專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于高度專(zhuān)一性檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及過(guò)亞辨酸根(peroxynitrite)的檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及可用作專(zhuān)一性檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的試劑的化合物。本發(fā)明包括探針?lè)肿?、其途?br>背景技術(shù)：
：過(guò)亞硝酸根(ONOO-)是硝酸根的異構(gòu)體，為人所知的歷史已有約一個(gè)世紀(jì)。由于它在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在重要作用，在過(guò)去十年里，人們對(duì)它做了廣泛研究，參見(jiàn)Beckman，J.S.，J附./戶(hù)/i",0/.CW//Vi"/o/.1996,271，C1424誦1437;Goldstein,S.等，F(xiàn)ree及fl力cfl/所o/.在1996，21，965-974;Groves,J.T.，Curr.Opin.Chem.Biol.1999，3,226;Radi，R.等，/^ee腸/.在2001，30，463-488;Ta卩pey，M.M.等，C7m2001，89，224-236;Koppenol，W.H.，2001，6，339-341。過(guò)亞硝酸根可通過(guò)氧化氮(NO)和超氧根(superoxide)(02—)以1:1的化學(xué)計(jì)量比率在活體中發(fā)生擴(kuò)散控制的反應(yīng)(k=0.4-1.9xl010M-V)來(lái)形成(Kissner，R.等，CTie附.r。ja'co/.1997，10，1285-1292)，在產(chǎn)生過(guò)亞硝酸根的過(guò)程中，NO的濃度是關(guān)鍵控制因素。當(dāng)NO的濃度增加時(shí)，氧化氮與超氧根發(fā)生反應(yīng)，并能克服超氧化物歧化酶引起的歧化反應(yīng)。當(dāng)氧化氮(NO)在受細(xì)胞因子刺激的誘導(dǎo)型氧化氮合酶(iNOS)作用下過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種情況。ONOO-的病理活性同它跟生物中普遍存在的C02之間的反應(yīng)有關(guān)，該反應(yīng)產(chǎn)生高反應(yīng)活性的自由基C(V和N02'，產(chǎn)率約為35%(Radi，R.等，及fl^/ca/歷o/.在Aferf.2001，30，463-488)。結(jié)果，過(guò)亞硝酸根能夠使酪氨酸發(fā)生硝化(Ischiropoulos，H.，JrcA.5&c/ie附.5fV/;/^s.1998，356，l畫(huà)ll，以及BeckmanJ.S.等，JrcA5/ocAe附.5/印Ajs.,1992，298，438-445)，并氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(Radi，R.等，^rc/i5z>p/^s.，1991,288,481，以及Shi,H.等，所oc/ie附.Com附"rt.，1999,257，651)和生物分子中的鐵及硫蔟(Radi，R.等，J.5,》/.CAew.，1991，266，4244-4250)。與生物活體中的其他氧化劑類(lèi)似，過(guò)亞硝酸根及其質(zhì)子化形式既產(chǎn)生有益作用，也具有有害作用。巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)亞硝酸根，作為對(duì)細(xì)菌入侵的宿主防御反應(yīng)。然而，若干研究表明，過(guò)亞硝酸根在許多人類(lèi)疾病中是導(dǎo)致組織損傷的一個(gè)因素，所述疾病例如為缺血再灌注損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、多發(fā)性硬化、動(dòng)脈硬化癥、中風(fēng)、炎癥性腸病、癌癥以及幾種神經(jīng)變性疾病(MacMillan-Crow，L.A.等，iVoc.V"rf.Sc/.USA1996，93,11853;Rodenas，J.等，F(xiàn)ree及flrfica/.5/。/.在2000，28，374;Cuzzocrea，S.等，戶(hù)Afl簡(jiǎn)actf/及ev.2001,53，135;Szabo，C.r頻co/.丄e汰2003，140,105;White,C.R.等，iVoc.胸/.」c".5W.USA1994，91，1044;Lipton，S.A.等，胸瞬1993,364,626;Pappolla，M.A.等，/.7Ve訓(xùn)/T腦亂2000,107,203;以及Beal,M.F.，/Vee及arf/ca/在Merf.2002,32，797-803)。對(duì)過(guò)亞硝酸根在生物活體中所起關(guān)鍵作用作出解釋變得日益重要。雖然過(guò)亞硝酸根在堿性溶液中穩(wěn)定，但它在生理pH下發(fā)生質(zhì)子化后迅速分解。由于過(guò)亞硝酸根在生物體系中的半衰期短(在中性pH值的緩沖劑中為1秒，在細(xì)胞中短于100毫秒)，所以不可能將其直接分離出來(lái)(Radi，R.，CTie附.r狄/o/.1998，11，720-721;Denicola，A.等，Jrc/^5/oc/ie附.5/o/7/^s.1996，333，49-58)。即便在有確鑿證據(jù)證明活體內(nèi)形成了過(guò)亞硝酸根的情況下，還沒(méi)有工具可用來(lái)明確檢測(cè)并定量細(xì)胞和組織中的過(guò)亞硝酸根。迄今為止，用來(lái)檢測(cè)和測(cè)定過(guò)亞硝酸根的可用分析方法可分為三類(lèi)。第一類(lèi)是電化學(xué)傳感器，其用來(lái)估測(cè)在氧化應(yīng)激下細(xì)胞中所產(chǎn)生的過(guò)亞硝酸根的量(Augusto，O.等，/五"矽附o/.1996，269，346-354;Gatti,R.M.等，F(xiàn)五^yIe汰，1994，348，287-290;Gatti,R.M.等，/^c/t.5/oc/ie附.1998，349，36-46;以及Karoui，H.等，/.CTie附.1996，271，6000-6009)。但此方法需要操作復(fù)雜的設(shè)備，且無(wú)法得到過(guò)亞硝酸根的立體圖像。第二類(lèi)方法依賴(lài)氧化探針的使用。例如，可被過(guò)亞硝酸根氧化成高熒光分子的DCFH(2，，7，-二氯二氫熒光素)和DHR123(二氫若丹明123),已被用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞和組織中的過(guò)亞硝酸根(Royall，J.A.等，JrcA.說(shuō)'ocAe附.5Zo/;/ijs.1993,302，348-355;Kooy，N.W.等，及atrf/c.及o/.^ferf.1994，16，149-156;Kooy，N.W.等，/^ee1997，27，245-254;Crow,J.P.，iVi加c1997，1，145-157;Ischiropoulos,H.等，^/^"/^rfs五"矽附o/.1999，301，367-373;以及Miles,A.M.等，J.所o/.CAe附.1996，271，40-47)。然而，過(guò)亞硝酸根氧化DCFH和DHR的機(jī)理還有大量不清楚之處，這些探針也能被細(xì)胞產(chǎn)生的許多其他ROS(活性氧中間體(species))氧化。用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的過(guò)亞硝酸根的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系也存在類(lèi)似的問(wèn)題。HPF(羥苯基熒光素)可用來(lái)鑒別過(guò)亞硝酸根和氧化氮，但(Setsukinai，K.等，丄B/o/.CTie附.2003，278，3170-3175;國(guó)際公開(kāi)WO01/64664(Nagano等)；以及國(guó)際公開(kāi)WO2004040296(Nagano等))。第三類(lèi)方法利用生物分子的足跡反應(yīng)。例如，可用免疫化學(xué)方法檢測(cè)3-硝基酪氨酸，其是在生物體系中蛋白質(zhì)上的酪氨酸殘基被過(guò)亞硝酸根氧化后產(chǎn)生的硝化產(chǎn)物(Kaur，H.等，尸五AS"1994，350，9-12)。近來(lái)也有人通過(guò)熒光法，用NADH(還原型煙酰胺腺噪呤二核苦酸)來(lái)監(jiān)測(cè)緩沖液中過(guò)亞硝酸根的濃度。然而，目前還沒(méi)有一種化學(xué)修飾方法能夠使探針或生物分子獲得完全專(zhuān)一性，使它們能夠直接而明確地顯示細(xì)胞中是否產(chǎn)生了過(guò)亞硝酸根。這意味著生物體系中存在的其它活性氧中間體和活性氮中間體可能與過(guò)亞硝酸根形成竟?fàn)?，干擾了結(jié)果。已知有若干方法用于檢測(cè)/測(cè)定過(guò)亞硝酸根，包括電化學(xué)方法、化學(xué)發(fā)光法和足跡法。然而，這些方法需要做煩瑣、耗時(shí)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中要聯(lián)合使用清除劑和抑制劑，靈敏度低，專(zhuān)一性差。因此，為了便于直接研究生物體系中的過(guò)亞硝酸根，開(kāi)發(fā)出靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)和測(cè)定過(guò)亞硝酸根的方法是極為重要的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于確切檢測(cè)和測(cè)定過(guò)亞硝酸根的新穎化合物。具體而言，本發(fā)明提供了化合物或其鹽，它們與過(guò)亞硝酸根發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)，而不與其他的活性氧中間體和活性氮中間體反應(yīng)，所述化合物由以下通式(I)、(II)、(III)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(I)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中Rj(i=l~22)的定義見(jiàn)下面的"發(fā)明詳述"。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定過(guò)亞硝酸根的試劑，該試劑包含上述任意化合物。本發(fā)明還提供了測(cè)定樣品中的過(guò)亞硝酸根的方法，其包括以下步驟a)使上述任意化合物與樣品接觸；的熒光。