專利名稱：抗il-6抗體、組合物、方法及應(yīng)用的制作方法
抗IL-6抗體、組合物、方法及應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及特異于至少一種IL-6蛋白或其片段的包括特定部分 或變體的抗體，以及抗獨(dú)特型抗體，和編碼上述抗IL-6抗體的核酸， 互補(bǔ)核酸，載體，宿主細(xì)胞，及其制備和使用方法，包括治療配方、
給藥和裝置。
背景技術(shù)：
IL-6是一種由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生和分泌的多效性促炎癥細(xì)胞因 子，最值得注意的是抗原呈遞細(xì)胞、T和B細(xì)胞。IL-6涉及不同活性， 例如B細(xì)胞生長和分化、T細(xì)胞活化、紅細(xì)胞生成作用、破骨細(xì)胞活 化、角質(zhì)形成細(xì)胞生長、神經(jīng)元生長以及肝細(xì)胞活化。IL-6結(jié)合跨膜 或可溶性IL-6R并通過為一些其他細(xì)胞因子所共有的gpl30傳導(dǎo)信 號。
如在全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤以及淋巴增生性障礙中所顯 示的，IL-6在B細(xì)胞異常中起重要作用。類似地，IL-6還涉及諸如類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的自身免疫性和炎性疾病的發(fā)病機(jī)理。近 來，間接證據(jù)暗示IL-6與慢性阻塞性肺病以及II型糖尿病中的胰島 素抵抗力有關(guān)。在免疫系統(tǒng)中IL-6具有促炎癥反應(yīng)和抗炎作用，表明 該細(xì)胞因子可能在調(diào)節(jié)對疾病的生理反應(yīng)中起主要作用。因此，在多 種疾病領(lǐng)域靶向IL-6可潛在地提供治療益處。
已在多種疾病中觀察到IL-6產(chǎn)生的增加，包括阿爾茨海默氏 病、諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫性疾病、炎癥、心肌梗塞、佩吉 特氏病、骨質(zhì)疏松、實體瘤(腎細(xì)胞癌)、前列腺癌和膀胱癌、神經(jīng)系 統(tǒng)癌癥以及B-細(xì)胞惡性腫瘤(如Castdeman氏病、某些淋巴瘤、慢性 淋巴細(xì)胞性白血病以及多發(fā)性骨髓瘤)。研究表明IL-6與許多種這些 疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，特別是與癌癥的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，因此阻斷IL-6 應(yīng)會轉(zhuǎn)化為臨床益處。
已開發(fā)了鼠、嵌合以及其他非人抗IL-6抗體；然而，它們可能受 限于其效力、有效性，經(jīng)?？赡苡|發(fā)而不能接受的免疫應(yīng)答(即免疫原性)和/或需要高劑量(參見Trikha等，Clin. Can. Res. 9， 4653-4665， Oct.
2003，在此并入作為參考)。例如，含有非人部分的抗體常常在人中產(chǎn) 生免疫應(yīng)答。因此，重復(fù)施用抗體并不適合作為治療，而且免疫復(fù)合 物介導(dǎo)的從循環(huán)中清除抗體會減少抗體的效力/有效性。血清病和過敏 反應(yīng)是兩種由于重復(fù)施用具有非人部分的抗體所引起的代表性病 癥。在這點(diǎn)上，需要具有較小免疫原性可能性的，即人更可容忍的， 更確切地說是更有效的抗IL-6抗體，使得與先前所使用的抗IL-6抗 體相比，所需要的劑量更小。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了分離的人工程化抗IL-6抗體(也稱為IL-6抗體)、免 疫球蛋白、其片段、切割產(chǎn)物和其他特定部分和變體，以及抗IL-6抗 體組合物，IL-6抗獨(dú)特型抗體，編碼核酸或互補(bǔ)核酸、栽體、宿主細(xì) 胞、組合物、配方、裝置、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物以及制備和使用
它們的方法。
在一方面，本發(fā)明提供了包含與編碼特定抗IL-6抗體或抗獨(dú)特型 抗體的多核苷酸互補(bǔ)或雜交的分離的核酸分子，所述抗體包含至少一 種其特定序列、結(jié)構(gòu)域、部分或變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含所述 抗IL-6抗體核酸分子的重組載體、含有上述核酸和/或重組栽體的宿 主細(xì)胞，以及制備和/或利用上述抗體、核酸、載體和/或宿主細(xì)胞的 方法。
