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      診斷和治療心血管疾病的方法

      文檔序號:432958閱讀:258來源:國知局

      專利名稱::診斷和治療心血管疾病的方法診斷和治療心血管疾病的方法本發(fā)明涉及體外或者體內(nèi)診斷心血管疾病(尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他的*形成事件)的方法,其中確定個(gè)體樣品中人ARK2蛋白編碼核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸,本發(fā)明還涉及ARK2在開發(fā)和/或生產(chǎn)用于治療心血管疾病的藥物中的用途。aurora激酶是在許多實(shí)體瘤中過表達(dá)的致癌性有絲分裂絲氨^/蘇氨酸激酶家族(Vankayalapati,H.等人,(2003)MolecularCancerTherapeutics,}283-294)。起初,一種果蠅(Dra>/7/7fl)的自發(fā)染色體分離缺陷突變體被鑒定和命名為aurora(Shindo,M.等人,(1998),244,285-292)。人auroral激酶也稱為AUR1、ARK2、Alk2、AIM-1和STK12。本文使用術(shù)語ARK2。ARK2在有絲分裂中發(fā)揮作用,在有絲分裂過程中其尤其在中間體中積累(Shindo,M.等人,(1998),同上)。也已證明ARK2缺陷細(xì)胞表現(xiàn)出胞質(zhì)分裂缺陷(Descamps&Prigent(2001),Sci.STKE,173,1)。ARK2的基因位于染色體17pl3.1。為了更好的理解ARK2在人類疾病的發(fā)生和進(jìn)程中的可能涉及情況,使用良好表征的患者群進(jìn)行基因型-表型相關(guān)性分析,該分析涉及以參考號NM—004217公開的ARK2參考序列中第950位的C—T變異。所述的變異導(dǎo)致在ARK2蛋白的相應(yīng)第298位的蘇氨酸向甲Ai氨酸(Thr—Met)的氨基酸改變。已經(jīng)已知ARK2基因的不同SNP遺傳變體(單核苦酸多態(tài)性),并且公開在網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp—ref.cgilocusld=9212;http:〃www.ensembl,org/Homo一sapiens/genesnpviewdb=&gene=ENSG00000178999。令人驚訝的發(fā)現(xiàn),在編碼人ARK2蛋白的核酸中第950位的從胞嗜啶向胸腺嘧咬核苷的變異,或者在ARK2蛋白第298位從蘇氨酸向甲硫氨酸的相應(yīng)的變異與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。涉及體外或者體內(nèi)診斷心血管疾病,其中確定個(gè)體或者患者樣品中編碼人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第289位的氨基酸。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中,心血管疾病是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。具體地,如果第950位的核苷酸在染色體DNA上被確定為胸腺嘧啶核普,或者在mRNA上被確定為尿嘧啶,或者在第298位的M酸被確定為甲石危氨酸,則存在患高血壓和/或狹窄的更高的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語"ARK2-C950C"指這樣的一群個(gè)體,所述個(gè)體編碼ARK2的基因的兩個(gè)等位基因上,位于參考序列NM一004217第950位的核苷都是胞苷,該胞苷導(dǎo)致在相應(yīng)的蛋白質(zhì)第298位的氨基酸為蘇氨酸。就此ARK2變體而言,這些個(gè)體是純合的。因此,術(shù)語"ARK2-C950T"指這樣的一群個(gè)體,所述個(gè)體在編碼ARK2的基因的一個(gè)等位基因上具有胞苷(該胞苷導(dǎo)致在相應(yīng)的蛋白質(zhì)第298位的M酸是蘇氨酸),并且在編碼ARK2的基因的另一個(gè)等位基因上具有胸腺嘧咬核苷(其導(dǎo)致在相應(yīng)的蛋白質(zhì)第298位的氨基酸是甲硫氨酸)。就此ARK2變體而言,這些個(gè)體是雜合的。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語"ARK2-T950T"指這樣的一群個(gè)體,其中所述個(gè)體編碼ARK2的基因的兩個(gè)等位基因上,位于參考序列NM_004217第950位的核苷都是胸腺嘧咬核苷,該胸腺嘧咬核苷導(dǎo)致在相應(yīng)的蛋白質(zhì)第298位的氨基酸為曱硫氨酸。就此ARK2變體而言,這些個(gè)體是純合的。編碼人ARK2蛋白的參考序列的核酸序列優(yōu)選具有SEQIDNO:1的核酸序列,并且人ARK2蛋白的氨基酸序列優(yōu)選具有SEQIDNO:3的氨基,列。然而,本發(fā)明還包括人ARK2的其他變體以及其非人的同系物,例如其他的哺乳動(dòng)物ARK2同系物或者果蠅、秀麗隱桿線蟲(CWwoW^M油'se/ega朋)、小鼠或者大鼠的ARK2同系物,條件是在相應(yīng)于所述的參考序列第950位的位置上存在胞苷向胸腺嘧咬核苷的核苷酸轉(zhuǎn)變,和/或在相應(yīng)于所述的參考序列第298位的位置上存在蘇氨酸向甲石危氨酸的M酸轉(zhuǎn)變,并且相應(yīng)的蛋白質(zhì)具有絲氨酸蘇氨酸激酶活性。所述.明說明書中描述的方法進(jìn)行檢測。一般地,在第950位的具體核苷酸可以通過核酸測序方法、核,語分析、雜交方法和/或擴(kuò)增方法進(jìn)行確定。核酸測序方法的實(shí)例是焦磷酸測序(pyrosequencing)和/或使用放射性和/或熒光標(biāo)記的核苷酸的測序。雜交方法的實(shí)例是Southernblot分析、Northernblot分析和/或基于DNA微陣列的雜交方法。