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的高通量篩選熒光法(high-throughputscreeningfluorescentmethod),該方法包括采用測(cè)定過(guò)亞硝酸根的試劑，其中所述試劑包含上述任意化合物。本發(fā)明還提供了用于篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過(guò)亞硝酸根的產(chǎn)生，所述方法包括使用上述任意化合物。圖1圖示了用過(guò)亞硝酸根或Oxone(2KHS05KHS04'K2S04)氧化酮的反應(yīng)(la/lb)。圖2顯示了通式(II)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=7~17)的定義見(jiàn)"發(fā)明詳述"部分。圖3顯示了通式(III)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=18~27)的定義見(jiàn)"發(fā)明詳述"部分，圖4~圖7顯示了實(shí)施例1的合成方案，圖8顯示了實(shí)施例1中所得到的本發(fā)明化合物(ss-6)的20jiM溶液的熒光光譜。圖9顯示了15當(dāng)量ONOO-與5毫升20jiMss-6反應(yīng)30分鐘后的溶液的熒光光譜。圖IO顯示了20nMss-6的吸收光譜。圖ll顯示了ss-6與濃度為0~300nM的ONOO'反應(yīng)30分鐘后獲得的熒光光鐠'圖12顯示了焚光強(qiáng)度與ONOO—濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系。圖13圖18顯示了實(shí)施例5的合成方案。圖19顯示了實(shí)施例5中所得到的本發(fā)明化合物(ss-12)的20jiM溶液的熒光光鐠。圖20顯示了15當(dāng)量ONOCT與5毫升20fiMss-12反應(yīng)30分鐘后的溶液的熒光光鐠。圖21顯示了20fiMss-12的吸收光譜。圖22顯示了ss-6與濃度為0-300pM的ONOCT反應(yīng)30分鐘后獲得的熒光光譜'圖23顯示了熒光強(qiáng)度與ONOO-濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系。圖24顯示了經(jīng)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞的熒光顯微鏡檢結(jié)果，所述神經(jīng)元細(xì)胞先用20jiM的ss-6和ss-12孵育，然后用10jiM和IOOjiM的SIN-1(3-嗎啉代-斯德酮亞胺《鹽酸)處理。發(fā)明詳述定義除非另外明確指出，本申請(qǐng)中所用下列各術(shù)語(yǔ)均應(yīng)具有下面所描述的含義。"烷基"指含有碳和氫的完全飽和的無(wú)環(huán)單價(jià)基團(tuán)，其可以是支鏈的或直鏈的.烷基的例子有甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和異丙基。"低級(jí)烷基"指1~6個(gè)碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基和異戊基。"烯基"指含有碳和氫的一價(jià)或二價(jià)不飽和(優(yōu)選單不飽和)基團(tuán)，其可以是環(huán)狀的、支鏈的或直鏈的。"低級(jí)烯基，，指具有15個(gè)碳原子的這樣的基團(tuán)。"芳基"指取代或未取代的一價(jià)芳基，一般含有一個(gè)單環(huán)(例如苯)或稠合雙環(huán)(例如萘)。一般優(yōu)選單環(huán)芳基。該術(shù)語(yǔ)包括雜芳基，它是環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)氮原子、氧原子或石危原子的芳環(huán)基團(tuán)，如呋喃基、吡咯基、吡啶基和吲哚。"取代"是指芳基中一個(gè)或多個(gè)環(huán)上氫原子被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)優(yōu)選選自氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、羥基、羥曱基、硝基、氨基、甲基氨基、二曱基氨基、甲氧基、卣代甲氧基和卣代甲基。"芳烷基，，指進(jìn)一步被芳基取代的烷基(優(yōu)選為低級(jí)烷基)取代基，其例子有節(jié)基和苯乙基。"熒光團(tuán)"指能被光激發(fā)而發(fā)射熒光的小分子或大分子的一部分。優(yōu)選地，在波長(zhǎng)范圍為約200~約1000納米，優(yōu)選為約500~約800納米的光的激發(fā)下熒光團(tuán)能有效地產(chǎn)生熒光。熒光團(tuán)優(yōu)選選自吖啶橙、蒽環(huán)、別藻藍(lán)蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙紅、赤蘚紅、熒光胺、熒光素、FAM(羧基熒光素)、HEX(六氯熒光素)、JOE(6-羧基-4，,5，-二氯-2，，7，-二甲氧基-熒光素)、俄勒岡綠(OregonGreen)、藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯熒光素)、德克薩斯紅、四曱基若丹明和黃嘌呤。這樣的基團(tuán)報(bào)道于《熒光探針和研究產(chǎn)品手冊(cè)》(i^"rf^do/jP/worescew,iVo6e51/fesearc/j9thEdition,MolecularProbes,Eugene,Oregon,Haughland，2003)中。"無(wú)機(jī)酯"指無(wú)機(jī)酸與醇的反應(yīng)產(chǎn)物。無(wú)機(jī)酯主要得自無(wú)機(jī)酸與醇的縮合。術(shù)語(yǔ)"鹽"指標(biāo)準(zhǔn)酸堿反應(yīng)的產(chǎn)物，其中堿性基團(tuán)(如氨基)的平衡離子來(lái)自有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。這樣的平衡離子包括氯根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、琥珀酸根、檸檬酸根、乳酸根、馬來(lái)酸根、富馬酸根、棕櫚酸根、膽酸根、谷氨酸根、戊二酸根、酒石酸根、硬脂酸根、水楊酸根、曱磺酸根、苯磺酸根、山梨酸根、苦味酸根、苯甲酸根、肉桂酸根等。術(shù)語(yǔ)"生理上可接受的鹽"包括含有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的羧酸鹽，所述陽(yáng)離子例如為堿金屬陽(yáng)離子和堿土金屬陽(yáng)離子(如鋰、鈉、鉀、鎂、鋇和鈣)；銨；或有機(jī)陽(yáng)離子，例如二芐基銨、芐基銨、2-羥乙基銨、二(2-羥乙基)銨、苯基乙基節(jié)基銨等。上述術(shù)語(yǔ)涵蓋的其它陽(yáng)離子包括普魯卡因、奎寧和N-曱基葡萄糖胺的質(zhì)子化形式，以及堿性氨基酸(如甘氨酸、鳥(niǎo)氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸)的質(zhì)子化形式。本發(fā)明的實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明提供了與過(guò)亞硝酸根發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)而不與其它活性氧中間體和活性氮中間體發(fā)生反應(yīng)的化合物。所述化合物具有以下通式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(I)其中R!為OR,，或NR2，R3，，其中R、R和R3，獨(dú)立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；⑾；⑷蝉；h(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳?；蚓勖训幕鶊F(tuán)；R2、R3、R4和R5獨(dú)立地為氫或選自鹵素、烷基、烷氧基、烷基氧基(alkyoxy)、聚醚的基團(tuán)；R2和R3共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)(heterocyclic)、雜芳基或雜芳環(huán)(heteroaromatic);或者Rt和Rs共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R6是吸電子基團(tuán)，選自CF3、鹵素取代的低級(jí)烷基(例如CFnH3_n，其中n為l或2)、或(C-O)-O-W,,其中W,是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團(tuán)；并且熒光團(tuán)或掩蔽(masked)熒光團(tuán)可與R,(i=l~5)之一共價(jià)鍵合。此外，上面剛剛討論過(guò)的化合物進(jìn)一步具有以下實(shí)施方式R2和R3共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R4和Rs共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R是CH3或OCHzOZp其中Zi是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；?、烯?；?、炔?；?、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳?；蚓勖训幕鶊F(tuán)；R3，是(C-0)Z2，其中Z2是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、或聚醚的基團(tuán)；且/或熒光團(tuán)選自吖啶橙、蒽環(huán)、別藻藍(lán)蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙紅、赤蘚紅、熒光胺、熒光素、FAM(羧基熒光素)、HEX(六氯熒光素)、JOE(6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二曱氧基熒光素)、俄勒岡綠、藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯熒光素)、德克薩斯紅、四甲基若丹明和黃嘌呤。本發(fā)明還提供了在過(guò)亞硝酸根的測(cè)定中具有高度專(zhuān)一性和選擇性的化合物。