本發(fā)明還提供了至少一種用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)至少一種抗IL-6 抗體或IL-6抗獨(dú)特型抗體的方法，包括在其中至少一種抗IL-6抗體 以可檢測和/或可回收的量表達(dá)的條件下培養(yǎng)在此所述的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了至少一種組合物，包含(a)分離的抗IL-6抗體編 碼核酸和/或在此所述的抗體；(b)適合的和/或藥學(xué)上可接受的載體或 稀釋劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種在細(xì)胞、組織、器官、動物或患者 中和/或在本領(lǐng)域已知的和/或在此所述的有關(guān)病癥之前、之后或期 間，用于施用治療有效量以調(diào)節(jié)或治療至少一種與IL-6有關(guān)的病癥的 抗IL-6抗體方法或組合物。
本發(fā)明還提供了至少 一種遞送治療或預(yù)防有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗IL-6抗體的組合物、裝置和/或方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了至少一種在細(xì)胞、組織、器官、動物或患者 中和/或在本領(lǐng)域已知的和/或在此所述的有關(guān)病癥之前、之后或期
間，用于診斷至少一種與IL-6有關(guān)的病癥的抗IL-6抗體方法或組合物。
本發(fā)明還提供了至少一種用于根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗IL-6抗 體診斷的遞送組合物、裝置和/或方法
還提供了一種醫(yī)療裝置，包含至少一種本發(fā)明的分離的哺乳動物 抗IL-6抗體，其中該裝置適合于接觸或施用至少 一種抗IL-6抗體、IL-6 抗獨(dú)特型抗體、核酸分子、化合物、蛋白和/或組合物。
還提供的是一種用于人類藥物或診斷應(yīng)用的產(chǎn)品，包含包裝材料 和含有溶液或凍千形式的至少一種本發(fā)明的分離的抗IL-6抗體的容 器。該產(chǎn)品可任選地具有作為遞送裝置或系統(tǒng)組成部分的容器。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所有在此描述的發(fā)明。
附圖簡述


圖1顯示了人工程和嵌合抗IL-6抗體與IL-6/IL-6R復(fù)合物的結(jié)合。
圖2顯示了本發(fā)明的人工程化抗IL-6抗體的結(jié)合表位。
圖3顯示了通過ELISA所測定的人工程化抗IL-6抗體抑制IL-6 刺激的U937細(xì)胞的MCP-1分泌。
圖4顯示了通過ELISA所測定的人工程化抗IL-6抗體抑制IL-6 和IL-1(3刺激的H印G2細(xì)胞的SAA分泌。
圖5A和5B顯示了通過經(jīng)由凝膠電泳所示的蛋白質(zhì)印跡分析所測 定的人工程化抗IL-6抗體阻斷IL-6介導(dǎo)的stat3磷酸化。
圖6顯示了人工程和嵌合抗IL-6抗體抑制Balb/C小鼠中人IL-6-誘導(dǎo)的SAA產(chǎn)生。
圖7顯示了在NZB/WF1小鼠中抗IL-6mAb抑制抗dsDNA自身 抗體產(chǎn)生。
圖8A顯示了在存在或不存在人工程化抗IL-6抗體下，IL-6對胰 島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化的影響。
圖8B顯示了在存在或不存在人工程化抗IL-6抗體下，IL-6對胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化的影響的蛋白質(zhì)印跡分析。
圖9顯示了實施例3中所述的ELISA結(jié)合測定結(jié)果。
圖IO顯示了實施例3中所述的使用IL-6依賴細(xì)胞系的抗增殖測
定結(jié)果。
圖IIA顯示了在用胰島素、IL-6蛋白和抗IL-6抗體處理的大鼠 肝細(xì)胞中PI3激酶活化。
圖IIB顯示了在大鼠肝細(xì)胞中用于研究PI3激酶活化的對照。
圖12A顯示了 IL-6對與胰島素誘導(dǎo)的IR磷酸化有關(guān)的大鼠肝細(xì) 胞中信號傳導(dǎo)的影響。
圖12B顯示了 IL-6對與胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化有關(guān)的大鼠肝細(xì) 胞中信號傳導(dǎo)的影響。
圖13A顯示了在用抗IL-6抗體處理后DIO小鼠中的葡萄糖水平。
圖13B顯示了在用抗IL-6抗體處理后DIO小鼠中的胰島素水平。 圖13C顯示了在用抗IL-6抗體處理后DIO小鼠中的穩(wěn)態(tài)模型評
價(HOMA)指數(shù)。
圖14A-F顯示了在用抗IL-6抗體處理前后的脂質(zhì)水平。
圖15顯示了對于腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗(ipGTT)，用抗IL-6mAb
