專利名稱：：用于提高植物的氮貯藏容量的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，這個(gè)發(fā)明涉及由營養(yǎng)貯藏蛋白的表達(dá)賦予的植物中提高的氮貯藏容量。
背景技術(shù)：
：目前對于用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的氮肥的全球需求為約9千萬公噸，到2050年計(jì)劃增加到約2億4千萬公噸。在作物生產(chǎn)中應(yīng)用的大量的氮由于淋失(leaching)和脫氮而流失，這不僅增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本，而且有助于環(huán)境污染。例如，淋失的氮污染地下水，而從富含氮的農(nóng)田流走的水造成江河和三角洲中的藻類生長。由于高度攝取其硝酸鹽形式的氮，地下水和流走的水中的過量氮還可以造成人類和牲畜中的健康問題。已經(jīng)提議了許多作物生產(chǎn)技術(shù)以減少氮從作物田流失。農(nóng)業(yè)最佳管理實(shí)踐已經(jīng)集中在通過提高氮應(yīng)用技術(shù)、采用任選的耕種系統(tǒng)、及利用改進(jìn)的排水方法來減少氮離去農(nóng)田的量。然而，這樣的實(shí)踐部分由于缺乏合適的刺激，通常遭受農(nóng)民中的低順應(yīng)性。雖然公共廢水處理工廠部分通過將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨降低了氮含量，但是由于高相關(guān)成本，另外的去除硝酸鹽的處理是不普遍的。天然的濕地也已經(jīng)用于與常規(guī)的處理工廠相比以更低成本和更大的有效性去除營養(yǎng)物，但是這樣的應(yīng)用已經(jīng)造成非故意的生物學(xué)后果，象一些植物物種的選擇性生長。對于上述方法的一個(gè)替換方法是開發(fā)可以更有效地吸收和利用來自土壤的氮的新型作物品種。已知許多植物通過積聚被稱為植物貯藏蛋白(VSP)的一類蛋白而在它們的營養(yǎng)細(xì)胞中截留(sequester)過量的氮。VSP的大小范圍從約15到約100kDa，并且已經(jīng)從其他類的蛋白鑒定，如石威性磷酸酶、幾丁酶、凝集素、及脂加氧酶。已經(jīng)報(bào)道VSP在多種一年生和多年生植物物種中存在，所述植物物種包括大豆、車軸草(clover)、苜蓿、MWcago、Jra6油戸's、齊花(canola)、楊樹(poplar)、黑桑(blackmulberry)、及桃樹。然而，至今仍未確定VSP在單子葉植物(monocot)中的存在。因此，本發(fā)明通過提高單子葉植物-來源的VSP的表達(dá)，解決了對于提高植物，尤其是單子葉植物中的氮貯藏容量的需要。
發(fā)明內(nèi)容提供了用于提高植物的氮貯藏容量，尤其是植物的營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的氮貯藏容量的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括提高營養(yǎng)貯藏蛋白(vegetativestorageprotein,VSP)在植物的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，尤其是單子葉植物-來源的VSP或具有VSP性質(zhì)的其生物活性片段或其變體的表達(dá)。以這種方式，所述方法包括將包含多核苷酸序列的至少一個(gè)核普酸構(gòu)建體51入感興趣的植物中，所述多核苷酸序列包含單子葉植物-來源的VSP或其生物活性片段或變體的編碼序列，其中所述編碼序列可操作地連接到驅(qū)動在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子。在一些實(shí)施方式中，VSP是SEQIDNO:2中陳列的玉蜀黍VSP-型脂加氧酶ZmLox6蛋白，所述核苷酸構(gòu)建體包括SEQIDNO:1的核普酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6的編碼序列、編碼ZmLox6蛋白的核苷酸序列、或者編碼ZmLox6蛋白的生物活性片段或變體的核普酸序列。依賴于用于VSP的截留的理想的亞細(xì)胞定位，核普酸構(gòu)建體可以可選地包括液泡類別信號或質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，以引導(dǎo)VSP或其片段或變體分別儲存入類;信號:質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，包:而不限4組成性、可誘導(dǎo)的:、和組織優(yōu)選的啟動子(tissue-preferredpromoters)。