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有以下通式(II):(II)其中R7和RK)獨(dú)立地為氬或選自卣素、低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、卣代烷基、CN或戰(zhàn)的基團(tuán)；R8、R9、Ru和Ru獨(dú)立地為氫、由素、烷基、卣代烷基、烯基，或是選自酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、烷基氨基、羥基、烷氧基、烷氧基烷基、聚醚、烷基硫代(alkylthio)、氰基、硝基的基團(tuán)，或者具有(C-O)-Y或(C-O)-X-Y形式，其中X是低級(jí)烷基或烯基鏈，Y是氫或者選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基羥基、烷氧基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺酰基、無(wú)機(jī)酯的基團(tuán)，或者為57元雜環(huán)，其環(huán)原子選自碳、氮、氧和硫，其中環(huán)原子進(jìn)一步包括3~6個(gè)碳原子以及一般不超過(guò)2個(gè)的雜原子；Ru是ORt，或NR5，R6，，其中R4，、Rs，和R6，獨(dú)立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；?、烯?；⑷蝉；?、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳?；蚓勖训幕鶊F(tuán)；R!4和Ri5獨(dú)立地為氫、卣素、烷基、烷氧基、聚醚；或者R"和R!5共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；Rw是氫、烷基、烷氧基或聚醚；以及R,7是吸電子基團(tuán)，其選自CF"鹵素取代的低級(jí)烷基(例如CFJH3-n,其中n為1或2)或(00)-0-W2，其中\(zhòng)￥2是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團(tuán)。此外，上面討論的通式(II)的化合物進(jìn)一步具有以下實(shí)施方式R9是(C-0)NR,R2"，其中R,和R2"是烷基(例如-(CH2)k-CH3，其中k=024，以及國(guó)(CH2)「CH3，其中1=0~24);Rs和R9共同形成環(huán)，優(yōu)選為5、6或7元環(huán)，以形成環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R,2是(C-0)NR3"R4"，其中Rs，，和R4"是烷基(例如-(CH2)p-CH3，其中p=0~24,以及-(CH2)q-CH3，其中q一24);R"和Ri2共同形成環(huán)，優(yōu)選為5、6或7元環(huán)，以形成環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；和/或Rt，是CH3或OCH2OZ3,其中Z3是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；⑾；?、炔?；?、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳?；蚓勖训幕鶊F(tuán)。通式(II)表示的化合物可以鹽的形式存在。生理上可接受的水溶性鹽可適用于本發(fā)明的試劑和測(cè)定方法。此外，游離態(tài)的通式(II)所示化合物或其鹽可以水合物或溶劑合物存在，這些物質(zhì)中的任何一種均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對(duì)形成所述溶劑合物的溶劑類(lèi)型沒(méi)有特別限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作為所述溶劑的例子。在另一種實(shí)施方式中，在過(guò)亞硝酸根的測(cè)定中具有高度專(zhuān)一性和選擇性的化合物具有以下通式(III):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(III)其中Rjs和R^獨(dú)立地為氫、囟素、烷基或烷氧基；R20是氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、羧酸酯或氨基烷基；R^和R22獨(dú)立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、羧基烷基、羧酸根、羧酸酯、氨基曱酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺?；驘o(wú)機(jī)酯的基團(tuán)；R23選自下式所示基團(tuán)R7，、R8，、R9，和Rn)，獨(dú)立地為氫或選自囟素(例如C1、Br或I)、烷基(例如CH3)、烷氧基、烷基氧基或聚醚的基團(tuán)；Ru，是吸電子基團(tuán)，其選自CF3、囟素取代的低級(jí)烷基(例如CFJH3-n,其中n為1或2)或(C-0)-0-W3，其中W3是選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團(tuán)；以及R24、R25、Rm和1127獨(dú)立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氧基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸、羧酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺?；?、無(wú)機(jī)酯的基團(tuán)；Rm和1125共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；Rm和R^共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；或R26和R27共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、其中j一或1;雜芳基或雜芳環(huán)。此外，上面討論的具有通式(III)的化合物進(jìn)一步具有以下實(shí)施方式R/和R8，共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R9，和R^，共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R2o是-(CH2U-COOH，其中m-l24;R24和R25共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；R25和R26共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)；和/或R26和Rr/共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)。通式(III)表示的化合物也可以鹽的形式存在。生理上可接受的水溶性鹽可適用于本發(fā)明的試劑和測(cè)定方法。此外，游離態(tài)的通式(III)所示化合物或其鹽可以水合物或溶劑合物存在，這些物質(zhì)中的任何一種均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。對(duì)形成所述溶劑合物的溶劑類(lèi)型沒(méi)有特別限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作為所述溶劑的例子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，過(guò)亞硝酸根對(duì)通式(I)表示的某些特定酮的氧化方式類(lèi)似于后者與過(guò)一硫酸根的反應(yīng)，所述過(guò)一硫酸根的商業(yè)來(lái)源是Oxone(2KHS05*KHS04'K2S04)(產(chǎn)率為30-55%，轉(zhuǎn)化率為100%)(圖1)。該反應(yīng)經(jīng)由二氧雜環(huán)丙烷(dioxirane)中間體進(jìn)行。二氧雜環(huán)丙烷的形成及其隨后在分子內(nèi)對(duì)酚衍生物的氧化，為設(shè)計(jì)用于專(zhuān)一性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)亞硝酸根的探針提供了基礎(chǔ)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物體系中存在的酮與其它活性氧中間體或活性氮中間體之間不會(huì)發(fā)生類(lèi)似的反應(yīng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用熒光團(tuán)取代酮中的一些基團(tuán)，可以合成針對(duì)過(guò)亞硝酸根的熒光探針。在一種實(shí)施方式中，可通過(guò)PET(光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移)機(jī)理來(lái)控制BODIPY基探針的熒光性質(zhì)?；赑M3計(jì)算方法，設(shè)計(jì)了受到依賴(lài)于PET(光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移)的熒光滅/亮開(kāi)關(guān)機(jī)理(fluorescenceoff/onswitchingmechanism)控制的熒光探4十(圖2)。在另一種實(shí)施方式中，在用過(guò)亞硝酸根氧化之前，將焚光團(tuán)掩蔽起來(lái)，所述探針沒(méi)有熒光性。然而，與過(guò)亞硝酸根反應(yīng)后，該焚光團(tuán)被釋放出來(lái)，變得具有強(qiáng)焚光性。例如，熒光素/二氯熒光素的酚羥基處發(fā)生的衍生可顯著降低熒光強(qiáng)度。因此，設(shè)計(jì)了不同的基于熒光素/二氯熒光素的探針。還發(fā)現(xiàn)，通式(II)或(III)表示的基本無(wú)熒光的化合物在生理?xiàng)l件下與過(guò)亞硝酸根高效反應(yīng)，給出強(qiáng)熒光信號(hào)。因此，通過(guò)測(cè)定氧化態(tài)熒光化合物的熒光，可以非常高的專(zhuān)一性和選擇性來(lái)測(cè)定過(guò)亞硝酸根，由所述通式(II)或(III)所示無(wú)熒光化合物與過(guò)亞硝酸根在活細(xì)胞或活組織內(nèi)反應(yīng)生成該氧化態(tài)熒光化合物。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定過(guò)亞硝酸根的試劑，其包含上述任意化合物。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定化學(xué)或生物樣品(例如來(lái)自動(dòng)物或植物的細(xì)胞和組織，以及微生物)中的過(guò)亞硝酸根的方法，其包括如下步驟a)使上述任意化合物與化學(xué)或生物樣品接觸；的熒光。