處理小鼠的時間表。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了分離的、重組的和/或合成的抗IL-6人工程抗體和 針對其的IL-6抗獨(dú)特型抗體，以及組合物和包含至少一種編碼至少一 種抗IL-6抗體或抗獨(dú)特型抗體的多核苷酸的編碼核酸分子。本發(fā)明進(jìn) 一步包括，但不限于制備和使用上述核酸和抗體以及抗獨(dú)特型抗體的 方法，包括診斷和治療組合物、方法和裝置。
在此使用的"抗IL-6抗體"、"IL-6抗體"、"抗IL-6抗體部 分"或"抗IL-6抗體片段"和/或"抗IL-6抗體變體"等包括任何含 有包含至少一部分的免疫球蛋白分子的分子的蛋白或肽，例如但不限 于重鏈或輕鏈的至少一個互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重 鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構(gòu)架區(qū)、或其任何部分、或IL-6 受體或結(jié)合蛋白的至少一部分，其可摻入本發(fā)明的抗體中。這樣的抗體任選地進(jìn)一步影響特異性配體，例如但不限于這樣的抗體在體外、 原位和/或體內(nèi)調(diào)節(jié)、減少、增加、對抗、激動、減輕、緩解、阻斷、
抑制、消除和/或干擾至少一種IL-6活性或結(jié)合、或IL-6受體活性或 結(jié)合的情況。作為非限制性的例子，本發(fā)明適合的抗IL-6抗體、特定 部分或變體可結(jié)合至少一種IL-6分子或其特定部分、變體或結(jié)構(gòu)域。 適合的抗IL-6抗體、特定部分或變體還可任選地影響至少一種IL-6 活性或功能，例如但不限于RNA、 DNA或蛋白合成，IL-6釋放，IL-6 受體信號傳導(dǎo)，膜IL-6切割，IL-6活性，IL-6產(chǎn)生和/或合成。
術(shù)語"抗體"進(jìn)一步意在包括抗體、消化片段、特定部分及其變 體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其特定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/ 或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括結(jié)合哺 乳動物IL-6的抗原結(jié)合片段。例如，能結(jié)合IL-6或其部分的抗體片 段包括但不限于為本發(fā)明所涵蓋的Fab(如通過木瓜蛋白酶消化的)、 Fab'(如通過胃蛋白酶消化并部分還原的)和F(ab')2(如通過胃蛋白酶消 化的)、facb(如通過纖溶酶消化的)、pFc'(如通過胃蛋白酶或纖溶酶消 化的)、Fd(如通過胃蛋白酶消化、部分還原及重聚合的)、Fv或scFv(如 通過分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的)片段(參見如Colligan， Immunology,同上)。
可利用本領(lǐng)域已知的和/或在此所述的酶切割、合成或重組技術(shù)產(chǎn) 生上述片段。還可利用其中已將一個或多個終止密碼子導(dǎo)入天然終止 位點(diǎn)上游的抗體基因產(chǎn)生多種截短形式的抗體。例如，可設(shè)計編碼 F(ab')2重鏈部分的組合基因以包括編碼CH,區(qū)和/或重鏈鉸鏈區(qū)的 DNA序列。可通過常規(guī)技術(shù)化學(xué)交聯(lián)不同的抗體部分，或可利用基因 工程技術(shù)將不同的抗體部分制備為鄰接的蛋白。
在此使用的術(shù)語"人工程抗體"是一種具有至少完整的人構(gòu)架區(qū) 和恒定區(qū)(C。 Ch區(qū)(如Ch1、 Ch2、 CH3)和鉸鏈區(qū))以及來源于抗原結(jié) 合抗體的CDRs的抗體。完整的人構(gòu)架區(qū)包含相應(yīng)于人種系序列以及 具有體細(xì)胞突變的序列的構(gòu)架區(qū)。CDRs可來源于一種或多種在上下 文任何抗體構(gòu)架區(qū)中結(jié)合IL-6的CDRs。例如，本發(fā)明的人工程抗體 的CDRs可來源于在上下文小鼠抗體構(gòu)架區(qū)中結(jié)合IL-6的CDRs，接 著被工程化以在上下文完整的人構(gòu)架區(qū)中結(jié)合IL-6。通常，人工程抗 體在人中是基本上無免疫原性的。類似地，命名為靈長類動物(猴、狒狒、黑猩猩等)、嚙齒動物(小 鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠等)以及其他哺乳動物的抗體指上述種、亞 屬、屬、亞科和科特異性抗體。此外，嵌合抗體可包括任何上述的組 合。相對于未修飾的抗體，這樣的改變或變化任選地且優(yōu)選地保留或 減少人或其他物種中的免疫原性。因此，人工程抗體不同于嵌合或人 源化抗體。
要指出的是可通過能表達(dá)功能重排的人或人工程免疫球蛋白(如 重鏈和/或輕鏈)基因的非人動物或原核或真核細(xì)胞產(chǎn)生人工程抗體。 此外，當(dāng)人工程抗體為單鏈抗體時，其可包含天然人抗體中不存在的