在一些實(shí)施方式中，可操作地連結(jié)的啟動子是葉子-優(yōu)選的啟動子，以便VSP、更具體地ZmLox6或其片段或變體的水平，優(yōu)先在植物的葉子組織內(nèi)提高。所述啟動子可以可選地被選擇以便提供VSP或其片段或變體以細(xì)胞-優(yōu)選的方式(例如葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的或維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的方式)的表達(dá)，以最小化VSP積聚對細(xì)胞代謝過程的影響。通過提高植物細(xì)胞內(nèi)的氮貯藏容量，可以提高全部的植物對施加的土壤氮的反應(yīng)，導(dǎo)致可獲得的土壤氮的利用提高。本發(fā)明的方法還提供用于提高植物的氮含量，尤其是葉子、莖、和種子組織內(nèi)的氮含量，其有益地提高了草料(forage)和青貯飼料(silage)作物植物的營養(yǎng)價(jià)值，以及種子，尤其是農(nóng)業(yè)作物物種的谷粒的營養(yǎng)價(jià)值。本發(fā)明的組合物包括核苦酸構(gòu)建體，其包括可操作地連接的液泡類別信號(vacuolarsortingsignal)和玉蜀黍ZmLox6VSP或具有VSP性質(zhì)的其生物活性片段或變體的編碼序列，以及可操作地連接的啟動子。所述可操作地連接的啟動子可以為驅(qū)動植物細(xì)胞中的表達(dá)的任何啟動子，包括而不限于組成性、可誘導(dǎo)的、或組織-優(yōu)選的啟動子。進(jìn)一步揭二供的是包含這些核苷酸構(gòu)建體的植物、植物細(xì)胞、植物組織、和轉(zhuǎn)基因種子。這些構(gòu)建體發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中的應(yīng)用，用于提高營養(yǎng)植物細(xì)胞的氮貯藏容量、提高植物或其植物部分的氮含量、提高草料和青飼作物植物的營養(yǎng)價(jià)值、以及提高種子的營養(yǎng)價(jià)值。圖1示出了攜帶在Rubisco小亞單位(SSU)啟動子的控制下的ZmLox6編碼序列的載體。圖1A示出了沒有可操作地連接的Zeawa，(ZM)proaleurain信號肽(SP)和液泡類別信號(VTS)的編碼序列的載體。圖IB示出了具有可才乘作地連接的ZMproaleurainSP和VTS的編碼序列的載體。圖2示出了攜帶在Zea(ZM)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)啟動子的控制下的ZmLox6編碼序列的載體。圖2A示出了沒有可操作地連接的ZMproaleurainSP和VTS的編碼序列的載體。圖2B示出了具有可操作地連接的ZMproaleurainSP和VTS的編碼序列的載體。圖3示出了攜帶在組成性Zea(ZM)UBI啟動子的控制下的ZmLox6編碼序列的載體。圖3A示出了沒有可操作地連接的ZMproaleurainSP和VTS的編碼序列的載體。圖3B示出了具有可操作地連接的ZMproaleurainSP和VTS的編碼序列的載體。圖4示出了從在四種不同的氮水平的存在下生長的植物采集的不同組織的勻漿的可溶部分的SDS-PAGE結(jié)果。示出了四個(gè)柱的三個(gè)組，對應(yīng)于來自葉子(左手組)、根(中間組)、及莖(右手組)的勻漿的可溶部分。在每組內(nèi)，所述四個(gè)柱對應(yīng)于來自在沒有硝酸鹽("0")、1mM硝酸鹽("l")、100mM硝酸鹽("100")、或50mM銨和50mM硝酸鹽的組合("50+50")的存在下生長的植物的勻漿。葉子組中的箭頭指出在葉子組織中在更高水平的氮暴露時(shí)鑒定的~100kDa多肽帶。圖5示出了在切除圖4所示的~100kDa多肽帶、消化、及對收集的蛋白水解肽測序后鑒定的12個(gè)不同的肽序列。如所示的，這些肽對應(yīng)于ZmLox6多肽(SEQIDNO:2)的多個(gè)節(jié)段。圖6示出了來自玉蜀黍和其它植物物種的ZmLox6到Lox蛋白的系統(tǒng)發(fā)生比4交。圖7示出了利用VectorNTI的ZmLox6(SEQIDNO:2)和ZmLoxl0(SEQIDNO:4)多肽的序列對準(zhǔn)。保守區(qū)被陰影化(shaded),用灰色正文(greytext)示出精確的殘基匹配。圖8示出了比較在創(chuàng)傷后V5發(fā)育階段V5玉米葉子中ZmLox6基因表達(dá)的誘導(dǎo)的圖。表達(dá)的誘導(dǎo)(以ppm測量)在創(chuàng)傷后0、3、12、及24小時(shí)隨時(shí)間示出。