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      被咖啡中的苦味分子(綠原酸內(nèi)酯)激活的人t2r受體的鑒定和用于鑒定人苦味調節(jié)劑的...的制作方法

      文檔序號:432388閱讀:1396來源:國知局
      專利名稱:被咖啡中的苦味分子(綠原酸內(nèi)酯)激活的人t2r受體的鑒定和用于鑒定人苦味調節(jié)劑的 ...的制作方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及苦味化合物的闡明,所述苦味化合物激活許多之前報 導的參與苦味感覺的T2R家族中的人G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。特別地, 本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)hT2R8、 hT2R14和hT2R54對綠原酸內(nèi)酯發(fā)生特異性 響應,所述綠原酸內(nèi)酯是至少部分形成咖啡的苦味的原因。因此,可 使用受試者T2R鑒定化合物,所述化合物調節(jié)(優(yōu)選阻斷)苦味,例 如咖啡中發(fā)現(xiàn)的苦味化合物和相關的苦味促味劑的苦味。
      更特別地,本發(fā)明顯示受試人苦味受體、其片段或變體或嵌合物 (包括其直系同源物(ortholog)、剪接變體、單核苷酸多態(tài)性(SNPS) 和基因工程改造的突變體)在用于鑒定化合物的測定法優(yōu)選基于高通 量細胞的測定法中是有用的,所述化合物調節(jié)(優(yōu)選阻斷)綠原酸內(nèi) 酯分子以及結構相關性化合物和激活此類受體的其他化合物的苦味。 可將使用這些測定法鑒定的化合物在食物、々大料或藥品中用作添加劑 以改善其味道。此外,本發(fā)明涉及為了減少或消除激活受試者T7R的
      苦味化合物而進行處理和配制的改良的食品、飲料和藥物。 相關領域描述人可識別的一種基本味覺是苦味。直至最近對苦味的生理學仍然
      知之甚少。近年來的研究已開始闡明味覺生物學(Lindemann, Naturs (2001))?,F(xiàn)在認為許多苦味化合物通過與細胞表面受體相互作用來產(chǎn) 生苦味。這些受體屬于與細胞內(nèi)G蛋白相互作用的7個跨膜結構域受 體的家族。已在人和嚙齒類動物中鑒定了稱為T2R的GPCR新家族 (Adler等人,Cell 100 (6): 693-702 (2000); Chandrashekar等人, Cell 100 (6): 703-711 (2000); Matsu議i H, Montmayeur J P, Buck LB. Nature 404 (6778): 601-4 (2000))。幾個證據(jù)線索顯示T2R介 導對苦味化合物的反應。首先,T2R基因在舌和腭上皮的味覺感覺器 細胞的亞群中特異性表達。第二,人T2R中的一種(hT2Rl)的基因位于 在人中與對苦味化合物6-正-丙基-2-硫脲嘧啶的敏感性相關的染色 體基因座中(Adler等人,(Id.) (2000))。第三,小鼠T2R中的一種 (mT2R5)的基因位于小鼠中與對苦味化合物環(huán)己酰亞胺的敏感性相關 的染色體基因座中。也顯示mT2R5可激活味導素(gustducin)(在味 覺細胞中特異性表達的G蛋白)和與苦味刺激轉導相關(Wong等人, Nature 381:796-800 (1996))。 mT2R5對味導素的激活只在對環(huán)己酰 亞胺的響應中發(fā)生(Chandrashekar等人,(Id.) U000)。因此,有人 提出mT2R家族在小鼠中介導苦味反應,而hT7R家族在人中介導苦味 反應。已鑒定了幾種作為某些苦味配體的受體的人 T2R (Chandrashekar等人,(Id.) 2000; Buf e等人,(Id.) 2002; Kim 等人Science 299, 2003; Pronin等人,Chemical Senses 29, 2004; Behrens等人,BBRC 319, 2004; Kuhn等人,J. Neuroscience 24, 2004; Bufe等人,Current Biology, 15, 2005)。也顯示各hT2R能夠結合 多種苦味配體。該假說基于這樣的事實,即hT2R家族只由24個已鑒 定的成員組成,然而人可識別數(shù)百種不同的苦味化合物。之前已報導 了hT2R的序列,其公開于Zuker等人(WO 01/18050 A2, (2001))和 Adler等人(WO 01/77676 Al (2001))的公開的PCT申請中,其兩者 在此以其全文引用作為參考。
      研究T2R功能的一個困難是這些受體不易在培養(yǎng)的哺乳動物細胞系中表達。為了提高T2R的表達,將來自良好表達的GPCR(視紫紅質) 的N末端序列附著至T2R序列(Chandrashekar等人,(Id.) 2000)。 由于可獲得的抗體的原因,該N-末端標記也使得能夠容易地監(jiān)測蛋白 表達。盡管視紫紅質標記的整合提高了 一些T2R在哺乳動物細胞系中 的表達,但它們中的許多的表達仍然不足以進行功能研究。在不同的 方法中,使mT2R5在昆蟲Sf9細胞中成功表達,然后通過使用化學GTP yS結合測定法將其用于功能研究(Chandrashekar等人,(Id.) 2000)。
      在本申請者的早期專利申請,美國系列No. 10/191, 058 (此處引 用作為參考)中,申請者發(fā)現(xiàn)了特異性激活3種不同的人T2R的配體。 此外,本申請人在2005年2月8日提交了進一步鑒定特異性結合7 種特定的人T2R的苦味配體(包括對乙酰氨基酚、雷尼替丁、 士的寧 和苯甲酸地那銨(denatonium))和相關測定法的美國臨時系列 No.60/650,555。
      然而,盡管有已報導的內(nèi)容和理解T2R成員調節(jié)苦味,但仍存在 對激活特定T2R受體的特異性配體的鑒定的需要。對不同的T2R特別 是人T2R的結合特性的更多的理解將是非常有益的,因為其將更有利 于其在選擇具有希望的味覺調節(jié)特性的化合物(即阻斷或抑制特定苦 味化合物的味道的化合物)中的用途。
      此外,在對本發(fā)明的特定關聯(lián)性中,存在對鑒定可用于抑制與咖 啡相關的苦味的化合物的特殊需要。 一方面近年來在美國和世界咖啡 的消費已顯著增加,但許多咖啡飲者的主要抱怨是許多咖啡引起了苦 味余味。因此,鑒定使咖啡展示苦味余味的化合物和/或鑒定阻斷咖啡 的苦味余味的測定法對于產(chǎn)生具有改善的可口性的咖啡是有益的。關 于這一點,已報導咖啡的烘焙與加工對咖啡中的綠原酸內(nèi)酯的形成具 有作用(Furah等人,J. Agric. Food Chem. 53 (5): 1505-13 (2005); Variyar等人,J. Agric, Food Chem. 51 (27): 7495-50 (2003))。
      發(fā)明概述由于是一原因,本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)T2R家族中的幾種受體特 別是hT2R8、hT2R14和hT2R54對咖啡中發(fā)現(xiàn)的綠原酸內(nèi)酯發(fā)生特異性 響應,所述綠原酸內(nèi)酯假定是(至少部分是)形成咖啡飲料的苦味的 原因。
      使用基于細胞的測定法獲得這些發(fā)現(xiàn),所述測定法使用在特定苦 味配體存在和不存在的情況下表達特定T2R的細胞測量T2R的活性。 特別地,如下文中更詳細描述的,在檢測細胞內(nèi)鉀濃度的變化的基于 細胞的測定中使用HEK細胞系(所述細胞系在它們的表面上表達上面 鑒定的特定T2R和進一步表達在功能上與所述T2R偶聯(lián)的嵌合G蛋 白),并發(fā)現(xiàn)所述細胞系被咖啡以及其他食物和飲料中發(fā)現(xiàn)的特定苦 味化合物(許多綠原酸內(nèi)酯分子)特異性激活,然而其他hT2R在相似 的條件下不被激活。
      因此,本發(fā)明包括這些人味覺受體在測定法(優(yōu)選高通量測定法) 中鑒定化合物的用途,所述化合物調節(jié)(優(yōu)選阻斷)綠原酸內(nèi)酯、其 衍生物和其他苦味化合物對此類受體的激活。
      此外,本發(fā)明還涉及此類受體用于鑒定咖啡和其他苦味食品以及 飲料中引起苦味的化合物的用途。
      本發(fā)明也包括測定方法,所述方法包括評價已鑒定的調節(jié)化合物 在人中的效應或其他味覺試驗的效果,以及評價已鑒定的化合物對苦 味的效應的額外步驟。此外,本發(fā)明包括已鑒定的化合物在食品、飲 料和藥物中用作香料或調味劑(taste modulator)的用途,即抑制苦 味例如與咖啡飲料和咖啡風味食物相關的苦味的用途。
      本發(fā)明的目的
      本發(fā)明的目的是鑒定阻斷化合物,所述化合物阻斷咖啡中發(fā)現(xiàn)的 綠原酸內(nèi)酯分子或激活至少一種此類T2R受體的結構上與該綠原酸內(nèi) 酯相關的化合物對hT2R8、 hT2R14或hT2R54或其片段、變體、直系同 源物或嵌合物的激活。
      本發(fā)明的明確目的是鑒定化合物,所述化合物阻斷咖啡中包含的3CoQAL(綠原酸內(nèi)酯)、結構上與其相關的、激活一種或所有此類hT2R 的化合物對hT2R58、 hT2R14和hT2R54或其片段、變體、直系同源物 或嵌合物的激活。
      本發(fā)明的另 一個明確的目的是鑒定化合物,所述化合物阻斷咖啡 中發(fā)現(xiàn)的3CQAL和4CQAL (綠原酸內(nèi)酯)或結構上與其相關的化合物 對hT2R8、 hT2R14和hT2R54的激活,所述結構上與其相關的化合物激 活至少一種此類受體。
      本發(fā)明的另一個明確的目的是鑒定化合物,所述化合物阻斷咖啡 飲料中發(fā)現(xiàn)的4FQAL (綠原酸內(nèi)酯)或結構上與其相關的化合物對 hT2R8和hT2R54的激活,所述結構上與綠原酸內(nèi)酯相關的化合物特異 性激活該受體。
      本發(fā)明的另一個明確的目的是在測定法中使用包含或表達(穩(wěn)定 地或瞬時地)hT2R8、 hT2R14或hT2R54或其片段、變體、直系同源 物、突變體或嵌合物的細胞或細胞膜鑒定化合物,所述化合物阻斷由 綠原酸內(nèi)酯和相關苦味化合物例如3CoQAL、 3CQAL和4FQAL對至少一 種所述受體的激活。
      本發(fā)明的甚至更明確的目的是在基于細胞的測定法(所述測定法 檢測細胞內(nèi)釣的變化)中使用表達與其偶聯(lián)的G蛋白(例如,Gal5、 G al6、味導素、轉導蛋白或其嵌合物例如Ga"味導素嵌合物或G^轉導 蛋白嵌合物)的細月包,優(yōu)選哺乳動物、兩棲動物或昆蟲的細胞例如 HEK293T細胞以檢測化合物,所述化合物調節(jié)(優(yōu)選阻止或抑制)咖 啡飲料中包含的綠原酸內(nèi)酯和相關化合物例如3CoQAL、 3CQAL、 4CQAL 和4FQAL對上述人味覺受體中的一種的激活。
      本發(fā)明的另一個目的是在味覺試驗優(yōu)選人味覺試驗中驗證已鑒定 的化合物調節(jié)(優(yōu)選抑制或阻斷)例如綠原酸內(nèi)酯和相關苦味化合物 例如在咖啡飲料中發(fā)現(xiàn)的所述化合物引起的苦味。
      本發(fā)明的另一個目的是,為了抑制或阻止由特異性地激活此類味 覺受體的化合物引起的苦味,將在此處描述的測定法中鑒定的化合物 用作組合物中的添加劑或調味劑。本發(fā)明優(yōu)選目的是為了阻斷含有綠原酸內(nèi)酯的食物、飲料和藥物(優(yōu)選咖啡或咖啡風味的飲料和食物)
      的苦味,使用抑制至少上面已鑒定的人T2R受體的激活的化合物。 附圖詳述


      圖1包括各種綠原酸內(nèi)酯的結構。
      圖2顯示hT2R8、 hT2R14和hT2R54對所述綠原酸內(nèi)酯中的一種 (3CoQAL)的劑量響應。
      圖3包含顯示hT2R8、hT2M4和hT2R54對圖1中描述的兩種綠原 酸內(nèi)酯3CQAL和4CQAL的特異性響應的4丐成^^實驗的結果。
      圖4包含顯示hT2R8和hT2R54以劑量依賴性的方式對圖1中描 述的另一種綠原酸內(nèi)酯4FQAL的響應的鈣成像實驗的結果。
      發(fā)明詳述
      在明確地描述本發(fā)明之前,提供下列定義。
      術語"T2R"家族包括多態(tài)性變體(polymorphic variant)、等 位基因、突變體和同源物,所述同源物(1)在大約25個氨基酸,最 優(yōu)50-100個氨基酸的窗口上具有對下文和此處引用作為參考的Zuker (Id) (2001)和Adler (Id.) (2001)的申請中公開的T2R大約30-40% 的氨基酸序列同一性,更優(yōu)選大約40、 50、 60、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 96、 97、 98或99%的氨基酸序列同一性;(2)特異性結合用包含 選自下文中公開的T2R序列和其保守性修飾的變體的氨基酸序列的免 疫原產(chǎn)生的抗體;(3)在嚴緊雜交條件下對選自對下文中公開的T2R DNA序列和其保守性修飾的變體特異性雜交(任意地,大小為至少大 約100個核苷酸;至少大約500-1000個核苷酸);(4)包含對選自下 文中公開的T2R氨基酸序列的氨基酸序列至少大約40%的同一性的序
      進;亍擴增。 "'、、,、 ,
      特別地,此類T2R包括稱為hT2R8、 hTlR14和hT2R54的味覺受體 GPCR (其具有本申請中提供的核酸序列和氨基酸序列)和其特異性結合苦味配體(即綠原酸內(nèi)酯和其衍生物例如3CQAL、 4CQAL、 3CoQAL 和4FQAL)的變體、等位基因、突變體、直系同源物和嵌合物,所述 苦味配體至少促成咖啡飲料的苦味。
      盡管T2R基因在蛋白質和DNA水平上展示顯著的序列趨異性,但 發(fā)現(xiàn)所有迄今為止分離的T2R在特定區(qū)域包含共有序列,所述共有序 列對之前在Adler等人(W0 01/77676 Al (2001)和Zuker等人W0 01/18050 A2 (兩者在此以其全文引用作為參考)中鑒定的T2R共有序 列同 一或具有所述T2R共有序列或具有對該T2R共有序列至少70-75% 的序列同一性。
      在拓樸學上,某些化學感覺GPCR具有"N末端結構域"、"細胞 外結構域"、包含7個跨膜區(qū)域的"跨膜結構域"和對應的細胞質和 細胞外環(huán)、"細胞質區(qū)域,,和"C末端區(qū)域"(參見,例如,Hoon等 人,Cell, 96:541-51 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-87 (1991))??墒褂帽绢I域技術人員已知的方法在結構上鑒定這些區(qū)域, 所述方法是例如鑒定疏水性和親水性構域的序列分析程序(參見,例如, Stryer, Biochemistry,(第3版,1988);也參見許多基于互聯(lián)網(wǎng)的
      序列分析程序中的任一種程序)。這些區(qū)域用于產(chǎn)生嵌合蛋白和用于本 發(fā)明的體外測定,例如配體結合測定。
      因而"細胞外結構域"是指從細胞膜伸出的并暴露于細胞的細胞 外表面的T2R多肽的結構域。該區(qū)域可包括暴露于細胞的細胞外表面 的"N末端結構域"和暴露于細胞的細胞外表面的跨膜結構域的細胞 外環(huán),即跨膜區(qū)域2和3之間、跨膜區(qū)域4和5之間以及跨膜區(qū)域6 和7之間的細胞外環(huán)。所述"N末端結構域"始于N末端并延伸至接 近跨膜區(qū)的起始位點的區(qū)域。這些細胞外區(qū)域用于溶性相和固相的體 外配體結合測定。此外,下面描述的跨膜區(qū)也可與細胞外區(qū)域一起或 單獨地參與配體結合,從而也用于體外配體結合測定。
      包含7個跨膜"區(qū)"的"跨膜結構域"是指位于質膜內(nèi)的T2R的 結構域,其也可包含對應的細胞質(細胞內(nèi))和細胞外環(huán),也稱為跨 膜"區(qū)"??墒褂脴藴史椒ǎ鏚yte & Doolittle, J. Mol. Biol.,157:105-32 (1982)),或Stryer (同上)中描述的方法鑒定所述7個 跨膜區(qū)和細胞外和細胞質環(huán)。
      "胞漿區(qū)(Cytoplasmic domain)"是指面對細胞內(nèi)部的T2R蛋 白的結構域,例如"C末端結構域"和跨膜結構域的細胞內(nèi)環(huán),例如 跨膜區(qū)l和2之間、跨膜區(qū)3和4之間以及跨膜區(qū)5和6之間的細胞 內(nèi)環(huán)。"C末端結構域"是指橫跨最后一個跨膜區(qū)的末端至蛋白的C 末端的區(qū)域,其通常位于細胞質內(nèi)。
      術語"7-跨膜受體"是指屬于具有7個區(qū)域、橫跨質膜7次(從 而,所述7個區(qū)域稱為"跨膜"或"TM,,結構域TM I至TM VII)的 跨膜蛋白的亞家族的多肽。嗅覺和某些味覺受體的亞家族各自屬于該 超家族。7-跨膜受體多肽具有相似的特征性一級、二有和三級結構, 如下面進一步詳細描述的。
      術語"配體結合區(qū)"是指來源于化學感覺受體或味覺受體的、基 本上包含跨膜結構域II至VII (TM II至VII)的序列。該區(qū)域可能 能夠結合配體,更特別地味覺引發(fā)化合物(taste eliciting compound )。
      術語"質膜轉位結構域 (plasma membrane translocation domain),,或簡單地"轉位結構域"是指功能上等同于示例性轉位結 構域(5, -MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV; SEQ ID NO: l)的多肽。這些肽 結構域,當整合入多肽編碼序列的氨基末端時,可非常有效地將雜交 ("融合")蛋白"伴護"或"轉位"至細胞質膜。該特定的"轉位 結構域,,最初來源于人視紫紅質受體多肽(7-跨膜受體)的氨基末端。 另 一種轉位結構域來源于牛視紫紅質序列并且也用于幫助轉位。來源 于視紫紅質的序列在將7-跨膜融合蛋白轉位至質膜中特別有效。