連接肽。例如，F(xiàn)v可包含連接肽，如連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的 2個-約8個甘氨酸或其他氨基酸殘基。這樣的連接肽被認(rèn)為是人來源的。
還可使用單克隆、優(yōu)選人、人工程或人源化抗體的雙特異性、異 種特異性、異種偶聯(lián)(heteroconjugate)或類似的抗體，這些抗體具有針 對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的抗體。此際， 一種結(jié)合特異性針 對至少一種IL-6蛋白，而另一種結(jié)合特異性則針對任何其他抗原。用 于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，基于兩個免疫 球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)重組產(chǎn)生雙特異性抗體，其中兩條重鏈具 有不同特異性(Milstein和Cuello， Nature 305:537 (1983))。由于免疫J求 蛋白重鏈和輕鏈的隨才幾組合，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤(quadromas))產(chǎn) 生可能的10種不同抗體分子的混合物，僅有一種混合物具有正確的 雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行正確分子的純化。類似的 方法披露于如WO 93/08829， US專利號6210668、 6193967、 6132992、 6106833、 6060285、 6037453、 6010902、 5989530、 5959084、 595卯83、 5932448、 5833985、 5821333、 5807706、 5643759、 5601819、 5582996、 5496549、 4676980， WO 91/00360, WO 92/00373， EP 03089, Traunecker 等，EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh等，Methods in Enzymology 121:210 (1986)中，各自在此完全并入作為參考。
用于本發(fā)明方法和組合物中的抗IL-6抗體可任選地具有與IL-6 高親和力結(jié)合以及，任選并優(yōu)選地具有低毒性的特性。特別是，其中 單個組分例如可變區(qū)、恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū)，單獨(dú)地和/或共同地、任選并 優(yōu)選地具有低免疫原性的本發(fā)明的抗體、特定片段或變體在本發(fā)明中是有用的。可用于本發(fā)明中的抗體任選地具有持續(xù)治療患者 一段時間 有著可測量的癥狀緩解以及低和/或可接受的毒性的能力的特性。低或 可接受的免疫原性和/或高親和力以及其他適合的特性，可有助于所獲
得的治療結(jié)果。在此"低免疫原性，，定義為在用抗IL-6抗體治療的患 者中，對于抗IL-6抗體，可滴定水平的抗體的發(fā)生率存在于少于25% 的在治療期間對于推薦的病程使用推薦的劑量治療的患者中，優(yōu)選地 存在于少于10%的患者中。
本發(fā)明分離的核酸可用于產(chǎn)生至少一種抗IL-6抗體或其特定變 體，所述至少一種抗IL-6抗體或其特定變體能用于在細(xì)胞、組織、器 官或動物(包括哺乳動物和人)中度量或起作用以對至少一種IL-6病 癥，選自^f旦不限于至少一種免疫病癥或疾病，心血管病癥或疾病，傳 染性、惡性和/或神經(jīng)病癥或疾病，或其他已知的或特定的IL-6有關(guān) 病癥起診斷、監(jiān)測、調(diào)節(jié)、治療、緩解、幫助預(yù)防發(fā)病率或減輕癥狀。
這樣的方法可包括施用有效量的包含至少一種抗IL-6抗體的組 合物或藥物組合物于在癥狀、效應(yīng)或機(jī)制中需要這樣的調(diào)節(jié)、治療、 緩解、預(yù)防或減輕細(xì)胞、組織、器官、動物或患者。有效量可包括約 0.001-500 mg/kg/單次(如推注)、多次或連續(xù)施用的量，或達(dá)到0.01-5000 ng/ml血清濃度/單次、多次或連續(xù)施用的血清濃度，或當(dāng)使用已 知方法施用并測定時，其中任何有效范圍或值，所述方法為在此所迷 的或相關(guān)領(lǐng)域已知的方法。
本發(fā)明的抗體一產(chǎn)生和形成
可任選地通過本領(lǐng)域眾所周知的細(xì)胞系、混合的細(xì)胞系、無限增 殖化細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞的克隆種群產(chǎn)生至少 一種本發(fā)明的抗IL-6 4元體。參見長口Ausubel，等，編，