圖9示出了比較在創(chuàng)傷后V5發(fā)育階段的玉米節(jié)根(nodalroot)中ZmLox6基因的表達(dá)的誘導(dǎo)的圖。表達(dá)的誘導(dǎo)(以ppm測量)在創(chuàng)傷后后("W"組)0、3、12、及24小時(shí)隨時(shí)間示出，與未受傷的實(shí)-瞼對照比較("U"組)。圖10示出了ZmLoxlO在B73、ILP、及IHP的葉子中的表達(dá)水平。圖11示出了Rosetta細(xì)胞的載體pET28A中ZmLox6蛋白的表達(dá)和純化。注意在~100kDa的蛋白高水平表達(dá)。圖12A和12B示出了不同的葉子部分、源自葉鞘的維管束和葉肉細(xì)胞的SDS凝膠(左側(cè))和相應(yīng)的Westernblot(右側(cè))。注意到ZmLox6蛋白主要在葉肉細(xì)胞中表達(dá)。圖13:用于ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)展的抗-Lox6抗體的滴定。給出了用于Lox6蛋白的對于抗體稀釋的滴定，其中吸光度從1:15,000到1:40,000稀釋是線性的。圖14:Lox6蛋白在玉蜀黍葉子中的表達(dá)。來自To代的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)ZmLox6基因。從六個(gè)不同的構(gòu)建體獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件(對于載體構(gòu)建信息，參見圖2)?？s寫Ubi-Intron,玉蜀黍泛素啟動子連通一個(gè)內(nèi)含子；PEPC,玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶啟動子；SSU,玉蜀黍Rubisco小亞單位啟動子；VTS,來自玉蜀黍aleurain的液泡把向信號。僅示出了具有單一拷貝轉(zhuǎn)基因插入的那些事件(event)。插入物表明借助抗-Lox6抗體在用星號標(biāo)志(identified)的一些事件上獲得的Westernblot。Western結(jié)果確認(rèn)了ELISA結(jié)果。在非轉(zhuǎn)基因系中平均表達(dá)是在Y軸上所用的尺度上的25。圖15:來自借助PEPC1-L0X6基因構(gòu)建體獲得的To轉(zhuǎn)基因植物的葉子的不同蛋白的重新流通?？s寫Rubisco,Ribulose二磷酸核酮糖羧化酶(bisphosphatecarboxylase);NR,硝酸還原酶(nitratereductase);PEP-C,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。圖16:源自PEPClPRO-Lox6構(gòu)建體的田地-生長的Tl事件中ZmLox6的表達(dá)(圖2A)。包含在表達(dá)由PEPC1驅(qū)動的ZmLox6的轉(zhuǎn)基因事件中玉蜀黍中開花后不同蛋白的重新流通。對于每個(gè)組，表示與用于轉(zhuǎn)化的對照近交系相關(guān)的數(shù)據(jù)。每個(gè)條代表來自跨越多個(gè)事件的128個(gè)植物的數(shù)據(jù)。還示出了通過ELISA定量的PEPC、Rubisco、及硝酸還原酶蛋白的表達(dá)水平。后綴E代表來自用于轉(zhuǎn)化的近交系的結(jié)果，其用作對照。來自16個(gè)田地生長的植物的每個(gè)的耳穗葉(earleaf)以一周的間隔取樣，跨越8個(gè)事件，起始于開花前兩周，結(jié)束于四周后葉子衰老時(shí)。提取后，利用針對ZmLox6,ZmPEPC,CA/aw;/cfowo^wRubisco(我們已經(jīng)顯示其特異性識別玉蜀黍Rubisco蛋白和玉蜀黍硝酸還原酶)的抗體，對來自葉子樣品的蛋白進(jìn)行ELISA。ELISA結(jié)果表示為相對于跨越轉(zhuǎn)基因或?qū)φ罩参锏淖畲笾?為100)的相對比例。結(jié)果清楚地表明在轉(zhuǎn)基因事件中僅Lox6蛋白的表達(dá)為5倍高的水平。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了用于提高植物的氮貯藏容量的方法和組合物，由此與野生型或?qū)φ罩参锟色@得的氮含量相比，提高植物或其植物部分的氮含-來源的營養(yǎng)貯藏蛋白(vsp)或其生物活性片段:戈變:。提高植物的細(xì)胞內(nèi)，尤其是營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)單子葉植物-來源的VSP或其片段或變體的表達(dá)，導(dǎo)致植物具有提高的對施加的土壤氮的反應(yīng)性和提高的可獲得的土壤氮的應(yīng)用。