      "功能等同性,,是指結構域在在相似條件下將新翻譯的蛋白轉移 至質膜的能力和效率與示例性SEQ ID N0:1的一樣有效;如此處所描
      述的,可測量(在數(shù)量方面)和比較相對效率??赏ㄟ^常規(guī)篩選就它 們與20個氨基酸長的轉位結構域SEQ ID NO: l相同的將新合成的多 肽轉位至細胞(哺乳動物、非洲蟾蜍等)的質膜的功效確定落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的結構域。
      在用于檢測調節(jié)T2R家族成員介導的味覺轉導的化合物的測定法 的上下文中,術語"功能效應"包括間接或直接在受體的影響下的任 何參數(shù)例如功能、物理和化學效應的確定。其包括體外、體內(nèi)和離體 的配體結合、離子流、膜電位、電流、轉錄、G蛋白結合、GPCR磷酸 化或去磷酸化、信號轉導、受體-配體相互作用、第二信使?jié)舛?例如, cAMP、 cGMP、 IP3或細胞內(nèi)Ca"的改變,也包括其他生理效應例如神 經(jīng)遞質或激素釋^:的增加或減少。
      "確定功能效應"是指對增加或減少間接或直接在T2R家族成員 影響下的參數(shù)例如功能性、物理學和化學效應的化合物的測定??赏?過本領域技術人員已知的方法測量此類功能性效應,例如光譜特征(例 如,熒光、吸光率、折射率)、流體動力學(例如,形狀)、色謙或溶解 度性質、膜片鉗、電壓敏感染料、全細胞電流、放射性同位素流出、 可誘導的標記、孵母細胞T2R基因的表達的變化;組織培養(yǎng)細胞T2R 的表達;T2R基因的轉錄激活;配體結合測定;電壓、膜電位和導電 系數(shù)的變化;離子流測定;細胞內(nèi)第二信使例如cAMP、 cGMP和三磷酸 肌醇(IP3)的變化;細胞內(nèi)鈞水平的變化;神經(jīng)遞質的釋放等。
      T2R蛋白受體的"抑制劑"、"激活物,,和"調節(jié)劑"可互換使 用,表示使用味覺轉導的體外和體內(nèi)測定法鑒定的抑制、激活或調節(jié) 分子,例如配體、激動劑、拮抗劑和它們的同源物和模擬物。抑制劑 是例如結合、部分或完全阻斷刺激、減少、防止、延遲激活味覺轉導、 使味覺轉導失活或下調味覺轉導的化合物,例如拮抗劑。激活物是例 如結合、刺激、增加、打開、激活、增強味覺轉導、使味覺轉導靈敏 或上調味覺轉導的化合物,例如激動劑。調節(jié)劑包括例如改變受體與 結合激活物或抑制劑的細胞外蛋白的相互作用的化合物(例如, ebnerin和疏水栽體家族的其他成員);G蛋白;激酶(例如,視紫紅 質激酶和參與使受體失活和脫敏的P -腎上腺素能受體激酶的同源物); 和也使受體失活和脫敏的抑制蛋白。調節(jié)劑包括T2R家族成員的經(jīng)基 因工程改造的形式,例如具有改變的活性的形式,以及天然發(fā)生的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學分子等。
      用于抑制劑和激活物的這些測定包括,例如,在細胞或細胞膜中
      表達T2R家族成員,在調節(jié)例如苦味化合物的化合物存在或不存在的 情況下使用假定的調節(jié)劑化合物,然后如上面所描述的,確定對苦味 轉導的功能效應。將包含用潛在的激活物、抑制劑或調節(jié)劑處理的T2R 家族成員的樣品或測定與不含抑制劑、激活物或調節(jié)劑的對照樣品比 較以檢查調節(jié)的程度。賦予對照樣品(未用調節(jié)劑處理的)100%的相 對T2R活性。當相對于對照的T2R活性值是大約80%,任意地50%或 25-0%時獲得對T2R的抑制。當相對于對照的T2R活性值是110%,任 意地150%,任意地200-500%或1000-3000%更高時,獲得對T2R的激 活。
      術語"純化的,,、"基本上純化的"和"分離的"此處是指不含 在本發(fā)明的化合物的天然狀態(tài)下通常與其結合的其他的、不同的化合 物的狀態(tài)。優(yōu)選地,"純化的,,、"基本上純化的"和"分離的,,是 指組合物包含按重量計算至少0.5%、 1%、 5%、 10%或20%和最優(yōu)選至少 50%或75%的給定的樣品的量。在一個優(yōu)選實施方案中,這些術語是指 本發(fā)明的化合物包含按重量計算至少95%的給定樣品的量。如此處所 用的,術語"純化的"、"基本上純化的"和"分離的",當指核酸 或蛋白時,也指與哺乳動物特別是人身體中天然發(fā)生的純度或濃度不 同的純化狀態(tài)或濃度。大于在哺乳動物特別是人體中天然發(fā)生的濃度 的任何程度的純度或濃度,包括(l)與其他結合的結構或化合物分離 的純化或(2)與在哺乳動物特別是人的身體中通常不與其結合的結構 或化合物的結合,在"分離的,,的涵義之內(nèi)。可按照本領域技術人員 熟知的許多方法和程序分離此處描述的核酸或蛋白或核酸或蛋白的種
      如此處所用的,術語"分離的,,,當指核酸或多肽時,是指與在
      濃度[大于體內(nèi)天然發(fā)生的純i或濃度的任;可程度的:度或濃度
      括(l)從其他天然發(fā)生的結合的結構或化合物分離的純化,或(2)與通常在體內(nèi)不與其結合的結合或化合物的結合)在此處使用的"分離 的"的涵義之內(nèi)??砂凑毡绢I域技術人員已知的許多方法和程序分離
      構或化合物』合r ^、一 。、 、'、一 、
      如此處所用的,術語"增加"和"擴增"是指如下面詳細描述的, 使用任何合適的擴增方法產(chǎn)生或檢測重組或天然表達的核酸。例如,
      本發(fā)明提供了用于體內(nèi)或體外擴增(例如,通過聚合酶鏈式反應,PCR) 本發(fā)明的天然表達的(例如,基因組或mRNA)或重組的(例如,cDNA) 核酸(例如本發(fā)明的味覺引發(fā)化合物結合序列)的方法和試劑(例如, 特定的寡核苷酸引物對)。
      術語"表達載體"是指用于體外或體內(nèi),在任何細胞(包括原核 細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞)中組成地或 可誘導地表達本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達系統(tǒng)。該術語包括線 性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術語包括保持附加體或整合入宿主細胞基因組 的表達系統(tǒng)。所述表達系統(tǒng)可具有自我修復的能力或不具有該能力, 即,只在細胞中驅動瞬時表達。該術語包括只包含重組核酸的轉錄所 需要的最小元件的重組表達盒。
      術語"文庫,,是指作為不同核酸或多肽分子的混合物的制劑,例 如重組產(chǎn)生的感覺(特別是味覺)受體配體結合區(qū)(通過使用簡并引 物對擴增核酸產(chǎn)生的)或分離的整合擴增的配體結合區(qū)的載體的集合 或各自用至少一個編碼味覺受體的載體隨機轉染的細胞的混合物。
      術語"核酸"或"核酸序列"是指以單鏈或雙鏈形式存在的脫氧 核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。該術語包括包含已知的天然核苷 酸的類似物的核酸,即寡核苷酸。該術語也包括具有合成的主鏈的核 酸樣結構。
      除非另外指出,特定核酸序列也暗指包括其保守性修飾的變體(例 如,筒并密碼子置換)和互補序列以及明確指出的序列。特別地,簡
      并密碼子置換可通過產(chǎn)生例如其中用混合堿基和/或脫氧次黃嘌呤核 苷置換一個或多個選擇的密碼子的第三位置的序列來實現(xiàn)(Batzer等人,Nucleic Acid Res. , 19:5081 (1991); Ohtsuka等人,J. Biol. Chem. , 260:2605-08 (1985); Rossolini等人,Mol. Cell. Probes, 8:"-98 (1994))。術語核酸可與基因、cDNA、 mRNA、寡核苷酸和多核 苷酸互換使用。
      術語"多肽"、"肽"和"蛋白"此處可互換使用,表示氨基酸 的聚合物。該術語用于其中 一個或多個氨基酸殘基是對應的天然發(fā)生 的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物和天然發(fā)生的氨基酸聚合 物以及非天然發(fā)生的氨基酸聚合物。
      此處描述的"轉位結構域"、"配體結合區(qū)"和嵌合受體組合物 也包括具有基本上對應于示例性序列的結構和活性的"類似物,,或"保 守性變體"和"模擬物"("模擬肽(pepUdomimetics),,)。因此, 術語"保守性變體"或"類似物"或"模擬物"是指多肽,所述多肽 具有這樣的經(jīng)修飾的氨基酸序列以致于變化不顯著地改變此處定義的 多肽的(保守性變體的)結構和/或活性。這些包括氨基酸序列的保守 性修飾的變化,即對于蛋白活性不是至關重要的殘基的氨基酸置換、 添加或缺失,或使用具有相似性質(例如,酸性、堿性、帶正電荷或 負電荷、極性或非極性等)的殘基進行的氨基酸的置換,這樣即使至 關重要的氨基酸的置換也基本上不改變結構和/或活性。
      更特別地,"保守性修飾的變體"用于氨基酸和核苷酸序列。對 于特定的核苷酸序列,保守性修飾的變體是指編碼同一的或基本上同 一的氨基酸序列的序列,或其中核酸不編碼氨基酸的序列,基本上同 一的序列。因為遺傳密碼子的簡并性,因此許多功能性同一的核酸編 碼任何給定的蛋白。
      例如,密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此, 在其中丙氨酸由密碼確定的每一個位置上,可將密碼子改變成任何所 述的對應密碼子而不改變編碼的多肽。
      這樣的核酸變異是"沉默變異(silent variation)",其是保 守性修飾的變異的一種。此處編碼多肽的每一個核酸序列也描述了該 核酸的每一種可能的沉默變異。本領域技術人員將認識到,可改變核酸中的各個密碼子(除了 AUG和TGG外,AUG通常是甲硫氨酸的唯一 密碼子,TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上同一的分子。 因此,編碼多肽的核酸的各個沉默變異隱含在各描述的序列中。
      提供功能相似的氨基酸的保守性置換表在本領域內(nèi)是熟知的。例 如,選擇保守性置換的一個示例性方針包括(原始殘基后接著示例性 置換)ala/gly或ser; arg/lys; asn/gln或hls; asp/glu', cys/ser; gin/asn; gly/asp; gly/ala或pro; his/asn或gin; ile/leu或val; leu/ile或val; lys/arg或gln或glu; met/leu或tyr或ile; phe/met或leu或tyr; ser/thr; thr/se" trp/tyr; tyr/trp或phe; val/ile或leu。備選的示例性方針使用下列6個組,各個組包含互為 保守性置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T); 2)天 冬氨酸(D)、谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸 (R)、賴氨酸(I); 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蘇氨酸(M)、纈氨酸 (V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);(也參見,例如, Creighton, Proteins, W. H. Freeman和Company (1984); Schultz 和Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979))。本領域技術人員將認識到上面鑒定的置換不是唯一可能的保 守性置換。例如,為了一些目的,人們可將所有帶電荷的氨基酸當作 相互之間的保守性置換而無論它們是帶正電荷還是帶負電荷。此外, 改變、添加或缺失編碼序列中的單個氨基酸或小百分比的氨基酸的單 個置換、缺失或添加也可被認為是"保守性修飾的變異"。
      術語"模擬物"和"肽模擬物"是指具有基本上與多肽例如本發(fā) 明的轉位結構域、配體結合區(qū)或嵌合受體相同的結構和/或功能特征的 合成的化合物。模擬物可以完全由氨基酸的合成的、非天然類似物組
      分子:';述嵌;物也;整合4何i:"天然氨:酸保^性置換,只要所 述置換也不顯著改變模擬物的結構和/或活性。
      關于作為保守性變體的本發(fā)明的多肽,常規(guī)實驗將確定模擬物是 否在本發(fā)明的范圍內(nèi),即,其結構和/或功能基本上不被改變。多肽模擬物組合物可包含非天然結構組分的任何組合,所述結構組分通常來
      自3個結構組a)除于天然酰胺鍵("肽鍵")外的殘基連接組;b) 取代天然發(fā)生的氨基酸殘基的非天然殘基;或c)誘導二級結構模擬 物即誘導或穩(wěn)定二級結構例如P轉角、Y轉角、P折疊片、(x螺旋形 成等的殘基。當所有或一些其殘基通過除了天然肽鍵外的化學方法連 接時多肽可表征為模擬物。單個肽模擬物殘基可由肽鍵、其他化學鍵 或偶聯(lián)方法例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、 N,『-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)或N, N' 二異丙基碳酰亞胺(DIC)連接。 可作為常規(guī)的酰胺鍵("肽鍵")連接的另一選擇的連接基團包括例 如酮亞甲基(ketomethylene )(例如,對于一C(. dbd. O)—NH--為 —C ( dbd. 0)-CH2)、氨甲烯基(aminomethylene) (C)、烯基、烯 烴基(CH. dbd. CH)、醚(CH20)、硫醚(CH2—S)、四唑(CNJ、瘞唑、 retroamide、石i^戈醜胺或酉旨(參見,,j:fe口, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, 第 7巻, 267-357, Marcell Dekker, Peptide Backbone Modifications, NY (1983))。通過包含所有或一些非天然殘基以取代天然發(fā)生的氨基酸殘 基也可將多肽表征為模擬物;在科學和專利文獻中詳盡地描述了非天 然殘基。
      "標記"或"可檢測的部分"是可通過分光光度法、光化學法、 生物化學法或化學方法檢測的組分。例如,有用的標記包括"P、熒光 染料、電子密度劑、酶(例如,如通常用于ELISA)、生物素、地高 辛或半抗原和可通過例如將放射性標記整合入肽中來使其可被檢測的 蛋白或用于檢測與肽特異性反應的抗體的蛋白。
      "標記的核酸探針或寡核苷酸"是通過連接體或化學鍵共價地, 或通過離子鍵、范德瓦爾斯力、靜電或氫鍵非共價地結合標記的核酸 探針或寡核苷酸,這樣可通過檢測結合所述探針的標記的存在來檢測 探針的存在。
      如此處所用的,"核酸探針或寡核苷酸"定義為能夠通過一種或 多種類型的化學鍵,通常通過互補堿基配對,通常通過氫鍵的形成結合互補序列靶核酸的核酸。如此處所用的,探針可包含天然(即,A、 G、 C或T)或纟至1奮飾的械基(7—deazaguanosine、肌芬等)。jt匕夕卜,可 通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵連接鍵探針中的堿基,只要其不干擾雜交。 因此,例如,探針可以是其中組成堿基通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵連 接的肽核酸。本領域技術人員理解依賴于雜交條件的嚴緊度,探針可 結合與該探針序列缺乏完全互補的靶序列。探針任意地可用同位素、 發(fā)色團、發(fā)光團、色原體(chromogen)直接標記或用例如鏈霉抗生物 素復合物可隨后標記的生物素間接標記。通過測定探針的存在或不存 在,可檢測選擇的序列或亞序列(subsequence)的存在或不存在。 術語"異源的",當用于指核酸的部分時,表示核酸包含兩個或
      如,所述核酸通常是i過^組產(chǎn)生的,使兩^或多個來自不相關基因 的序列(例如來自一種來源的啟動子和來自另一種來源的編碼區(qū))排 列,從而產(chǎn)生具有新功能的核酸。類似地,異源蛋白顯示該蛋白包含 兩個或更多個相互之間在天然狀況下未發(fā)現(xiàn)處于相同親緣關系中的序 列(例如,融合蛋白)。
      "啟動子"定義為指導核酸轉錄的核酸序列的排列。如此處所用 的,啟動子包括靠近轉錄起始位點的必需核酸序列,例如在聚合酶ll 型啟動子的情況下,是TATA元件。啟動子任意地也包含遠側增強子或 阻抑物元件,所述元件可位于離轉錄起始位點多達數(shù)千堿基對的位置。 "組成型"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動子。 "誘導型,,啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調控下具有活性的啟動子。術語"有 效連接的"是指核酸表達控制序列(例如啟動子或轉錄因子結合位點 的排列)和笫二核酸序列之間的功能性連接,其中表達控制序列指導 對應于第二序列的核酸的轉錄。
      如此處所用的,"重組體"是指合成的或體外操作的多核苷酸(例 如,"重組多核苷酸")、使用重組多核苷酸在細胞或其他生物系統(tǒng)中 產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法,或由重組多核苷酸編碼的多肽("重組蛋白")。 "重組方法"也包括將具有來自不同來源的不同編碼區(qū)或結構域或啟動子的核酸連接入表達盒或栽體,以表達例如可誘導地或組成地表達
      序列。,、 、、s I、 ^ 、;、
      短語"對……選擇性(或特異性)雜交"是指在嚴緊條件下使分 子只對特定的核苷酸序列結合、形成雙鏈體或雜交,當雜交時該序列
      以復雜混合物(例如,總細胞或文庫DNA或RNA)的形式存在。
      短語"嚴緊雜交條件,,是指在探針對其靶序列(通常以核酸的復 雜混合物的形式存在)雜交而不與其他序列雜交時的條件。嚴緊雜交