擴(kuò)增方法的實(shí)例是TaqMan分析,差異RNA展示分析和/或代表性差異分析(ShiM.M.(2002)AmJPharmacogenomics.,2(3),197-205;Kozian&Kirschba腿(1999),TrendsBiotechnol.,17(2),73-8.)。另外,在第298位的^J^酸序列可以通過檢測特定蛋白質(zhì)的量的方法確定和/或通過檢測特定蛋白質(zhì)的活性的方法確定。檢測特定蛋白質(zhì)的量的方法的實(shí)例是Westernblot分析和/或ELISA。檢測特定蛋白質(zhì)的活性的實(shí)例是體外試驗(yàn)方法和/或使用人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或者酵母菌細(xì)胞的體外全細(xì)胞試驗(yàn)方法,所有的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是已知的和/或在本發(fā)明中被描述。用于檢測相應(yīng)變體的樣品的實(shí)例是細(xì)胞、組織或者體液,尤其是血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞。優(yōu)選通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法預(yù)處理樣品,以分離和/或純化樣品中的核酸或者染色體DNA或者蛋白質(zhì)用于進(jìn)一步分析。在一個(gè)任選的額外步驟中,個(gè)體罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)可以如實(shí)施例中顯示的進(jìn)行確定。在另一個(gè)任選的額外步驟中,選擇合適的藥物或者確定藥物的劑量。一般地,可以根據(jù)本發(fā)明將在ARK2基因中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異作為遺傳標(biāo)記,用于心血管疾病(也稱為"冠心病")(尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件)的個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)評估、遺傳表征或分類和/或預(yù)防性治療。另外,根據(jù)本發(fā)明,該遺傳變異可以作為遺傳標(biāo)記,用于適應(yīng)性調(diào)整用于治療個(gè)人或患者(在下文中也稱為"個(gè)體")的有效治療劑的劑量或者一般性地增加其有效性,和/或用于鑒定具有增加的心血管疾病(尤其為高血壓和/或狹窄)風(fēng)險(xiǎn)的正在或者被選擇將要進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)研究的個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明,該遺傳變異還可以被用于評估藥物活性物質(zhì)針對具體個(gè)體的耐受性、安全性和有效性,或者用于鑒定適宜于所述疾病的特定治療的個(gè)體。本發(fā)明還可以被用于針對待接受治療或者建議的每個(gè)個(gè)體鑒定所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素。一般地,合適的個(gè)體是(i)沒有顯示出心血管疾病的癥狀的個(gè)體,(ii)已經(jīng)被檢測出有t艮為心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),但是還沒有顯示出疾病癥狀的個(gè)體,(iii)之前被診斷為罹患心血管疾病的個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明,一個(gè)優(yōu)選的診斷心血管疾病的方法包括下述步驟(a)任選地,從待檢查的個(gè)體或者患者獲得樣品,尤其是細(xì)胞、組織、體液、血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞;(b)從樣品分離核酸探針,尤其是DNA探針;(c)使用引物(尤其如在實(shí)施例中所述的引物)擴(kuò)增包括ARK2基因第950位的特定區(qū)域;(d)對擴(kuò)增區(qū)域測序;(e)分析測序的區(qū)域;(f)評估心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),特別是評估高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明,診斷心血管疾病的一個(gè)備選方法包括下述步驟(a)任選地,從待檢查的個(gè)體或者患者獲得樣品,尤其是細(xì)胞、組織、體液、血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞;(b)從樣品分離ARK2蛋白;(c)確定ARK2蛋白第298位的M酸;(d)評估心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),尤其是評估高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明一般地還涉及確定個(gè)體罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法,其中該方法包括下述步驟(a)體外或體內(nèi)確定個(gè)體的ARK2基因的基因型,(b)轉(zhuǎn)換從(a)中獲得的數(shù)據(jù),以便預(yù)后所述個(gè)體t艮為心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),其中檢出ARK2Met298Met變異指示著增加的發(fā)展為心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),所述心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案一般地涉及針對罹患心血管疾病的個(gè)體選擇藥物活性化合物或者確定藥物活性化合物劑量的方法,所述心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件,或者涉及用于確定心血管疾病治療性處理的有效性的方法,所述心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件,其中該方法包括下述步驟(a)體外測定個(gè)體的ARK2基因的基因型,(b)針對所述的個(gè)體選擇藥物活性化合物或者確定藥物活性化合物的劑量,或者確定治療性處理的有效性,其中,針對具有ARK2Met298Met變異的個(gè)體,選擇藥物活性化合物和/或確定藥物活性化合物的劑量和/或治療性處理有效性。