作用。此外，與昆蟲和/或蜘蛛類動物接觸的組合物可以保留在昆蟲和/或蜘蛛類動物的表皮上。當(dāng)昆蟲和/或蜘蛛類動物自我清潔或者昆蟲和/或蜘蛛類動物相互清潔時(shí)，所述組合物可以被攝取并且因此能夠在昆蟲和/或蜘蛛類動物中介導(dǎo)它們的效應(yīng)。這要求所述組合物充分穩(wěn)定，以使得dsRNA保持完整并能夠介導(dǎo)RNAi，即使在它們被長時(shí)間(例如可以是幾天的時(shí)間)暴露于外部環(huán)境條件時(shí)。可以在適合的"室(housing)"或者"誘捕器，，中提供所述誘斜。這樣的室和誘捕器可從商業(yè)獲得并且可以改造現(xiàn)有誘捕器以包含本發(fā)明的組合物。任何可吸引昆蟲和/或蜘蛛類動物進(jìn)入的室或誘捕器包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。室或誘捕器可以是例如盒形，并且可以在預(yù)成形條件下提供或者可形成例如可折疊的紙板。適合用于室或誘捕器的材料包括塑料和紙板，尤其是波紋狀的紙板。對于所述室或誘捕器而言適合的尺度為例如7-15cm寬，15-20cm長和1-5cm高。諸捕器的內(nèi)表面可以排布有粘性物質(zhì)，從而一旦昆蟲和/或蜘蛛類動物進(jìn)入誘捕器內(nèi)就限制其移動。室或誘捕器可以包含適合的內(nèi)槽，其能夠?qū)⒄T鉺保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩ＵT捕器與室是有區(qū)別的，因?yàn)槔ハx進(jìn)入后不能容易地離開誘捕器，而室擔(dān)當(dāng)"飼喂站"，其提供給昆蟲和/或蜘蛛類動物一個(gè)較佳的環(huán)境，在其中它們能夠進(jìn)食并且感覺免受捕食者之患。因此，在本發(fā)明的另一方面中提供針對昆蟲和/或蜘蛛類動物的包含本發(fā)明組合物的室或誘捕器，其可以并入本文所述組合物的任何特性。在另一可替代實(shí)施方案中，可以以噴霧劑形式提供所述組合物。因此，人使用者可以用所述組合物直接向有害生物噴灑。隨后所述組合物被昆蟲和/或蜘蛛類動物內(nèi)化，并于此它可以介導(dǎo)RNA干擾，由此防治昆蟲和/或蜘蛛類動物。所述噴霧劑優(yōu)選是加壓的/氣溶膠化的噴霧劑或者泵式噴霧劑。顆粒可以為合適的大小，以使得它們附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物，例如附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物的外骨骼，并且可以于此凈皮吸收?？梢詰?yīng)用已知工具測量顆粒大小，比如應(yīng)用激光粒度儀(Mastersizer)，其是可從商業(yè)獲得的裝置。仍在另一實(shí)施方案中，所述載體是帶靜電的粉末或者顆粒，其附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物的表皮。能附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物并由此遞送本發(fā)明RNA構(gòu)建體的適合的粉末和顆粒在WO94/00980和WO97/33472中有詳細(xì)的描述，這兩篇文獻(xiàn)通過參考并入本文?；蛘?，所述載體可以包括附著于昆蟲表皮的磁性顆粒。能附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物并由此遞送本發(fā)明RNA構(gòu)建體的適合的磁性顆粒在WO00/01236中有詳細(xì)描述，其通過參考并入本文。仍在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的組合物的載體包括金屬顆粒，其初始時(shí)是未磁化的，但是當(dāng)其被置于由昆蟲和/或蜘蛛類動物體提供的電場中時(shí)，其能變成磁極化。該作用方式在WO2004/049807中有詳細(xì)描述并且其通過參考并入本文。這些與昆蟲和/或蜘蛛類動物接觸的組合物可保留在昆蟲和或蜘蛛類動物的表皮上。當(dāng)昆蟲和/或蜘蛛類動物個(gè)體自身清潔或者昆蟲和/或蜘蛛類動物互相清潔時(shí)，所述組合物可以被攝入并能因此介導(dǎo)它們在昆蟲和/或蜘蛛類動物中的效應(yīng)。這要求所述組合物充分穩(wěn)定，以使得dsRNA保持完整并能夠介導(dǎo)RNAi，即使在它們被長時(shí)間(例如可以是幾天的時(shí)間)暴露于外部環(huán)境條件時(shí)。優(yōu)選地，所述組合物摻入載體，該載體增加昆蟲和/或蜘蛛類有害生物(見上述"靼生物體/物種")對雙鏈RNA的攝入，所述有害生物優(yōu)選昆蟲和/或蜘蛛類動物并優(yōu)選蟑螂物種。這樣的載體可以是基于脂質(zhì)的栽體，優(yōu)選包括水包油乳劑、膠束、膽固醇、脂多胺和脂質(zhì)體的一種或多種。其它促進(jìn)本發(fā)明構(gòu)建體攝入的試劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并且包括聚陽離子、葡聚糖和(tris)陽離子脂質(zhì)，比如CS096、CS102等?？蓮纳虡I(yè)獲得的脂質(zhì)體包括LIPOFECTIN⑧和CELLFECTIN⑧等。在WO03/004644的"Transfectionpromotingagent"標(biāo)題下列舉了許多合適的載體并且所提供的各個(gè)實(shí)例通過參考并入本文。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是核酸凝聚劑。優(yōu)選地，核酸凝聚劑包括亞精胺或者硫酸魚精蛋白或者其衍生物。本發(fā)明的組合物可以與另外的活性成分組合在一起，包括另外的殺蟲劑。因此，可以提供本發(fā)明的"組合物"作為"套裝試劑盒"，其包括在一個(gè)容器中的含有雙鏈RNA的組合物和在另外容器中的一種或多種合適的殺蟲劑，其可以是化學(xué)殺蟲劑或者生物殺蟲劑?；蛘?，可以提供所述組合物作為混合物，其是穩(wěn)定的并且相互之間將聯(lián)合應(yīng)用?？梢砸匝a(bǔ)充方式與本發(fā)明雙鏈RNA分子一起作用的合適的活性成分包括但不限于以下各項(xiàng)毒死蜱(Chlorpyrifos)、丙烯菊酯(Allethrin)、爺吹菊酯(Resmethrin)、四溴乙基(Tetrabromoethyl)、二羥甲基-環(huán)丙烷欺酸(Dimethol國cyclopropanecarboxylicacid)(其通常包含在液體組合物中)；和氟蟻腙(Hydramethylnon)、齊螨素(Avermectin)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氟蟲胺(Sulfuramid)、歸蟲炔酯(Hydroprene)、氟蟲腈(Fipronil)(GABA受體)、異丙基苯基氨基甲酸甲酉旨(Isopropylphenylmethylcarbamate)、茚蟲威(Indoxacarb)(PARA)、多i脲(Noviflumuron)(幾丁質(zhì)合成抑制劑)、炔咪菊酯(Imiprothrin)(PARA)、阿維菌素(Abamectin)(谷氨酸門控氯離子通道)、吡蟲啉(Imidacloprid)(乙酰膽堿受體)(其通常包含在誘斜組合物中)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，就健康和環(huán)境的考慮而言，已知所述活性成分是優(yōu)選的殺昆蟲劑和/或殺蜘蛛劑，比如例如氟蟻腙和齊螨素。根據(jù)另一實(shí)施方案，dsRNA在適合的宿主細(xì)胞(比如細(xì)菌細(xì)胞或者真菌細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)并且所述細(xì)胞被有害生物物種所攝取或者攝食。根據(jù)另一實(shí)施方案，從細(xì)胞中分離或者純化dsRNA，所述細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)dsRNA的細(xì)菌或者真菌細(xì)胞，并且提供所述dsRNA作為針對有害生物物種的殺蟲劑或者殺蟲制劑?？梢詫⑺拗骷?xì)胞(比如細(xì)菌和真菌宿主細(xì)胞)工程化以產(chǎn)生任何本發(fā)明的dsRNA或者RNA構(gòu)建體。這些宿主細(xì)胞(優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞)可以被有害生物物種攝食或者以其它方式內(nèi)化。當(dāng)dsRNA被攝取時(shí)，dsRNA可以啟動RNAi反應(yīng)，導(dǎo)致靶mRNA降解并弱化或者殺傷有害生物。因此，在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，由原核(比如細(xì)菌)或者真核(比如酵母)宿主細(xì)胞或者宿主生物表達(dá)所述雙鏈RNA或者RNA構(gòu)建體。可以在任何合適的制劑中提供這些細(xì)胞或者生物以促進(jìn)昆蟲和/或蜘蛛類動物的攝取。本發(fā)明的用途和方法仍在另一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明RNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明DNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體和/或本發(fā)明組合物和/或本發(fā)明的室或誘捕器通過RNA干擾用于防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的用途?？梢詫⒃撚猛緫?yīng)用于許多處于任何發(fā)育階段的昆蟲和/或蜘蛛類動物，其具有針對本文鑒定的新靶標(biāo)的直系同源靶基因，所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括居室昆蟲和/或蜘蛛類動物、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物比如，作為舉例但非限制的蠅、葉螨、薊馬、壁虱，家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。最優(yōu)選的靶物種是蟑螂，例如小蠊屬蟑螂，包括德國蟑榔(德國小蠊<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>大蠊屬蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>))和澳洲蜂辨(澳洲大嫌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>蜚蠊屬()蟑螂,包括東方蟑螂(東方蜚蠊())和蠊屬<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>蟑榔，包括褐帶蟑螂(褐帶蠊<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>最優(yōu)選的耙標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(Blatellagermanica))。優(yōu)選地，通過RNAi對抗有害生物，并從而殺傷、麻痹有害生物、延遲其生長、抑制其攝食和/或阻止其繁殖。在一個(gè)補(bǔ)充方面中，本發(fā)明還提供防治昆蟲和/或蜘蛛類動物(有害生物)的方法，其包括向昆蟲和/或蜘蛛類動物施用包含如上定義dsRNA區(qū)的RNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和/或如上定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如上定義的宿主細(xì)胞和/或如上定義的組合物和/或如上定義的室或誘捕器，其中所述雙鏈RNA能通過RNA干擾來下調(diào)至少一種昆蟲基因的表達(dá)。