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的高通量篩選熒光法，該方法包括使用以上提到的用于測(cè)定過(guò)亞硝酸根的試劑。本發(fā)明還提供了篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過(guò)亞硝酸根的產(chǎn)生，所述方法包括采用上述任意化合物。通用合成程序借助已知技術(shù)以及本文揭示的通用合成程序，有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員可以制備本發(fā)明的化合物。例如，通式(I)表示的一些化合物一般可利用Yang等概述的程序(義CTiew.，2000，65，4179-4184)來(lái)合成。通式(II)的化合物一般可通過(guò)以下程序合成(Nagano,T.等，j挑.CTie附.5"oc，2004,126,3357-3367)。一般合成方案如圖2所示。在室溫80。C的溫度下，用催化量的TFA(三氟乙酸)在合適的溶劑(如二氯曱烷或1,2-二氯乙烷)中處理相應(yīng)的(corresponding)吡咯部分和醛部分。當(dāng)TLC監(jiān)控顯示相應(yīng)的醛消耗完畢時(shí)，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醍)，并繼續(xù)攪拌15~30分鐘。通過(guò)后處理(work-up)和柱純化，可以分離出純的中間體，然后用乙醚合三氟化硼和三乙胺在二氯甲烷中處理所述中間體。在室溫下攪拌溶液14小時(shí)。通式(II)表示的本發(fā)明化合物可先后通過(guò)后處理和純化而分離出來(lái)。用于實(shí)施合成反應(yīng)的優(yōu)選化合物見(jiàn)"實(shí)施例"部分。其中，可獨(dú)立制備相應(yīng)的吡咯部分和醛部分，一些官能團(tuán)可通過(guò)保護(hù)基予以保護(hù)。上述合成方案有時(shí)可通過(guò)選擇不同的保護(hù)基來(lái)優(yōu)化。舉例而言，有關(guān)保護(hù)基的詳細(xì)解釋和合適的保護(hù)基的選擇技術(shù)可參見(jiàn)名為《有機(jī)合成中的保護(hù)基》一書(shū)(iVCe"/veGVowps/wOrgam'c5^w^rew's，Greene,T.W.，JohnWiley&Sons,Inc.,1999)。通式(III)所示化合物一般可通過(guò)以下程序合成(John,E.T.等，丄CAe附.Soc，戶(hù)e^/"7>a"s/.,1995,1993;McWatt，M.等，五w./CTie附.2001,2535-2545;Rychnovsky，S.D.等，義爿附.CAe/w.Src.1992，114，671~677)。該一般合成方案如圖3所示。用叔丁醇鉀在適當(dāng)溶劑(如苯和甲醇的混合物)中的溶液處理相應(yīng)的熒光素衍生物。當(dāng)熒光素衍生物固體完全溶解時(shí)，真空蒸發(fā)溶劑，得到相應(yīng)的鉀鹽。然后，加入溶于合適溶劑(如吡啶)中的R23I和CuCl，其中Ru如前文所定義。所得混合物在氬氣下回流24小時(shí)。冷卻至室溫后，可先后通過(guò)后處理和純化而分離出通式(III)所示的本發(fā)明化合物。用于實(shí)施合成反應(yīng)的優(yōu)選化合物見(jiàn)"實(shí)施例"部分。其中，可獨(dú)立制備相應(yīng)的熒光素衍生物和R23I，一些官能團(tuán)可通過(guò)保護(hù)基予以保護(hù)。跟通式(II)所示化合物的一般合成方案一樣，上述合成方案有時(shí)可通過(guò)選擇不同的保護(hù)基來(lái)優(yōu)化。術(shù)語(yǔ)"后處理"和"純化"是指有機(jī)合成中所用的技術(shù)的組合，例如洗滌、過(guò)濾、萃取、蒸發(fā)、蒸餾、結(jié)晶、色譜處理等。中間體也可不經(jīng)純化而直接用于后續(xù)反應(yīng)。實(shí)施例以下實(shí)施例1~4是對(duì)通式(II)所示化合物的制備和使用方法的詳細(xì)描述。該詳述落入上述"通用合成程序"的范圍之內(nèi)，并起示例作用，而所述"通用合成程序"構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這些實(shí)施例以及實(shí)施例5-9僅用于說(shuō)明目的，無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1一ss-6的合成方案1)吡咯-2-甲酸的合成(如圖4所示)將吡咯-2-曱醛(IO.O克，105毫摩爾)溶解在50毫升曱醇中，然后用500毫升蒸餾水稀釋。加入新鮮制備的氧化銀(48.3克，210毫摩爾)和氫氧化鈉(8.5克，212毫摩爾)。然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。濾出沉淀，用熱水洗滌。用乙醚(500毫升)萃取合并的濾液和洗滌液，然后在O'C用37%鹽酸酸化。用乙醚(200毫升x4)萃取所得溶液。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)萃取液。減壓蒸發(fā)溶劑，得到吡咯-2-甲酸634-97-9(9.9克，產(chǎn)率85%)。2)N，N-二乙基-lH-吡咯-2-甲酰胺(ss-l)的合成(如圖4所示)將吡咯-2-曱酸(IO.O克，90毫摩爾)溶解在250毫升二氯甲烷中，隨后在氬氣氣氛下于O'C加入DCC(N，N，-二環(huán)己基碳二亞胺)(20.4克，99毫摩爾)、DMAP(4-二曱基氨基吡啶)(2.2克，18毫摩爾)和二乙胺(10.2毫升，99毫摩爾)。在0。C攪拌反應(yīng)混合物30分鐘，然后在室溫?cái)嚢?小時(shí)。用二氯甲烷稀釋所得溶液，濾去固體。先后用稀鹽酸和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。用硫酸鈉干燥有機(jī)層，然后減壓蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱色譜純化殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/2),得到N，N-二乙基-lH-吡咯-2-曱酰胺，其為白色固體(10.5克，產(chǎn)率70%),熔點(diǎn)78.6-79.9。C;'HNMR(300MHz，CDC13):S10.1(br，1H),6.94-6.88(m，1H)，6.57-6.51(m，1H),6.26-6.21(m，1H)，3.95國(guó)3.86(m，4H)，1.31-1.24(m，6H);13C醒R(75.5Hz,CDC13):S161.9，120.7，111.3，110.1，109.5，41.9，13.4;IR(CH2C12)3442，2981，2937，1716,1600cm1;LRMS(EI)m/z(%)166(M+;100);HRMS(EI):對(duì)于C9H14N20，計(jì)算值166.1106,測(cè)量值116.1106。3)4-曱氧基肉桂酸甲酯的合成(如圖5所示)將對(duì)羥基肉桂酸(IO.O克，61毫摩爾)溶解在200毫升丙酮中，在室溫下加入碳酸鉀(58.7克，213毫摩爾)。15分鐘后，在氬氣下于室溫加入硫酸二曱酯(16.4毫升，213毫摩爾)，然后在氬氣氣氛下加熱回流8小時(shí)。濾去固體，在濾液中加入50毫升水。減壓蒸發(fā)溶劑，用200毫升乙酸乙酯萃取所得混合物兩次。用硫酸鈉干燥合并的有機(jī)層，然后減壓蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱色譜純化殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/10)，得到4-甲氧基肉桂酸甲酯832-01-91Ul.7克，產(chǎn)率99%)。4)3-(4-曱氧基苯基)丙酸曱酯的合成(如圖5所示)將4-甲氧基肉桂酸甲酯Ul.7克，61毫摩爾)溶解在300毫升甲醇中。在強(qiáng)氬氣流下緩慢加入鈀(5%位于活化碳粉上；1.1克)。鼓泡通入氫氣，將反應(yīng)混合物劇烈攪拌2小時(shí)。濾出固體，用硫酸鈉干燥濾液。減壓蒸發(fā)溶劑，得到3-(4-甲氧基苯基)丙酸甲酯[15823-04-8(U.7克，99%)。5)3-(3-甲?；?4-曱氧基苯基)丙酸甲酯(ss-2)的合成(如圖5所示)將3-(4-甲氧基苯基)丙酸曱酯(500毫克，2.56毫摩爾)溶解在30毫升無(wú)水二氯曱烷中，隨后在氬氣下于-20。C加入TiClj(2.1毫升，19毫摩爾)和MeOCHCl2(0.81毫升，9.0毫摩爾)。在-20。C下攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物緩慢倒入稀鹽酸溶液中。分離二氯甲烷層，依次用水和鹽水洗滌，然后用硫酸鎂干燥。減壓蒸發(fā)溶劑。然后用硅膠柱色語(yǔ)純化粗殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/10),得到3-(3-曱?；?4-曱氧基苯基)丙酸曱酯(ss-2),其為無(wú)色油狀物(429毫克，產(chǎn)率75%)。^NMR(400MHz，CDC13):510.4(s，1H)，7.65(s，1H)，7.40(dd，J=6.3，1.6Hz，1H)，6.92(d，J=6.4Hz，1H),3.91(s，3H)，3.66(s,3H);2.92(t，J=5.6Hz，2H)，2.61(t，J=5.6Hz，2H);13C醒R(100MHz，CDC13):8189.7，173.0，160.4，135.9，132.7，127.8，124.6，111.8，55.7，51.6，35.4，29.7;IR(CH2C12)3055,2945，1734，1682cm1;LRMS(EI)m/z(%)222(M+;61)，149(100);HRMS(EI):對(duì)于C12H1404，計(jì)算值222.0892，測(cè)量值222.0892。6)N，N-二乙基-5-[2-甲氧基-5-(3-曱氧基-3-氧代丙基)苯基卜10H-二吡咯曱烯(dipyrrin)-1,9-二曱酰胺(ss-3)的合成(如圖6所示)在氬氣氣氛下將化合物ss-1(134毫克，0.81毫摩爾)和ss-2(90毫克，0.41毫摩爾)溶解在30毫升無(wú)水1，2-二氯乙烷中。加入一滴TFA(三氟乙酸)，加熱回流所得溶液。當(dāng)TLC監(jiān)控(二氧化硅；CH2Cl2)顯示搭消耗完時(shí)，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌)(189亳克，0.81毫摩爾)在CH2C12中的溶液，持續(xù)攪拌15分鐘。用水洗滌反應(yīng)混合物，用MgS04干燥，過(guò)濾，蒸發(fā)。用硅膠柱色譜純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯曱烷/正己烷=1/1/1)，得到化合物ss-3，其為棕紅色油狀物(289毫克，67%)。