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案一般地涉及鑒定具有增加的患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法,其中該方法包括下述步驟(a)體外或者體內(nèi)確定個(gè)體的ARK2基因的基因型,(b)為了鑒定所述個(gè)體,將U)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換,其中檢出ARK2Met298Met變異指示著t艮為心血管疾病的增加的風(fēng)險(xiǎn),所述的心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件??梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法,尤其是通過本文公開的任何方法實(shí)現(xiàn)對ARK2基因的基因型的確定。另夕卜,根據(jù)本發(fā)明,本文公開的ARK2和/或ARK2變體可以被用于生產(chǎn)用于治療心血管疾病的藥物。因此,本發(fā)明的另外的實(shí)施方案涉及含有如SEQIDNO:3的氨基酸序列的ARK2蛋白或者在第298位存在M酸變異的ARK2變體和/或相應(yīng)的編碼ARK2蛋白或其變體的核酸序列在生產(chǎn)用于治療心血管疾病的藥物中的用途,所述的心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。特別地,變體是如SEQIDNO:7的ARK2蛋白的Met298Met變體,或者如SEQIDNO:6的ARK2核酸的T950T變體。具體地,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和/或本文公開的激酶試驗(yàn)可以,皮用于鑒定ARK2蛋白和/或ARK2變體(尤其是ARK2-Met298Met變體)的調(diào)制劑,例如激活劑或抑制劑。因此,才艮據(jù)本發(fā)明,本文>5^開的ARK2和/或ARK2變體也可以:故用做高通量篩選方法的一部分,以檢測和評估用于治療所述疾病的藥物活性化合物。因而,本發(fā)明的另外的實(shí)施方案涉及篩選用于治療心血管疾病的藥物活性劑的方法,其中該方法包括下述步驟(a)提供含有如SEQIDNO:3的氨基紗列的ARK2蛋白或者在第298位存在氨基酸變異的ARK2變體,和/或編碼ARK2蛋白或其變體的相應(yīng)的核酸,(b)提供受試化合物,(c)測量或檢測該受試化合物對ARK2蛋白或者ARK2變體或者相應(yīng)的核酸的影響,(d)分離適于治療心血管疾病的化合物,所述的心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件。特別地,變體是如SEQIDNO:7的ARK2蛋白的Met298Met變體,或者如SEQIDNO:6的ARK2核酸的T950T變體。一般地,在例如試驗(yàn)系統(tǒng)中提供ARK2蛋白、ARK2變體或者編碼ARK2蛋白或變體的核酸,使其直接或者間接地與受試化合物接觸,受試化合物尤其為生化的或者化學(xué)的受試化合物,例如化學(xué)化合物文庫形式的受試化合物。然后,測量或者檢測受試化合物對ARK2蛋白或者編碼ARK2蛋白的核酸的影響。之后,可以分析和/或分離合適的調(diào)制劑,例如激活劑或抑制劑。關(guān)于對化學(xué)化合物文庫的篩選,優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者是可以商售獲得的高通量試驗(yàn)。一般地,受試化合物對ARK2蛋白或者ARK2變體或者編碼ARK2蛋白或變體的核酸的影響可以是化合物對蛋白質(zhì)或者核酸或者對包括該蛋白質(zhì)或者核酸的細(xì)胞產(chǎn)生的任何物理、化學(xué)或者表型影響,由此鑒定調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或者核酸的化合物。在本發(fā)明中,優(yōu)選測量或者檢測受試化合物對如本文/〉開的ARK2蛋白或者ARK2變體的激酶活性的影響。激酶試驗(yàn)的一般概念是待分析的激斷這里是ARK2絲氨i^/蘇氨酸激酶)與合適的含有絲氨酸或者蘇氨酸殘基的底物或者肽接觸,其中所述殘基在合適的緩沖液中在優(yōu)選存在ATP的情況下,可以被激酶磷酸化。優(yōu)選的底物是染料標(biāo)記的底物,例如熒光染料標(biāo)記的肽,例如熒光素標(biāo)記的肽。絲氨^/蘇氨酸激酶試驗(yàn)可以商售獲得,例如AppliedBiosystems,Inc.,California,USA的HitHunter絲氨酸/蘇氨酸激酶試驗(yàn)或者PierceBiotechnology,Inc.,Illinois,USA的IQ"'絲氨i^/蘇氨酸激酶試驗(yàn)。其他的激酶試驗(yàn)在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語"化學(xué)化合物文庫"指多個(gè)化學(xué)化合物,其從任意的多種來源(包括化學(xué)合成分子和天然產(chǎn)物)匯集在一起而產(chǎn)生,或者其通過組合化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。