      條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中是不同的。更長的序列明確 地在更高的溫度下雜交。在Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中查找到對于核酸雜交的更詳盡的指 導方針。 一般地,選擇嚴緊條件使之比確定的離子強度、pH下的特定 序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5至IO'C。 Tm是在平衡時50%的與靶 互補的探針對靶序列雜交時所處的溫度(在確定的離子強度、PH和核 酸濃度下)(當靶序列過量存在時,在Tm下,50%的探針在平衡時被 結合)。嚴緊條件是其中在pH 7.0至8. 3下,鹽濃度低于大約1. 0M 鈉離子,通常大約0. 01至1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)和對于短探針 (例如,10至50個核苷酸)溫度是至少大約30C ,對于長探針(例 如,超過50個核苷酸)至少大約60"C的條件。通過加入去穩(wěn)定劑例 如曱酰胺也可獲得嚴緊條件。對于選擇性或特異性雜交,陽性信號至 少是背景的2倍,任意地是背景雜交的10倍。示例性嚴緊雜交條件可 以如下50%甲酰胺、5xSSC和1% SDS,在42。C下溫育或5xSSC、 1% SDS, 在65。C下溫育,在65。C下在0. 2xSSC和0. 1% SDS中洗滌。進行該雜 交和洗滌步驟,進^f亍例如1、 2、 5、 10、 15、 30、 60或更多分鐘。
      如果它們編碼的多肽是顯著相關的,在嚴緊條件下相互之間不雜 交的核酸仍然是顯著相關的。這可在例如使用遺傳密碼子允許的最大 密碼子簡并性產(chǎn)生核酸的拷貝時發(fā)生。在該情況下核酸通常在中等嚴緊雜交條件下雜交。示例性"中等嚴緊雜交條件"包括在37。C下在40% 甲酰胺、1 M NaCl、 1% SDS的緩沖液中的雜交和在45"C下在lxSSC 中的洗滌??蓪⒃撾s交和洗滌步驟進行1、 2、 5、 10、 15、 30、 60或 更多分鐘。陽性雜交是背景的至少2倍。本領域技術人員將容易地認 識到可選擇的雜交和洗滌條件可用于提供相似的嚴緊條件。
      "抗體"是指包含來自免疫球蛋白基因的構架區(qū)或其片段、特異 性結合和識別抗原的多肽。公認的免疫球蛋白基因包括K 、入、oc、 Y、 5、 e和iu恒定區(qū)基因和無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類 為K或入。重鏈分類為y、 P、 a、 5或s,這反過來分別定義了免 疫球蛋白的種類,IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
      示例性免疫球蛋白(抗體)結構單位由四聚體組成。各個四聚體 由兩個相同的多肽鏈對組成,各多肽鏈對具有一個"輕鏈"(大約25 kDa)和一個"重"鏈(大約50-70 kDa)。各鏈的N末端界定了大約100 至110或更多個氨基酸的主要負責抗原識別的可變區(qū)。術語可變輕鏈 OO和可變重鏈(Vh)分別指這些重鏈和重鏈。
      "嵌合抗體"是這樣的抗體分子,即在該分子中(a)恒定區(qū)或 其部分被改變、取代或交換以使抗原結合位點(可變區(qū))連接至不同 的或改變的種類、效應子功能和/或物種的恒定區(qū),或連接至給嵌合抗 體賦予新的性質的完全不同的分子(例如,酶、毒素、激素、生長因 子、藥物等);或(b)可變區(qū)或其部分被改變、取代或與具有不同或 改變的抗原特異性的可變區(qū)交換。
      "抗-T2R,,抗體是特異性結合由T2R基因、cDNA或其亞序列編碼
      的多肽的抗體或抗體片段。
      術語"免疫測定法"是使用特異性結合抗原的抗體的測定法。免 疫測定法的特征在于使用特定抗體的特異性結合性質分離、靶向和/ 或定量抗原。
      短語對抗體的"特異發(fā)(或選擇性)結合"或"與……特異性(或 選擇性)免疫反應",當指蛋白或肽時,是指確定蛋白在異源蛋白群 體和其他生物中存在的結合反應。因此,在已設計的免疫測定條件下,指定的抗體對特定蛋白的結合高于背景至少2倍并且基本上不以顯著 的量結合存在于樣品中的其他蛋白。在這樣的條件下對抗體的特異性 結合可能需要就其對于特定蛋白的特異性選擇的抗體。
      例如,可選擇針對來自特定物種例如大鼠、小鼠或人的T2R家族 的成員產(chǎn)生的多克隆抗體以只獲得這樣的多克隆抗體,所述多克隆抗 體與T2多肽或其免疫原性部分發(fā)生特異性免疫反應而不與其他蛋白 (除了 T2R多肽的直系同源物或多態(tài)性變體和等位基因以外)發(fā)生特 異性免疫反應。可通過扣除與來自其他物種的T2R分子或其他T2R分 子交叉反應的抗體來實現(xiàn)該選擇。也可選擇只識別T2RGPCR家族成員 而非來自其他家族的GPCR的抗體??墒褂迷S多免疫測定形式來選擇與 特定蛋白發(fā)生特異性免疫反應的抗體。例如,固相ELISA免疫測定法 常規(guī)地用于選擇與蛋白發(fā)生特異性免疫反應的抗體(參見,例如, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), 關于 可用于確定特定的免疫反應性的免疫測定形式和條件的描述)。通常特 異性或選擇性反應至少為背景信號或噪聲的兩倍,更常見地超過10 至IOO倍的背景。
      短語"與......選擇性結合"是指核酸與另一種核酸進行如上定義
      的"選擇性雜交,,的能力,或抗體對蛋白進行如上定義的"選擇性(或 特異性)"結合的能力。
      術語"表達載體"是指用于在體外或體內(nèi)、在任何細胞(包括原 核細胞、酵母細胞、真菌、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中組 成型或誘導型地表達本發(fā)明的核酸序列的任何重組表達系統(tǒng),該術語 包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術語包括保持附加型或整合入宿主細胞 基因組的表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)可具有自我復制的能力或不具有自我復 制的能力,即,只在細胞中驅動瞬時表達。該術語包括只包含重組核
      酸轉錄所需要的是最小元件的重組表達盒。
      "宿主細胞"是指包含表達載體并且支持所述表達載體的復制或 表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞例如大腸桿菌(E, coli)或真 核細胞例如酵母細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞或哺乳動物細胞例如CH0、 HeLa、 HEK-"3等,例如培養(yǎng)細胞、外植體和體內(nèi)細胞。
      基于上述內(nèi)容,本發(fā)明提供了用于鑒定化合物的測定法,所述化 合物調節(jié)(優(yōu)選阻斷)苦味化合物(例如咖啡和其他食物或飲料中發(fā) 現(xiàn)的綠原酸內(nèi)酯和結構相產(chǎn)性化合物)對之前鑒定的人苦味受體的特 異性激活。特別地,本發(fā)明提供了用于鑒定化合物的基于細胞的測定 法,所述化合物調節(jié)咖啡中發(fā)現(xiàn)的化合物即綠原酸內(nèi)酯例如圖1中包 括的綠原酸內(nèi)酯對特定的人T2R的激活。特別地,本發(fā)明包括發(fā)現(xiàn) hT2R8、 hT2R14或hT2R54凈皮綠原酸內(nèi)酯3CoQAL或結構相關性化合物 激活;hT2R8、 hT2R14或hT2R54被綠原酸內(nèi)酯3CQAL和4FQAL或結構 相關性化合物激活;或hT2R8和hT2R54被綠原酸內(nèi)酯4FQAL或結枸相 關性化合物激活。如所指出的,圖1中包含這些指定的綠原酸內(nèi)酯和 其他化合物的結構。預期使用本發(fā)明的測定法鑒定的化合物可調節(jié)與 人受試者中的此類苦味受體相關的苦味。這將在味覺試驗中得到驗證。
      使用其他出版物和由本人Assignee提交的專利申請例如美國系 列No. 10/191, 058和09/825, 882 (兩者在此以其全文引用作為參考) 中報導的HEK293表達系統(tǒng)和鈣成像方法確定上述味覺受體對苦味配 體(即咖啡中發(fā)現(xiàn)的綠原酸內(nèi)酯例如3CQAL、 4CQAL、 3CoQAL和4FQAL ) 發(fā)生特異性反應。更特別地,本發(fā)明者用特定的hT2R和嵌合G蛋白 (G16gust44)(其包含通過用味導素的羧基-44氨基酸殘基取代Gal6G 蛋白的羧基-44氨基酸殘基修飾的G。wG蛋白)一起轉染HEK293細胞, 然后通過鉤成像方法記錄這些細胞對特定苦味配體的反應。
      如圖2中所顯示的,發(fā)現(xiàn)hT2R8、 hT2R14和hT2R54以劑量依賴性 的方式對不同濃度的3CoQAL發(fā)生反應。相反地,這些細胞不對相同濃 度的蔗糖發(fā)生反應。因此,這些細胞或功能性表達此類受體的其他細 胞可在測定中用于鑒定化合物(所述化合物調節(jié)苦味化合物即綠原酸 內(nèi)酯對此類受體的激活)例如阻斷此類受體的3CoQAL活的化合物。
      此外,如圖3中所示,也觀察到表達hT2R8、 hT2R14或hT2R54 的HEK-293細胞對2mM濃度的綠原酸內(nèi)酯3CQAL和4CQAL發(fā)生特異性 反應。相反地,這些細胞對蔗糖(對照)不發(fā)生反應。此外,如圖4中所示,使用這些相同的鉤成像方法觀察到表達 hT2R8或hT2R54的HEK-293細胞以劑量信賴性的方式對綠原酸內(nèi)酯 4FQAL發(fā)生特異性反應。相比之下,這些細胞對蔗糖不發(fā)生反應。
      這些結果表明功能性表達hT2R8、hT2R14和hT2R54味覺受體中的 任一種的細胞可在測定中用于鑒定配體,所述配體調節(jié)與苦味相關的 hT2R8、 hT2R14或hT2R54,所述苦味由例如咖啡飲料和其他包含綠原 酸內(nèi)酯的苦味食物、飲料或藥物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸內(nèi)酯或結構相關性化 合物引起。
      優(yōu)選地,這些測定法使用表達編碼具有下文中鑒定的一個氨基酸 序列的hT2R的DNA的受試細胞。然而,預期此類受體多肽的保留這些 苦味受體的功能特征(即對一些苦味化合物起反應)的片段、直系同 源物、變體或嵌合物也可用于這些測定法。此類變體的實例包括剪接 變體、單核苷酸多態(tài)性、等位基因變體和由重組或化學方法產(chǎn)生的或 天然發(fā)生的突變。下面顯示用于分離和表達T2R的方法,所述T2R用 于本發(fā)明的測定法和涉及在本發(fā)明用于鑒定抑制此類受體的激活的化 合物的測定法。
      T2R的分離和表達
      可通過良好建立的克隆方法,使用基于本申請中公開的T2R核酸 序列構建的探針或引物進行本發(fā)明的T2R或其片段或變體的分離和表 達。也可使用此處公開的序列和已知的基于計算機的搜尋技術例如 BLAST序列搜尋從人或其他物種的基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定相關的T2R序 列。在特定的實施方案中,可將此處公開的假基因用于鑒定功能等位 基因或相關的基因。
      然后可將表達載體用于感染或轉染宿主細胞以功能性表達這些序 列??稍隗w外或體內(nèi)產(chǎn)生和表達這些基因和載體。本領域技術人員將 認識到可通過在本發(fā)明的載體內(nèi)調節(jié)基因和核酸(例如,啟動子、增 強子等)的表達或活性獲得改變和控制核酸表達的希望的表型??墒?用任何描述用于增加或減少表達或活性的已知方法??山Y合科學和專利文獻中詳盡描述的本領域內(nèi)已知的任何方法或方案實施本發(fā)明。
      備選地,可通過熟知的化學合成寺支術例如Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-18 (1982); Adams, Am. Chem. Soc, 105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blommers, Biochemistry 33: 7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); 美國專利 4, 458, 066中描述的技術體外合成這些核酸。然后通過合成互補鏈, 在合適的條件下將鏈退火在一起,或通過使用DNA聚合酶和合適的引 物序列加入互補鏈來獲得雙鏈DM片段。
      用于核酸操作例如用于在序列中產(chǎn)生突變、亞克隆、標記探針、 測序、雜交等的技術詳細地描述于科學和專利文獻中。參見,例如, Sambrook, 編著,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.),第l-3巻,Cold Spring Harbor Laboratory (1989); A謂bel, 編著,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , New York (1997); Tijssen, 編著,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, 第I部分,Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N. Y. (1993)。
      可通過許多本領域技術人員熟知的常用方法中的任一種方法分析 和定量核酸、載體、衣殼(capsid)、多肽等。這些方法包括例如分 析生物化學方法例如NMR、分光光度法、放射照相術(radiography)、 電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)和高融合層 析(hyperdif fus ion chromatography)、各種免疫學方法,例如, 流體或凝膠沉淀素反應(fluid or gel precipitin reaction)、免 疫擴散、免疫電泳法、放射免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、免疫焚光測定、Southern分才斤、Northern分才斤、斑點印跡 分析(dot-blot analysis)、凝膠電泳(例如,定量PCR、其他核酸或靶或信號擴增方法、放射性標記、閃爍計數(shù)和 親和層析。
      可使用寡核苷酸引物擴增編碼T2R配體結合區(qū)的核酸。也可使用 擴增技術克隆或定量測定此處描述的核酸。擴增方法在本領域內(nèi)是熟 知的,其包括例如聚合酶鏈式反應(PCR) (Innis編著,PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, N. Y. (1990); Innis編著,PCR Strategies, Academic Press, Inc., N. Y. (1995)); 連接酶鏈式反應(LCR) (Wu, Genomics, 4: 560 (1989); Landegren, Science, 241:1077 (1988); Barringer, Gene, 89:117 (1990));轉 錄擴增(Kwoh, PNAS, 86:1173 (1989));自主序列復制(Guatel 1 i, PNAS, 87:1874 (1990)); Q P復制酶擴增(Smith, J. Clin. Microbiol. , 35: 1477-91 (1997));自動化Q P復制酶擴增測定(Burg, Mol. Cell. Probes, 10:257-71 (1996));和其他RNA酶介導的技術 (例如,NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario),也參見,Berger, Methods Enzymol, 152: 307-16 (1987); Sambrook; A畫bel; 美國 專利 4, 683, 195 和 4, 683, 202;Sooknanan, Biotechnology, 13:563-64 (1995)。
      擴增后,如果想要,可按照本領域內(nèi)已知的方法使用常規(guī)的分子 生物學方法將核酸單個地或以文庫的方式克隆入許多種載體中的任一 種載體;用于克隆體外擴增的核酸的方法描述于例如美國專利 5,426, 039。為了幫助克隆擴增的序列,可將限制性內(nèi)切酶位點"克隆 入,,PCR引物對。例如,將Pst I和Bsp El位點設計在本發(fā)明的示例 性引物對中。這些特定的限制性位點具有這樣的序列,當所述序列被 連接時,其相對于它們被剪接入的7-膜受體"供體,,編碼序列是"符 合讀框的,,(配體結合區(qū)編碼序列內(nèi)化入7-膜多肽內(nèi),因而,如果希 望構建體在限制性內(nèi)切酶剪接位點的下游被翻譯,應當避免不符合讀 框的結果,如果插入的配體結合區(qū)包含絕大部分跨膜VII區(qū),這可以 不是必需的)。可設計引物以保留"供體"7-膜受體的原始序列。備選 地,引物可編碼作為保守性置換(例如,對于疏水殘基使用疏水殘基,參見上面的討論)或功能上有利的置換(例如,不阻止質膜插入,通過 肽酶產(chǎn)生切割,導致受體的異常折疊等)的氨基酸殘基。
      可設計引物對以使之選擇性擴增T2R蛋白的配體結合區(qū)。這些結 合區(qū)對于不同的配體可發(fā)生變化;從而,對于一種配體可以是最小結 合區(qū)的區(qū)域對于第二潛在配體太小而不能成為結合區(qū)。因此,可擴增 包含不同結構域結構的不同大小的結合區(qū);例如,7-跨膜T2R的跨膜 (TM)結構域II至VII、 III至VII、 III至VI或II至VI或其變體(例 如,只是特定結構域的亞序列,混合結構域的順序,等)。