^NMR(400MHz，CDC13):37.27(dd，J=8.4，1.9Hz，1H)，7.07(d，J=1.9Hz，1H)，6.92(d，J=8.4Hz，1H)，6.62(d，J=4.3Hz，2H)，6.45(d，J=4.3Hz，2H);3.72-3.60(m，14H),2.93(t，J=7.5Hz,2H),2.64(t,J=7.5Hz，2H)，1.30畫(huà)1.23(m，12H);13C畫(huà)R(75.5MHz,CDC13):S172.8，162.8，155.7，148.6，141.7，139.4，131.5，131.3，129.8，128.0，125.1,119.1，111.0，55.5，51.3，41.0(br)，35.5，29.6，12.5(br);IR(CH2C12)3483，2938，1639cm1;LRMS(EI)m/z(%)534(M+;21)，463(100);HRMS(EI):對(duì)于C3。H38N4Os,計(jì)算值534.2842,測(cè)量值534.2842。7)N，N-二乙基-8-2-甲氧基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基]-4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3，5-二曱酰胺(ss-4)的合成(如圖7所示)在氬氣氣氛下將化合物ss-3(100毫克，0.19毫摩爾)和三乙胺(0.73毫升，5.2毫摩爾)溶解在20毫升無(wú)水二氯甲烷中，室溫下攪拌所得溶液10分鐘。加入BF3-OEt2(0.73毫升，5.8毫摩爾)，繼續(xù)攪拌40分鐘。用水和2NNaOH洗滌反應(yīng)混合物。用CH2Cl2萃取水溶液。用Na2S04干燥合并的有機(jī)萃取液，過(guò)濾，蒸發(fā)。用硅膠柱色鐠純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯曱烷=1/1),得到化合物ss-4，其為橙色晶體(74毫克，產(chǎn)率70%)。熔點(diǎn)77.0~77.9°C;NMR(400MHz，CDC13):S7.33(dd，J=8.2，2.2Hz，1H)，7.12(d，J=2.2Hz，1H),6.98(d，J=8.5Hz,1H)，6.78(d，J=4.2Hz，2H)，6.44(d，J=4.2Hz，2H)，3.73(s，3H);3.66(s，3H)，3.58(q，J=7.1Hz，4H)，3.29(q，J=7.1Hz，4H)，2.95(t，J=7.5Hz，2H),2.64(t，J=7.5Hz，2H)，1.25(t，J=7.1Hz，6H)，1,10(t，J=7.1Hz，6H);13C應(yīng)R(100MHz，CDC13):8172.7，162.6，155.4,151.0，145.1，135.2,131.9，131.3，131.2，131.1,121.9，116.6，111.3，55.4，51.4，42.8，38.4，35.4,29.5，13.7,11.9;19FNMR(376.5MHz，CDC13):S-144.2(m，J=30Hz)，-145.2(m,J=30Hz);IR(CH2C12)2980,1734，1640cm1;LRMS(EI)m/z(%)582(M+;21)，551(100);HRMS(EI):對(duì)于C30H37BF2N4O5，計(jì)算值582,2825，測(cè)量值582.2831。8)N，N-二乙基-8-5-羧乙基-2-甲氧基苯基卜4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮雜-s國(guó)引達(dá)省-3，5-二曱酰胺(ss-5)的合成(如圖7所示)將化合物ss-4(100毫克，0.17毫摩爾)溶解在3毫升THF中，然后加入1毫升甲醇和l毫升蒸餾水。加入一水合氫氧化鋰(22毫克，0.52毫摩爾)，持續(xù)攪拌6小時(shí)，然后加入1毫升鹽水。用10毫升Et20將所得溶液萃取3次。用Na2S04干燥合并的有機(jī)萃取液，過(guò)濾，蒸發(fā)。所得粗化合物無(wú)須進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。9)N，N-二乙基-8-[2-甲氧基-(4，4，4-三氟-3-氧代丁基)苯基]-4,4-二氟-4-硼-33，48,-二氮雜-8-引達(dá)省-3，5-二曱酰胺(ss-6)的合成(如圖7所示)將粗化合物ss-5(560毫克，約1.0毫摩爾)溶解在20毫升無(wú)水二氯甲烷中，然后在O'C和氬氣氣氛下加入草酰氯和一滴DMF。然后在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物30分鐘。蒸發(fā)溶劑，在高真空條件下用泵抽掉痕量水和溶劑。然后，將所得固體重新溶解在20亳升無(wú)水二氯甲烷中。隨后在-40'C和氬氣氣氛下加入三氟醋酐(0.84毫升，6.0毫摩爾)和無(wú)水吡啶(0.65毫升，8.0毫摩爾)。然后在-20。C攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)。加入5毫升水，使反應(yīng)猝滅，并用20毫升二氯曱烷萃取所得溶液2次。用MgS04干燥合并的有機(jī)萃取物，過(guò)濾，蒸發(fā)。用硅膠柱色i瞽純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯甲烷=1/2)，得到化合物ss-6，其為紅色晶體(210毫克，約34%)。熔點(diǎn)83.6~84.6°C;HNMR(300MHz，CDC13):87.32(d，J=8,6，1H)，7.12(dd，J=6.5,2.2Hz，1H)，6.96(d，J=8.6Hz，1H)，6'73(d，J=4.0Hz，2H),6.43(d，J-4.6Hz，2H)，3.73(s，3H);3.59(q，J=7.2Hz,4H)，3.31(q，J=7.2Hz，4H)，3.06-3.00(m，2H)，2.83-2.77(m，1H)，2.08畫(huà)2.03(m，1H)，1.25(t，JN7.1Hz，6H)，1.09(t，J=7.1Hz，6H);13CNMR(100MHz，CDCI3):Sl卯.4(q，Jc_F=35.4Hz),162.9，155.8，151.2，145.0，135,3，131.4，131.2，122.3，116.8,U1.6(q，Jc.產(chǎn)285Hz)，55.6，43.0，38.7，37.8，36.1，29.6，27.2，13.8，12.0;19FNMR(376.5MHz，CDC13):8畫(huà)79.3(m，J=llHz)，-144.0(m，J=30Hz)，-145.3(m，J=30Hz);IR(CH2C12)2980，1639，1565cm、LRMS(EI)m/z(%)620(M+;30)，589(100);HRMS(EI):對(duì)于C3。H34BF5N404，計(jì)算值620.2593，測(cè)量值620,2598。實(shí)施例21)ss-6的熒光光譜將實(shí)施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至濃度為2mM，然后向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20pM。用PerkinElmerLS50熒光光譜儀測(cè)定20jiMss-6溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。用于測(cè)定激發(fā)光譜和熒光光譜的狹縫寬度均為5納米，光電倍增管電壓為775伏。在515納米的激發(fā)光波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。所得結(jié)果示于圖8。為了研究ss-6與過(guò)亞硝酸根(ONOO-)之間的反應(yīng)，按照Keith和Powell(Keith,W.G.&Powell,R.E.;氾weft.csrfec糊/7柳'ft'卵o//;emx:j;m'^"sac/rf;J.Chem.Soc.A.，1969，l，90)的方法制備ONOCT溶液。筒而言之，用鹽酸(0.6摩爾/升)酸化亞硝酸鈉(0.6摩爾/升)和過(guò)氧化氫(0.7摩爾/升)的混合物，在1~2秒內(nèi)加入氫氧化鈉(1.5摩爾/升)以中和酸，使溶液呈堿性。使該溶液通過(guò)二氧化錳，以驅(qū)除過(guò)量的過(guò)氧化氫。然后冷凍該溶液，分離出富含過(guò)亞硝酸根的暗黃色溶液，用于以下所有試驗(yàn)。利用1670厘米"(摩爾/升)"的消光系數(shù)(302納米處)估測(cè)所用儲(chǔ)備溶液中過(guò)亞硝酸根的濃度(Hughes&Nicklin;Thechemistryofpernitrites.PartI.Kineticsofdecompositionofpernitriousacid;CAew.5"ocA，1968,2,450-452)。所制備的過(guò)亞硝酸鹽溶液的堿性一般非常強(qiáng)(pH12)。當(dāng)加入較大量的過(guò)亞硝酸鹽時(shí)，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天中和部分過(guò)量的堿。在研究開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，都要檢查該較低堿性的過(guò)亞硝酸鹽溶液的吸光率，以確定過(guò)亞硝酸根在所需孵育時(shí)間內(nèi)沒(méi)有分解。還要定期檢查孵育管，以確信加入過(guò)亞硝酸鹽后，最終的pH沒(méi)有變化。隨后在室溫和劇烈攪拌下，向20nMss-6溶液中緩慢加入不同濃度的15當(dāng)量ONOO-溶液。體積變化不得超過(guò)1%。30分鐘后測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果示于圖9。反應(yīng)完成后，利用上述相同條件測(cè)定溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。與圖8相比，可以看到熒光強(qiáng)度急劇增加。2)ss-6的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜將化合物ss-6溶解于二氯甲烷至濃度為20jiM,測(cè)定所得20pMss-6溶液的吸收光譜，結(jié)果示于圖10。該結(jié)果證實(shí)了ss-6在515納米附近有最大吸光度。實(shí)施例3—比較ss-6與不同活性氧中間體的專(zhuān)一性將實(shí)施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至濃度為2mM，然后向所得溶液中加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20jiM。將50微升不同的活性氧中間體(10當(dāng)量)分別加入5毫升相應(yīng)的ss-6溶液中。測(cè)定處理前后熒光強(qiáng)度的變化，在實(shí)施例2中所述相同條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。