一般地,在多相的或者均相的試驗(yàn)中測量或者檢測受試化合物對ARK2、ARK2變體或者編碼ARK2蛋白或者變體的核酸的影響。本文中,多相試驗(yàn)是指包括一個(gè)或者多個(gè)洗滌步驟的試驗(yàn),而在均相的試驗(yàn)中這種洗滌步驟是不必要的。僅僅混合試劑和化合物然后測量。合適的功能試驗(yàn)可以基于ARK2的基因表達(dá)或者其絲氨^/蘇氨酸激酶活性。一般地,商售可獲得的激酶試驗(yàn)系統(tǒng)可以定量地檢測摻入底物中的磷酸的量。多相試驗(yàn)例如是ELISA,DELFIA、SPA和flashplate試驗(yàn)?;贓LISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))的試驗(yàn)由多家公司提供。該試驗(yàn)使1用可以被激酶(例如ARK2)磷酸化的隨機(jī)的肽。含有激酶的樣品通常被稀釋到含有例如ATP和必需的陽離子的反應(yīng)緩沖液中,然后#>入到板的孔中。反應(yīng)可以通過簡單地移去混合物而終止。此后,洗滌板。所述反應(yīng)可以例如通過添加生物素酰化的底物到激酶而起始。反應(yīng)之后,加入特異的抗體。樣品通常被轉(zhuǎn)移到預(yù)封閉的蛋白質(zhì)G板,并且在洗滌之后加入例如鏈霉抗生物素-HRP。之后,去除未結(jié)合的鏈霉抗生物素-HRP(辣根過氧化物酶)。通過添加過氧化物酶底物而起始過氧化物酶顏色反應(yīng),并且在合適的光密度計(jì)上測量光密度?;贒ELFIA(解離增強(qiáng)的鑭系熒光免疫試驗(yàn))的試驗(yàn)是固相試驗(yàn)。抗體經(jīng)常使用銪或者其他的鑭系元素標(biāo)記,并且在洗去未結(jié)合的銪標(biāo)記的抗體之后檢測銪的熒光。SPA(閃爍親近試驗(yàn))和flashplate試驗(yàn)通常使用生物素/抗生物素相互作用而捕獲放射性標(biāo)記的底物。通常反應(yīng)混合物包括激酶、生物素?;碾牡孜锖蚘-[P"ATP。反應(yīng)之后,生物素酰化的肽被鏈霉抗生物素捕獲。在SPA檢測中,鏈霉抗生物素被結(jié)合在含有閃爍體的珠子上,而在flashplate檢測中,鏈霉抗生物素被結(jié)合在含有閃爍體的微量培養(yǎng)板的孔的內(nèi)部。一旦被固定,放射性標(biāo)記的底物充分地接近閃爍體以刺激光發(fā)射。備選的均相試驗(yàn)例如是TR-FRET、FP、ALPHA和基因試驗(yàn)?;赥R-FRET(時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的試驗(yàn)通常使用銪與APCH務(wù)飾的別藻藍(lán)蛋白)或具有重疊光語的其他染料(例如Cy3/Cy5或Cy5/Cy7)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Schobel,U.等人,(1999)BioconjugateChem.10,1107-1114)。例如以337nm的光激發(fā)銪之后,分子發(fā)射620nm熒光。但是,如果此熒光團(tuán)充分接近APC,銪將轉(zhuǎn)移其激發(fā)能給APC,其在665mn發(fā)熒光。激酶底物通常是生物素標(biāo)記的底物。激酶反應(yīng)之后,銪標(biāo)記的-(P)-特異性抗體與鏈霉抗生物素-APC被加入。磷酸化的肽使得銪標(biāo)記的抗體與鏈霉抗生物素-APC密切接觸。APC密切親近銪熒光團(tuán)將引起有利于APC發(fā)熒光的銪熒光淬滅(FRET)?;跓晒馄?FP)的試驗(yàn)是使用偏振光以激發(fā)溶液中的熒光底物肽的方法。這些熒光肽在溶液中是自由的并發(fā)生翻轉(zhuǎn)的,引起發(fā)射光去偏振化。然而,當(dāng)?shù)孜镫慕Y(jié)合至較大的分子,例如(P)-Tyr時(shí),其翻轉(zhuǎn)速度被極大地降低,發(fā)射光保持高度的偏振性。對于激酶試驗(yàn),通常存在兩個(gè)選擇(a)熒光磷酸肽示蹤劑結(jié)合至(P)-特異性抗體。磷酸化產(chǎn)物將與熒光磷酸肽竟?fàn)幒涂贵w結(jié)合,導(dǎo)致偏振性從強(qiáng)向弱的改變。(b)磷酸化的底物肽結(jié)合至磷酸特異性抗體,導(dǎo)致偏振性從弱向強(qiáng)的改變?;贏LPHA(放大發(fā)光親近均相)的試驗(yàn)是依賴單線態(tài)氧在通過磷酸化的肽而接近的,和受體珠之間的轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)。一旦在680nm激發(fā),在供體珠中的光敏劑將周圍的氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧,其擴(kuò)散最多200nm的距離。在受體珠中的化學(xué)發(fā)光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給珠內(nèi)的熒光受體,其然后在大約600nm發(fā)射光?;贓FC(酶片段互補(bǔ))的試驗(yàn)或者等價(jià)的試驗(yàn)可以被尤其用于高通量篩選化合物。EFC試驗(yàn)是以工程化的P-半乳糖苷酶(由兩個(gè)片段--酶受體(EA)和酶供體(ED)組成)為1^5出的。當(dāng)將片段分開時(shí),沒有P-半乳糖苷酶活性,但是當(dāng)這些片段在一起的時(shí)候,它們締合(互補(bǔ))以形成活性酶。EFC試驗(yàn)4吏用ED-分析物綴合物,其中該分析物可以被特異性結(jié)合蛋白質(zhì),例如抗體或者受體識別。在缺少特異性結(jié)合蛋白質(zhì)時(shí),ED-分析物綴合物能夠與EA互補(bǔ)以形成活性的P-半乳糖苷酶,產(chǎn)生陽性發(fā)光信號。如果ED-分析物綴合物被特異性結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合,則與EA的互補(bǔ)被阻止,并且因此沒有信號。