Current Protocols in Molecular Bioogy， John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1卯7-2001); Sambrook,等，Molecular Cloning:八Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow和Lane' Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (l訴9); Colligan,等，編，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligem等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY' NY, (1997-2001)。
可產(chǎn)生針對適當(dāng)?shù)拿庖咴钥乖绶蛛x的IL-6蛋白和/或其部 分(包括合成分子，例如合成肽)的特異于人IL-6蛋白或其片段的人工程抗體?？深愃频禺a(chǎn)生其他特異的或一般的哺乳動物抗體。可利用任 何適合的技術(shù)制備免疫原性抗原以及產(chǎn)生單克隆抗體。
在一種方法中，通過將適合的無限增殖化細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞 系，例如4旦不限于Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1， NS2， AE-1, L.5， L243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI， Sp2 SS1， Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-l, JURKAT. WEHl K-562, COS, RAJI，NIH3T3,HL^0,MLA144,NAMALWA,NEURO2A等，或雜合骨髄瘤 (heteromyelomas)，其融合產(chǎn)物，或任何衍生于其中的細(xì)胞或融合細(xì) 胞，或本領(lǐng)域已知的任何其他適合的細(xì)胞系)(參見如www.atcc.org, www.lifetech.com等)與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合制備雜交瘤，所述抗體產(chǎn)生 細(xì)胞例如但不限于分離的或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃體細(xì)胞或 其他免疫細(xì)胞或含有B細(xì)胞的細(xì)胞，或任何其他作為內(nèi)源或異源核酸 表達(dá)重鏈或輕鏈恒定區(qū)或可變區(qū)或構(gòu)架區(qū)或CDR序列的細(xì)胞，所述 內(nèi)源或異源核酸如重組或內(nèi)源的病毒、細(xì)菌、藻類、原核生物、兩棲 動物、昆蟲、爬4亍動物、魚類、哺乳動物、嚙齒動物、馬、羊(ovine)、 山羊、綿羊(sheep)、靈長類動物、真核動物基因組DNA、 cDNA、rDNA、 線粒體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、 hnRNA、 mRNA、 tRNA、 單鏈體、雙鏈體或三鏈體、雜合體等或任何它們的組合。參見如 Ausubel， 同上和Colligan， Immunology, 同上，第2章，在此完全并 入作為參考。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞還可獲得自業(yè)已用目的抗原免疫的人或其他適合 的動物的外周血或優(yōu)選地獲得自脾或淋巴結(jié)。任何其他適合的宿主細(xì) 胞也可用于表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體、其特定片段或變體的異源或內(nèi)源 核酸?？衫眠x擇性培養(yǎng)條件或其他適合的已知方法分離并通過有限 稀釋或細(xì)胞分選或其他已知方法克隆融合細(xì)胞(雜交瘤)或重組細(xì)胞。 可通過適合的測定法(如ELISA)選擇產(chǎn)生具有期望特異性的抗體的細(xì) 胞。
還可使用用于工程化或人源化非人或人抗體的方法并為本領(lǐng)域 眾所周知。人源化或工程抗體可具有一個或多個非人源氨基酸，如但 不限于小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物或其他哺乳動物。這些非人 氨基酸殘基為通常稱為"輸入(import)"殘基的殘基所取代，其通常獲 得自已知人序列的"輸入"可變區(qū)、恒定區(qū)或其他區(qū)域。已知的人Ig序列披露于，如WWW. ncbi.n!m.nih.gov/節(jié)加z/query.fcgi; www. ncbi,nih,gov/igbl站t; www.