上述熒光探針的濃度均為20jiM(lOOmM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)。結(jié)果示于表1。結(jié)果證實(shí)了ss-6具有非常高的選擇性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(a)SIN-1在緩沖液中能緩慢產(chǎn)生ONOO-。(b)加入Fe(CI04)2(25微升，40mM在緩沖液中)和H202(25微升，80mM),(c)在37。C下加入3-(l，4-二氫-l，4-橋二氧-l-萘基)丙酸(50微升，20mM)。(d)首先加入黃嘌呤氧化酶，待所有XO溶解后，加入黃嘌"H50微升，20mM)。實(shí)施例4—ss-6對(duì)過(guò)亞硝酸根的專(zhuān)一性檢測(cè)將實(shí)施例1中得到的化合物ss-6溶解于CH3CN至濃度為2mM，然后向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20jiM。然后加入過(guò)亞硝酸才艮，使其終濃度達(dá)到0、20、60、100、200、240和300nM，30分鐘后測(cè)定熒光光語(yǔ)。在與實(shí)施例2中相同的條件下測(cè)定熒光光譜，結(jié)果示于圖11。從圖ll可清楚看到，ss-6極大提高了熒光強(qiáng)度，且熒光強(qiáng)度與ONOO-的濃度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(如圖12所示)。以下實(shí)施例詳細(xì)描述了通式(III)所示化合物的制備和使用方法。該詳述落入上述"通用合成程序"的范圍之內(nèi)，并起示例作用，而所述"通用合成程序"構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，無(wú)意本限制發(fā)明的范圍。實(shí)施例5—ss-12的合成方案1)ss-7的合成(如圖13所示)向2，7-二氯熒光素(l.O克，2.5毫摩爾)的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中加入烯丙基溴(0.47毫升，5.0毫摩爾)。在60。C下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)后，加水，形成紅色固體。過(guò)濾得到化合物ss-7，產(chǎn)率大于99%。NMR(300MHz，CDC13):S8.33(d，J=7.6，1H)，7'78(t，J=7.3Hz，1H)，7'74(t，J=7.3Hz，1H)，7.30(d，J=7.3Hz，1H)，7.03(d，J=2.8Hz，2H)，6.96(s，1H);6.58(s，1H)，6.12國(guó)6.00(m，1H)，5.74國(guó)5.58(m,1H)，5.56誦5.38(m，2H)，5.21-5.13(m，2H)，4.75(d，J=6.2Hz,2H)，4.53(d，J=5.8Hz,2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.71，164.54，158.16，157.79，152.35，149.52，135.28，133.55,133,12，131.59，131.05，130.97，130.38，130.27，130.13，128.03，127.29，120.43，119.29，119.08，117.71，115.04，105.67，101.14，70.35，66.10;IR(CH2C12)1718，1589cm';LRMS(EI)m/z(%)480(M+;100);HRMS(EI):對(duì)于C26H17C1205，計(jì)算值480.0453，測(cè)量值480.0447。2)ss-8的合成(如圖14所示)將化合物ss-7(1.2克，2.5毫摩爾)溶解在丙酮(50毫升)與NaOH(1.25M,50毫升)的混合物中，將所得溶液加熱至回流，并保持1小時(shí)。冷卻到室溫后，在反應(yīng)混合物中加入1N鹽酸，以將溶液中和到pH2。加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)。用硅膠柱色語(yǔ)純化殘留物，得到化合物ss-8(760毫克，產(chǎn)率68%)。，HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.07(d，J=7.1Hz，1H)，7.72(t,J=7.3Hz,IH)，7.68(t，J=7.3Hz，1H),7.16(d，J=7.4Hz，IH)，6.91(s，IH);6.80(s,IH)，6.73(s，1H),6.71(s，IH)，6.10畫(huà)6.03(m，IH)，5.48(d，J=17.2Hz,IH)，5.36(d，J=10.5Hz，IH)，4.12(d，J=7.2Hz，2H);13C醒R(lOOMHz，CDC13):S168.27，155.21，155.04，151.51，150.30，149.98，135.96，132.59,130.59，128.27，128.09，125.83，125.18，123.95，118.10，117.26，116.44，111.48，110.34,103.62，102.39，81.23，69.53;IR(CH2CI2)2955，1771，1597cm1;LRMS(EI)m/z(%)440(M+;3)，361(100);HRMS(EI):對(duì)于C23H14C1205，計(jì)算值440.0218,測(cè)量值440.0222'3)ss-9的合成(如圖15所示)在室溫下，在叔丁醇鉀(230毫克，2.0毫摩爾)在苯(8毫升)和甲醇(3毫升)的混合物中形成的溶液中加入ss-8。當(dāng)固體完全溶解后，真空蒸發(fā)溶劑，得到相應(yīng)的鉀鹽。然后，加入CuCl(204毫克，1.9毫摩爾)和溶于吡啶(9毫升)中的化合物ss-8(980毫克，3.4毫摩爾)。所得混合物在氬氣下回流24小時(shí)。冷卻到室溫后，反應(yīng)混合物用HC1水溶液酸化。用乙酸乙酯萃取所得混合物。有機(jī)層用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)。用硅膠柱色譜純化殘留物，得到化合物ss-9(200毫克，產(chǎn)率20%)。力NMR(300MHz，CDCI3):88.07(d，J=6.6Hz，1H),7.74(t,J=7.3Hz，1H)，7'71(t，J=7.3Hz，1H)，7.24(d，J=8.3Hz，2H),7'18(d，J=7.0Hz，1H)，7.00(d，J=8.4Hz,2H);6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H),6.08-6.01(m，1H)，5.46(d,J=17.2Hz，1H),5.34(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d，J=5.0Hz，2H),3.70(s，3H)，2.98(t，J=7.5Hz，2H)，2.66(t，J=7.5Hz,2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5173.16，168.74，155.62，155.33，153.67，151.91，150.43，150.37，137.21，135.51,131.65，130.38，129.94，129.36，128.74，126.34，125.50，123.81，119.78，118.83，118.47，115.29，114.10，111.32，106.29，101.52，81.53，69.83，51.68，35.64，30.19;IR(CH2C12)3055，2928，1765，1589，1475，1412cm";LRMS(EI)m/z(%)602(M+;100);HRMS(EI):對(duì)于C33H24C1207,計(jì)算值602.0899，測(cè)量值602.0890。4)ss-10的合成(如圖16所示)在室溫下，向化合物ss-9(874毫克，1.44毫摩爾)在THF(IO毫升)和水(3毫升)中的溶液里加入LiOH'H20(300毫克，7.2毫摩爾)。在40。C下攪拌3小時(shí)后，用1N鹽酸酸化反應(yīng)混合物。用NaCI使所得溶液達(dá)到飽和，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。用無(wú)水硫酸鈉干燥合并的有機(jī)層，濃縮得到ss-10(500毫克，產(chǎn)率60%)。'HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.08(d，J=7.3Hz，1H)，7.74(t，J=7.3Hz,1H)，7.70(t,J=7.3Hz，1H)，7.26(d，J=8.3Hz,2H)，7.18(d，J=7.0Hz，1H);7.01(d，J=8.4Hz，2H),6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s,1H),6.06-6.00(m:1H)，5.46(d，J=17.2Hz，1H),5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.61(d，J=5.0Hz，2H)，2.99(t，J=7.5Hz，2H)，2.72(t，J=7.5Hz，2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.77，168.81，155.67，155.30，154.83,151.93，150.46，150.42，136.87，135.55，131.67，130.42，129.97，129.41，128.78，126.38，125.55，123.83，119.80，118.89，118.50，115.37，114.21，111.35，106.42,101.56，81.59，69.87，35.76，29.93;IR(CH2C12)3421，3055，1765，1624,1416cm1;FABm/z589(JVT);HRMS(EI):對(duì)于C32H22C1207，計(jì)算值589.0821，測(cè)量值589.0820。5)ss-11的合成(如圖17所示)在化合物ss-10(490毫克，0.83毫摩爾)的CH2C12(15毫升)溶液中加入將草酰氯(0,22毫升，2.5毫摩爾)，在室溫下攪拌所得溶液3小時(shí)。減壓蒸發(fā)掉溶劑和過(guò)量的草酰氯。將所得?；热芙庠贑H2C12(20毫升)中，然后在氮?dú)庀掠?40"加入三氟醋酐(0.7毫升，5毫摩爾)和吡啶(0.54毫升，7毫摩爾)'使所得混合物緩慢升溫到-20。C，在該溫度下持續(xù)攪拌4小時(shí)。緩慢加水，使反應(yīng)猝滅。用鹽水洗滌反應(yīng)混合物。用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層并濃縮。用快速柱色譜純化殘留物，得到ss-l1，其為黃色固體(240毫克，產(chǎn)率45%)。