如果(在樣品中)提供游離的分析物,其將與ED-分析物綴合物竟?fàn)幒吞禺愋越Y(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合。游離的分析物將造成ED-分析物綴合物被釋放以用于與EA互補(bǔ),產(chǎn)生依賴于樣品中存在的游離分析物的量的信號?;蛟囼?yàn)的另一個(gè)實(shí)例是功能試驗(yàn),其中激酶的活性被轉(zhuǎn)化為功能性的細(xì)胞反應(yīng),例如生長、生長抑制、分化或凋亡。對于這種類型的篩選,酵母是特別合適的模型系統(tǒng)。例如在ARK2酵母功能試驗(yàn)中,當(dāng)在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),例如ARK2酵母細(xì)胞象正常的酵母細(xì)胞一樣生長。然而,當(dāng)暴露于半乳糖時(shí),誘導(dǎo)了ARK2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),引起酵母細(xì)胞死亡。在這種情況下,抑制ARK2活性的化合物將防止細(xì)胞死亡。另一個(gè)試驗(yàn)是基于固相結(jié)合的多肽(例如ARK2)和受試化合物造成的干擾作用。因此,受試化合物含有可檢測的標(biāo)記,例如上文已經(jīng)解釋的,可以將化合物放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或者發(fā)光標(biāo)記。另外,可以將化合物與允許間接檢測的蛋白質(zhì)偶聯(lián),所述間接檢測例如通過使用過氧化物酶試驗(yàn)(其使用顯色底物)的酶催化方式進(jìn)行,或者通過結(jié)合可檢測抗體的方式進(jìn)行。另一個(gè)可行的方法是通過質(zhì)鐠(SELDI)研究固相結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。對于例如本文公開的ARK2或者ARK2變體,例如可以通過該多肽內(nèi)的內(nèi)源性色氨酸殘基的熒光改變,檢測因與受試底物的相互作用而引起的構(gòu)象改變。固相結(jié)合的多肽也可以是陣列的一部分。使用固相化學(xué)和光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)制備這樣的陣列的方法在例如US5,744,305中公開。也可以使這些陣列與受試化合物或者化合物文庫接觸,并檢測相互作用,例如結(jié)合或者構(gòu)象改變。陣列的合適格式是目前用于初級和次級篩選的96-、384-或1,536格式。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案,使用全細(xì)胞實(shí)施該方法。通常生長在多孔板的底部的細(xì)胞^皮固定和透化處理,封閉和與例如抗目的底物的一級(P)一特異抗體孵育。然后,使用例如銪標(biāo)記的或者HRP綴合的二抗聯(lián)合特異的化學(xué)發(fā)光或者顯色底物(例如如上文描述的)以產(chǎn)生信號。結(jié)合^f吏用顯微鏡,不僅可以在單個(gè)細(xì)胞水平上定量(P)-特異抗體的量,還可以檢測底物的磷酸化誘導(dǎo)的移位或者細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。本發(fā)明的方法方^f更地在自動(dòng)化的系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn),該系統(tǒng)例如包括自動(dòng)化的種板(plating)和自動(dòng)化的液體轉(zhuǎn)移系統(tǒng),例如使用微流控技術(shù)(microfluidics),即通道4匕結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,該方法以高通量篩選系統(tǒng)的形式實(shí)現(xiàn)。在這樣的系統(tǒng)中,篩選方法被方便地自動(dòng)化和小型化,其尤其可以使用由機(jī)器人控制的小型化的孔和微流控技術(shù)。鑒于上述的主題,本發(fā)明還涉及用于制備治療心血管疾病的藥物的方法,心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其他血栓形成事件,其中該方法包括下述步驟(a)實(shí)施如上文解釋的篩選方法,(b)以一種或者多種藥學(xué)上可接受的載體或者輔助物質(zhì)配制分離的化合物。根據(jù)上述方法的步驟(b),取決于施用方式,通常以一種或者多種藥學(xué)上可接受的添加劑或者輔助物質(zhì)配制所纟皮檢測到的受試化合物。所述添加劑或輔助物質(zhì)為例如生理緩沖溶液(例如氯化鈉溶液)、脫礦質(zhì)水、穩(wěn)定劑、s-氨基己酸或胃蛋白酶抑制劑A或者螯合劑(例如EDTA)、凝膠形成劑,例如白凡士林、低黏性石蠟和/或黃蠟等等。其它的合適的添加劑是,例如去污劑(例如TritonX-100或者脫氧膽酸鈉)、還有多元醇類(例如聚乙二醇或者甘油)、糖(例如蔗糖或者葡萄糖)、兼性離子化合物(例如氨基酸,例如甘氨酸或者尤其是?;撬峄蛘咛鸩藟A)和/或蛋白質(zhì)(例如?;蛉说难灏椎鞍?。優(yōu)選去污劑、多元醇和/或兼性離子化合物。優(yōu)選的生理緩沖溶液具有大約6.0-8.0的pH,特別是大約6.8-7.8的pH,尤其大約7.4的pH,和/或大約200-400毫滲透壓摩爾/升的摩爾滲透壓濃度,優(yōu)選大約290-310毫滲透壓摩爾/升的摩爾滲透壓濃度。通常使用合適的有機(jī)或者無機(jī)緩沖液調(diào)整藥物的pH,例如優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷)、HEPES緩沖液([4-(2-羥乙基)哌溱l-乙磺酸)或者M(jìn)OPS緩沖液(3-嗎啉代-l-丙磺酸)。相應(yīng)緩沖液的選擇通常取決于所期望的緩沖液的體積摩爾濃度。例如磷酸鹽緩沖液適合于注射和輸注溶液。藥物可以使用常規(guī)的方式給藥,例如通過口服劑型(例如片劑或者膠嚢)、通過粘膜(例如鼻腔或者口腔),以皮下植入的栓劑形式、通過含有本發(fā)明的藥物的注射液、輸注液或者凝膠。