所述施用可以包括例如給昆蟲和/或蜘蛛類動物喂食所述dsRNA(其以如上描述和定義的各種形式呈現(xiàn))或者可以包括讓昆蟲和/或蜘蛛類動物與所述dsRNA接觸。適合直接接觸的手段包括如上定義和描述的有關(guān)本發(fā)明組合物的誘辨、粘性帶、磁性和帶電粉末以及顆粒、噴霧、凝膠、軟膏、表面處理等。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括任何施用手段，如果它導(dǎo)致有效的針對靶基因表達(dá)的雙鏈RNA介導(dǎo)的干擾并由此防治昆蟲和/或蜘蛛類動物即可。提供含有針對多靶標(biāo)的多個(gè)雙鏈RNA區(qū)的構(gòu)建體是有益的，因?yàn)檫@增加了昆蟲和/或蜘蛛類動物防治的功效并且還降低了昆蟲和/或蜘蛛類動物獲得抗性的可能性。因此，在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，向有害生物提供/施用多種如上定義的RNA構(gòu)建體和/或如上定義的DNA構(gòu)建體和/或如上定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如上定義的宿主細(xì)胞和/或如上定義的組合物和/或如上定義的室或誘捕器，從而介導(dǎo)多個(gè)不同的RNAi事件?？梢酝瑫r(shí)耙向多種耙標(biāo)的全部，或者可以依次進(jìn)行耙向。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，依次提供/施用所述的多種RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表達(dá)構(gòu)建體和/或宿主細(xì)胞和/或組合物和/或室或誘捕器，從而降低昆蟲和/或蜘蛛類動物獲得抗性的可能性。可以將本發(fā)明的方法應(yīng)用于處于任何發(fā)育階段的許多昆蟲和/或蜘姝類動物，其具有針對本文鑒定的新靶標(biāo)的直系同源靶基因。靶昆蟲包括居室昆蟲和/或蜘蛛類動物、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物比如，作為舉例的但非限制的蠅、葉螨、薊馬、壁虱，家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚、書虱、曱蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。最優(yōu)選的靶物種是蟑螂，例如小蠊屬蟑螂，包括德國蟑螂(德國小蠊(B/fl&〃flg^附flW/c")),大蠊屬蟑螂，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(i^n》/tfwe似fl附w/c""fl))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(T^f7》/flW^！fl"Wra/Zfls/fle))，蜚蠊屬(fi/fl"fl)蟑螂，包括東方蟑螂(東方蜚蠊(5/fl加))和蠊屬()蟑螂，包括褐帶蟑螂(褐帶蠊&^>m//7"))。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國蟑螂(德國小蠊(Blatellagermanica))。優(yōu)選地，通過RNAi對抗昆蟲和/或蜘蛛類有害生物，并從而殺傷、麻痹有害生物、延遲其生長、抑制其攝食和/或阻止其繁殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，其已被改造以產(chǎn)生本發(fā)明的RNA構(gòu)建體。仍在另一方面中，本發(fā)明提供防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑埤提供/施用RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與編碼蟑螂核糖體蛋白質(zhì)的核普酸序列一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。蟑螂核糖體蛋白質(zhì)代表RNAi的一種新靶標(biāo)，其可介導(dǎo)對蟑螂侵染的有效防治。優(yōu)選地，所述的至少一種雙鏈RNA區(qū)的至少一條鏈包含以下任意核酸分子的至少約17、18、19、20、21個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約23個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、60個(gè)核普酸、70個(gè)核苷酸、80個(gè)核苦酸、卯個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、150個(gè)核苷酸、200個(gè)核普酸、250個(gè)核苦酸、300個(gè)核苷酸、350個(gè)核苷酸、400個(gè)核香酸、450個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、550個(gè)核苷酸、600個(gè)核苷酸、650個(gè)核苷酸、700個(gè)核苷酸、卯O個(gè)核苷酸、IOOO個(gè)核苷酸、IIOO個(gè)核苷酸、1200個(gè)核苷酸或者約1300個(gè)核脊酸，所述核酸分子包含如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181任意序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。甚至在另一方面中，本發(fā)明提供防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑螂提供/施用RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與編碼原肌球蛋白、HMG輔酶A合成酶基因或者肌動蛋白5C基因的核苷酸序列一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。蟑螂原肌球蛋白、HMG輔酶A合成酶和肌動蛋白5C蛋白質(zhì)4戈表RNAi的新耙標(biāo)，其可以介導(dǎo)對蟑螂侵染的有效防治。優(yōu)選地，所述的至少一種雙鏈區(qū)的至少一條鏈包含以下任意核酸分子的至少約17個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約18個(gè)核苷酸、19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、23個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、30個(gè)核苷酸、40個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、60個(gè)核香酸、70個(gè)核苷酸、80個(gè)核苷酸、90個(gè)核苷酸、IOO個(gè)核苷酸、150個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、250個(gè)核苷酸、300個(gè)核苦酸、350個(gè)核苷酸、400個(gè)核苷酸、450個(gè)核苷酸、500個(gè)核普酸、550個(gè)核普酸、600個(gè)核普酸、650個(gè)核苷酸、700個(gè)核苦酸、卯0個(gè)核苷酸、1000個(gè)核苦酸、1100個(gè)核苷酸、1200個(gè)核苷酸或者約1300個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含如SEQIDNO41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200任意序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。可以將本發(fā)明的方法應(yīng)用于處于任何發(fā)育階段的許多昆蟲和/或蜘蛛類動物，其具有本文鑒定的新靶標(biāo)的直系同源靶基因。靶昆蟲包括居室昆蟲、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物比如作為舉例但非限制的蠅、葉螨、薊馬、壁虱，家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀(包括家蟋蟀)、衣魚，書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。更優(yōu)選的靼物種是蟑埤(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊屬("toe//"spp.)(例如德國小蠊(德國蟑螂))、大蠊屬(i^f7》/flwe似spp.)(例如美洲大蠊(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(別"加spp.)(例如東方蜚蠊(東方蟑螂))和蠊屬(S"/^/flspp.)(例如褐帶蠊(褐帶蟑螂))；螞蟻(蟻總科(Formicoidea))，比如但不限于火蟻屬(iSWe，/sspp.)(例如入侵紅火議(5Wewo戸、/"v/"fl)(紅火蚊))、小家議屬(Mowo附or/M附spp.)(例如法老小家議(Mowo柳onV/柳/7力flm卵/s)(法老蚊(PharaohAnt))、弓背蚊屬(C腿/70w齒sspp.)(例:ft口弓背蚊屬(CVwi/70wCmsspp)(木匠蚊(CarpenterAnts))、毛議屬(/fls/wsspp.)(例如黑毛蚊(lasiusniger)(小黑蟻(SmallBlackAnt)))、4甫道議屬(r&rfl附or/M柳spp.)(傘j如4甫道議(rcr"附or/M附a1es/7/,w附)(鋪道蚊(PavementAnt)))、紅蚊屬(AfyfTw/oispp.)(例如小紅蚊(聊r柳/c"ra6m)(紅蚊(RedAnt)))、蚊屬(i^W/w/cflspp.)(木蚊(woodants))、舉腹蚊屬(CV纖fl^"s^spp.)(例如Oe柳"^^"他f//weo/"似(AcrobatAnt))、虹臭議屬(/nV/。附3;f7wdspp.X例如伊議(JnV/o柳jT附ex)(阿才艮廷蚊(ArgentineAnt)))、大頭議屬(i^e/do/espp.)(大頭議(BigHeadedAnts))和Z)a5^附M&7/flspp.(命J如D^sy附w&7/fl(VelvetAnt));白蚊類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白議科(Termitidae))比如但不限于暗白蚊屬(J柳/^fTW^sspp.)(例如佛羅里達(dá)暗白議(Jw/,^7WMyZw/^/^/s)(佛羅里達(dá)暗翅土白議(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白議屬(WC'CM/Zf^Twesspp.)(例ft口黃肢散白蚊(WC/cw/Z^fTM^syZflvzj^s)(東方散白議(theeasternsubterraneantermite))、WC/cmZ/^twcs1/res/^ras1(西方散白議(WesternSubterraneanTermite)))、乳白議屬(CV/"&r附esspp.)(例如豸L白議(CV7/7^^er附es/OfTMOSflWWS)(臺灣孚L白蚊(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白蚊屬(7mc/s^w附^sspp.)(例:A口小楹白議(/wc/5i&f附es附/wor)(西方干木白蚊(WesternDrywoodTermite)))和新白議屬(7V^^^"柳esspp.)