根據(jù)本文披露的方法遺傳修飾的農(nóng)作物植物有益地減輕與以肥料形式供應(yīng)給土壤的氮的淋失和脫氮相關(guān)的問題。通過提高植物的細(xì)胞內(nèi)的氮貯藏容量，本發(fā)明的方法提供了具有提高的氮含量的植物，尤其是在葉子、莖、及種子內(nèi)。因此本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生具有提高的營養(yǎng)價(jià)值的草料和青伺作物植物，以及用于產(chǎn)生具有提高的營養(yǎng)價(jià)值的種子，尤其是谷粒。根據(jù)本發(fā)明，VSP或其生物活性片段或變體是具有VSP性質(zhì)的多肽，即，用作儲庫以貯藏過量氮的多肽，所述過量氮隨后可以被釋放和在植物內(nèi)重新流通(remobilized),以便在例如，瞬時(shí)應(yīng)激(如營養(yǎng)和/或水分虧缺)的周期期間支持現(xiàn)存植物組織的代謝，和/或支持新的組織的生長和發(fā)育。具有VSP性質(zhì)的多肽被稱為"VSP"、"VSP多肽"、或"VSP蛋白"，并且編碼具有VSP性質(zhì)的多肽的多核苷酸被稱為"VSP多核苷酸"。"單子葉植物-來源的"VSP或VSP多核普酸指的是天然存在于單子葉植物物種內(nèi)的VSP或VSP多核苷酸，或者已經(jīng)從天然存在于單子葉植物物種內(nèi)的VSP或VSP多核苷酸獲得的VSP或VSP多核苷酸，其中獲得是通過單子葉植物VSP或VSP多核苦酸的遺傳性操作和/或單子葉植物VSP多核苷酸的應(yīng)用以從其它植物物種分離編碼同源VSP的VSP多核普酸。尤其是，用在本發(fā)明的方法中的單子葉植物-來源的VSP多核苷酸包括，例如，SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的玉蜀黍(maize)VSP-型脂加氧酶ZmLox6基因的編碼序列、編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的序列、以及下面限定的其片段和變體。本發(fā)明的單子葉植物-來源的VSP多肽包括，例如，SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白以及本文下面限定的其生物活性片段和變體。如本文其他地方的實(shí)驗(yàn)部分中更充分描述的，ZmLox6蛋白表現(xiàn)出VSP的特征，因此代表VSP-型脂加氧酶。例如，ZmLox6蛋白在生長培養(yǎng)基中供應(yīng)高水平的N后被誘導(dǎo)，并且在葉子中表達(dá)最高，方式類似于被稱為VLX-D的大豆VSP(Tranbarger,etal.,(1991)PlantCell3:973-988)?？紤]到其VSP性質(zhì)，ZmLox6在本文中被稱為VSP,并且編碼ZmLox6的序列被認(rèn)為是VSP多核苦酸。雖然ZmLox6蛋白表現(xiàn)出VSP性質(zhì)并且因此為VSP-型脂加氧酶，但是認(rèn)為ZmLox6蛋白或其變體還可以表現(xiàn)出與蛋白的脂加氧酶家族的其他成員相關(guān)的其它生物學(xué)活性(參見，例如，美國專利No.6,921,847;其全部內(nèi)容以引用方式并入本文)。根據(jù)本發(fā)明，植物、或其植物部分或植物細(xì)胞的"提高氮貯藏容量"指的是所述植物、或其植物部分或植物細(xì)胞的總可溶蛋白部分相對于分別用野生型或?qū)φ罩参?、或其植物部分或植物?xì)胞觀察到的，提高至少1%、5%、10%、20%、30%、40%或50%。通過提高氮l&藏容量，尤其是葉子和莖組織內(nèi)的氮貯藏容量，可以提高草料作物或青飼作物植物的氮含量，并由此提高營養(yǎng)價(jià)值。草料是由食草動物吃的草本植物材料(包括稻科植物類和豆類)，而青貯飼料是通常供應(yīng)給反芻類動物的發(fā)酵的、高濕氣的草料。用在青貯飼料生產(chǎn)中的植物包括玉米(corn)、高粱(Milo)、多年生稻科植物類(如狗牙根(Bermudagrass)、星草(Stargrass)、及牛鞭草(Limpograss)(牛鞭草屬(Hemarthria)))、一年生稻科植物類(如如〕草高粱(foragesorghum)、高粱-蘇丹草雜種(sorghum-sudanhybrids)、珍珠栗(pearlmillet)、及小粒谷類作物和麥草)、豆類(legumes)(如苜蓿、紅三葉草和其它冷季豆類、及夏季豆類，包括毛槐藍(lán)(hairyindigo)、鏈莢豆、合萌(aeschynomene)、及才艮莖多年生花生(rhizomeperennialpeanut))、甘蔗、燕麥、及作物組合，如高粱和大豆或燕麥和豌豆。