另外,治療可以通過經(jīng)皮治療18系統(tǒng)(TTS)而實(shí)現(xiàn),其使得控制藥物釋放時(shí)間成為可能。TTS可以例如從EP0944398Al、EP0916336Al、EP0889723Al或者EP0852493Al已知。如果僅僅是相對少量的溶液或者懸浮液向身體給藥,例如大約1至大約20ml,則通常使用注射溶液。如果施用較大量的溶液或者懸浮液,例如一升或者多于一升,則通常使用輸注溶液。由于不同于輸注溶液,在注射溶液的情況下僅僅給藥幾毫升,注射劑與血液或者組織液在pH和滲透壓上的小的差異不會(huì)被注意到,或者僅僅會(huì)在疼痛感覺方面被輕微地注意到。因此,在使用之前稀釋本發(fā)明的制劑通常是不必要的。然而在施用相對大量時(shí),應(yīng)在臨給藥之前,將本發(fā)明的制劑稀釋到至少獲得近似的等滲溶液的程度。等滲溶液的實(shí)例是0.9%濃度的氯化鈉溶液。在輸注的情況下,可以例如使用無菌水實(shí)現(xiàn)稀釋,而給藥可以通過例如所謂的通路(bypass)實(shí)現(xiàn)。更優(yōu)選的步驟在實(shí)施例中逐一地或者集中地說明,并且通過作為每個(gè)步驟的參考而并入此處。下述的附圖、表格、序列和實(shí)施例將用于解釋本發(fā)明,而不限制本發(fā)明的范圍。圖1A顯示具有NCBI號NM—004217的人ARK2基因的核酸序列。圖1B顯示具有AC135178編號的ARK2的染色體核酸序列的部分。使用粗體和下劃線標(biāo)記出用于擴(kuò)增相應(yīng)于參考序列NM—004217第950位的具有遺傳變異C—T的遺傳部分的引物。(ARK2-298R=CCTGCAGGTGGACCTAAAGTTC;ARK2畫298F-GCCTGAGCAGTTTGGAGATGAG)。圖2顯示衍生自具有NCBI號NM一004217的核酸序列的人ARK2的氨基,列。ARK2蛋白第298位的M酸使用粗體和下劃線標(biāo)出。圖3顯示人ARK2基因T950T變體的核^列。圖4顯示人ARK2Met298Met變體的>^絲列。序列描述SEOID隱1顯示具有NCBI號NM_004217的人ARK2蛋白的核,列。SEOIDNO:2顯示具有AC135178編號的ARK2的染色體核酸序列的部分。SEOIDNO:3顯示衍生自具有NCBI號NM—004217的核酸序列的人ARK2的#^*列。SEOIDNO:4顯示第一個(gè)引物序列ARK2-298R。SEOIDNO:5顯示互補(bǔ)序列的第二個(gè)引物序列ARK2-298F。SEOIDNO:6顯示人ARK2基因T950T變體的核*列。SEOIDNO:7顯示人ARK2的Met298Met變體的氨基酸序列。實(shí)施例通過5'-核酸酶試驗(yàn)(TAOMANTM)進(jìn)行SNP檢測用于擴(kuò)增的寡核苷酸(引物)下述引物用于檢測在具有索引號NM_004217的ARK2序列中第950位的核苷酸從C向T的改變-.引物1:5,-GCCTGAGCAGTTTGGAGATGAG-3'(參考序列AC135178的核苷酸179605-179584;Fig.IB;SEQIDNO:5);引物2:5'-CCTGCAGGTGGACCTAAAGTTC-3'(參考序列AC135178的核苷酸179532-179553的互補(bǔ)序列;Fig.IB;SEQIDNO:4)。用于擴(kuò)增的PCR方法使用的試劑來自AppliedBiosystems(FosterCity,USA)。在Primus96plus熱循環(huán)儀(MWGBiotechAG,Germany)上進(jìn)行PCR反應(yīng),總體積為5jil,含2.5piSuperHot-Master-Mix(BioronGmbH,Germany),0.125pJAssay-by-Design-Mix(AppliedBiosystems,Austria),0.375jilH20和2nlDNA。使用15礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序940C,lminxl循環(huán)92。C,15secx45循環(huán)600C,lminx1循環(huán)。PCR產(chǎn)物的分析在VICTOR熒光板讀數(shù)器(HVDLifeSciences,Austria)上檢測焚光,針對FAM標(biāo)記的探針(298Thr等位基因;ARK2-298M1(Thr)FAM-TCCCGTGGGCACG),使用485nm/520nm的狄/發(fā)射過濾器,針對VIC標(biāo)記的探針(298Met等位基因;ARK2-298V1(Met)VIC-CTCCCATGGGCACG),使用530nm/572nm的^iC/發(fā)射過濾器。數(shù)據(jù)以MS-Excel格式輸出,并且使用散點(diǎn)圖分析。結(jié)果人群的特征表1顯示所研究的人群的特征ri%總數(shù)2074性別女性60329,07男性147170,93年齡61,8(+/-10,5)BMI(體重指數(shù))29,1(+/-4,4)血壓121458,7吸煙者137266,4121<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>ARK2基因的變體的頻率和分布表2顯示在研究的患者群中,ARK2基因在參考序列NM一004217的第950位的遺傳變體的頻率和分布。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>ARK2的Thr298Met變體的影響表3顯示ARK2的Thr298Met變體在研究的患者群中對高血壓、冠心病(具有>20%的狹窄)的發(fā)生、多于1次的心M^死和中風(fēng)/TIA/PRIND(TIA=短暫性局部缺血發(fā)作;PRIND=長期的可逆性局部缺血性神經(jīng)障礙)的發(fā)生率的影響。