(例如TV^W^tw^sco/iwcxms(森林白蟻(ForestTreeTermite))),蟑埤，例如小蠊屬蟑埤，包括德國蟑螂(德國小蠊(丑/fl&〃flg^7Mflw/cfl))，大蠊屬蟑埤，包括美洲蟑螂(美洲大蠊(P^"Z/7/"we似"/weWomfl))和澳洲蟑螂(澳洲大蠊(i^f7》/flw^"a""m//fls/"e)),蜚蠊屬(必/flrtfl)蟑螂，包括東方蟑螂(東方蜚蠊(5/fl""w/eW^//s))和蠊屬(Sw/^〃fl)蟑螂，包括褐帶蟑螂(褐帶蠊(5^/7"/fl/o"^》fl/;M))。更優(yōu)選的靶標(biāo)是蟑螂。最優(yōu)選的靶標(biāo)是德國蟑螂(德國'J、蠊(5/"&〃flge/7Mfl/Cfl))。優(yōu)選地，通過RNAi對抗昆蟲和/或蜘蛛類有害生物，并從而殺傷、麻痹有害生物、延遲其生長、抑制其攝食和/或阻止其繁殖。本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明還提供在本發(fā)明方法中使用的試劑盒。這些試劑盒可以摻入本發(fā)明的RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表達(dá)構(gòu)建體和/或宿主細(xì)胞和/或組合物和/或室或誘捕器，它們都遞送dsRNA區(qū)從而實(shí)現(xiàn)針對特異性靼基因的RNAi。優(yōu)選地，所述試劑盒還將包括應(yīng)用試劑盒組件的使用說明。在本發(fā)明試劑盒中提供的或者由本發(fā)明試劑盒組分產(chǎn)生的雙鏈RNA能夠通過RNA干擾下調(diào)至少一種昆蟲(有害生物)基因的表達(dá)。優(yōu)選地，為了提供更有效的有害生物防治(如以上所述)，所述試劑盒包含多種組分，其每個(gè)組分介導(dǎo)針對不同靶基因或者昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的RNAi。因此，所述試劑盒可以包括多種RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表達(dá)構(gòu)建體和/或組合物，其中每個(gè)雙鏈RNA能夠通過RNA干擾下調(diào)至少一種昆蟲和/或蜘蛛類動物(有害生物)基因的表達(dá)。優(yōu)選地，依次施用試劑盒的組分以介導(dǎo)有效的有害生物防治。然而，如果需要最大效應(yīng)的話，可以同時(shí)施用一些或者所有的組分。所述試劑盒可以額外包含已知的殺蟲劑，其可以與組成本發(fā)明一部分的組分一起或者分開地提供?？梢砸匝a(bǔ)充方式與本發(fā)明雙鏈RNA分子一起作用的合適的活性成分包括但不限于以下各項(xiàng)毒死蜱(Chlorpyrifos)、丙烯菊酯(Allethrin)、爺吹菊酯(Resmethrin)、四溴乙基(Tetrabromoethyl)、二幾曱基國環(huán)丙烷羧酸(Dimethol畫cyclopropanecarboxylicacid)(其通常包含在液體組合物中)；和氟蟻腙(Hydramethylnon)、齊螨素(Avermectin)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氟蟲胺(Sulfuramid)、烯蟲炔酉旨(Hydroprene)、氟蟲腈(Fipronil)(GABA受體)、異丙基苯基氨基曱酸曱酉旨(Isopropylphenylmethylcarbamate)、茚蟲威(Indoxacarb)(PARA)、多底脲(Noviflumuron)(幾丁質(zhì)合成抑制劑)、炔咪菊酯(Imiprothrin)(PARA)、阿維菌素(Abamectin)(谷氨酸門控氯離子通道)、吡蟲啉(Imidacloprid)(乙酰膽堿受體)(其通常包含在誘飾組合物中)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，已知活性成分是就健康和環(huán)境考慮而言"優(yōu)選的"殺昆蟲劑和/或殺蜘蛛劑，比如例如氟蟻腙和齊螨素。因此，本發(fā)明的試劑盒還可以同時(shí)定向針對多個(gè)物種，從而提供對更廣范圍有害生物防治的選擇。多種雙鏈RNA分子可以被包含在試劑盒中(作為適合的構(gòu)建體的一部分等)以介導(dǎo)多靶標(biāo)的RNAi，所述靶標(biāo)包括例如相同靶標(biāo)的種間直系同源物。所述試劑盒可以包括適合的緩沖液和包裝等以確保其中組分的穩(wěn)定性和保存。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)相對于常規(guī)化學(xué)殺蟲劑的應(yīng)用，本發(fā)明有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)。(1)介導(dǎo)RNAi的dsRNA必須以高度的核苷酸序列一致性與靶標(biāo)匹配，從而有效地下調(diào)表達(dá)并由此防治有害生物。因此，通過設(shè)計(jì)雙鏈RNA分子可以實(shí)現(xiàn)特異性，其中一條鏈與靶序列具有高同源性，但是該鏈針對哺乳動物物種(比如人)的直系同源序列只具有低同源性。這種特異性要高于常規(guī)化學(xué)殺蟲劑所能達(dá)到的特異性。(2)已鑒定了一組新的靶標(biāo)，其能夠在有害生物防治中應(yīng)用。因?yàn)橄惹斑@些靶標(biāo)沒有被鑒定過，所以在有害生物物種中應(yīng)不會獲得抗性。(3)與已知的化學(xué)合成殺蟲劑(例如DMSO等)相比，在RNAi中應(yīng)用的針對所述新靶標(biāo)的雙鏈RNA是生物可降解產(chǎn)物。所述構(gòu)建體的生物可降解特性使得它們更加無害于環(huán)境。(4)RNAi不是一定立即提供有關(guān)殺傷有害生物的效應(yīng)，其所提供的有效介導(dǎo)的效應(yīng)需要時(shí)間讓雙鏈RNA與它的靼標(biāo)結(jié)合。RNAi效應(yīng)可以導(dǎo)致在稍后時(shí)間殺傷有害生物并且不直接依賴于接觸，比如多氟脲(Noviflumuron)(其是一種幾丁質(zhì)合成抑制劑，來自DowAgroSciences)。因此，應(yīng)用RNAi可以允許更容易地防治有害生物(比如昆蟲和/或蜘蛛類動物)的大規(guī)模侵染，因?yàn)閹缀醪粫l(fā)生在有害生物中傳播的沖擊效應(yīng)(shockeffect),這種效應(yīng)是在當(dāng)它們在殺昆蟲劑和/或殺蜘蛛劑附近可能遭遇到大量死的有害生物時(shí)發(fā)生的。(5)同時(shí)應(yīng)用多種靶標(biāo)可以提供對有害生物群體更有效的防治并且降低獲得抗性的可能性。所述靶標(biāo)可以是大量有害生物物種共有的，從而提供廣泛的處置。(6)與常規(guī)殺蟲劑相反，由于本發(fā)明的DNA和RNA構(gòu)建體、組合物和宿主細(xì)胞較為安全的特性，所以在為了處置相關(guān)區(qū)域時(shí)，并不需要專業(yè)的協(xié)助。(7)對人活性的最小破壞是必需的，因?yàn)閷p鏈RNA區(qū)的構(gòu)建體的設(shè)計(jì)使得它們對靶有害生物群體以外的基因表達(dá)沒有副作用或者只有輕微的影響。根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)部分將對本發(fā)明有更進(jìn)一步的了解。圖表說明表1:新鑒定的昆蟲靶基因的實(shí)例。根據(jù)FlyBase直系同源物確定基因功能。表2:與德國小蠊(必/fl^〃"gw附""/cfl)耙序列互補(bǔ)的dsRNA片段。表3:dsRNA處置對成功蛻皮至成蟲期的蟑埤數(shù)量的影響，以活昆蟲的百分率表示(平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=4)。表4:靶基因的選擇序列*。所述序列*的至少17bp片段存在于昆蟲物種的特定直系同源序列中(由GI值表示)。表5:靶基因的選擇序列*。所述序列*的至少17bp片段存在于蜘蛛類動物物種的特定直系同源序列中(由GI值表示)。圖1:德國小蠊(gw附flw/cfl)對于人工顆粒食物的死亡率。顆粒中dsRNA的濃度為1%w/w。吡蟲啉(imidacloprid)的濃度為1%w/w。圖2:德國小蠊(fi.^fTWflw/cfl)對于人工顆粒食物的死亡率。顆粒中dsRNA(Bg001，具有如SEQIDNO9所示的序列，和BgOOl多聯(lián)體2，具有如SEQIDNO68所示的序列)的濃度為1%w/w。在此實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)氟鈴脲(hexaflumuron)(1%w/w)作為陽性對照和溶劑作為陰性對照。圖3:在室溫下和八個(gè)月期間，Bg032dsRNA在LB培養(yǎng)基(LB)和無核糖核酸酶水(MQ)中的穩(wěn)定性。圖4:在一周內(nèi)向一齡若蟲施用dsRNA(BgOOl)對蟑螂死亡率的影響。在此實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)各種dsRNA和溶劑作為陰性對照。dsRNA在顆粒中的濃度為l%w/w。圖5:本發(fā)明的序列表1<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>t<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>將薪室實(shí)施例1:通過家族PGR克隆德國小蠊(^/a"e〃a^AV77a/7/ca)的Bg001、Bg003、Bg004和Bg005的部分序列按照4吏用i兌明應(yīng)用TRIzolReagent(目錄號15596-026/15596-018,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)從德國小蠊(gmwfl/i/ai)(來源CentralScienceLaboratory,York)分離高質(zhì)量、完整的RNA。按照使用說明通過Dnase處理去除RNA制備物中存在的基因組DNA。按照使用說明應(yīng)用可商業(yè)獲得的試劑盒(S，erScriptTMIII反轉(zhuǎn)錄酶，目錄號18080044，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)生成cDNA。為分離包含一部分Bg001、Bg003、Bg004和Bg005基因的cDNA序列，按照4吏用i兌明應(yīng)用AmplitaqGold(目錄號N8080240;AppliedBiosystems)來實(shí)施應(yīng)用簡并引物的一系列PCR反應(yīng)。對于BgOOl，在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用簡并引物oGBKA002和oGBKA020(分別如本文SEQIDNO3和SEQIDNO4所示)95"C10分鐘，接著為95C30秒、57X^1分鐘和分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40,Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO1所示并且凈皮稱為BgOOl基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO2所示。對于Bg003,在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用簡并引物oGBKCOOl和oGBKC010(分別如本文SEQIDNO13和SEQIDNO14所示)分鐘，接著為95t:30秒、55X:i分鐘和72XU分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40,Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO11所示并且被稱為BgO(B基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO12所示。