雖然玉米是用于牛和乳牛飼料的青貯飼料的主要來源，但是玉米青貯飼料的蛋白含量較低，必須補(bǔ)充以較高蛋白含量的飼料，如來自大豆粉的飼料。雖然大豆產(chǎn)生具有比玉米中發(fā)現(xiàn)的高得多的氮水平的營養(yǎng)植物組織，但是大豆不適于青貯飼料生產(chǎn)。因此，開發(fā)具有提高的VSP多肽(如ZmLox6或其生物活性變體)的表達(dá)的單子葉植物將提高氮截留和草料和青飼作物的營養(yǎng)價(jià)值。根據(jù)本發(fā)明，用于草料和青貯飼料的"提高植物、或其植物部分的氮含量"指的是相對于野生型或?qū)φ罩参?、或其植物部分觀察到的，基于干重測量的植物或其植物部分內(nèi)的％總氮增加至少1%、2%、5%、10%、20%或50%。當(dāng)種子是農(nóng)藝學(xué)感興趣時(shí)，如在谷類作物中，本發(fā)明的方法可以相對于從天然對照植物獲得的種子提高種子產(chǎn)量、和/或提高種子的氮含量、和/或提高種子的營養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)槿~子和莖組織內(nèi)以ZmLox6蛋白或其變體形式截留的過量的氮可以被重新流通以支持更大的種子生產(chǎn)和種子填充，尤其是在土壤氮水平限于再生庫(reproductivesink)發(fā)育時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，"提高種子的氮含量"指的是相對于野生型或?qū)φ罩参锏姆N子觀察到的，種子內(nèi)基于種子干重測量的％氮提高至少1%、2%、5%、10%、20%、或50%。本發(fā)明的方法包括提高單子葉植物-來源的VSP在植物中的表達(dá)，尤其是玉蜀黍VSP-型脂加氧酶ZmLox6或具有VSP性質(zhì)的其生物活性片段或變體的表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將至少一個(gè)核苷酸構(gòu)建體引入感興趣的植物，所述構(gòu)建體包含可操作地連接至驅(qū)動在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子的編碼ZmLox6蛋白或其生物活性片辜殳或變體的核普酸序列。所述核苷酸構(gòu)建體可以可選地包括用于液泡類別"f言號(vacuolarsortingsignal)或質(zhì)體辟爭運(yùn)月太(plastidtransitpeptide)的可操作地連結(jié)的編碼序列，以便將ZmLox6蛋白或其片段或變體分別引導(dǎo)入這個(gè)蛋白在其中表達(dá)的植物細(xì)胞的液泡區(qū)室或質(zhì)體區(qū)室。在特別地實(shí)施方式中，VSP為ZmLox6或其生物活性片段或變體，所述植物為單子葉植物，如玉蜀黍。任何啟動子可以用于驅(qū)動單子葉植物-來源的VSP的表達(dá)，所述單子葉植物-來源的VSP例如ZmLox6蛋白或其具有VSP性質(zhì)的生物活性片段或變體，所述啟動子包括而不限于下文描述的啟動子。因此，例如，在一些實(shí)施方式中，VSP,例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體的表達(dá)，由組成性啟動子驅(qū)動，以提供在整個(gè)植物的細(xì)胞中在多數(shù)時(shí)間和多數(shù)組織中的表達(dá)，或者由可誘導(dǎo)的啟動子驅(qū)動，以便表達(dá)響應(yīng)于剌激而,皮誘導(dǎo)，例如響應(yīng)于創(chuàng)傷、外部施加的化學(xué)制品、或環(huán)境應(yīng)激。在另外的實(shí)施方式中，VSP,例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體的表達(dá)，由組織-優(yōu)選的啟動子驅(qū)動，以便表達(dá)優(yōu)先發(fā)生在希望的組織內(nèi)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子，以提供在葉子組織的細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)。在另外的實(shí)施方式中，選擇啟動子以提供VSP,例如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體優(yōu)先在特定的葉子細(xì)胞內(nèi)(如在葉肉細(xì)胞或維管束鞘細(xì)胞內(nèi))的表達(dá)，以提供VSP或其片段或變體在葉子組織的這些細(xì)胞內(nèi)的局部積聚。