      由于許多7-膜T2R蛋白的結構域結構和序列是已知的,因此本領 域技術人員可容易地選擇側連接結構域的序列和結構域內(nèi)部序列作為 模型序列以設計簡并擴增引物對。例如,可通過PCR擴增,使用引物 對產(chǎn)生編碼結構域II至VII的核酸序列。為了擴增包含跨膜結構域I (TM I)序列的核酸,可根據(jù)編碼上述T2R家族共有序列1的氨基酸序 列的核酸設計簡并引物。該銜并引物可用于產(chǎn)生包含TM I至TM III、 TM I至TM IV、 TM I至TM V、 TM I至TM VI或TM I至TM VII的結 合區(qū)。可基于此處提供的其他T2R家族共有序列設計其他簡并引物。 這樣的簡并引物可用于產(chǎn)生包含TM III至TM IV、 TM III至TM V、 TM III至TM VI或TM III至TM VII的結合區(qū)。
      設計簡并引物對的范例在本領域內(nèi)是熟知的。例如, COnse醒s-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide引物(CODE,)策略 計算機程序可從http: 〃blocks. fhcrc. org/codehop. html獲得,其
      與用于始于成組相關蛋白序列如已知的味覺受體配體結合區(qū)的雜交引 物的預測的BlockMaker多序列比對位點直接鏈接(參見,例如,Rose, Nucleic Acids Res., 26:1628-35 (1998); Singh, Biotechniques, 24: 318-19 (1998))。
      合成寡核苷酸引物對的方法在本領域內(nèi)是熟知的??墒褂?天然" 堿基對或合成的堿基對。例如,人造核堿基的使用為操作引物序列和 產(chǎn)生更復雜的擴增產(chǎn)物的混合物提供了通用方法。人造核堿基的不同 家族能夠通過內(nèi)部鍵的旋轉采取多種氫鍵取向,從而提供簡并分子識別的方法。這些類似物至PCR引物的單個位置中的整合允許產(chǎn)生復雜 的擴增產(chǎn)物文庫。參見,例如,Hoops, Nucleic Acids Res., 25:4866-71 (1997)。也可將非極性分子用于模擬天然DNA堿基的形狀。 腺嘌呤的非氫鍵結合形狀模擬物可有效地復制并且選擇性針對胸腺嗜 啶的非極性形狀模擬物(參見,例如,Morales, Nat. Struct. Biol,, 5:950-54 (1998))。例如,兩種簡并堿基可以是嘧啶堿基6H, 8H-3, 4-二羥基嗜啶[4,5-c] [1,2]噁噪-7-酮或嘌呤堿N6-曱氧基-2,6-二氨 基嘌呤(參見,例如,Hill, PNAS, 95: 4258-63 (1998))。本發(fā)明的 示例性簡并引物包含核堿基類似物5' -二甲氧基三苯曱基-N-苯曱酰 基-2'-脫氧-胞嘧啶,3, -[(2-氰乙基)一(N,N-二異丙基)]-亞磷酰胺 (序列中的"P"項,參見上面)。該嘧啶類似物與噪呤(包括A和G 殘基)形成氫鍵。
      可使用上述的核酸探針分離多態(tài)性變體、等位基因和基本上與此 處公開的味覺受體同一的種間同源物。備選地,通過使用針對T2R多 肽產(chǎn)生的抗血清或純化的抗體(所述血清或抗體也識別和選擇性結合 T2R同源物)對表達的同源物進行免疫學檢測,可使用表達文庫克隆 T2R多肽和其多態(tài)性變體、等位基因和種間同源物。
      可通過使用合適的(完全互補的或簡并)引物對擴增(例如,PCR ) 合適的核酸序列來產(chǎn)生編碼味覺受體的配體結合區(qū)的核酸。擴增的核 酸可以是來自任何細胞或組織的基因組DNA或來源于表達味覺受體的 細胞的raRNA或cDNA。
      在一個實施方案中,可構建包含融合至轉位序列的編碼T2R的核 酸的編碼雜交蛋白的序列。也提供了包含思位基元和其他家族的化學 感覺受體特別是味覺受體的味覺引發(fā)化合物結合區(qū)的雜交T2R。這些 核酸序列可有效連接至轉錄或翻譯控制元件,例如,轉錄和翻譯起始 序列、啟動子和增強子、轉錄和翻譯終止子、聚腺苷化序列和用于將 DNA轉錄成RNA的其他序列。在重組表達盒、載體和轉基因的構建中,
      可將啟動子片段用于指導希望的核酸在所有希望的細胞或組織中表 達。在另 一個實施方案中,融合蛋白可包含C末端或N末端轉位序列。 此外,融合蛋白可包含額外的元件,例如用于蛋白質檢測、純化或其 他用途的元件。有助于檢測和純化的結構域包括,例如,金屬螯合肽 例如多組氨酸束(polyhistidine tract)、組氨酸-色氨酸組件 (module)或允許在固定的金屬上進行純化的其他結構域;允許在固 定的免疫于蛋白上純化的A蛋白結構域;或用于FLAGS延伸/親和純化 系統(tǒng)的結構域(Immunex Corp, Seattle Wash.)。
      在轉位結構域(為了有效的質膜表達)和余下的新翻譯的多肽之 間包含可切割的連接體序列例如因子Xa (參見例如,0ttavi, Biochimie, 80:289-93 (1998))、枯草桿菌蛋白酶識別基元(參見, 例如,Polyak, Protein Eng., 10: 615-19 (1997)); 腸、激酶 (Invitrogen, San Diego, Calif.)等可用于幫助純化。例如, 一個 構建體可包含編碼連接至六組氨酸殘基,接著連接硫氧還蛋白(腸激 酶切割4立點)(參見,例如,Williams, Biochemistry, 34:1787-97 (1995))和C末端轉位結構域的多肽的核酸序列。組氨酸殘基幫助檢測 和純化,而腸激酶切割位點提供從融合蛋白的剩余部分純化希望的蛋 白的方法。在科學和專利文獻(參見,例如,Kroll, DNACell. Biol., 12: 441-53 (1993))中詳細地描述了關于編碼融合蛋白的載體和融合 蛋白的應用的技術。
      可將作為單個表達載體或作為表達載體文庫的表達載體(所述表
      達載體包含編碼配體結合區(qū)的序列)導入基因組或細胞的細胞質或細 胞核中,然后使用科學和專利文獻中詳細描述的多種常規(guī)技術進行表 達。參見,例如,Roberts, Nature, 328:731 (1987); Berger同上, Schneider, Protein Expr. Purif., 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubel。來自生物試劑和實驗設備廠商的產(chǎn)品信息也提供 了關于已知的生物學方法的信息。可從天然來源分離,從這樣的來源 如ATCC或GenBank文庫獲得所述栽體,或通過合成或重組方法制備所 述載體。
      可在細胞中穩(wěn)定或瞬時表達(例如,附加型表達系統(tǒng))的表達盒、載體或病毒中表達核酸??蓪⑦x擇標記整合入表達盒和載體中,從而 為轉化細胞和序列賦予可選擇的表型。例如,選擇標記可編碼附加型 維持和復制,從而使得不必進行至宿主基因組中的整合。例如,標記
      可編碼抗生素抗性(例如,氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉 素)或除草劑抗性(例如,氯磺隆或Basta)以允許選擇用希望的DNA序 列轉化的細胞(參見,例如,Blondelet-Rouault, Gene, 190:315-17 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther. , 281: 992-97 (1997))。 因為賦予對底物如新霉素或潮霉素的抗性的選擇標記基因只可用于組
      內(nèi)的選捧才示i己。
      因為7-膜受體多肽具有相似的一級序列和二級和三級結構,所以 嵌合核酸序列可編碼任何7-膜多肽內(nèi)的T2R配體結合區(qū),可通過序列 分析容易地鑒定結構結構域(例如,細胞外結構域、TM結構域、胞漿 區(qū)等)。例如,同源性建模,傅里葉分析和螺旋周期性檢測可鑒定和 表征具有7-膜受體序列的7個結構域??焖俑道锶~變換(Fast Fourier Transform ) (FFT)算法可用于估量表征^皮分析的序列的疏水性和可變 小生特征的主周期(dominant period )??砂凑绽?i口 Donnelly, Protein Sci, 2: 55-70 (1993)估量周期檢測增強和a螺旋周期指數(shù)。其他比 對和建模算法在本領域內(nèi)是熟知的(參見,例如,Peitsch, Receptors Channels, 4:161-64 (1996); Kyte & Doolittle, J. Md. Biol., 157:105-32 (1982);和Cronet, Protein Eng. , 6: 59-64 (1993)。
      同樣,本發(fā)明不僅包括具有特定核酸和氨基酸序列的核酸分子和 多肽,而且還包括其片段,特別是例如40、 60、 80、 100、 150、 200 或250或更多個核苷酸的片段,或和例如10、 20、 30、 50、 70、 100 或150或更多個氨基酸的多肽片段。任意地,核酸片段可編碼能夠結 合針對T2R家族成員產(chǎn)生的抗體的抗原性多肽。此外,本發(fā)明的蛋白 片段可任意地是能夠結合針對T2R家族成員產(chǎn)生的抗體的抗原性片 段。
      也涉及嵌合蛋白,其包含至少一種偶聯(lián)至代表另一種GPCR (優(yōu)選7跨膜超家族的成員)的全部或部分的額外氨基酸的此處描述的T2R 多肽的至少IO、 20、 30、 50、 70、 IOO或150或更多個氨基酸??蓮?本受體和另 一種GPCR制備這些嵌合物,或可組合兩種或更多種本受體 來制備它們。在一個實施方案中,嵌合物的一個部分對應于,或來源 于本發(fā)明的T2R多肽的跨膜結構域。在另一個實施方案中,嵌合物的 一個部分對應于,或來源于此處描述的T2R多肽的一個或多個跨膜區(qū), 其余部分可來自另一種GPCR。嵌合受體在本領域內(nèi)是熟知,用于產(chǎn)生 它們以及選擇和界定G蛋白偶聯(lián)受體的結構域或片段以將其整合入其 中的技術也是熟知的。因此,本領域技術人員的該知識可容易地用于 此類嵌合抗體。此類嵌合受體的用途可提供例如此處明確公開的受體 中的一種的味覺選擇性特征,所述味覺選擇性特征與另一種受體(例 如用于現(xiàn)有技術測定系統(tǒng)的熟知的受體)的信號轉導特征偶聯(lián)。
      例如,可常規(guī)地將區(qū)域例如配體結合區(qū)、細胞外結構域、跨膜結 構域、胞漿區(qū)、N末端結構域、C末端結構或其任何組合連接至異源蛋 白。例如,可將T2R跨膜區(qū)連接至異源GPCR跨膜結構域,或可將異源 GPCR細胞外結構域連接至T2R跨膜區(qū)。選擇的其他異源蛋白可包括例 如綠色熒光蛋白、p-半乳糖苷酶多肽、谷氨酸受體和視紫紅質多肽, 例如視紫紅質(例如牛視紫紅質)的N末端片段。
      使用不同的用于表達本發(fā)明的T2R、其片段或變體的細胞也在本 發(fā)明的范圍之內(nèi)。為獲得克隆的基因或核酸例如編碼本發(fā)明的T2R、 其片段或變體的cDNA的高表達水平,本領域技術人員通常將目的核酸 序列亞克隆入表達載體,所述表達載體包含指導轉錄的強啟動子、轉 錄/翻譯終止子和如果對于編碼蛋白的核酸還有用于翻譯起始的核糖 體結合位點。合適的細菌啟動子在本領域內(nèi)是熟知的并且描述于例如 Sambrook等人中。優(yōu)選地,使用真核表達系統(tǒng)表達受試者hHR受體。
      可使用任何熟知的用于將外源核苷酸序列導入宿主細胞的方法。 這些方法包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺法(polybrene)、原生質體融 合、電穿孔、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒栽體和任何其他熟 知的用于將克隆的基因組DM、 cDNA、合成的DM或其他外源遺傳物質導入宿主細胞的方法(參見,例如,Sambrook等人)。使用的特定基 因工程方法能夠成功地將至少一種核酸分子導入能夠表達本發(fā)明的 T2R、片段或變體的宿主細胞是必要的。
      在將表達載體導入細胞后,在有利于本發(fā)明的受體、片段或變體 表達的條件下培養(yǎng)轉染的細胞,然后使用標準技術從培養(yǎng)物中回收所 述細胞。該技術的實例在本領域內(nèi)是熟知的。參見,例如,W0 00/06593, 其以與本公開內(nèi)容一致的方式引用作為參考。
      用于檢測調節(jié)本發(fā)明的T2R的活性的化合物的測定法 下面描述用于確定受試化合物是否在體外和體內(nèi)特異性結合本發(fā) 明的T2R多肽的方法和組合物??杀O(jiān)測細胞生理學的許多方面以評估 對天然發(fā)生或嵌合的T2R的配體結合的效應??稍谕暾谋磉_T2R多 肽的細胞上、在經(jīng)透化的細胞上或在由標準方法產(chǎn)生的膜部分上進行 這些測定法。
      味覺受體結合味覺引發(fā)化合物,然后起始化學刺激至電信號的轉 導。激活的或被抑制的G蛋白反過來將改變靶酶、通道和其他效應器 蛋白的性質。 一些實例是視覺系統(tǒng)中轉導素對cGMP磷酸二酯酶的激 活、激活型G蛋白對腺苷酸環(huán)化酶的激活、Gq和其他同源G蛋白對磷 脂酶C的激活和Gi和其他G蛋白對不同通道的調節(jié)。也可檢查下游結 果例如由磷脂酶C導致的二酰甘油和IP3的產(chǎn)生和由此IP3對鈣的動 員。
      測定的受試hT2R8、 hT2R14和hT2R54蛋白或多肽通常選自具有 SEQ ID NO: 3、 5和7中包含的序列的多肽或其片段或保守性修飾的 變體。
      備選地,測定的T2R蛋白或多肽可來源于真核宿主細胞,其可包 含具有與SEQ ID NOS. :2、 4或7同一的氨基酸序列的氨基酸序列或其 經(jīng)保守性修飾的變體。通常,氨基酸序列同一性至少為30%,優(yōu)選 30-40°/。,更優(yōu)選50-60、 70%、 75°/。、 80%、 85°/。、 90%、 95%、 96°/。、 97%、 98%或99%。任意地,測定的T2R蛋白或多肽可包含T2R多肽的區(qū)域,例如細胞外結構域、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)、配體結合結構域等。任意地,
      可將T2R多肽或其部分共價連接至異源蛋白以產(chǎn)生用于此處描述的測 定法的嵌合蛋白。
      可使用上述的T2R蛋白或多肽(重組的或天然發(fā)生的)檢驗T2R 活性的調節(jié)劑??煞蛛x重組的或天然發(fā)生的T2R蛋白或多肽,在細胞 中表達其,在來源于細胞的膜中表達其,在組織或動物中表達其。例 如,可使用舌的切片、來自舌的分離的細胞、轉化細胞或膜??墒褂?此處描述的體外或體內(nèi)測定法中的一種檢驗調節(jié)作用。
      調節(jié)劑的檢測
      下面描述用于確定受試化合物是否在體外和體內(nèi)特異性結合本發(fā) 明的T2R多肽的組合物和方法。可監(jiān)測細胞生理學的許多方面以評估 對本發(fā)明的T2R多肽的配體結合的效應??稍诒磉_化學感覺受體的完 整細胞上、在經(jīng)透化的細胞上或在由標準方法產(chǎn)生的膜部分上或體外 使用從新合成的蛋白進行這些測定法。
      在體內(nèi),味覺受體結合味覺調節(jié)化合物,然后起始化學刺激至電 信號的轉導。激活的或被抑制的G蛋白反過來將改變靶酶、通道和其 他效應器蛋白的性質。 一些實例是在視覺系統(tǒng)中轉導素對cGMP磷酸二 酯酶的激活、激活型G蛋白對腺苷酸環(huán)化酶的激活、Gq和其他同源G 蛋白對磷脂酶C的激活和Gi和其他G蛋白對各種通道的調節(jié)。也可檢 查下游結果例如由磷脂酶C導致的二酰甘油和IP3的產(chǎn)生和由此IP3 對鈣的動員。
      備選地,測定的T2R蛋白或多肽可來源于真核宿主細胞,其可包 含具有與此處公開的T2R多肽同一的氨基酸序列的氨基酸序列或其片 段或經(jīng)保守性修飾的變體。通常,氨基酸序列同一性至少為35%-50%, 或任意地為75%、 85°/。、 90%、 95%、 96°/。、 97%、 98°/?;?9%。任意地,測 定的T2R蛋白或多肽可包含T2R蛋白的結構域,例如細胞外結構域、 跨膜區(qū)、跨膜結構域、胞漿區(qū)、配體結合結構域等。此外,如上所述, 可將T2R多肽或其結構域共價連接至異源蛋白以產(chǎn)生用于此處描述的測定法的嵌合蛋白。
      如上所述,使用重組或天然發(fā)生的T2R蛋白或多肽檢驗T2R受體 活性的調節(jié)劑??煞蛛x重組的或天然發(fā)生的T2R蛋白或多肽,在細胞 中表達其、在來源于細胞的膜中表達其,在組織或動物中表達其。例 如,可使用舌的切片、來自舌的分離的細胞、轉化細胞或膜??墒褂?此處描述的體外或體內(nèi)測定法中的一種檢驗調節(jié)作用。
      1.體外結合測定
      也可在體外用溶性狀態(tài)或固體狀態(tài)的反應,使用本發(fā)明的T2R多 肽來檢查味覺轉導。在特定的實施方案中,可在體外在溶性狀態(tài)或固 體狀態(tài)的反應中使用T2R配體結合結構域測定配體結合。
      可能可用N末端結構域與細胞外結構域的額外部分例如跨膜結構 域的細胞外環(huán)一起形成配體結合結構域。
      已對其他GPCR例如親代謝性谷氨酸鹽受體(參見,例如,Han和 Hampson, J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999))使用體外結合 測定。這些測定可包括置換放射性標記或熒光標記的配體,測量內(nèi)熒 光的改變或蛋白水解易感性的改變等。
      可在溶液中、在任意地附著至固相的雙層膜中、在脂質單層中或 在媒介物中檢驗對本發(fā)明的T2R多肽的配體結合??墒褂?,例如光譜 特征(例如,熒光、吸光度、折光指數(shù))、流體動力學(例如,形狀)、 色譜或穩(wěn)定性特征的變化來檢驗調節(jié)的結合。
      在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,使用ws]GTPyS結合測定法。如上 所述,在GPCR激活后,G蛋白復合物的G。亞基經(jīng)激發(fā)將結合的GDP 與GTP交換。可在生物化學測定法中,在假定的配體存在的情況下通 過測量加入的放射性標記的,GTPyS對G蛋白的結合來測量配體介 導的G蛋白交換活性的刺激。通常,將包含目的化學感覺受體的膜與 G蛋白混合。向測定物中加入潛在的抑制劑和/或激活物以及[35S] GTP y S ,測量(,GTPvS對G蛋白的結合。可通過液體閃爍計數(shù)或通過本 領域內(nèi)已知的任何其他方法包括閃爍迫近分析法(SPA)測量結合。在其 他測定形式中,可使用熒光標記的GTPyS 。2.熒光偏振測定法