對于Bg004，在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用簡并引物oGBKDOOl和oGBKD006(分別如本文SEQIDNO23和SEQIDNO24所示)95*€10分鐘，接著為95X^30秒、50t!l分鐘和72分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72匸7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706,Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40，Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO21所示并且被稱為Bg004基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO22所示。對于Bg005,在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用簡并引物oGBKE002和oGBKE009(分別如本文SEQIDNO33和SEQIDNO34所示)分鐘，接著為95"C30秒、52X^1分鐘和72XM分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706,Qiagen),克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40,Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)4亍測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO31所示并且,皮稱為Bg005基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO32所示。實(shí)施例2:通過EST序列克隆德國小蠊(S/a"e〃agen77a/7/ca)的Bg031、Bg032和Bg033基因的部分序列按照使用說明應(yīng)用TRIzolReagent(目錄號15596-026/15596-018，Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)從德國小蠊(^/"rte〃"ger附aw/c")(來源CentralScienceLaboratory,York)分離高質(zhì)量、完整的RNA。按照使用i兌明通過DNAse處理去除RNA制備物中存在的基因組DNA。按照使用說明應(yīng)用可商業(yè)獲得的試劑盒(SuperscriptIII反轉(zhuǎn)錄酶，目錄號18080044,Invitrogen,Rockville,Maryland,USA)生成cDNA。為鑒定來自Bg031、Bg032和Bg033基因的部分cDNA序列，在公用數(shù)據(jù)庫Genbank中，針對每個(gè)基因確定一個(gè)EST,登記號分別為源于乂^用數(shù)據(jù)庫Genbank的AF260897、X73679和AY004248。為分離包含一部分Bg031、Bg032和Bg033基因的cDNA序列，按照4吏用i兌明應(yīng)用PerfectshotExTaq(目錄號RR005A，TAKARABIOINC.)來實(shí)施應(yīng)用基于EST的特異性引物的一系列PCR反應(yīng)。對于Bg031，在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性引物oGBLAOOl和oGBLA002(分別如本文SEQIDNO43和SEQIDNO44所示)分鐘，接著為95C30秒、55"Cl分鐘和分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575國40，Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO41所示并且被稱為Bg031基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO42所示。對于Bg032，在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性引物oGBLB003和oGBLB004(分別如本文SEQIDNO51和SEQIDNO52所示)95*C10分鐘，接著為95C30秒、55XM分鐘和分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72匸7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706，Qiagen),克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40,Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO49所示并且被稱為Bg032基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO50所示。對于Bg033,在兩個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性引物oGBLCOOl和oGBLC004(分別如本文SEQIDNO59和SEQIDNO60所示)95X:i0分鐘，接著為95X^30秒、分鐘和72tU分鐘的40個(gè)循環(huán)，接著為72C7分鐘。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物，純化(QIAquickGelExtractionKit;目錄號28706，Qiagen)，克隆入pCR4-TOPO載體(目錄號K4575-40,Invitrogen)并測序。對兩種PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序產(chǎn)生的共有序列如本文SEQIDNO57所示并且被稱為Bg033基因的部分序列。相應(yīng)的部分氨基酸序列如本文SEQIDNO58所示。實(shí)施例3:德國小蠊(S/a"e〃ager/77a/7/'ca)的Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的dsRNA產(chǎn)物應(yīng)用可商業(yè)獲得的試劑盒T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(目錄號P1700,Promega)合成毫克量的dsRNA。首先在兩個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)中生成兩種分開的單一5，T7RNA聚合酶啟動子模板，每個(gè)反應(yīng)包含關(guān)于T7啟動子的不同方向的靶序列。對于Bg001，在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLDOOl和特異性RV引物oGBLD010(分別如本文SEQIDNO5和SEQIDNO6所示)生成正義T7模板95tM分鐘，接著為95C30秒、51*C30秒和72X:i分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72X^10分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLD009和特異性T7RV引物oGBLD002(分別如本文SEQIDNO7和SEQIDNO8所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaCK)4沉淀進(jìn)^f亍純化。按照4吏用i兌明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)4亍轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)4亍退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO9所示。對于Bg003，在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLD003和特異性RV引物oGBLD012(分別如本文SEQIDNO15和SEQIDNO16所示)生成正義T7模板95"C4分鐘，接著為95匸30秒、51C30秒和72X:i分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72"C10分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLDOll和特異性T7RV引物oGBLD004(分別如本文SEQIDNO17和SEQIDNO18所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀進(jìn)4亍純化。按照4吏用i兌明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO19所示。對于Bg004，在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLD005和特異性RV引物oGBLD014(分別如本文SEQIDNO25和SEQIDNO26所示)生成正義T7模板95XM分鐘，接著為95匸30秒、51"C30秒和72*C1分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72"C10分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLD013和特異性T7RV引物oGBLD006(分別如本文SEQIDNO27和SEQIDNO28所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀來純化。按照4吏用說明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO29所示。對于Bg005,在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLD007和特異性RV引物oGBLD016(分別如本文SEQIDNO35和SEQIDNO36所示)生成正義T7模板95XM分鐘，接著為95匸30秒、51*C30秒和分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLD015和特異性T7RV引物oGBLD008(分別如本文SEQIDNO37和SEQIDNO38所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀來純化。按照4吏用說明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO39所示。對于Bg031,在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLA007和特異性RV引物oGBLA002(分別如本文SEQIDNO45和SEQIDNO44所示)生成正義T7模板95T4分鐘，接著為95"C30秒、51"C30秒和72"C1分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72X310分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLAOOl和特異性T7RV引物oGBLA008(分別如本文SEQIDNO43和SEQIDNO46所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀來純化。按照4吏用i兌明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO47所示。