P值小于0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>相比較于在第950位具有不同的ARK2基因型的患者,具有ARK2-T950T的患者顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高的高血壓和冠心病的發(fā)病率以及多于1次的心肌梗死和中X/TIA/PRIND的發(fā)病率。結(jié)論上述的編碼ARK2的基因和/或ARK2蛋白的遺傳變體之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性清楚地指明所述的遺傳變體涉及心血管疾病的發(fā)生,所述心血管疾病尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件。因此,所述的遺傳變體是例如心血管疾病(尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件)預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記。基于本發(fā)現(xiàn)的另外的本發(fā)明實(shí)施方案在說明書中更詳細(xì)的描述。權(quán)利要求1.體外診斷心血管疾病的方法,其中確定個(gè)體樣品中編碼人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸。2.如權(quán)利要求l的方法,其中心血管疾病是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件。3.如權(quán)利要求1或2的方法,其中第950位的核苷酸在染色體DNA中被確定為胸腺嘧咬核苷,或者在mRNA中被確定為尿嘧啶,或者第298位的M酸被確定為甲硫氨酸。4.如權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的方法,其中編碼人ARK2蛋白的核酸具有SEQIDNO:6的核苷酸序列。5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,其中人ARK2蛋白具有SEQIDNO:7的JL&^列。6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法,其中在第950位的核苷酸由選自核酸測序方法、核酸的質(zhì)i昝分析、雜交方法和/或擴(kuò)增方法的方法確定。7.如權(quán)利要求6的方法,其中核酸測序方法選自焦磷酸測序和/或在放射性和/或熒光標(biāo)記的核苷酸的協(xié)助下的測序。8.如權(quán)利要求6的方法,其中雜交方法選自Southernblot分析、Northernblot分析和/或基于DNA微陣列的雜交方法。9.如權(quán)利要求6的方法,其中擴(kuò)增方法選自TaqMan分析,差異RNA展示分析和/或代表性差異分析。10.如權(quán)利要求1-3和5中任一項(xiàng)的方法,其中第298位的^J^,列由檢測特定蛋白質(zhì)的量的方法和/或檢測特定蛋白質(zhì)的活性,優(yōu)選絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法確定。11.如權(quán)利要求10的方法,其中特定蛋白質(zhì)的量由選自westernblot分才斤和/或ELISA的方法檢測。12.如權(quán)利要求10的方法,其中特定蛋白質(zhì)的活性由體外試驗(yàn)和/或使用人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或者酵母細(xì)胞的體外全細(xì)胞試驗(yàn)檢測。13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法,其中樣品選自細(xì)胞、組織和/或體液。14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法,其中在一個(gè)另外的步驟中確定個(gè)體罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。15.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法,其中在一個(gè)另外的步驟中選擇合適的藥物或者確定藥物的劑量。16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法,包括下述步驟(a)任選地,從待檢查的個(gè)體獲得樣品;(b)從樣品分離核酸探針,尤其是DNA探針;(c)在引物協(xié)助下擴(kuò)增包括ARK2基因第950位的特定區(qū)域;(d)對擴(kuò)增的區(qū)域進(jìn)4亍測序;(e)分析測序的區(qū)域(f)評估心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)。17.如4又利要求16的方法,其中引物選自SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:5。18.如權(quán)利要求l-4、6-9或13-15中任一項(xiàng)的方法,包括下述步驟(a)任選地,從待檢查的個(gè)體或者患者獲得樣品,特別是細(xì)胞、組織、體液、血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或者平滑肌細(xì)胞;(b)從樣品分離ARK2蛋白;(c)確定ARK2蛋白第298位的氨基酸;(d)評估心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)。19.確定個(gè)體罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法,其中該方法包括下述步臘.U)體外確定個(gè)體的ARK2基因的基因型,(b)轉(zhuǎn)換(a)中獲得的數(shù)據(jù),以對所述個(gè)體t艮為心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)后,其中ARK2Met298Met變異的檢出指示著t艮為心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)增加。