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這樣的輸入序列可用于降低免疫原性或減少、增加或改變結(jié)合、 親和力、結(jié)合速率(on-rate)、解離速率(off-rate)、親合力、特異性、半 衰期或任何其他本領(lǐng)域已知的適合的特性。 一般而言，CDR殘基是直 接或最實質(zhì)地涉及影響抗原結(jié)合。因此，當(dāng)可變區(qū)或恒定區(qū)的非人序 列可為人或其他氨基酸所取代時，要保持部分或全部的非人或人CDR 序列。
抗體還可任選地被人源化或工程化或人抗體工程化，同時保留對 抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為實現(xiàn)該目的，可任選地 通過利用親本、工程化和人源化序列的三維模型，分析親本序列和不 同概念上的人源化和工程化產(chǎn)物的方法制備人源化(或人)或工程抗 體。三維免疫球蛋白模型是通?？色@得的且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？色@得圖解并顯示所選擇的候選免疫球蛋白序列的大概三維構(gòu)象 結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。對這些顯示內(nèi)容的檢查使得對殘基在候選免疫球
蛋白序列功能中可能的作用的分析，即殘基影響候選免疫球蛋白與其 抗原結(jié)合的能力的分析得以進(jìn)行。這樣，可由共有和輸入序列選擇并
組合構(gòu)架區(qū)(FR)殘基，以致獲得期望的抗體特性，例如增加的靶抗原 親和力。
此外，本發(fā)明的人工程IL-6抗體可包含人種系輕鏈構(gòu)架區(qū)。在特
定的實施方案中，輕鏈種系序列選自人VK序列，包括但不限于 Al， Alt), All, A14， A17, A18, A19, A2, A20, A23， A26, A27, A3,
A30, A5, A7, B2， B3, LI, L10, Ul， L12, U4, L15, L16, L18, L19, L2, L20， L22,
L23, L24, L25, U/18a^ L5, L6, L8, L9,01,011,012,014' 018,02,04，和08 。
在一些實施方案中，輕鏈人種系構(gòu)架區(qū)選自 Vl-11, Vl-13, Vl-16, Vl-17, Vl-18, Vl-19, Vl-2, Vl-20, Vl-22, Vl-3' VM, VI-
5' Vl-7, Vl-9， V2-1' V2-11, V2-13, V2-14, V2-15' V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-
8' V3-2, V3-3, V3-4, V4-l， V4-2, V4-3, V4-4, V4>6， V5-1, V5-2， V5-4，和V5-6 。
參見PCT WO 2005/005604對不同種系序列的描述。
在其他的實施方案中，本發(fā)明的人工程IL-6抗體可包含人種系重
鏈構(gòu)架區(qū)。在特定的實施方案中，重鏈人種系構(gòu)架區(qū)選自VH1-18, VH1-2, VH1-24, VHl-3, VH145, VH1>46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30' VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3 43, VH3^48' VH349, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4 34, VH4-39'VH4-4, VH4"59,VH4~61，VH5-51,VH6-1，和VH7-81。參見 pc丁 WO
2005/005604對不同種系序列的描述。
在特定的實施方案中，輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)包含構(gòu)架區(qū)或 至少一部分的構(gòu)架區(qū)(如含有2或3個亞區(qū)，例如FR2和FR3)。在一 些實施方案中，至少FRL1、 FRL2、 FRL3或FRL4完全是人的。在其 他的實施方案中，至少FRH1、 FRH2、 FRH3或FRH4完全是人的。 在某些實施方案中，至少FRL1、 FRL2、 FRL3或FRL4是種系序列(如 人種系)或包含用于特定構(gòu)架區(qū)的人共有序列(易于獲得自上述已知的 人Ig序列的來源處)。在其他的實施方案中，至少FRH1、 FRH2、 FRH3 或FRH4是種系序列(如人種系)或包含用于特定構(gòu)架區(qū)的人共有序 列。在優(yōu)選的實施方案中，構(gòu)架區(qū)是人構(gòu)架區(qū)(如下表13和14中所示的人構(gòu)架區(qū))。在某些實施方案中，構(gòu)架區(qū)包含SEQ IDNOS: 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112或其組合。
可使用任何已知的方法進(jìn)行本發(fā)明抗體的人源化或工程化，例如 但不限于如下描述的那些方法