      在另一個實施方案中,可使用基于熒光偏振("FP")的測定法檢 測和監(jiān)測配體的結合。熒光偏振是用于測量平衡結合、核酸雜交和酶 活性的通用實驗室技術。熒光偏振測定是均質性的,因為它們不需要 分離步驟例如離心、過濾、層析、沉淀或電泳。這些測定法可在溶液 中實時進行而不需要固定相。因為測量偏振非??焖俨⑶也黄茐臉悠?, 從而可重復地和在加入試劑后測量偏振值。通常,該技術可用于測量 從較低的皮摩爾至微摩爾水平的熒光基團的偏振值。本部分描述了可 以簡單和定量的方法將熒光偏振用于測量配體對本發(fā)明的T2R多肽的
      結合的方法。
      當用平面偏振光激發(fā)熒光標記的分子時,其發(fā)射具有與其分子旋 轉成反比的偏振度數(shù)的光。大的熒光標記的分子在激發(fā)狀態(tài)下保持相 對穩(wěn)定(在螢光素的情況4納秒)并且光的偏振在激發(fā)和發(fā)射之間保持 相對恒定。小的熒光標記的分子在激發(fā)狀態(tài)下快速旋轉,偏振在激發(fā) 和發(fā)射之間顯著變化。因此,小分子具有較低的偏振值而大分子具有 較高的偏振值。例如,單鏈螢光素標記的寡核苷酸具有相對較低的偏 振值但當其與互補鏈雜交時,其具有更高的偏振值。當使用FP檢測和 監(jiān)測味覺引發(fā)化合物結合(所述結合可激活或抑制本發(fā)明的化學感覺 受體)時,可使用熒光標記的味覺引發(fā)化合物或自發(fā)熒光味覺引發(fā)化 合物。
      熒光偏振(P)定義為
      P- [Intpar-IntW)l
      其中,IntpH是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光的強度,Int^p是與激 發(fā)光平面垂直的發(fā)射光的強度。P,光強度的比率,是無因次數(shù)。例如, BeaconTM和Beacon 2000 ??蓪⑾到y(tǒng)與這些測定結合使用。此類系統(tǒng) 通常以毫偏振單位(l偏振單位-1000 mP單位)表示偏振。
      用Perr in公式描述分子旋轉和大小之間的關系,讀數(shù)參考引用作 為參考的 Jolley, M. E.(1991) in Journal of AnalyticalToxicology, pp. 236_240,所述文獻給出了該公式的詳盡解釋。簡而 言之,Summarily, the Perrin公式說明偏振與旋轉張弛時間(使分 子旋轉通過大約68. 5°所花的時間)成正比。旋轉松弛時間通過下列 公式與粘度(eta.)、絕對溫度(T)、分子體積(V)和氣體常數(shù)(R)產(chǎn)生相 系2(旋轉木〉弛時間)- 3 V RT
      旋轉松弛時間對于小分子(例如,螢光素)較短(約等于納秒), 對于大分子較長(約等于1Q0納秒)。如果粘度和溫度保持恒定,那 么偏振與分子體積成正相關。分子體積的改變可歸因于與其他分子的 相互作用、分離、偏振、降解、雜交、或熒光標記的分子的構象變化 相關。例如,已將熒光偏振用于測量蛋白酶、DNA酶和RNA酶對荄光 素標記的聚合物的酶促切割。其也用于測量蛋白/蛋白相互作用、抗體 /抗原結合和蛋白/DNA結合的平衡結合。
      A.固體狀態(tài)和溶性狀態(tài)的高通量測定法
      在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了使用T2R多肽或表達T2R多 肽的細胞或組織的溶性狀態(tài)測定法。在另一個實施方案中,本發(fā)明提 供了高通量形式的基于固相的體外測定法,其中將T2R多肽或表達T2R 多肽的細胞或組織附著至固相基質或味覺刺激化合物并與T2R受體接 觸,然后使用合適的標記或針對T2R受體產(chǎn)生的抗體檢測結合。
      在本發(fā)明的高通量測定法中,可能在一天內(nèi)篩選出高達數(shù)千種不 同的調節(jié)劑或配體。特別地,可使用微量滴定板的各孔進行針對選擇 的潛在的調節(jié)劑的分離測定,或,如果要觀察溫度或溫育時間效應, 可在每5至IO個孔中試驗單種調節(jié)劑。因此,單個標準微量滴定板可 測定大約100 (例如,96)種調節(jié)劑。如果使用1536孔板,那么可在
      單個板中容易地測定大約iooo至大約lsoo種不同的化合物。也可能
      在單個板孔中測定多種化合物??赡苊刻鞙y定幾塊不同的板;使用本 發(fā)明的整合的系統(tǒng)可能測定篩選多達大約6, 000-20, 000種不同的化 合物。最近,已發(fā)展了用于試劑操作的微流方法。
      可直接或間接,通過共價或非共價鍵例如通過標簽(tag)將目的分子結合至固體狀態(tài)的組分。所述標簽可以是多種組分中的任一種。 通常,將結合標簽的分子(標簽粘合劑)固定至支持物,將被標記的 目的分子(例如,目的味覺轉導分子)通過標簽與標簽粘合劑的相互 作用附著至固體支持物。
      基于文獻中詳細描述的已知的分子相互作用,可使用許多標簽和
      標簽粘合劑。例如,當標簽具有天然粘合劑例如生物素、A蛋白或G 蛋白時,可將其與合適的標簽粘合劑(抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、 neutravidin、免疫球蛋白的Fc區(qū)等)一起使用??咕哂刑烊徽澈蟿┑?分子例如生物素的抗體和合適的標簽粘合劑也是可廣泛商購獲得的 (參見,SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis Mo.)。
      類似地,可將任何半抗原或抗原性化合物與合適的抗體一起使用, 從而形成標簽/標簽粘合劑對。數(shù)千種特定的抗體可商購獲得,許多額 外的抗體描述于文獻中。例如,在一個通用構型中,標簽是第一抗體 而標簽粘合劑是識別第 一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用之 外,受體-配體相互作用也適合作為標簽和標簽-粘合劑對。例如,細 胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如,細胞受體-配體相互作用例如轉鐵 蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白細胞 介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、 選擇家族等;參見,例如,Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993))。類似地,毒素和毒液(venom)、病毒表位、 激素(例如,阿片制劑(opiate)、類固醇等)、細胞內(nèi)受體(例如,介 導各種小配體(包括類固醇、甲狀腺激素、類視黃醇和維生素D)的 效應的細胞內(nèi)受體;肽)、藥物、外源凝集素、糖、核酸(線性的和環(huán) 形的聚合物構型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗體全部都可與各種細胞受 體結合。
      合成的聚合物,例如聚氨基曱酸乙酯、聚脂、聚碳酸酯、聚脲 (polyurea)、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亞 胺和聚乙烯(polyacetate)也可形成合適的標簽或標簽粘合劑。許多其他標簽/標簽粘合劑對也用于此處描述的測定系統(tǒng),在回顧本公開內(nèi) 容后,這對于本領域技術人員來說是顯然的。
      通用連接體例如肽、聚酯等也可用作標簽,其包括多肽序列,例
      如大約5至200個氨基酸的聚甘氨酸序列。這樣的柔韌的連接體對于 本領域技術人員來說是已知的。例如,可從Shearwater Polymers, Inc. HuntsviUe, Ala商購獲得聚(乙二醇)連接體。此類連接體任意地 具有酰胺鍵、巰基鍵(sulf hydryl 1 inkage )或雜功能鍵 (heterofunctional linkage)。
      使用目前可獲得的多處方法中的任一種方法將標簽粘合劑固定至 固體基質。通常可通過將基質的全部或部分暴露于化學試劑中來衍生 或功能化固體基質,所述化學試劑將化學基團固定至與標簽粘合劑的 部分反應的表面。例如,適合附著至更長鏈部分的基團包括胺基、羥 基、巰基和羧基。氨基烷基甲硅烷(Aminoalkylsilane)和羥醛賴氨 酸(hydroxyalkylsilane)可用于功能化各種表面例如玻璃表面。這
      樣的固相生物聚合物陣列的構建詳細地描述于文獻中。參見,例如, Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)(描述例如 肽的固相合成);Geysen等人,J. Immun. Meth. , 102:259-274 (1987) (描述針上的固相組分的合成);Frank & Doring, Tetrahedron, 44: 60316040 (1988)(描述纖維素盤上的各種肽序列的合成);Fodor 等人,Science, 251:767-777 (1991); Sheldon等人,Clinical Chemistry, 39 (4): 718-719 (1993);和Kozal等人,Nature Medicine, 2 (7): 753759 (1996)(全都描述固定至固體基質的生物聚合物的排 列)。用于將標簽粘合劑固定至底物的非化學方法包括其他通用方法, 例如加熱、使用UV照射的交聯(lián)法等。
      3.基于細胞的測定法
      在一個優(yōu)選實施方案中,T2R蛋白以未經(jīng)修飾的形式或作為嵌合 物、變體或截斷的受體形式在真核細胞中表達,其具有或優(yōu)選不具有 幫助其成熟和通過分泌途徑靶向的異源伴侶序列。這樣的T2R多肽可以在任何真核細胞例如HEK-293細胞中表達。優(yōu)選地,所述細胞包含 功能性G蛋白,例如G. 。15或嵌合G. al6、味導素或轉導蛋白或嵌合G 蛋白例如G16gust44或Gal6trans44嵌合物,所述蛋白能夠將嵌合物 受體偶聯(lián)至細胞內(nèi)信號轉導途徑或偶聯(lián)至信號轉導蛋白例如磷脂酶 C。可使用任何標準方法,例如通過檢測細胞中FURA-2依賴性熒光來 檢測細胞內(nèi)釣的變化來檢測此類細胞中T2R受體的激活。這樣的測定 是本申請中展示的實驗發(fā)現(xiàn)的基礎。
      激活的GPCR受體通常是磷酸化該受體的C末端尾部(和可能其他 位點)的激酶的底物。因此,激活物將提高32P從放射性標記的ATP 至受體的轉移,這可用閃爍計數(shù)來測定。C末端尾部的磷酸化將促進 抑制蛋白樣蛋白的結合以及將干擾G蛋白的結合。關于GPCR信號轉導 和測定信號轉導的方法的一般綜述,參見,例如,Methods in Enzyniology,第237和238巻(1994)和第96巻(1983); Bourne等人, Nature, 10: 349:117-27 (1991); Bourne等人,Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher等人,Annu. Rev. Biochem. , 67:653-92 (1998)。
      可通過將用假定的T2R調節(jié)劑處理的T2R多肽的反應與未處理的 對照樣品或包含已知的"陽性"對照的樣品的反應進行比較來測定T2R 調節(jié)作用。該假定的T2R調節(jié)劑可包括抑制或激活T2R多肽活性的分 子。在一個實施方案中,給用激活T2R的化合物處理的對照樣品賦予 100的相對T2R活性值。當相對于對照樣品的T2R活性值是大約90%, 任意地50%,任意地25-0%時獲得對T2R多肽的抑制。當相對于對照樣 品的T2R活性值是大約110%,任意地150%, 200-500%或1000-2000% 時,獲得對T2R多肽的激活。
      可通過確定表達T2R多肽的細胞或膜的離子極化(即,電勢)的 變化來估量離子流的變化。確定細胞極化的變化的一個方法是通過用 電位鉗和膜片鉗技術(參見,例如,"細胞附著的(cell-attached)" 模型、"內(nèi)-外(inside-out )"模型和"完整細胞"模型,例如,Acke纖n 等人,New Engl. J Med. , 336:1575-1595 (1997))測量電流的變化 (從而測量極化的變化)。z使用標準技術常規(guī)地確定完整細胞的電流。其他已知的測定法包括放射性標記的離子流測定法和使用電壓敏感 染料的熒光測定法(參見,例如,Vestergarrd-Bogind等人,J. Membrane Biol. , 88: 67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269-277 (1997); Daniel等人,J. Pharmacol. Meth. , 25: 185-193 (1991); Holevinsky 等人,J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994))。
      可通過檢查上述的任何參數(shù)來測量受試化合物對多肽功能的影 響。影響GPCR活性的任何合適的生理改變可用于估量受試化合物對本 發(fā)明的多肽的影響。當使用完整細胞或動物確定功能性效果時,也可 測量各種效應例如遞質釋放、激素釋放、對已知的和未表征的遺傳標 記的轉錄的改變(例如,northern印跡)、細胞代謝的變化例如細胞 生長或pH的變化和細胞內(nèi)第二信使例如Ca. sup. 2+、IP3、cGMP或cAMP 的變化。
      用于GPCR的優(yōu)選測定法包括裝載離子或電壓敏感染料以報告報 告子活性的細胞。用于確定此類報告子活性的測定法也可使用其他G 蛋白偶聯(lián)受體的已知的激動劑和拮抗劑作為對照來估量受試化合物的 活性。在用于鑒定調節(jié)化合物(例如激動劑、拮抗劑)的測定法中, 分別使用離子敏感指示劑或膜電位熒光指示劑來監(jiān)測細胞質中的離子 水平或膜電位的變化。可使用的離子敏感指示劑和電壓探針是 Molecular Probes 1997 Catalog中公開的指示劑和探針。對于G蛋 白偶聯(lián)受體,混合的G蛋白例如G。"和Gal6可用于選擇的測定法 (Wilkie等人,Proc. Nat'1 Acad. Sci. , 88:10049-10053 (1991))。 備選地,可使用其他G蛋白例如味導素、轉導蛋白和嵌合G蛋白例如 G oc 16gust44或Goc 16trans44。
      受體激活起始了隨后的細胞內(nèi)事件,例如,第二信使的增加。一 些G蛋白偶聯(lián)受體的激活通過磷脂酶C介導的磷脂酰肌醇的水解刺激 三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984))。 IP3又刺激細胞內(nèi)鈣離子庫的釋放。從而,細胞質鈣離子水 平的改變或第二信使例如IP3的水平的改變可用于估量G蛋白偶聯(lián)受體的功能。作為鈣從細胞內(nèi)庫釋放和鈣通過質膜離子通道進入的結果,
      表達此類G蛋白偶聯(lián)受體的細胞可展示增加的細胞質鉤水平。
      在優(yōu)選實施方案中,通過在異源細胞中表達T2R基因來測量T2R 肽的活性,所述細胞具有將該受體連接至磷脂酶C信號轉導途徑的混 合 G 蛋白(參見 Offermanns & Simon, J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995))。優(yōu)選地,所述細胞是HEK-293 (其異常地 表達T2R基因),所述混合G蛋白是Gd5 (Offermanns & Simon,同上) 或嵌合G蛋白例如Get 16gust44。通過測量細胞內(nèi)0&2+水平的變化來測 定味覺轉導的調控,所述Ca2+水平響應對T2R信號轉導途徑的調節(jié)(所 述調節(jié)通過施用與T2R多肽結合的分子而產(chǎn)生)而發(fā)生變化。任意地 使用熒光Ca2+指示劑染料和熒光成像術測量Ca"水平的變化。
      在另一個實施方案中,可按照美國專利5, 436,128 (此處引用作 為參考)分析磷脂酰肌醇(PI)的水解。簡而言之,所述測定包括用 3H-肌醇標記細胞進行48或更多小時。用受試化合物標記處理標記的 細胞,進行1小時。裂解經(jīng)處理的細胞,然后在氯仿-甲醇-水中提取, 之后通過離子交換層析分離磷酸肌醇,用閃爍計數(shù)進行定量。通過計 算激動劑存在時的cpm對緩沖劑對照存在時的cpm的比率來確定刺激 倍數(shù)。同樣,通過計算拮抗劑存在時的cpm對緩沖劑對照(其可以包 含或可以不包含激動劑)存在時的cpm的比率來確定抑制倍數(shù)。
      其他受體測定包括確定細胞內(nèi)環(huán)核苷酸例如cAMP或cGMP的水平。
      在其中受體的激活導致環(huán)核苷酸水平隆低的情況下,可在向測定中的 細胞加入激活受體的化合物之前,優(yōu)選地將細胞暴露于增加細胞內(nèi)環(huán) 核苷酸水平的試劑例如福斯高林(forskolin)。在一個實施方案中, 可使用免疫測定法測量細胞內(nèi)cAMP或cGMP的變化??蓪ffermanns & Simon, J. Bio. Chem. , 270:15175-15180 (1995)中描述的方法用 于確定cAMP的7K平。此外,也可將Felley-Bosco等人,Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. , 11: 159-164 (1994)中描述的方法用于確定cGMP 的水平。此外,美國專利4, 115, 538 (此處引用作為參考)中描述了 用于測量cAMP和/或cGMP的測定試劑盒。在另一個實施方案中,可測量轉錄水平以估量受試化合物對信號