對于Bg032，在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLB007和特異性RV引物oGBLB004(分別如本文SEQIDNO53和SEQIDNO52所示)生成正義T7模板95"C4分鐘，接著為95"C30秒、51C30秒和72X:i分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72"Cl0分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLB003和特異性T7RV引物oGBLB008(分別如本文SEQIDNO51和SEQIDNO54所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀來純化。按照使用說明，混合生成的T7FW和RV模板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO55所示。對于Bg033，在PCR反應(yīng)中依照以下條件應(yīng)用特異性T7FW引物oGBLC007和特異性RV引物oGBLC004(分別如本文SEQIDNO61和SEQIDNO60所示)生成正義T7模板95匸4分鐘，接著為30秒、51"C30秒和72C1分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著為72"Cl0分鐘。在PCR反應(yīng)中依照上述的相同條件應(yīng)用特異性FW引物oGBLC001和特異性T7RV引物oGBLC008(分別如本文SEQIDNO59和SEQIDNO62所示)生成反義T7模板。在瓊脂糖凝膠上分析所獲得的PCR產(chǎn)物并通過NaC104沉淀來純化。按照4吏用i兌明，混合生成的T7FW和RV才莫板以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，并且將生成的RNA鏈進(jìn)行退火，Dnase和Rnase處理以及通過醋酸鈉純化。所得dsRNA的正義鏈如本文SEQIDNO63所示。實(shí)施例4:篩選具有抵抗德國蟑螂(德國小蠊(S/a"e〃a^AV77a/7/ca))活性的dsRNA耙標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)制備溶于蒸餾水的1-10jtg>ldsRNA的儲備溶液。將各個(gè)dsRNA溶液稀釋至適合的濃度并與細(xì)磨的實(shí)驗(yàn)室食物(大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)食物，B&KUniversalLtd,Hull,UK)混合，所述實(shí)驗(yàn)室食物之前經(jīng)過加熱處理，從而使所有的酶失活。將所述混合物或者制劑制成同樣重量(0.3g)的小顆粒以達(dá)到0.1%-2%w/wdsRNA的終濃度并在室溫下干燥過夜。在具有塑料蓋的容器(29±2*C,最小相對濕度40%,12:12的有光照:無光照光周期)中各放置10只新孵化的德國蟑螂(凡gw/wfl/i/cfl)的若蟲。在動物接觸到所述顆粒之前，被停食24小時(shí)。一周兩次評價(jià)蟑螂的存活、瀕死或者死亡，直至成蟲期。所述顆粒一周一次用新制備的顆粒替換。將含dsRNA的顆粒、制劑與陰性對照(溶劑)和陽性對照(1或2%吡蟲淋(imidacloprid),通常被用于可商業(yè)獲得的蟑螂誘飾)進(jìn)行比較。如圖l所示，在用BgOOl、Bg003和Bg005處理的第一次施用后24天內(nèi)或者在用Bg004處理起的29天內(nèi)，至少80%的蟑螂死亡。實(shí)施例5:檢驗(yàn)不同片段的功效鑒定德國小蠊(5/flWe〃flge/7Mfl"/ai)BgOOl、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的與人基本沒有同源性的片段分才斤BgOOl、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033基因的部分序列(在本文中分別如SEQIDNOl、SEQIDNOll、SEQIDNO21、SEQIDNO31、SEQIDNO41、SEQIDNO49和SEQIDN057所示)，以找到與非靶生物基本沒有同源性的片段。尤其是，因?yàn)閐sRNA在生物中將被切成siRNA分子，掃描所述序列的與非靼物種具有同源性的siRNA序列。這樣的siRNA會在非靶生物中引起副作用，因此優(yōu)選應(yīng)當(dāng)避免將該dsRNA片段摻入終產(chǎn)物。當(dāng)例如存在于誘辨并通過蟑螂進(jìn)食從該誘飾攝取時(shí)，所選的片段適合通過RNA干擾對蟑螂進(jìn)行防治。對于此分析，非靶生物是人(Fo柳osfl/;/e/^)。鑒定21個(gè)連續(xù)核苷酸(bestl—human—21—0)或者24個(gè)連續(xù)核苷酸的允許3個(gè)錯(cuò)配(bestl/2/3—human—24—3)的片段，其不在非耙生物中存在，在本文中被稱為"自由片段(freefrags)"。應(yīng)用第一選擇標(biāo)準(zhǔn)鑒定的無非靶生物序歹'J的BgOOl、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033的最長序列在SEQIDNO中給出并被稱為"自由片段"。這些Bg001、Bg003、Bg004、Bg005、Bg031、Bg032和Bg033的自由片段在本文中分別如SEQIDNO10、SEQIDNO20、SEQIDNO30、SEQIDNO40、SEQIDNO48、SEQIDNO56和SEQIDNO64所示。其它適于在本發(fā)明中應(yīng)用的自由片段序列的一些實(shí)例的序列和長度在表2中顯示。從該表中可以很容易地推導(dǎo)出正確的序列。在該表中描述的所有自由片段屬于本發(fā)明的序列的組。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，在本文描述的德國小蠊序列中、以及在本發(fā)明其它有害生物序列中的相應(yīng)基因和蛋白質(zhì)直系同源物的序列中可以鑒定更多這樣的各種長度的自由片段，因此本發(fā)明擴(kuò)展至另外這些可鑒定的自由片段。實(shí)施例6:選擇最佳片段；檢驗(yàn)多聯(lián)體的功效設(shè)計(jì)針對各個(gè)靶基因的多聯(lián)體。多聯(lián)體是50-100bp雙鏈片段的合成串聯(lián)重復(fù)。在本實(shí)施例中，通過在蛋白質(zhì)家族中以及在核苷酸水平上的具有同源性的區(qū)域中、在包含最佳預(yù)測siRNA的區(qū)域中以及在GC含量為40-60%(如果可能優(yōu)選約50%GC含量)的區(qū)域中選擇最可能片段來設(shè)計(jì)多聯(lián)體。對于Bg001,設(shè)計(jì)了兩種多聯(lián)體，由50bp片段的5次重復(fù)組成，即由SEQIDNO65和66所示，產(chǎn)生BgOOl多聯(lián)體1和BgOOl多聯(lián)體2，在本文中被分別顯示為SEQIDNO67和SEQIDNO68,并且設(shè)計(jì)一種多聯(lián)體，其由100bp重復(fù)序列的3次重復(fù)組成，由SEQIDNO69所示，產(chǎn)生BgOOl多聯(lián)體3，在本文中^皮顯示為SEQIDNO70。添加Xbal和Smal旁側(cè)位點(diǎn)用于載體中的克隆以產(chǎn)生dsRNA。在蟑螂實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中檢驗(yàn)這些包含多聯(lián)體的dsRNA構(gòu)建體。在如圖2所示的另一實(shí)驗(yàn)中，與負(fù)對照(溶劑)相比，當(dāng)用BgOOl和Bg001多聯(lián)體2處理時(shí)，死亡率要明顯更高。除了死亡率之外，處理對發(fā)育顯示出明顯的影響。例如，在48天時(shí)，在用BgOOl處理過的存活蟑螂中，只有33.3%的蟑螂蛻皮至成蟲期，而在用BgOOl多聯(lián)體2處理過的蟑螂中，沒有蟑瑯蛻皮至成蟲期，如表3所示。實(shí)施例7:檢驗(yàn)不同的制劑RNA干擾(RNAi)是在許多不同物種中以序列特異性方式抑制靶基因表達(dá)的一種潛在的非常有效的手段。然而，對于有價(jià)值且有效的RNAi而言，特異性地沉默任何指定靶基因是必需的，其中沒有非特異性的敲低(knockdown)和毒性副作用。由于不能有效地遞送這些化合物至它們在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)，從而阻礙了dsRNA的應(yīng)用。對dsRNA進(jìn)行化學(xué)修飾以增加相互作用的強(qiáng)度和穩(wěn)定性并且不損失特異性的進(jìn)展正在進(jìn)行中。在本研究中，對幾種用于遞送dsRNA至德國小蠊中靶基因的設(shè)計(jì)進(jìn)行了評估。通過促進(jìn)內(nèi)吞作用來增加dsRNA的胞內(nèi)攝取或者通過應(yīng)用遞送劑(比如脂質(zhì)和脂質(zhì)體)來增加dsRNA在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性可以改善RNAi誘導(dǎo)效應(yīng)。siRNA具有陰離子磷酸二酯主鏈，并為此原因研究陽離子脂質(zhì)體/脂質(zhì)介導(dǎo)的siRNA遞送(siFection)。從許多可商業(yè)獲得的產(chǎn)品中選擇這些基于陽離子脂質(zhì)體/脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括lipofectamine和1，2-二油?；?3-三甲基-銨基-丙烷(DOTAP)-膽固醇，并在蟑榔實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中檢驗(yàn)dsRNA制劑。待研究的參數(shù)包括混合的脂質(zhì):dsRNA比率、陽離子脂質(zhì)體/脂質(zhì)-dsRNA復(fù)合物形成的程度、顆粒大小、遞送方式和劑量效應(yīng)作用。實(shí)施例8:檢驗(yàn)dsRNA穩(wěn)定性將dsRNA應(yīng)用于基因沉默將取決于在分子生物穩(wěn)定性、特異性和遞送方面的改進(jìn)。在pH7和pH9的TRIZMA緩沖液中和用于才莫擬一些靼物種腸中pH的pH11的CAPS緩沖液中檢驗(yàn)所生成dsRNA的穩(wěn)定性。孵育dsRNA幾天，并在不同的時(shí)間間隔在20。/。聚丙烯酰胺凝膠上分析等分試樣?；谀z結(jié)果可以觀察到pH對dsRNA的穩(wěn)定性沒有影響。在8個(gè)月的期間，在室溫條件下，在無RNase水中和在LB培養(yǎng)基中檢驗(yàn)作為時(shí)間函數(shù)的所生成dsRNA的穩(wěn)定性。每周一次和/或每月一次采集等分試樣，并且在20%聚丙烯酰胺凝膠上分析之前保存在-20n中。如圖3所示，在聚丙烯酰胺凝膠上可觀察到dsRNA沒有明顯的實(shí)施例9:檢驗(yàn)單劑dsRNA在德國蟑螂(德國小蠊(S/a"e〃ager/7/aA7/cs))的早期若蟲階段中對死亡率影響的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)制備溶于蒸餾水的10pg/nldsRNA的儲備溶液，并與細(xì)磨的實(shí)驗(yàn)室食物(大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)食物，B&KUniversalLtd,Hull,UK)混合，所述實(shí)驗(yàn)室食物之前經(jīng)過加熱處理，從而使所有的酶失活。將所述混合物或者制劑制成同才羊重量(0.3g)的小顆凈立以達(dá)到1%w/wdsRNA的終濃度并在室溫下干燥過夜。在具有塑料蓋的容器(29士2X:，最小相對濕度40%，12:12的有光照:無光照光周期)中各放置IO只新孵化的德國蟑螂(德國小蠊)的若蟲。在動物接觸到所述顆粒之前，被停食24小時(shí)。一周后，該初始劑用未經(jīng)處理的顆粒替換。一周兩次評價(jià)蟑埤的存活、瀕死或者死亡，直至成蟲期。如圖4所示，與兩種負(fù)對照(溶劑和混雜的dsRNA)相比，包含BgOOldsRNA的顆粒顯示出明顯更高的死亡率。