Winter (〗oncs等，Nature 321:522 (1986〉； Riech邁咖等，Nature 332:323 (1988); Verhoeyen等，Science 239:1534 (1988))， Sims等，J, Imraunol. 151: 2296 (l卯3); Chothia和L k, J. Mol, Biol. 196:901 (1987), Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta等，J. Immunol. 151:2623 (1993), US 專利號5723323， 5976862， 5824514'5817483,5814476,5763192， 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023,6180370, 5693762' 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134,咖2/01755; WO90/14443,
WO90/14424,WO90/14430,BP229246,包括其中所引用的參考文獻(xiàn)在內(nèi)，各自
在此完全并入作為參考。
在一些實施方案中，抗體包含改變的(如突變的)Fc區(qū)。例如，在 某些實施方案中，已改變Fc區(qū)以減少或增加抗體效應(yīng)子功能。在某 些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是選自I gM、 IgA、 IgG、 IgE的同種型，或其他
同種型。
擇一地或此外，可利用改變IL-6結(jié)合分子Fc區(qū)的Clq結(jié)合和/ 或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)功能的具有 一 個或多個額外氨基酸修飾 的組合氨基酸修飾。起始具體目的多肽可以是結(jié)合Clq并展示依賴補(bǔ) 體的細(xì)胞毒性的多肽。可對具有預(yù)先存在的Clq結(jié)合活性、任選地 進(jìn)一步具有介導(dǎo)CDC能力的多肽進(jìn)行修飾，使得這些活性的一種或 兩種得以增強(qiáng)。改變Clq和/或調(diào)節(jié)其補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性功能的氨基 酸修飾描述于例如WO0042072中，在此并入作為參考。
如上所披露的，可例如通過改變Clq結(jié)合和/或FcyR結(jié)合并因此 改變了 CDC活性和/或ADCC活性，以設(shè)計具有改變的效應(yīng)子功能的 本發(fā)明的人工程IL-6抗體Fc區(qū)。"效應(yīng)子功能"負(fù)責(zé)激活或減弱生 物活性(如受試者中的)。效應(yīng)子功能的例子包括但不限于Clq結(jié)合； 依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC); Fc受體結(jié)合；依賴抗體的細(xì)胞毒性 (ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)節(jié)等。 這樣的效應(yīng)子功能可能需要Fc區(qū)與結(jié)合區(qū)(如抗體可變區(qū))結(jié)合并能使用多種測定法(如Fc結(jié)合測定、ADCC測定、CDC測定等)進(jìn)行評估。
例如，可產(chǎn)生具有改善的Clq結(jié)合和改善的FcyRIII結(jié)合(如具有 都改善的ADCC活性和CDC活性)的人工程IL-6抗體的變體Fc區(qū)。 或者，如果期望效應(yīng)子功能減少或消除，可工程化具有減少的CDC 活性和/或減少的ADCC活性的變體Fc區(qū)。在其他的實施方案中，這 些活性中僅有一種得以增加，以及任選地，還有其他活性被減少(如產(chǎn) 生具有改善的ADCC活性，但CDC活性減少的Fc區(qū)變體，反之亦然)。
在工程化中還可導(dǎo)入Fc突變以改變它們與新生兒Fc受體(FcRn) 的相互作用，并改善它們的藥物代謝動力學(xué)特性。業(yè)已描述了具有改 善的與FcRn結(jié)合的人Fc變體集合(Shields等，(2001). High resolution mapping of the binding site on human IgGl for FcryRI， FcyRII， FcyRIII, and FcRn and design oflgGl variants with improved binding to the FcyR， J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。