這樣的啟動子在本文中被稱為"葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子，，或"維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子，，，并且包括本文其他地方描述的那些啟動子。雖然C3植物的葉子組織通常包括松散組織的維管束鞘細(xì)胞，但是大部分光合作用酶和相關(guān)的光合作用機(jī)器被包含在更豐富的葉肉細(xì)胞的葉綠體內(nèi)。當(dāng)VSP或其生物活性片段或變體的優(yōu)先表達(dá)在C3植物的葉子的葉肉細(xì)胞內(nèi)被靶向時(shí)，包含可操作地連接到葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子的感興趣的VSP或其片段或變體的編碼序列的核苷酸構(gòu)建體可以可選地包含液泡類別信號，以便將表達(dá)的VSP或其片段或變體引導(dǎo)入這些細(xì)胞的液泡區(qū)室以最小化對葉綠體和細(xì)胞功能的影響。C4植物的葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞之間的光合功能的明顯區(qū)別表示可以被有利地操作以提高這些植物的氮貯藏容量的不同的氮儲庫機(jī)會。C4植物如玉蜀黍的葉肉細(xì)胞內(nèi)的較少豐富的葉綠體包含少量Rubisco或不包含Rubisco,其在維管束鞘細(xì)胞的豐富的葉綠體內(nèi)濃集。不限于理論，C4植物的葉子內(nèi)的葉肉細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室可以被預(yù)期為以單子葉植物-來源的VSP或其片段或變體形式的氮的貯藏提供額外的4諸庫(除了由C4植物葉子組織的葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中均存在的細(xì)胞質(zhì)和液泡區(qū)室提供的儲庫以外)，同時(shí)最小限度地影響葉綠體功能。認(rèn)識到在C4植物的葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)可以是希望的。這可以通過例如將作為單個(gè)的核苷酸構(gòu)建體或作為多個(gè)核苷酸構(gòu)建體的下列多核苷酸引入植物而實(shí)現(xiàn)包含可操作地連接到優(yōu)先驅(qū)動VSP或其片段或變體在葉肉細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的啟動子的感興趣的VSP或其片段或變體的編碼序列的至少一個(gè)多核香酸、以及包含可操作地連接到驅(qū)動VSP或其片段或變體在維管束鞘細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動子的感興趣的VSP或其片段或變體的編碼序列的至少另一多核苷酸。當(dāng)VSP或其片段或變體要被優(yōu)先在C4植物如玉蜀黍的葉肉和/或維管束鞘細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，所述核苦酸構(gòu)建體可以可選地包含可操作地連接的液泡類別信號的編碼序列，以引導(dǎo)表達(dá)的VSP或其片段或變體進(jìn)入葉肉或維管束鞘細(xì)胞的液泡區(qū)室內(nèi)。當(dāng)VSP或其片段或變體要在C4植物的葉肉細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先表達(dá)時(shí)(單獨(dú)或與在維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)結(jié)合)，要被引入植物中的核苷酸構(gòu)建體可以被設(shè)計(jì)以便所述多核苷酸編碼上述可操作地連接的液泡轉(zhuǎn)運(yùn)肽，或者可以被設(shè)計(jì)以便所述多核苷酸編碼可操作地連接的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以便引導(dǎo)表達(dá)的VSP或其片段或變體進(jìn)入葉肉細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室內(nèi)。通過提高單子葉植物-來源的VSP,如ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體在植物中的表達(dá)，可以提高植物內(nèi)的氮貯藏容量，產(chǎn)生了在感興趣的一個(gè)或多個(gè)組織中總植物氮含量的全面提高。以這種方式，本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)了在提高用于草料和青貯飼料的植物的總氮含量和營養(yǎng)價(jià)值中的應(yīng)用，以及在提高種子(如谷類作物中的種子)的總氮含量和營養(yǎng)價(jià)值中的應(yīng)用。