權(quán)利要求1.核酸分子，其包含如SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180和181中任一序列所示的核苷酸序列或者來自昆蟲或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列，其中所述直系同源核苷酸序列與SEQIDNO1、11、21和31任一序列的核苷酸序列具有至少70％序列一致性。2.RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與以下任一核酸分子的一部分核苷酸序列互補(bǔ)的核普酸序列(i)權(quán)l(xiāng)利要求l中定義的核酸分子或者(ii)核酸分子，其包含如SEQIDNO41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列。3.權(quán)利要求2的RNA構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)具有至少17bp長。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的RNA構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列的互補(bǔ)性包含與(i)或(ii)具有至少70%的核苷酸序列一致性，其中序列一致性百分率是在相同長度上計(jì)算的，(i)權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2中定義的核酸分子的一部分核苷酸序列，(ii)核酸分子，所述核酸分子包含如SEQIDN041、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所序列。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其中所述的至少一條鏈與來自哺乳動物物種的相應(yīng)核苷酸序列在24個(gè)連續(xù)核苷酸上具有小于12.5%的序列一致性，所述的至少一條鏈包含與(i)或(ii)互補(bǔ)的核苷酸序列，(i)權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2中定義的核酸分子的一部分核苷酸序列或者(ii)核酸分子，其包含如SEQIDN041、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其來自昆蟲或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其包含獨(dú)立地選自下述任意序列的至少兩個(gè)核苷酸序列SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200，例如SEQIDNO65-70的任意序列。7.DNA構(gòu)建體，(i)包含權(quán)利要求1的核苷酸序列或者(ii)包含編碼權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)之RNA構(gòu)建體的區(qū)域。8.表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建體。9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)構(gòu)建體，其還包含能驅(qū)動權(quán)利要求7中所定義核酸之表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選地轉(zhuǎn)錄終止序列。10.宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體、權(quán)利要求7或8的DNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要求9的表達(dá)構(gòu)建體。11.殺蟲組合物，其包含如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞以及適合的載體。12.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中所述載體包括帶靜電的粉末或顆粒和/或磁性顆粒，優(yōu)選金屬顆粒，其初始時(shí)是未磁化的，但是當(dāng)其被置于由昆蟲和/或蜘蛛類動物體所提供的電場中時(shí)能被磁性極化，所述粉末或顆粒附著于昆蟲或蜘蛛類動物的表皮并且可被昆蟲或蜘蛛類動物攝入。13.用于昆蟲和/或蜘蛛類動物的室或誘捕器，其包含如權(quán)利要求11或12中定義的組合物。14.如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器通過RNA干擾防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的用途。15.防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的方法，其包括向昆蟲和/或蜘蛛類動物施用如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器，其中所述雙鏈RNA能通過RNA干擾下調(diào)至少一種昆蟲和/或蜘蛛類動物基因的表達(dá)。16.權(quán)利要求15的方法，其中多種如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器被施用給所述昆蟲和/或蜘蛛類動物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的多種如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器被依次施用，以降低昆蟲和/或蜘蛛類動物獲得抗性的可能性。18.根據(jù)權(quán)利要求14的用途或者根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括居室昆蟲、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物，優(yōu)選蠅、葉螨、薊馬、壁虱、家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀包括家蟋蟀、衣魚、書虱、曱蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途或者方法，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊屬(B/fl^〃"spp.)(例如德國小蠊(丑/"^〃"gw附flw/ai)(德國蟑螂))、大蠊屬(i^7》/"wCflspp.X例如美洲大蠊(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(Spp.)(例如東方蜚蠊(東方蟑螂))和蠊屬(^"/7^/flSpp.)(例如褐帶蠊(褐帶蟑螂))；螞蟻(蟻總科(Formicoidea))，比如但不限于火蟻屬(5We"，/sspp.)(例如入侵紅火蚊(5We"o戸'sZ謂."fl)(紅火蚊))、小家議屬(Mo"o附or/w附spp.)(例如法老小家議(Mo/io附or/w附/;/iflmo/i/s)(法老議(PharaohAnt))、弓背議屬(CV1附/70腳tospp.)(例:fi口弓背蚊屬(CVww/7owo似sspp)(木匠議(CarpenterAnts))、毛蚊屬(/"s/msspp.)(例如黑毛議(lasiusniger)(小黑蟻(SmallBlackAnt)))、鋪道議屬(r"m附wVi附spp.)(例如鋪道議(T^m附or/"附c"邵f7"附)(鋪道蟻(PavementAnt)))、紅議屬(聊,.oispp.)(例如小紅議(聊f附/c")(紅議(RedAnt)))、蚊屬(/^W柳/c"spp.)(木議(woodants))、舉腹蚊屬(Oe附"Mgflsterspp.)(舍'J:fi口Oe附flfogflster//weo/flto(AcrobatAnt))、虹臭議屬(/nV/o柳jr附ejcspp.)(例如伊議(/f7V/0附F附ex)(阿才艮廷蚊(ArgentineAnt)))、大頭蚊屬(T^cV/o/espp.)(大頭蚊(BigHeadedAnts))和Z)fl5^附w"〃flspp.(侈寸長口Dfl5^/wt^/〃"0c"V/ew似Z/s(VelvetAnt));白議類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蚊科(Termitidae))比如但不限于暗白蚊屬(^w/^r柳^spp.)(例如佛羅里達(dá)暗白議(爿柳/^7wmyZw/^/is/s)(佛羅里達(dá)暗翅土白議(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白議屬(/c/cw/fY^7wes1spp.)(例如黃肢散白議(Wc/cw/Z^/tw^s/7"w》^s)(東方土白議(theeasternsubterraneantermite))、7^&"http://^附^/re5/7eras(西方土白議(WesternSubterraneanTermite)))、家白議屬(Co/7^^^7w^SSpp.)(例ft口家白議(C^/7^^^7wm/O/TMOS^WMS1)(臺灣土白蚊(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白蚊屬(/wc/si^/vwesspp.)(例j口小楹白蚊(/wc/si^fTWM附/wof)(西方干木白蚊(WesternDrywoodTermite)))和新白議屬(iVe^f附esspp.)(例如TVco^tw^scow/idws(森林白蟻(ForestTreeTermite))),并且最優(yōu)選德國蟑螂(德國小蠊)。20.用于權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)方法的試劑盒，其包含如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器以及使用說明，其中所述雙鏈RNA能夠通過RNA干擾下調(diào)至少一種有害生物基因的表達(dá)。21.權(quán)利要求20的試劑盒，其包含多種如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器，其中每種雙鏈RNA能夠通過RNA干擾下調(diào)至少一種有害生物基因的表達(dá)。22.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述的多種如權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求7或8中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求9中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求10中定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求11或12中定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器被依次應(yīng)用，以降低有害生物獲得抗性的可能性。23.防治蟑螂有害生物的方法，其包括向蟑埤提供RNA構(gòu)建體，所述RNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與編碼蟑埤核糖體蛋白質(zhì)的一部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)的至少一條鏈包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21個(gè)或者更多個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含如SEQIDNO1、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。