熔點(diǎn)85.0~86.1°C;NMR(400MHz，CDC13):S8.08(d，J=7.4Hz，1H)，7.76-7.68(m，2H)，7.26(d，J=8.5Hz，2H)，7.18(d，J=7.4Hz，1H)，7.02(d，J=8.4Hz,2H),6.83(s，1H);6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H)，6.07-6.00(m，1H),5.46(d，J=17.2Hz，1H)，5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d,J=4.4Hz，2H),3.10-3.07(m，2H)，3.04畫(huà)3.00(m,2H);13CNMR(101MHz，CDC13):S190.5(q，Jc.F=35.3Hz)，168.72，155.67，155.09，154.12，151.91，150.43，150.41，135.79,135.53，131.66，130.41，129.97，129.44，128.76，126.36，125.52，123.81，120.07，119.82，118.92，118.47，H5.70(q，Jc.F=292Hz)，114.41，111.34，106.60，101.55，81.49，69.86，37.99，27.61;19F(376MHz，CDC13)S-79.18;IR(CH2C12)3055，1765，1597，1475，1402cm1;LRMS(EI)m/z(%)640(M4)，561(100);HRMS(EI):對(duì)于C33H21a2F306,計(jì)算值640.0665，測(cè)量值640.0667。6)ss-12的合成(如圖18所示)向化合物ss-11(260毫克，0.4毫摩爾)在混合溶劑CH3CN(4毫升)、CC14(4毫升)和水(6毫升)中形成的溶液里依次加入催化劑RuCl3'3H20(5毫克)和NaI04(865毫克，4,0毫摩爾)在室溫下劇烈攪拌所得混合物1小時(shí)，然后加入CH2Clz。分離有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后得到殘留物。用快速柱色語(yǔ)純化殘留物，得到化合物ss-12(214毫克，產(chǎn)率80%)。熔點(diǎn)105.0~106.0°C;NMR(400MHz，CDC13):58.09(d，J=7.2Hz，IH)，7.76-7.71(m，2H)，7.24(d，J=8.5Hz，2H),7.18(d，J=7.4Hz，IH)，7.01(d，J=8.5Hz，2H)，6.83(s，1H);6.78(s，IH)，6'71(s，1H)，6'67(s，IH)，4.76(d,J=2.5Hz，2H)，3.08(t，J=6.2Hz，2H)，3.02(t，J=6.2Hz，2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5190.48(q，Jc.F=35.3Hz)，172.44，168.82，155.23，154.72，153.97，151.77，150.32，150.24,135.88，135.64,130.51，129.99，129.40，129.24，126.21，125.59，123.82，120.16，119.87，118.94，U5.46(q，Jc—F=292.2Hz)，114.13，112.71，106.44，101.67，81.34，65.49，37.96，27.57;IR(CH2C12)3420，3055，1765，1610，1408cm1;LRMS(EI)m/z(%)614(M+畫(huà)COOH;19)，579(100);HRMS(EI):對(duì)于C31H18CI2F306，計(jì)算值613.0433,測(cè)量值613.0469。實(shí)施例61)ss-12的熒光光譜將實(shí)施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至濃度為2mM，然后向所得溶液中加入lOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20fiM。用PerkinElmerLS50熒光光鐠儀測(cè)定20fiMss-12溶液的激發(fā)光鐠和熒光光譜。用于測(cè)定激發(fā)光譜和熒光光譜的狹縫寬度均為2.5納米，光電倍增管電壓為775伏。在490納米的激發(fā)光波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。所得結(jié)果示于圖19。隨后在室溫和劇烈攪拌下，向20jiMss-12溶液中緩慢加入不同濃度的15當(dāng)量ONOO-溶液。體積變化不得超過(guò)1%。30分鐘后測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化，結(jié)果示于圖20。反應(yīng)完成后，利用上述相同條件測(cè)定溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。與圖19相比，可以看到熒光強(qiáng)度急劇增加。2)ss-12的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜將化合物ss-12溶解于二氯甲烷至濃度為20pM，測(cè)定所得的20jiMss-12溶液的吸收光譜，結(jié)果示于圖21。結(jié)果表明，ss-12在460納米和490納米附近有兩個(gè)吸收峰。實(shí)施例7—比較ss-12與不同活性氧中間體的專(zhuān)一性將實(shí)施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至濃度為2mM,然后向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20fiM。將50微升不同的活性氧中間體(10當(dāng)量)分別加入到5毫升相應(yīng)的ss-12溶液中。測(cè)定處理前后熒光強(qiáng)度的變化，在實(shí)施例2中所述相同條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。上述熒光探針的濃度均為20jiM(100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)。結(jié)果示于表2。結(jié)果證實(shí)了ss-12具有非常高的選擇性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(a)請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例3表1中ROS的產(chǎn)生過(guò)程。(b)通過(guò)SNP(二水合亞硝基鐵(III)氰化鈉)產(chǎn)生NO(FeelischM.，義1993，14,123-132)。實(shí)施例8—ss-12對(duì)過(guò)亞硝酸根的專(zhuān)一性檢測(cè)將實(shí)施例5中得到的化合物ss-12溶解于CH3CN至濃度為2mM，然后向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20pM。然后加入過(guò)亞硝酸根，使其終濃度達(dá)到0、20、60、100、200、240和300fiM，30分鐘后測(cè)定熒光光譜。在與實(shí)施例6中相同的條件下測(cè)定熒光光譜，結(jié)果示于圖22。從圖22可清楚看到，ss-12極大提高了熒光強(qiáng)度，且熒光強(qiáng)度與ONOCT的濃度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(如圖23所示)。實(shí)施例9一細(xì)胞試驗(yàn)在該研究的整個(gè)過(guò)程中，由胚齡為15天的Sprague-Dawley大鼠制備原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元。簡(jiǎn)而言之，在聚-L-賴(lài)氨酸包被的6孔板上(BDBiosciences,SanDiego，CA，USA)上用Neurobasal/2%B27(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)平板培養(yǎng)(plated)解離的細(xì)胞懸浮體，密度為2xl()S個(gè)細(xì)胞/孔，所述Neurobasal/2%B27中有含谷氨酸(0.5mM，SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO)、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100jig/mL).在5%C02-95%空氣和37。C條件下，將細(xì)胞保持在增濕孵育器中。在第10天，將培養(yǎng)的皮質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，用濃度為20fiM的ss-6和ss-12在孵育所述經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞15分鐘，然后用磷酸鈉緩沖液(100mM，pH7.4)洗滌3次。隨后，分別用10和IOOjiMSIN-1(3-嗎啉代_斯德酮亞胺*鹽酸)處理細(xì)胞15分鐘。用磷酸鈉緩沖液(100mM,pH7.4)洗滌后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞。結(jié)果表明，探針在測(cè)定分子內(nèi)ONOO-的產(chǎn)生方面給出了令人滿(mǎn)意的結(jié)果(如圖24所示)。參考文獻(xiàn)1.PCT國(guó)際公開(kāi)WO01/64664，公開(kāi)于2001年9月7日(Nagano等)。2.PCT國(guó)際公開(kāi)WO2004040296，公開(kāi)于2004年5月31日(Nagano等)。3.Augusto，O.;Radi，R,Gatti，R.M.;Vasquez國(guó)Vivar，J.MethodsEnzymol.1996，269，346-354.4.Beal，M.F.，F(xiàn)reeRadicalBiol.&Med.2002,32，392.5.Beckman，J.S.，Am.J.Physiol.CellPhysiol.1996，271，C1424.6.BeckmanJ.S.，IschiropoulosH，ZhuL，vanderWoerdM，SmithC,ChenJ,HarrisonJ，MartinJ,C.andTsaiM.，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?；o(wú)機(jī)酯的基團(tuán)；R24和R25共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)；R25和R26共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)；或R26和R27共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R是CH3。