      轉導的影響。將包含目的T2R多肽的宿主細胞與受試化合物接觸足夠 的時間以產(chǎn)生任何相互作用,然后測量基因表達的水平??赏ㄟ^經(jīng)驗 確定,例如通過進行時間進程和測量作為時間的函數(shù)的轉錄水平來確 定產(chǎn)生該相互作用的時間量。可通過使用本領域技術人員已知的適合 的任何方法測量轉錄量。例如,可使用northern印跡法檢測目的蛋 白的mRM表達或使用免疫測定法鑒定它們的多肽產(chǎn)物。備選地,可 如美國專利5, 436,128 (此處引用作為參考)中所描述的,使用基于 轉錄、使用報告基因的測定法。報告基因可以是例如氯霉素乙酰轉移 酶、螢光素酶、半乳糖苷酶、P-內(nèi)酰胺酶和堿性磷酸酶。此外, 通過附著至第二報告子例如綠色熒光蛋白可將目的蛋白用作間接報告 子(參見,例如,Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15: 961-964 (1997))。
      然后將轉錄的量與在受試化合物不存在的情況下在相同細胞中的 轉錄量比較,或可將其與缺乏目的T2R多肽的、基本上相同的細胞中 的轉錄量比較。基本上相同的細胞可由從其制備重組細胞但未通過導 入異源DNA而被修飾的相同細胞衍生。轉錄量上的任何差異表明受試 化合物以某種方式改變目的T2R多肽的活性。
      4.表達化學感覺受體的轉基因非人動物
      表達本發(fā)明的一種或多種味覺受體序列的非人動物也可用于受體 測定。可通過將非人動物(所述非人動物是用編碼化學感覺受體或其 配體結合區(qū)的核酸穩(wěn)定或瞬時轉染的非人動物)與受試化合物接觸來 這樣的表達用于確定受試化合物是否在體內(nèi)特異性結合哺乳動物味覺 跨膜受體復合物,然后確定動物是否通過特異性結合所述受體多肽復 合物而對受試化合物發(fā)生反應。
      特別地將用本發(fā)明的載體轉染或感染的動物用于鑒定和表征味覺 刺激物的測定法,所述味覺刺激物可結合特定的或成組的受體。這樣 的載體感染的、表達人味覺受體序列的動物可于體內(nèi)篩選味覺刺激物和它們對例如細胞生理(例如,對p未覺神經(jīng)元)、對CNS或行為的影 響。
      單個地或作為文庫感染/表達核酸和載體的方法在本領域內(nèi)是熟 知的。可通過許多方法測量許多單個細胞、器官或完整動物的參數(shù)。 本發(fā)明的T2R序列可通過感染劑例如腺病毒表達載體遞送在例如動物 味覺組織中表達。
      內(nèi)源味覺受體基因可保持功能并且野生型(天然)活性仍然可以 存在。在希望所有味覺受體活性由導入的外源雜交受體提供的其他情 況下,優(yōu)選地使用基因敲除系。用于構建非人轉基因動物特別是轉基 因小鼠和選擇和制備用于產(chǎn)生轉化細胞的重組構建體的方法在本領域 內(nèi)是熟知的。
      "基因敲除"細胞和動物的構建基于前提,即可通過將新DNA序
      列導入基因組來減少或完全消除哺乳動物細胞中特定基因的表達水 平,所述新DNA序列用于打斷被抑制的基因的DNA序列的某些部分。 此外,可將"基因捕獲插入"用于斷裂宿主基因,和可使用小鼠胚胎 干 (ES)細胞產(chǎn)生基因敲除轉基因動物(參見,例如,Holzschu, Transgenic Res 6: 97-106 (1997))。通常通過互補核酸序列之間的 同源重組進行外源序列的插入。外源序列是被修飾的靶基因的某個部 分,例如外顯示子、內(nèi)含子或轉錄調控序列,或能夠影響靶基因表達 的水平的任何基因組序列;或其組合。通過多能胚胎千細胞中的同源
      重組進行的基因靶向允許人們精確地改變目的基因組序列。任何技術 可用于產(chǎn)生、篩選、繁殖基因敲除動物,例如,參見Bijvoet, Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Meredith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19: 161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321-328 (1997);美國專利5,616,491、 5, 464, 764、 5,631,153、 5, 487,992、 5,627,059、 5,272,071; W0 91/09955、 W0 93/09222、 WO 96/29411、 W0 95/31560、 W0 91/12650。
      本發(fā)明的核酸也可用作產(chǎn)生"基因敲除"的人細胞和其后代的試劑。同樣,本發(fā)明的核酸也可用作在小鼠中產(chǎn)生"基因替換
      (knock-ins )"的試劑。人或大鼠T2R基因序列可替換小鼠基因組中 的直系同源T2R。這樣,產(chǎn)生了表達人或大鼠T2R的小鼠。然后將該 小鼠用于分析人或大鼠T2R的功能和鑒定該T2R的配體。
      調節(jié)劑
      作為T2R家族成員的受試化合物可以是任何小化學化合物或生物 實體,例如蛋白、糖、核酸或脂質??蛇x地,調節(jié)劑可以是T2R家族 成員的經(jīng)基因工程改變的形式。通常,受試化合物可以是小化學分子 和肽。本質上任何化合物可在本發(fā)明的測定中用作潛在的調節(jié)劑或配 體,盡管大部分?;衔锟扇芙庠谑褂玫乃蛴袡C(特別是基于DMS0 的)溶液??赏ㄟ^使測定步驟自動化和從任何方便的來源向測定提供 化合物來設計篩選大規(guī)?;瘜W文庫的測定法,通常平行進行(例如, 在自動化測定中以微量滴定板上的微量滴定形式)所述測定。存在許 多化合物的供應商,包括Sigma (St. Louis, Mo. )、Aldrich (St. Louis: Mo.) 、 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.) 、 Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland)等。
      在一個實施方案中,高通量篩選方法包括提供包含大量潛在治療 化合物(潛在調節(jié)劑或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后如此 處所描述的,在一個或多個測定中篩查"組合化學文庫"或"配體文 庫,,以鑒定展示希望的特征活性的文庫成員(特定的化學物質種類或 亞類)。所鑒定的化合物可用作常規(guī)的"前導化合物"或其自身可用 作潛在的或實際的消費品。
      組合化學文庫是通過化學合成或生物合成,通過組合許多化學"建 筑塊,,(building blocks )例如試劑產(chǎn)生的不同化合物的集合。例如, 線性組合化學物質文庫例如多肽文庫是通過以每一種可能的方式就給 定的化合物長度(即,多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)組合成組的化學建 筑塊(氨基酸)形成的。可通過這樣的化學建筑塊的組合的混合合成 數(shù)百萬種化合物。組合化學物質文庫的制備和篩查對于本領域技術人員來說是熟知 的。這樣的組合化學文庫包括但不限于肽文庫(參見,例如,美國專利
      5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. , 37:487-93 (1991) 和Houghton等人,Nature, 354:84-88 (1991))。也可使用用于產(chǎn)生 化學物質多樣性文庫的其他化學物質。此類化學物質包括但不限于 類肽(例如,WO 91/19735)、編碼的多肽(例如,WO 93/20242)、隨機 生物寡聚物(例如,W092/00091)、苯二氮平類(benzodiazepines )(例 如,美國專利5, 288, 514) 、 diversomer例如乙內(nèi)酰脲類、苯二氮平類 和二肽(Hobbs等人,PNAS. , 90:6909-13 (1993))、 vinylogous多肽 (Hagihara等人,J. Amer. Chem. Soc, 114: 6568 (1992))、具有葡 萄糖骨架的非狀狀才莫才以物(nonpeptidal peptidomimetics ) (Hirschmann等人,J. Amer. Chem. Soc, 114:9217-18 (1992))、小 化合物文庫的類似的有機合成(Chen等人,J. Amer. Chem. Soc, 116:2661 (1994))、寡氨基甲酸酯類(oligocarbamates ) (Cho等人, Science, 261:1303 (1993))、肽基膦酸酯(peptidyl phosphonate) (Campbell等人,J. Org. Chem. , 59:658 (1994))、核酸文庫(Ausubel, Berger, 和Sambrook, 所有同上)、肽核酸文庫(美國專利 5, 539, 083)、 抗體文庫(Vaughn等人,Nature Biotechnology, 14 (3): 309-14 (1996)和PCT/US96/10287)、糖類文庫(Liang等人, Science, 274: 1520-22 (1996)和美國專利5, 593, 853)、小有機分子文 庫(苯并二氮卓類,Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993);瘞唑烷 酮和間瘞溱酮類,美國專利5, 549, 974;吡咯烷,美國專利5, 525, 735 和5, 519, 134;嗎啉代化合物,美國專利5, 506, 337;苯并二氮卓類, 5, 288, 514等)。
      用于制備組合文庫的裝置可商購獲得(參見,例如,35/7 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville Ky.) 、 Symphony (Rainin, Woburn, Mass.)、 433A (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)、 9050 Plus (Millipore, Bedford, Mass.))。此外,許多組合文庫本 身可商購獲得(參見,例如,ComGenex, Princeton, N. J. ; Tripos,Inc., St. Louis, Mo.; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences; Columbia, Md.; etc.)。
      在本發(fā)明的一個方面,T2R調節(jié)劑可用于任何食品、糕餅、藥物 組合物或其成分,從而以希望的方式調節(jié)所述產(chǎn)品、組合物或成分的 味道。例如,可加入增強苦味感覺的T2R調節(jié)劑以給產(chǎn)品或組合物提 供苦味,可加入阻斷苦味感覺的T2R調節(jié)劑以阻斷產(chǎn)品或組合物的苦 味。此外,本發(fā)明也提供了鑒定食物、飲料和藥物中發(fā)現(xiàn)的苦味化合 物和產(chǎn)生味道改善的、缺乏其或具有減少的其的量的食物、飲料和藥 物的方法。
      本發(fā)明鑒定的化合物的用途
      可將根據(jù)本發(fā)明鑒定的化合物加入食物、飲料或藥物組合物以調 節(jié)(優(yōu)選阻斷)苦味化合物(例如咖啡或其他食物和飲料中發(fā)現(xiàn)的綠 原酸內(nèi)酯和結構相關化合物例如其他綠原酸苦味化合物)對hT2R8、 hTlR14和hT2R54的激活而引發(fā)的苦味。例如,為了阻斷與綠原酸內(nèi) 酯或其他苦味化合物相關的苦味,可將阻斷綠原酸內(nèi)酯或相關化合物 對hT2R8、hT2R14或hT2R54的激活的化合物用作咖啡々大料和咖啡風味 的食物中的添加劑。例如,可將此類化合物以有效抑制苦味的量加入 咖啡風味的食物和々大料中。
      如之前所指出的,優(yōu)選地,可在味覺試驗例如人味覺試驗中驗證
      基于受試者T2R的測定中鑒定的化合物的味覺調節(jié)特性。 試劑盒
      T2R基因和其同源物是用于鑒定味覺受體細胞,用于法庭論證和 親子關系確定以及用于檢查味覺轉導的有用工具。將對T2R核酸特異 性雜交的T2R家族成員特異性試劑例如T2R探針和引物以及對T2R蛋 白特異性結合的T2R特異性試劑例如T2R抗體用于檢測味覺細胞的表
      達和味覺轉導調控。
      就樣品中T2R家族成員的DM和RNA的存在進行的核酸測定包括許多本領域^支術人員已知的技術,例如southern分析、northern分 析、點印跡法、RNA酶保護法、Sl分析、擴增技術例如PCR和原位雜 交。例如,在原位雜交中,將靶核酸以例如可獲得用于在細胞內(nèi)進行 雜交的方式從其細胞環(huán)境中釋放出來,同時保持細胞的形態(tài)學以進行 隨后的解釋和分析。下列論文提供了關于原位雜交領域的概述 Singer等人,Biotechniques, 4: 230250 (1986); Haase等人, Methods in Virology,第VII巻189-226 (1984);和Names等人,編 著,Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (1987)。 此外,可使用上述的各種免疫測定技術檢測T2R蛋白。通常將受試樣 品與正對照(例如,表達重組T2R蛋白的樣品)和負對照進行比較。
      本發(fā)明也提供了用于調節(jié)T2R家族成員的試劑盒。可容易地從可 獲得的材料和試劑制備這樣的試劑盒。例如,該試劑盒可包含任一種 或多種下列物質T2R核酸或蛋白、反應試管和用于檢測T2R活性的 說明書。任意地,試劑盒包含功能性T2R多肽。可按照本發(fā)明,依賴 于試劑盒的希望的用戶和用戶的特殊需要制備許多種試劑盒和組分。
      現(xiàn)已在本發(fā)明中進行了 一般描述,參考下列實施例將更容易地理 解本發(fā)明,以舉例說明的方式提供所述實施例而不希望將其作為限制。 要理解可對此處公開的示例性實施方案進行各種修飾和改變而不背離 本發(fā)明的精神和范圍。
      實施例 實施例1
      在本實施例中,我們顯示3CoQAL (苦味綠原酸內(nèi)酯化合物)特異 性激活具有本申請中包含的DM序列的hT2R8、hT2R14和hTH54人苦 味受體。
      在基于細胞的測定法中通過檢測細胞內(nèi)鈣濃度的變化來測量 3CoQAL對此類受體的激活。簡而言之,將人胚胎腎細胞接種在48孔 組織培養(yǎng)板中。24小時后,用包含hT2R8、 hT2R14或hHR54核酸序列的質粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的質粒瞬時轉染細胞。再過 24小時后,將所述細胞與對于鈣是特異性的熒光染料(Fluo-4或 Fura-2;分子探針)一起溫育,所述染料提供了快速、簡單和可靠的基 于熒光的檢測細胞內(nèi)部鉤濃度變化的方法。T2R的激活引發(fā)了導致PLC 的活化和隨后細胞內(nèi)鈣濃度的增加的信號級聯(lián)反應。該鉤離子濃度的 增加改變了鈣染料在細胞內(nèi)的焚光特性。使用焚光顯微鏡和專門設計 的軟件(Imaging Workbench, Axon)監(jiān)控這些變化。通過使用該方法, 我們觀察到綠原酸內(nèi)酯3CQAL和4CQAL都特異性激活表達此類T2R的 細胞(增加細胞內(nèi)鉀濃度)(參見圖3)。(參見圖2中所列的受試劑 量)。
      實施例2
      在本實施例中,我們顯示3CQAL和4CQAL (兩種苦味綠原酸內(nèi)酯 化合物)特異性激活hT2R8、 hT2R14和hT2R54,分別具有本申請中的 SEQ ID NO: 2、 4和6中包含的DNA序列的人苦味受體。
      在基于細胞的測定法中通過檢測細胞內(nèi)鈣濃度的變化來測量 3CQAL和4CQAL對該受體的激活。簡而言之,將人胚胎腎細胞接種在 48孔組織培養(yǎng)板中。24小時后,用包含hT2R8、 hT2R14或hT2R54核 酸序列的質粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的質粒瞬時轉染細胞。再 過24小時后,將所述細胞與對于釣是特異性的熒光染料(Fluo-4或 Fura-2;分子探針)一起溫育,所述染料提供了快速、簡單和可靠的基 于熒光的檢測細胞內(nèi)部鈣濃度變化的方法。T2R的激活引發(fā)了導致PLC 的活化和隨后細胞內(nèi)鈣濃度的增加的信號級聯(lián)反應。該鈣離子濃度的 增加改變了鉤染料在細胞內(nèi)的熒光特性。使用熒光顯微鏡和專門設計 的軟件(Imaging Workbench, Axon)監(jiān)控這些變化。通過使用該方法, 我們觀察到綠原酸內(nèi)酯3CQAL和4CQAL都特異性激活表達此類HR的 細胞(增加細胞內(nèi)鈣濃度)(參見圖3)。
      實施例3在本實施例中,我們顯示4FQAL (苦味綠原酸內(nèi)酯化合物)特異 性激活hT2R8、 hT2R14和hT2R54,即分別具有本申請中的SEQ ID N0: 2、 4和6中包含的DNA序列的人苦味受體。
      在基于細胞的測定法中通過檢測細胞內(nèi)4丐濃度的變化來測量 4FQAL對該受體的激活。簡而言之,將人胚胎腎細胞接種在48孔組織 培養(yǎng)板中。24小時后,用包含hT2R8、 hT2R14或hT2R54核酸序列的 質粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的質粒瞬時轉染細胞。再過24小 時后,將所述細胞與對于鈣是特異性的熒光染料(Fluo-4或Fura-2; 分子探針)一起溫育,所述染料提供了快速、簡單和可靠的基于熒光的 檢測細胞內(nèi)部鈣濃度變化的方法。T2R的激活引發(fā)了導致PLC的活化 和隨后細胞內(nèi)鈣濃度的增加的信號級聯(lián)反應。該鈣離子濃度的增加改 變了鈣染料在細胞內(nèi)的熒光特性。使用熒光顯微鏡和專門設計的軟件 (Imaging Workbench, Axon)監(jiān)控這些變化。通過使用該方法,我們觀 察到兩種綠原酸內(nèi)酯4FQAL都特異性激活表達此類T2R的細胞(增加 細胞內(nèi)鉀濃度)(參見圖4)。
      此處例舉的hT2R基因和多肽的序列 >hT2R8核香酸(SEQ ID NO: 2)
      ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGA TACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAOTTGACTACATCCTTACCAAT TTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTC3TAATGGTTOTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTT TATACAAAAAATAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATOTGGATTACC ApCTGCCTTAATCTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAA ATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCMTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATA GTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGT AAAATACCATACTTTGAACCCTTGACTCTCTTTAACCTGTTTGCAATTGTCqCATTTATTGTGTCACTGATATCA TTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGCAAATAAAACTCi7VTGCTACCGGCAC3TAGA(3ACCCC AGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTTATCTTCTmTTTTCCTATACTATATTTCT TCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGTGGAGTTTC5GAGAGATT(3CAGCAATT CTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGCAGACATTTGTCAGAATGCTG ACATOTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
      >hT2R8蛋白(SEQ ID NO: 3)
      MFSPADNIFIIUTGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYIIjTN lAaARICLISVMWNGIVIVLNPDVyTKNKQQIVIFTFWTFANYXiNMWIT TCLNVFYFliKIASSSHPliFLWLKWKIDMWHWILIjGCFAISIjIjVSLIAAl VXiSCDYRFHAIAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPL/rijFNLFAIVPFIVSIjIS FFLIiVRSIiWRHTTO工KLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFF"FIjyyi:S SILMTFSyiiMTKYKLAVEFGElAAII/ypi/GHSLILIVLNNKLROTFVRML TCRKIACMI
      >hT2R14核苷酸(SEQ ID NO: 4)ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCOTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGT TTCATAGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCT TTGGCAATCTCTC(3AATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTC3GTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTA TTTGCCACTGAAAAAATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAOTGTCTGGTTAGCT ACAGGCCTCGGTACTTTTTATTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAA(5TGGA(3G GTTAAAAAGGTC3GTTTTGGTGCTGCTTCTTQTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATC CMATAAATGCCAOTATdAATGGATACAGAAGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTT TCCAOTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCATTTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCT'丄'CTC CTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAQAAGATQCAGCACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAA GCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTATGCCATTrTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCA GTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGTGATGGGAATGGCTTATCCTTCATGT CACrCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGfACAGGCCTCTCTGTCAGTGCTACTGTGGCTGAGGTAC: ATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA
      >hT2R14蛋白(SEQ ID NO: 5)
      MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNClDWVKGRklSSVDRlLTA
      LAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEKMFRMLTNIWTVINHFSVWLA
      TGLGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLliljVTSVFLFLNIALlNI
      H工NASINGYRRNKTCSSDSSNFTRFSSIjIVLTSTVFIF工PFTIjSIiAMFLL
      LIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLYAIFSLSFFIS
      VWTSERtiEENLI IliSQVMGMAYPSCHSCVLIliGNKKLHQASliSVIiliWLRY
      MFKDGEPSGHKEFRESS
      〉hT2R54核普酸(SEQ ID NO: 6)
      ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAOTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTA(5CAGTTTTACTT GCTGAATACCTCATTGGTATCATTQCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAG GCAGTrTCCACAAGTGGCAGGArcCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCWGATGTTA GAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTT ATATTCrTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTrTGCTGCCTGGCTCAGTTTCrTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTC TCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTT ATTTCCTTCAGTCACAGCATGrTCrGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCC TCCAACTCCACTAA(3AAAACATACTTGTCTGAC3ATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATT GTGACTCCrCTGATCATGITCArCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATG GGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAQGCTCACATGQGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTT CTCATrCTCXACATTTTCAATGCAGTTGCTCTOTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTCTGG AATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGG CTGAGAAGAGCCTOGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA
      >hT2R54蛋白(SEQ ID NO: 7)
      MTKLCDPAESELSPFIilTLIIAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVONK AVSTSGRI LVFIiSVSRlALQSLMMLE工TI SSTSIiSFTSEDAVYYAFKI SF IFLNFCSIjWFAAWLSFFyPVKIANFSmiFIiKLRWRITGljIPWLIjWLSVF
      工sfshsmfcinictvycnnsfpihssnstkktyliSeinvvglafffnlg:i: vtplimfrltatliillslkrhtiihm(3snatgsndpsmeahmga工kaisyf lii/nfnavalfiyiisnmpdinslwnnlcqiimaaypashsilliqdnpg
      XiRRAWKRLQLRIiHriYPKEWTIi
      盡管前面的詳細描述已描述了本發(fā)明的幾個實施方案,但要理解 上面的描述只是舉例說明的而不限制公開的發(fā)明。本發(fā)明只受下面的 權利要求的限定。
      權利要求
      1. 用于鑒定化合物的測定法,所述化合物調節(jié)對綠原酸內(nèi)酯發(fā)生特異性響應的人T2R苦味受體,所述hT2R選自hT2R8、hT2R14和hT2R54,該方法包括i. 就其對綠原酸內(nèi)酯化合物誘導hT2R8、hT2R14、hT2R54或其片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物的激活的影響篩選化合物,所述片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物被綠原酸內(nèi)酯或結構相關性化合物激活,和ii. 基于其對所述綠原酸內(nèi)酯或結構相關性化合物對所述受體的激活的影響確定所述化合物是否調節(jié)hT2R8、hT2R14和/或hT2R54相關性苦味。
      2. 權利要求l的測定法,其中所述hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 2中包含的序列雜交的核 酸序列編碼,或Hi.具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      3. 權利要求l的測定法,其中所述hT2R14選自i. SEQ ID NO: 5中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 6中包含的序列雜交的核 酸序列編碼,或iii. 具有與SEQ ID NO: 5中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      4. 權利要求l的測定法,其中所述hT2R54選自i. SEQ ID NO: 7中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 6中包含的序列雜交的核 酸序列編碼,或iii. 具有與SEQ ID NO: 7中包含的多肽具有至少90°/。的序列同一性的氨基酸序列。
      5. 權利要求l的測定法,其中所述味覺受體在細胞膜上表達。
      6. 權利要求1的測定法,其中所述味覺受體在分離的細胞膜上表達。
      7. 權利要求1的測定法,其中所述味覺受體在完整的細胞上表達。
      8. 權利要求l的測定法,其中所述味覺受體在真核細胞上表達。
      9. 權利要求1的測定法,其中所述味覺受體由兩棲類動物、哺乳 類動物或昆蟲的細胞表達。
      10. 權利要求1的測定法,其中所述味覺受體在選自HEK293、 BHK、 C0S、 HEK293T、 CH0和爪蟾卵母細胞的細胞上表達。
      11..權利要求l的測定法,其為熒光測定法。
      12. 權利要求l的測定法,其為結合測定法。
      13. 權利要求1的測定法,其通過測定它對細胞內(nèi)離子濃度的影響 來檢測所述化合物的影響。
      14. 權利要求1中測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)鈉或鈣的影響。
      15. 權利要求1的測定法,其檢測所述化合物對細胞膜電位的影響。
      16. 權利要求1的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體的轉 錄的影響。
      17. 權利要求1的測定法,其中基于它阻斷所述味覺受體與雷尼替 丁的相互作用的能力選擇所迷化合物。
      18. 權利要求1的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)cAMP、 cGMP 或IP3的影響。
      19. 權利要求1的測定法,其中所述味覺受體包含所述味覺受體的 細胞外結構域或跨膜區(qū)。
      20. 權利要求1的測定法,其中所述測定法使用鈣特異性熒光染料 檢測釣的變化。
      21. 權利要求1的測定法,其中所述測定法使用選自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料檢測細胞內(nèi)4丐的變化。
      22. 權利要求l的測定法,其中所述味覺受體存在于溶液中。
      23. 權利要求l的測定法,其是檢測光鐠特征、流體動力學特征或 溶解度的變化的結合測定法。
      24. 權利要求l的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與G 蛋白的復合的影響。
      25. 權利要求1的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與選 自轉導蛋白、導味素、Gal5、 0。16或其嵌合物的G蛋白的復合的影響。
      26. 權利要求l的測定法,其是熒光偏振測定法。
      27. 權利要求l的測定法,其中將所述味覺受體附著至固相基質。
      28. 權利要求l的測定法,其是高通量測定法。
      29. 權利要求l的測定法,其中由HEK293細胞表達味覺受體。
      30. 用于鑒定調節(jié)苦味受體的化合物的測定法,所述苦味受體對綠 原酸內(nèi)酯3CoQAL發(fā)生特異性反應,其中所述味覺受體選自hT2R8、 hT2R14和hT2R54,該方法包括i. 就其對3CoQAL結構相關性化合物誘導hT2R8、hT2R14或hT2R54 或其片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物的激活的影響篩選化合 物,所述片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物被3CoQAL或結構 相關性化合物激活;和ii. 基于其對3CoQAL或結構相關性化合物對所述受體的激活的影 響確定所述化合物是否調節(jié)hT2R8、 hT2R14或hT2R54。
      31. 權利要求30的測定法,其中所述hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的多肽,ii. 由與SEQ ID NO: 2中包含的核酸序列特異性雜交的核酸序列 編碼的多肽;和Hi.具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一 性的多肽。
      32. 權利要求30的測定法,其中所述hT2RM選自 i. SEQ ID NO: 3中包含的多肽,ii. 由與SEQ ID NO: 2中包含的核酸序列特異性雜交的核酸序列 編碼的多肽;和iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一 性的多肽。
      33. 權利要求30的測定法,其中所述hT2R54選自i. SEQ ID NO: 3中包含的多肽,ii. 由對SEQ ID NO: 2中包含的核酸序列特異性雜交的核酸序列 編碼的多肽;和iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一 性的多肽。