25.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)另外的dsRNA區(qū)，其至少一條鏈包含與來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的另外基因的一部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。26.權(quán)利要求2-6或者25中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其還包含至少一個(gè)另外的功能性序列和任選地接頭。27.根據(jù)權(quán)利要求26的RNA構(gòu)建體，其中所述另外的功能性序列選自包括以下序列的組(i)促進(jìn)大規(guī)模生產(chǎn)所述RNA構(gòu)建體的序列；(ii)實(shí)現(xiàn)增加或者降低dsRNA穩(wěn)定性的序列；(iii)允許結(jié)合蛋白質(zhì)或者其它分子以促進(jìn)昆蟲和/或蜘蛛類動物攝取所述RNA構(gòu)建體的序列；(iv)作為適配子結(jié)合昆蟲腸道中受體或分子以促進(jìn)昆蟲和/或蜘蛛類動物攝取、內(nèi)吞和/或轉(zhuǎn)胞吞的序列。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的RNA構(gòu)建體，其中所述接頭是條件性自切割RNA序列，優(yōu)選pH敏感性接頭或者疏7JC敏感性接頭。29.根據(jù)權(quán)利要求26或27的RNA構(gòu)建體，其中所述接頭是內(nèi)含子。30.才艮據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列的互補(bǔ)性包含與(i)或(ii)具有至少70%的核苷酸序列一致性，其中序列一致性百分率是在相同長度上計(jì)算的，(i)權(quán)利要求l或者權(quán)利要求2中定義的核酸分子的一部分核苷酸序列，(ii)核酸分子，其包含如SEQIDN041、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列。31.根據(jù)權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其中所述的至少一條鏈與來自哺乳動物物種的相應(yīng)核苷酸序列在24個(gè)連續(xù)核苷酸上具有小于12.5%的序列一致性，所述的至少一條鏈包含與(i)或(ii)互補(bǔ)的核苷酸序列，(i)權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2中定義的核酸分子的一部分核苷酸序列或者(ii)核酸分子，其包含如SEQIDN041、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其來自昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的直系同源核苷酸序列。32.根據(jù)權(quán)利要求3-6或者25-28任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體，其中所述的至少一條鏈包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21個(gè)或者更多個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。33.根據(jù)權(quán)利要求31或者32的RNA構(gòu)建體，其中所述哺乳動物物種是人。34.包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)的RNA構(gòu)建體，其至少一條鏈包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21個(gè)或者更多個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核普酸序列或者其互補(bǔ)序列。35.DNA構(gòu)建體，其包含編碼權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)之RNA構(gòu)建體的區(qū)域。36.表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求35的DNA構(gòu)建體。37.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的RNA構(gòu)建體、權(quán)利要求35的DNA構(gòu)建體或者權(quán)利要求36的表達(dá)構(gòu)建體。38.如權(quán)利要求10或37定義的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌細(xì)胞。39.如權(quán)利要求38定義的宿主細(xì)胞，其是滅活的細(xì)菌細(xì)胞。40.用于產(chǎn)生權(quán)利要求2-6或25-34中任一項(xiàng)之RNA構(gòu)建體的方法，其包括在允許所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生所述RNA構(gòu)建體的條件下實(shí)施以下步驟a.將權(quán)利要求7或35的DNA構(gòu)建體或者權(quán)利要求8、9或36的表達(dá)構(gòu)建體與無細(xì)胞組分接觸；或者b.向細(xì)胞施用權(quán)利要求7或35的DNA構(gòu)建體或者權(quán)利要求8、9或36的表達(dá)構(gòu)建體。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。42.殺蟲組合物，其包含如權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞以及適合的載體。43.才艮據(jù)權(quán)利要求IO、11或43中任一項(xiàng)的組合物，其為適于昆蟲和/或蜘蛛類動物攝入的形式。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43的組合物，其是固體形式，比如顆?；蚍勰⒁后w形式或凝膠形式。45.根據(jù)權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)的組合物，其為誘鉺的形式。46.根據(jù)權(quán)利要求45的組合物，其中所述誘飾還包含至少一種食物，比如基于蛋白質(zhì)的食物或者硼酸和/或引誘劑，比如信息素。47.根據(jù)權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物被存放在昆蟲和/或蜘蛛類動物為了攝取該組合物能夠進(jìn)入的室或誘捕器中。48.根據(jù)權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)的組合物，其是噴霧劑的形式，優(yōu)選加壓的/氣溶膠化的噴霧劑或者泵式噴霧劑。49.根據(jù)權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)的組合物，其是在適合表面上的涂料形式，當(dāng)昆蟲和/或蜘蛛類動物與所述涂料接觸時(shí)，所述涂料就附著于昆蟲和/或蜘蛛類動物。50.根據(jù)權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)的組合物，其中所述栽體包括帶靜電的粉末或顆粒和/或磁性顆粒，優(yōu)選金屬顆粒，其初始時(shí)是未磁化的，但是當(dāng)其被置于由昆蟲和/或蜘蛛類動物體提供的電場中時(shí)能被磁性極化，其附著于昆蟲或者蜘蛛類動物的表皮。51.根據(jù)權(quán)利要求42-50中任一項(xiàng)的組合物，其中所述栽體提高有害生物對所述雙鏈RNA的攝取。52.權(quán)利要求51的組合物，其中所述載體是基于脂質(zhì)的載體，優(yōu)選包括一種或者多種的水包油乳劑、膽固醇、膠束、脂多胺和脂質(zhì)體。53.權(quán)利要求51的組合物，其中所述載體包含核酸凝聚劑，優(yōu)選亞精胺或者硫酸魚精蛋白。54.權(quán)利要求11、12或者42-53中任一項(xiàng)的組合物，其與另外的殺蟲劑相組合。55.用于昆蟲和/或蜘蛛類動物的室或誘捕器，其包含如權(quán)利要求42-46或者54中任一項(xiàng)定義的組合物。56.如權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物和/或如權(quán)利要求55中定義的室或誘捕器通過RNA千擾防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的用途。57.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括居室昆蟲、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物，優(yōu)選蠅、葉螨、薊馬、壁虱、家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀包括家蟋蟀、衣魚、書虱、曱蟲、蠼螋、蚊和跳蚤。58.根據(jù)權(quán)利要求57的用途，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括蟑螂(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊屬(別齒〃"spp.)(例:S口，德國小蠊(5/fl^〃"gw附fm/cfl)(德國蟑螂))、大蠊屬(i^n》/"we似spp.)(例如美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲蟑埤)和澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(spp.)(例如東方蜚蠊(B/""flw/ew似fc)(東方蟑螂))和蠊屬(Sw/7e〃flspp.)(例如褐帶蠊(Supellalongipalpa)(褐帶蟑螂)；螞蚊(蚊總科(Formicoidea))，比如但不限于火議屬(5Wewo/^/sspp.)(例如入4曼紅火蚊(5Wewo戸、/"v/cto)(紅火議))、小家蚊屬(Afow函on7/附spp.)(例如法老小家蚊(她w謂w.謂//^raom、)(法老議(PharaohAnt))、弓背議屬(C"柳/70wWwsspp.)(侈寸ft口弓背議屬(C"附/70wo似sspp)(木匠議(CarpenterAnts))、毛議屬(/"wV/sspp.)(例如黑毛蚊(lasiusniger)(小黑蚊(SmallBlackAnt)))、鋪道蚊屬(脅謹(jǐn)o"w附spp.)(例如鋪道議(J^fl附on.w附cfl邵/似柳)(鋪道議(PavementAnt)))、紅議屬(Af3;r附/caspp.)(侈'如d、紅蚊(A(vr附/cflrw6ra)(紅議(RedAnt)))、議屬(Fof7w/cflspp.)(木蚊(woodants))、舉腹議屬(CVe附"^gflsterspp.)(伊J:ft口Oe附a^^fls^f"http://weo/"似(AcrobatAnt))、虹臭蚊屬(/nV/。附j(luò);r柳exspp.)(傘j如^尹蚊(/nV/o附j(luò)r柳d)(阿才艮廷議(ArgentineAnt)))、大頭議屬(i^cV/o/espp.)(大頭議(BigHeadedAnts))和Z)fl砂柳W/〃flspp.