20.用于針對罹患心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的個(gè)體選擇藥物活性化合物或者確定藥物活性化合物劑量,或者用于確定心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的治療性處理的有效性的方法,其中該方法包括下述步驟(a)體外確定個(gè)體ARK2基因的基因型,(b)針對所述的個(gè)體選擇藥物活性化合物或者確定藥物活性化合物的劑量,或者確定治療性處理的有效性,其中針對具有ARK2Met298Met變異的個(gè)體選擇藥物活性化合物和/或確定藥物活性化合物的劑量和/或確定治療性處理的有效性。21.用于鑒定具有增加的罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法,其中該方法包括下述步驟(a)體外確定個(gè)體的ARK2基因的基因型,(b)轉(zhuǎn)換(a)中獲得的數(shù)據(jù),以便鑒定該個(gè)體,其中ARK2Met298Met變異的檢出指示著t艮為心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或血栓形成事件的風(fēng)險(xiǎn)增加。22.含有如SEQIDNO:3的^J^酸序列的ARK2蛋白質(zhì)或者在M酸第298位具有變異的ARK2變體和/或編碼所述ARK2蛋白或者其變體的相應(yīng)核酸序列在生產(chǎn)用于治療心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的藥物中的用途。23.如權(quán)利要求22的用途,其中該變體是如SEQIDNO:7的ARK2蛋白的Met298Met變體,或者如SEQIDNO:6的ARK2核酸的T950T變體。24.篩選用于治療心血管疾病的藥物活性劑的方法,其中該方法包括下述步驟(a)提供含有如SEQIDNO:7的城絲列的ARK2蛋白、在氨基酸第298位具有變異的ARK2變體和/或編碼所述ARK2蛋白或其變體的相應(yīng)核酸,(b)提供受試化合物,(c)測量或檢測該受試化合物對ARK2蛋白或者ARK2變體或者對相應(yīng)的核酸的影響,(d)分離適于治療心血管疾病,特別是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的化合物。25.如權(quán)利要求24的方法,其中該變體是如SEQIDNO:7的ARK2蛋白的Met298Met變體,或者是如SEQIDNO:6的ARK2核酸的T950T變體。26.如權(quán)利要求24或25的方法,其中該受試化合物以化學(xué)化合物文庫的形式提供。27.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)的方法,其中在多相或者均相試驗(yàn)中測量或者檢測該受試化合物對ARK2蛋白或者ARK2變體或者相應(yīng)的核酸的影響。28.如權(quán)利要求27的方法,其中多相試驗(yàn)是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、DELFIA(解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫試驗(yàn))、SPA(閃爍親近試驗(yàn))或flashplate試驗(yàn)。29.如權(quán)利要求27的方法,其中均相試驗(yàn)是TR-FRET(時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移)試驗(yàn)、FP(熒光偏振)試驗(yàn)、ALPHA(放大發(fā)光親近均相試驗(yàn))、EFC(酶片段互補(bǔ))試驗(yàn)或者基因分析試驗(yàn)。30.如權(quán)利要求24-29中任一項(xiàng)的方法,其中該方法在陣列上實(shí)施。31.如權(quán)利要求24-30的方法,其中該方法使用全細(xì)胞實(shí)施。32.如權(quán)利要求24-31中任一項(xiàng)的方法,其中該方法在自動(dòng)化系統(tǒng)中實(shí)施。33.如權(quán)利要求24-32中任一項(xiàng)的方法,其中該方法4吏用微流控技術(shù)實(shí)施。34.如權(quán)利要求24-33中任一項(xiàng)的方法,其中該方法是高通量篩選方法。35.用于生產(chǎn)治療心血管疾病,特別是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的藥物的方法,其中該方法包括下述步驟(a)實(shí)施如權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的方法,(b)用一種或者多種藥學(xué)上可接受的載體或者輔助物質(zhì)配制分離的化合物。36.如權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的方法或者如說明書,包括實(shí)施例中描述的任何主題。全文摘要本發(fā)明涉及體外或者體內(nèi)診斷心血管疾病,尤其是高血壓、狹窄、血管阻塞和/或其它血栓形成事件的方法,其中確定個(gè)體樣品的編碼人ARK2蛋白的核酸第950位的核苷酸,或者人ARK2蛋白第298位的氨基酸,本發(fā)明還涉及ARK2在開發(fā)和/或生產(chǎn)用于治療心血管疾病的藥物中的用途。文檔編號C12Q1/68GK101326291SQ200680045877公開日2008年12月17日申請日期2006年11月23日優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日發(fā)明者D·科齊安,M·赫爾曼,T·萊烏,W·梅爾茨,W·雷內(nèi)申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司
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