      34. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體在分離的細胞膜上 表達。
      35. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體在完整的細胞上表達。
      36. 權利要求30、 31的測定法,其中所述味覺受體在真核細胞上 表達。
      37. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體在兩棲類動物、哺 乳動物或昆蟲的細胞上表達。
      38. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體在選自HEK293、BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞上表達。
      39. 權利要求30的測定法,其為熒光測定法。
      40. 權利要求30的測定法,其為結合測定法。
      41. 權利要求30的測定法,其通過測定它對細胞內(nèi)離子濃度的影 響來檢測所述化合物的影響。
      42. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)鈉或鈣的 影響。
      43. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對細胞膜電位的影響。
      44. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體的轉錄的影響。
      45. 權利要求30的測定法,其中基于它阻斷所述味覺受體與綠原 酸內(nèi)酯化合物的相互作用的能力選擇所述化合物。
      46. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)cAMP、cGMP 或IP3的影響。
      47. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體包含所述味覺受體 的細胞外結構域或跨膜區(qū)。
      48. 權利要求30的測定法,其中所述測定法使用鉀特異性熒光染 料檢測鉀的變化。
      49. 權利要求30的測定法,其中所述測定法使用選自Fluo-3、 Fluo-4和Fura-2的染料檢測細胞內(nèi)4丐的變化。
      50. 權利要求30的測定法,其中所述味覺受體存在于溶液中。
      51. 權利要求30的測定法,其是檢測光謙特征、流體動力學特征 或溶解度的變化的結合測定法。
      52. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與 G蛋白的復合的影響。
      53. 權利要求30的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與選自轉導蛋白、導味素、Ga!5或Gau和其嵌合物的G蛋白的復合的影響。
      54. 權利要求30的測定法,其是熒光偏振測定法。
      55. 權利要求30的測定法,其中將所述味覺受體附著至固相基質。
      56. 權利要求30的測定法,其是高通量測定法。
      57. 權利要求30的測定法,其中由HEK293細胞表達味覺受體。
      58. 用于鑒定調節(jié)苦味T2R味覺受體的化合物的測定法,所述T2R 味覺受體對綠原酸內(nèi)酯3CQAL和4CQAL中的任一種或兩者發(fā)生特異性反 應,所述T2R選自hT2R8、 hTlR14和hT2R54,該方法包括i.就其對苯曱酸地那銨或結構相關性化合物誘導hT2R8、 hTlR14 和/或hT2R54或其片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物的激活的 影響篩選化合物,所述片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物被3CQAL 和4CQAL中的任一種或兩者或者結構相關性化合物激活,和ii.基于其對3CQAL和4CQAL中的任一種或兩者或者結構相關性化 合物對所述受體的激活的影響確定所述化合物是否調節(jié)hT2R8、 hT2R14 和/或hT2R54。
      59. 權利要求58的測定法,其中所述hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 2中包含的序列雜交的核 酸序列編碼;和iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      60. 權利要求58的測定法,其中所述hT2R14選自i. SEQ ID NO: 5中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 4中包含的序列雜交的核 酸序列編碼;或iii. 具有與SEQ ID NO: 5中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      61. 權利要求58的測定法,其中所述hT2R54選自i. SEQ ID NO: 7中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 6中包含的序列雜交的核 酸序列編碼;或iii. 具有與SEQ ID NO: 7中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      62. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體在細胞膜上表達。
      63. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體在分離的細胞膜上 表達。
      64. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體在完整的細胞上表達。
      65. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體在真核細胞上表達。
      66. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體由兩棲類動物、哺 乳動物或昆蟲細胞表達。
      67. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體由選自HEK293、BHK、 C0S、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞表達。
      68. 權利要求58的測定法,其為熒光測定法。
      69. 權利要求58的測定法,其為結合測定法。
      70. 權利要求58的測定法,其通過測定其對細胞內(nèi)離子濃度的影 響來檢測所述化合物的影響。
      71. 權利要求58的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)鈉或4丐的 影響。
      72. 權利要求58的測定法,其檢測所述化合物對細胞膜電位的影響。
      73. 權利要求58的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體的 轉錄的影響。
      74. 權利要求58的測定法,其中基于其阻斷所述味覺受體與 denatonium的相互作用的能力選擇所述化合物。
      75. ^又利要求58的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)cAMP、cGMP 或IP3的影響。
      76. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體包含所述味覺受體 的細胞外結構域或跨膜區(qū)。
      77. 權利要求58的測定法,其中所述測定法使用鈣特異性熒光染 料檢測釣的變化。
      78. 權利要求58的測定法,其中所述測定法使用選自Fluo-3、 Fluo-4和Fura-2的染料檢測細月包內(nèi)鉤的變化。
      79. 權利要求58的測定法,其中所述味覺受體存在于溶液中。
      80. 權利要求58的測定法,其是檢測光譜特征、流體動力學特征 或溶解度的變化的結合測定法。
      81. 權利要求58的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與 G蛋白的復合的影響。
      82. 權利要求58的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與 選自轉導蛋白、導味素、G。"和G^和其嵌合物的G蛋白的復合的影響。
      83. 權利要求58的測定法,其是熒光偏振測定法。
      84. 權利要求58的測定法,其中將所述味覺受體附著至固相基質。
      85. 權利要求58的測定法,其是高通量測定法。
      86. 權利要求58的測定法,其中由HEK293細胞表達味覺受體。
      87. 用于鑒定調節(jié)人味覺受體的化合物的測定法,所述人味覺受體 對綠原酸內(nèi)酯4FQAL發(fā)生特異性響應,該受體選自hT2R8和hT2R54, 該方法包括i. 就其對4FQAL或結構相關性化合物誘導hT2R8和/或hT2R54或 其片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物的激活的影響篩選化合物, 所述片段、變體、直系同源物、突變體或嵌合物被士的寧或結構相關性 化合物激活,和ii. 基于其對綠原酸內(nèi)酯4FQAL或結構相關性化合物對所述受體 的激活的影響確定所述化合物是否調節(jié)hT2R8和/或hT2R54相關性苦味。
      88. 權利要求87的測定法,其中所述hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 2中包含的序列雜交的核 酸序列編碼;或iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      89. 權利要求87的測定法,其中所述hT2RM選自i. SEQ ID NO: 5中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 4中包含的序列雜交的核 酸序列編碼;或iii. 具有與SEQ ID NO: 5中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      90. 權利要求l的測定法,其中所述hT2R54選自i. SEQ ID NO: 7中包含的氨基酸序列,ii. 由在嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO: 6中包含的序列雜交的核酸序列編碼;或iii.具有與SEQ ID NO: 7中包含的多肽具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
      91. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體在細胞膜上表達。
      92. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體在分離的細胞膜上 表達。
      93. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體在完整的細胞上表達。
      94. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體在真核細胞上表達。
      95. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體在兩棲類動物、哺 乳動物或昆蟲細胞上表達。
      96. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體由選自HEK293、BHK、 C0S、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞表達。
      97. 權利要求87的測定法,其為熒光測定法。
      98. 權利要求87的測定法,其為結合測定法。
      99. 權利要求87的測定法,其通過測定其對細胞內(nèi)離子濃度的影 響來檢測對所述化合物的影響。
      100. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)鈉或鈣的影響。
      101. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對細胞膜電位的影響。
      102. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體的 轉錄的影響。
      103. 權利要求87的測定法,其中基于其阻斷所述味覺受體與雷尼 替丁的相互作用的能力選擇所述化合物。
      104. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對細胞內(nèi)cAMP、 cGMP或IP3的影響。
      105. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體包含所述味覺受體 的細胞外結構域或跨膜區(qū)。
      106. 權利要求87的測定法,其中所述測定法使用鉤特異性焚光染 料檢測鉤的變化。
      107. 權利要求87的測定法,其中所述測定法使用選自Fluo-3、 Fluo-4和Fura-2的染料檢測細胞內(nèi)《丐的變化。
      108. 權利要求87的測定法,其中所述味覺受體存在于溶液中。
      109. 權利要求87的測定法,其是檢測光譜特征、流體動力學特征 或溶解度的變化的結合測定法。
      110. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與 G蛋白的復合的影響。
      111. 權利要求87的測定法,其檢測所述化合物對所述味覺受體與 選自轉導蛋白、導味素、G。,5和G^和其嵌合物的G蛋白的復合的影響。
      112. 權利要求87的測定法,其是熒光偏振測定法。
      113. 權利要求87的測定法,其中將所述味覺受體附著至固相基質。
      114. 權利要求87的測定法,其是高通量測定法。
      115. 權利要求87的測定法,其中由HEK293細胞表達味覺受體。
      116. 減輕食物、飲料或藥物中的苦味的方法,其包括向其中加入 抑制苦味的量的使用權利要求1的任何測定法鑒定的化合物。
      117. 減輕食物、飲料或藥物中的苦味的方法,其包括向其中加入 抑制苦味的量的使用權利要求30的測定法鑒定的化合物。
      118. 減輕食物、飲料或藥物中的苦味的方法,其包括向其中加入 抑制苦味的量的使用權利要求58的測定法鑒定的化合物。
      119. 減輕食物、飲料或藥物中的苦味的方法,其包括向其中加入 抑制苦味的量的使用權利要求87的測定法鑒定的化合物。
      120. 權利要求116的方法,其中所述食物、々大料或藥物包含至少 一種促成其苦味的綠原酸內(nèi)酯。
      121. 權利要求120的方法,其中所述食物、々大料或藥物是咖啡飲 料或咖啡風味的食物或藥劑。
      122. 權利要求120的方法,其中所述綠原酸內(nèi)酯選自3CoQAL、4CQAL、 4CQAL和4FQAL。
      123. 減輕食物、飲料或藥物中的苦味的方法,其包括從其中除去 在權利要求1的任一種測定法中鑒定的至少一種化合物,所述化合物誘 導或增強綠原酸內(nèi)酯化合物對hT2R8、 hT2R14和/或hT2R54的激活。
      124. 權利要求123的方法,其中所述化合物是綠原酸內(nèi)酯。
      125. 權利要求124的方法,其中所述綠原酸內(nèi)酯選自3CoQAL、 3CQAL、 4CQAL和4FQAL。
      126. 權利要求123的方法,其中所述除去是從咖啡飲料或咖啡風 味的食物或藥物中除去。
      127. 權利要求126的方法,其包括在減少至少一種促成苦味的綠 原酸內(nèi)酯的量的條件下烘焙或加工咖啡材料。
      128. 鑒定分別與其他食物、飲料或藥物相比具有減少的苦味的食 物、飲料或藥物的方法,其包括a. 從成組的食物、飲料或藥物制備提取物;b. 使用權利要求1中所述的測定法接觸來自提取物的等分試樣;c. 記錄使用各種不同等分試樣的測定法的應答;d. 將不同提取物的應答分級;和e. 選擇具有最低激活活性的食物、飲料或藥物樣品。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及T2R味覺受體家族中的特定人味覺受體對特定的苦味化合物即綠原酸內(nèi)酯化合物發(fā)生響應,所述化合物至少部分導致許多咖啡飲料的苦味的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及在測定法中使用此類受體鑒定調節(jié)綠原酸內(nèi)酯和相關化合物對此類味覺受體的激活的配體,和為了改變(阻斷)T2R相關性苦味,可將所述配體用作食物、飲料和藥物的添加劑和/或將其從食物、飲料和藥物中除去。優(yōu)選實施方案是將已鑒定的化合物用作咖啡和咖啡風味的食物、飲料和藥物中的添加劑。
      文檔編號A23F5/16GK101416055SQ200680030606
      公開日2009年4月22日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權日2005年6月22日
      發(fā)明者Q·李, 紅 徐, 李曉東, 湯輝仙 申請人:塞諾米克斯公司
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