另一種類型的氨基酸取代用于改變?nèi)斯こ蘄L-6抗體Fc區(qū)的糖基 化型。Fc區(qū)的糖基化通常為N聯(lián)或O聯(lián)。N聯(lián)指糖類部分連接到天 冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。O聯(lián)糖基化指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或 木糖之一連接到羥基氨基酸上，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可 以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。用于酶連接糖類部分到天冬酰 胺側(cè)鏈肽序列上的識別序列為天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨 酸，其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中任何一種這 些肽序列的存在就形成了潛在的糖基化位點(diǎn)。
例如通過缺失多肽中存在的 一個或多個糖基化位點(diǎn)，和/或添加一 個或多個多肽腫不存在的糖基化位點(diǎn)可以改變糖基化型。通過改變氨 基酸序列使之含有一個或多個上述三肽序列(用于N聯(lián)糖基化位點(diǎn))， 就能方便地實現(xiàn)添加糖基化位點(diǎn)到人工程IL-6抗體Fc區(qū)。作例證的 糖基化變體具有重鏈的殘基Asn 297的氨基酸取代。還可通過對原始 多肽序列添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或用之取代(用于O聯(lián) 糖基化位點(diǎn))進(jìn)行改變。此外，將Asn 297改變?yōu)锳la可除去一個糖基 化位點(diǎn)。
在一些實施方案中，在表達(dá)p(l,4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnT III)的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的人工程IL-6抗體，4吏得GnT III添加GicNAc 到人工程IL-6抗體上。產(chǎn)生上迷形式抗體的方法提供于WO/9954342、 WO/03011878、專利公開20030003097A1以及Umana 等，Nature Biotechnology, 17:176-180， Feb. 1999。
可任選地通過免疫能產(chǎn)生如在此所述和/或本領(lǐng)域已知的人抗體 的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠、大鼠、倉鼠、非人靈長類動物 等)，產(chǎn)生人抗IL-6抗體。產(chǎn)生人抗IL-6抗體的細(xì)胞可分離自這樣的 動物，并利用適合的方法例如在此所述的方法使之無限增殖化。
可通過已知方法產(chǎn)生能產(chǎn)生與人抗原結(jié)合的人抗體的所有組成
成分的轉(zhuǎn)基因小鼠(如但不限于"油嗎等的U.S. 專利號5,770,428' 5,569,825, 5,545,806， 5'625，U6, 5,625,825,5,633,425,
5,661,016和5,789,650 ; Jakobovits等WO 98/50433,
Jakobovits等 WO 98/24893, Lonberg等 WO 98/24884, Lonberg等WO
97/13852， Lonberg等WO 94/25585, Kucherlapate等 WO 96/34096'
Kuchcrapate ^FaZ, EP 0463 151 Bl, Kucherlapate等 EP 0710 719 Al' Surani
等US.專利號5,545,807,Biugge邁咖等WO 90/04036,Bruggem抑n等EP
0438 474Bl, Lonberg等EP 0814 259 A2, Lonberg等 GB2 272 440A,
Lonberg等 Warww 368:856-859 (1994), Taylor等> J"f./mmwioZ. 6(4)579-591
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(l"。，各自在此完全并入作為參考)。
一般而言，這些小鼠包含至少一
種含有來自至少一種人免疫球蛋白基因座的DNA的轉(zhuǎn)基因，該基因
座為功能性基因重排的或可經(jīng)受功能性基因重排?？善茐幕蛉笔н@樣
的小鼠中的內(nèi)源免疫球蛋白基因座以消除動物產(chǎn)生為內(nèi)源基因所編
碼的抗體的能力。
體的篩選。該方法包括對于具有期望功能或結(jié)構(gòu)的單個成員的肽大集 合的篩選。肽展示文庫的抗體篩選是本領(lǐng)域眾所周知的。所展示的肽 序列可為3-5000個或更多個氨基酸長，通常為5-100個氨基酸長，且 經(jīng)常為約8-25個氨基酸長。除用于產(chǎn)生肽文庫的直接化學(xué)合成法之 外，已描述了一些重組DNA方法。 一種方法包括在噬菌體或細(xì)胞表 面上展示肽序列。每個噬菌體或細(xì)胞舍有編碼特定的展示肽序列的核 苷酸序列。這樣的方法描述于PCT專利
發(fā)明者A·P·瓦塞羅特, B·梁, D·J·希利, D·M·克賴特, D·M·馬奎斯, D·加德納, E·M·史密斯, J·楊, M·W·拉克, R·W·斯威特, S·H·譚, S·-J·吳, V·斯托賈諾韋-蘇蘇里, X·-Y·R·宋, Y·陳 申請人:森托科爾公司;應(yīng)用分子發(fā)展公司