3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Rr是OCBhOZ"4.權(quán)利要求3所述的化合物，其中Z，是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；?、烯酰基、炔酰基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳?；蚓勖训幕鶊F(tuán)。5.權(quán)利要求4所述的化合物，其中Zi是CH3。6.權(quán)利要求1所述的化合物，其中IV是NR2，R3，。7.權(quán)利要求6所述的化合物，其中R是氫。8.權(quán)利要求7所述的化合物，其中R3，是(C-0)Z2。9.權(quán)利要求8所述的化合物，其中Z2是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基或聚醚的基團(tuán)。10.權(quán)利要求l所述的化合物，其中&和R3共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。11.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R4和Rs共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。12.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R6是卣素取代的低級(jí)烷基。13.權(quán)利要求12所述的化合物，其中R6是CFnH3—n。14.權(quán)利要求13所述的化合物，其中"n"為1或2。15.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Wn是CH3。16.權(quán)利要求1所述的化合物，其中W,是叔丁基。17.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R7是CH3。18.權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述熒光團(tuán)選自吖啶橙、蒽環(huán)、別藻藍(lán)蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙紅、赤蘚紅、熒光胺、熒光素、FAM(羧基熒光素)、HEX(六氯熒光素)、JOE(6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素)、俄勒岡綠、藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四曱基若丹明)、TET(四氯熒光素)、德克薩斯紅、四曱基若丹明和黃嘌呤。19.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R9是(00)NR，R2"。20.權(quán)利要求19所述的化合物，其中R，是-(CH2)k-CH3.21.權(quán)利要求20所述的化合物，其中k-024。22.權(quán)利要求19所述的化合物，其中R2"是-(CH2),-CH3。23.權(quán)利要求22所述的化合物，其中1=0~24。24.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Rg和R9共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)。25.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Ru選自(C-0)NR3"R4"。26.權(quán)利要求25所述的化合物，其中R3"是-(CH2)p-CH3。27.權(quán)利要求26所述的化合物，其中p=0~24。28.權(quán)利要求25所述的化合物，其中R4"是-(CH2)q-CH3。29.權(quán)利要求28所述的化合物，其中q=0~24。30.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Rn和Ru共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。31.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4，是CH3。32.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4，AOCH2OZ3。33.權(quán)利要求32所述的化合物，其中Z3是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷?；?、烯酰基、炔酰基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳酰基或聚醚的基團(tuán)。34.權(quán)利要求33所述的化合物，其中Z3是CH3。35.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Ru，是NRs，R6，。36.權(quán)利要求35所述的化合物，其中Rs，是氫。37.權(quán)利要求36所述的化合物，其中IV是(C-0)Z4。38.權(quán)利要求37所述的化合物，其中Z4是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、聚醚的基團(tuán)。39.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R"和Rw共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)。40.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Rn是卣素取代的低級(jí)烷基。41.權(quán)利要求40所述的化合物，其中Rn是CFJH:^。42.權(quán)利要求41所述的化合物，其中"n"為1或2。43.權(quán)利要求1所述的化合物，其中\(zhòng)￥2是CH3。44.權(quán)利要求1所述的化合物，其中\(zhòng)￥2是叔丁基。45.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。46.權(quán)利要求1所述的化合物，其中議18是CH3。47.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。48.權(quán)利要求1所述的化合物，其中Rw是CH3。49.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2Q是-(CH2)m-COOH。50.權(quán)利要求49所述的化合物，其中m-l24。51.權(quán)利要求l所述的化合物，其中R/和Rs，共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。52.權(quán)利要求l所述的化合物，其中119，和R^，共同形成5、6或7元環(huán)，其選自芳基、雜環(huán)、雜芳基或雜芳環(huán)。53.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Ru，是自素取代的低級(jí)烷基。54.權(quán)利要求40所述的化合物，其中Ru，是CFnH3—n。55.權(quán)利要求41所述的化合物，其中"n"為1或2。56.權(quán)利要求1所述的化合物，其中W3是CH3。57.權(quán)利要求1所述的化合物，其中\(zhòng)￥3是叔丁基。58.權(quán)利要求l所述的化合物，其中1124和R2s共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。59.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Rm和Rm共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán).60.權(quán)利要求l所述的化合物，其中Rm和1127共同形成5、6或7元環(huán)，其選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或雜芳基或雜芳環(huán)。61.用于測(cè)定過(guò)亞硝酸根的試劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物。62.測(cè)定樣品中過(guò)亞硝酸根的方法，其包括以下步驟a)使根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物與樣品接觸；熒光。63.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述樣品是化學(xué)樣品或生物樣品。64.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述生物樣品是動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物組織、植物細(xì)胞、植物組織或微生物。65.用于檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的高通量篩選熒光法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求61所述的試劑。66.用于篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過(guò)亞硝酸根的產(chǎn)生，所述方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求l所述的化合物。全文摘要本發(fā)明提供了能與過(guò)亞硝酸根發(fā)生專(zhuān)一性反應(yīng)，而不與其他的活性氧中間體和活性氮中間體反應(yīng)的組合物。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定過(guò)亞硝酸根的相關(guān)試劑。本發(fā)明還提供了利用這樣的組合物和試劑測(cè)定樣品中過(guò)亞硝酸根的相關(guān)方法、檢測(cè)過(guò)亞硝酸根的高通量篩選熒光法和篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過(guò)亞硝酸根的產(chǎn)生。文檔編號(hào)G01N31/22GK101321767SQ200680045462公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2006年8月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月7日發(fā)明者D·揚(yáng),H·王,J·沈,Z·孫申請(qǐng)人:香港大學(xué)