(例ft口Z)fl砂附w&7/fl0c"V/e/ito//s(VelvetAnt));白蚊類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白議科(Termitidae))比如但不限于暗白蚊屬(爿柳&^tw^sspp.)(例如寸弗羅里達(dá)暗白議(爿附/^r附es/7onV^ws/s)(寸弗羅里達(dá)暗翅土白議(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白蚊屬(ifC/c"http://"/7^sspp.)(例如黃肢散白蚊(iW/cw//^/7W^s_/7flv//;^s")(東方土白蚊(theeasternsubterraneantermite))、iC/cM/fY^7w^s/1^s/7^Y/s(西方土白議(WesternSubterraneanTermite)))、家白蚊屬(C^/^o^fTWeSSpp.)(例如家白蚊(CV/^,ef7MeS/(/7W0SWIWS)(臺灣土白蚊(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白議屬(J/ic/s&er附esspp.)(例3口小楹白議(/wc/s^ef附M附/wor)(西方干木白蚊(WesternDrywoodTermite)))和新白議屬(A^W^tm^s1spp.)(例如iV(^&f7Mescowwexws(森林白蟻(ForestTreeTermite)))，并且最優(yōu)選德國蟑螂(德國小蠊)。59.根據(jù)權(quán)利要求14、18或56-58中任一項(xiàng)的用途，其中使所述昆蟲和/或蜘蛛類動物生長延遲、麻痹、使其不育或者被殺傷。60.防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的方法，其包括向昆蟲和/或蜘蛛類動物施用如權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器，其中所述雙鏈RNA能通過RNA干擾下調(diào)至少一種昆蟲和/或蜘蛛類動物基因的表達(dá)。61.權(quán)利要求60的方法，其中施用多種如權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器。62.權(quán)利要求61的方法，其中所述的多種如權(quán)利要求25-34中定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器被依次施用，以降低有害生物獲得抗性的可能性。63.根據(jù)權(quán)利要求60-62中任一項(xiàng)的方法，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包含居室昆蟲、外寄生物和涉及公眾健康和衛(wèi)生的昆蟲和/或蜘蛛類動物，優(yōu)選蠅、葉螨、薊馬、壁虱、家禽紅螨、螞蟻、蟑螂、白蟻、蟋蟀包括家蟋蟀、衣魚、書虱、甲蟲、蠼螋、蚊和跳虱。64.根據(jù)權(quán)利要求60-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述昆蟲和/或蜘蛛類動物包括蟑埤(蜚蠊目(Blattodea))比如但不限于小蠊屬(別fl"e〃flspp.)(例如，德國小蠊(5/"^〃flgw/mm/c")(德國蟑榔))、大蠊屬(戶m》/"w"flspp.)(例如美洲大蠊(Periplanetaamericana)(美洲蟑螂)和澳洲大蠊(Periplanetaaustraliasiae)(澳洲蟑螂))、蜚蠊屬(5/""aspp.)(例如東方蜚蠊(丑/"rt")(東方蟑螂))和蠊屬(AM/;"/"spp.)(例如褐帶蠊(Supellalongipalpa)(褐帶蟑螂)；螞蚊(蚊總科(Formicoidea))比如但不限于火蟻屬(5Wdio/7sZsspp.)(例如入侵紅火議(5V/cwo/;s7s/wv/c似)(紅火議))、'J、家蚊屬(Afowowior/MWspp.)(例如法老小家議(Mo腳腳n'謂/7Aflra卵/s)(法老蚊(PharaohAnt))、弓背議屬(Cfl柳/7o/iotospp.)(例如弓背議屬(C函/7ow幽sspp)(木匠蚊(CarpenterAnts))、毛蚊屬(/固7/sspp.)(例如黑毛議(lasiusniger)(小黑蚊(SmallBlackAnt)))、鋪道議屬(rcra/woWw/wspp.)(例如4甫道蚊(T^"fl附or/M附cfles/^Yw附)(4煮道議(PavementAnt)))、紅蚊屬(Afj;r附z'cflspp.)(合j如d、紅蚊(Afj;r/w/cflrwZ^fl)(紅議(RedAnt)))、議屬(/^簡/cflspp.X木議(woodants))、舉腹議屬(CVe柳"f。gfls^spp.)(例如Or柳fl^^fl欲r//weo/"似(AcrobatAnt))、虹臭議屬(/nV/o附F附exspp.)(例如伊議(/r/fl^附F柳^cAw附///51)(阿根廷議(ArgentineAnt)))、大頭議屬(i^e/rfo/espp.)(大頭議(BigHeadedAnts))和D"s戸w"7/flspp.(例ft口/)fl矽柳M&'〃"oc"V/e"似/Zs1(VelvetAnt));白議類(termites)(等翅目(Isoptera)和/或白蟻科(Termitidae))比如但不限于暗白蚊屬(y4附z7^7wmspp.)(例ft口寸弗羅里達(dá)暗白議(^4柳/^r附es/ZowV/ewsis1)(4弗羅里達(dá)暗翅土白蚊(Floridadark-wingedsubterraneantermite)))、散白蚊屬(Spp.)(例如黃肢散白蚊(iC/CM//^f7W^S/7flV,》c51)(東方土白議(theeasternsubterraneantermite))、WC/cm//^7w^s/^s/7wms(西方土白議(WesternSubterraneanTermite)))、家白議屬(0/7^7&f7W^SSpp.)(例長口家白議(CV/7^^er附e51/bf附0SWIW5")(臺灣土白議(FormosanSubterraneanTermite)))、楹白蚊屬(/M".si.&f附^sspp.)(例如小楹白蚊(/""si&fTM^s柳/wor)(西方干木白議(WesternDrywoodTermite)))和新白議屬(TV^^^twcs1spp.)(例i口7Ve0&r附^scowwejcws(森林白議(ForestTreeTermite)))。65.根據(jù)權(quán)利要求15-16或6-62中任一項(xiàng)的方法，其中使所述昆蟲和/或蜘蛛類動物生長延遲、麻痹、使其不育或者被殺傷。66.用于權(quán)利要求60-65中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒，其包含如權(quán)利要求25-34中定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物和/或如權(quán)利要求13中定義的室或誘捕器以及施用說明，其中所述雙鏈RNA能通過RNA干擾下調(diào)至少一種有害生物基因的表達(dá)。67.權(quán)利要求64的試劑盒，其包含多種如權(quán)利要求25-34中定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物，其中每種雙鏈RNA能通過RNA干擾下調(diào)至少一種有害生物基因的表達(dá)。68.權(quán)利要求67的試劑盒，其中所述的多種如權(quán)利要求25-34中定義的RNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求35中定義的DNA構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求36中定義的表達(dá)構(gòu)建體和/或如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞和/或如權(quán)利要求42-54中任一項(xiàng)定義的組合物纟皮順序地應(yīng)用，以降低有害生物獲得抗性的可能性。69.防治蟑埤有害生物的方法，其包括向蟑埤施用RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與編碼原肌球蛋白、HMG輔酶A合成酶基因或肌動蛋白5C基因的一部分核普酸序列互補(bǔ)的核普酸序列。70.根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所述的至少一個(gè)雙鏈區(qū)的至少一條鏈包含下述任一核酸分子的至少17、18、19、20、21個(gè)或者更多個(gè)核苷酸，所述核酸分子包含如SEQIDNOl、4、6、7、9、10、65-70、71-79、11、16、17、19、20、80-87、21、26、27、29、30、88-93、31、36、37、39、40、94-108、180、181、41、43、44、47、48、109-147、182-187、49、51、52、55、56、148-150、57、63、64、151-179和188-200中任一序列所示的核苷酸序列或者其互補(bǔ)序列。71.根據(jù)權(quán)利要求23、24、69或者70中任一項(xiàng)的方法，其中所述蟑螂有害生物選自屬于包含以下屬的組的物種小蠊屬(別《&//")、大蠊屬(尸m》taeto)、蜚蠊屬(B/fl加)和蠊屬(5"w/;e〃fl)。72.根據(jù)權(quán)利要求23、24或69-71中任一項(xiàng)的方法，其中所述蟑埤有害生物選自以下組，所述的組包含德國蟑埤(德國小蠊(別《"http://G^f7Mfl/l/Cfl))、美'洲蜂鄭(美洲大嫌(尸^7》/fl/lCfl))、澳洲蟑螂(澳洲大蠊(尸en》^me似"M"m/fVw/"e))、東方蟑螂(東方蜚蠊(必/Wto。"V她to))和褐帶蟑螂(褐帶蠊(5wpe〃fl))。73.蛋白質(zhì)，其包含如SEQIDN02、12、22或32任一序列所示的氨基酸序列或者直系同源蛋白質(zhì)，所述直系同源蛋白質(zhì)具有來自另外昆蟲和/或蜘蛛類動物物種的保守氨基酸序列。74.權(quán)利要求73的蛋白質(zhì)，其中所述直系同源物與如SEQIDNO2、12、22或32任一序列所示的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列一致性。75.用于產(chǎn)生權(quán)利要求2-6或25-34中任一項(xiàng)之RNA構(gòu)建體的方法，其包括在允許所述RNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求10或37-39中任一項(xiàng)定義的宿主細(xì)胞。76.權(quán)利要求75的方法，其還包括純化所述RNA構(gòu)建體。全文摘要本發(fā)明描述了新的不基于化合物的防治昆蟲和/或蜘蛛類動物的方法。本發(fā)明人已首次鑒定了新的RNAi靶標(biāo)，其能夠有效地防治昆蟲和/或蜘蛛類有害生物群體。由此，本發(fā)明提供有關(guān)新靶標(biāo)的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明還提供包含用于在昆蟲中介導(dǎo)RNAi的雙鏈RNA區(qū)的RNA構(gòu)建體、DNA構(gòu)建體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和組合物，其利用RNAi來防治昆蟲和/蜘蛛類動物。最后，本發(fā)明還提供所述的構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞和組合物在防治昆蟲和/或蜘蛛類動物群體中的用途以及適用于基于RNAi來防治昆蟲和/或蜘蛛類有害生物的方法的試劑盒。文檔編號C12N15/113GK101213301SQ200680024099公開日2008年7月2日申請日期2006年5月31日優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日發(fā)明者蒂圖斯·揚(yáng)·卡萊塔申請人:德福根有限公司