雖然本文描述的單子葉植物-來源的VSP極其生物活性片段和變體的編碼序列可以用于提高任何感興趣的植物的氮貯藏容量，但是發(fā)現(xiàn)ZmLox6編碼序列及其片段和變體在提高單子葉植物如玉蜀黍的氮貯藏容量、組織氮含量、及營養(yǎng)價(jià)值中的特別應(yīng)用，因?yàn)檫@個(gè)VSP已經(jīng)發(fā)展到在單子葉植物細(xì)胞環(huán)境內(nèi)起作用。進(jìn)一步認(rèn)識到提高植物的氮貯藏容量可以有益地提供來自環(huán)境的更有效的氮應(yīng)用，同時(shí)為所述植物提供過量氮儲量，其可以在隨后的植物發(fā)育周期期間被流通，如在結(jié)實(shí)(seedset)和種子填充期間，尤其是在所述植物遭受水和/或營養(yǎng)應(yīng)激時(shí)。本發(fā)明的方法包括分離的或基本上純化的VSP多核苷酸或蛋白組合物(包括ZmLox6編碼序列和蛋白)的應(yīng)用，以便提高植物的氮貯藏容量、提高草料或青飼作物植物的氮含量和營養(yǎng)價(jià)值、提高種子(尤其是農(nóng)作物植物的谷粒)的氮含量和營養(yǎng)價(jià)值。"分離的"或"純〗匕的"多核苦酸或蛋白，或其生物活性部分，實(shí)質(zhì)上或基本上不含有通常伴隨其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的多核香酸或蛋白或與天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的多核普酸或蛋白相互作用的成分。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)、或通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)的培養(yǎng)基、或基本上不含化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其它化學(xué)成分(chemicals)。最佳地，"分離的"多核苷酸不含天然地位于多核苷酸來源的有機(jī)體的基因組DNA中的多核苷酸(即，位于多核苷酸的5'和3'端的序列)的側(cè)翼的序列(最佳地蛋白編碼序列)。例如，在多個(gè)實(shí)施方式中，分離的多核苷酸可以包含少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其天然地位于多核苷酸來源的細(xì)胞的基因組DNA中的多核苷酸的側(cè)翼?；旧喜缓?xì)胞物質(zhì)的蛋白包括具有少于約30%、20%、10%、5%或1%(以干重計(jì)算)的污染蛋白的蛋白的制備。當(dāng)重組產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或其生物活性部分時(shí)，最佳的培養(yǎng)基顯示少于約30%、20%、10%、5%或1%(以干重計(jì)算)的化學(xué)前體或非感興趣的蛋白的化學(xué)成分。單子葉植物-來源的VSP多核苷酸和由其編碼的多肽的片段和變體的應(yīng)用也由本發(fā)明包括。依賴于上下文，"片段"指的是多核苷酸的部分或由其編碼的氨基酸序列和由此的蛋白的部分。多核苷酸的片段可以編碼保留原始蛋白的生物學(xué)活性并因此提供VSP性質(zhì)的蛋白片段。因此，核苦酸序列的片段的范圍可以從至少約20個(gè)核普酸、約50個(gè)核苷酸、約IOO個(gè)核苷酸一直到編碼VSP多肽的全長多核苷酸。編碼VSP多肽的生物活性部分的VSP多核苦酸的片段將編碼全長VSP多肽(例如，SEQIDNO:2的ZmLox6多肽的892個(gè)氨基酸)中存在的至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或875個(gè)相鄰氨基酸，或最多全部數(shù)量的氨基酸?？梢詳y帶完整蛋白的特征的VSP多肽的部分可以通過分離VSP多核苷酸的部分、表達(dá)VSP多肽的編碼的部分(如，通過體外重組表達(dá))、以及評估VSP多肽的編碼的部分的活性而制備。作為VSP多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600或2,650個(gè)相鄰核苷酸、或至多全長VSP多核苷酸中存在的核苷酸的數(shù)量(如，對于SEQIDNO:1的ZmLox6核苷酸序列的2,909個(gè)相鄰核苷酸，或者對于SEQIDNO:3的ZmLox6編碼序列的2，676個(gè)相鄰核苷酸)。術(shù)語"變體"指的是基本上類似的序列。對于多核苷酸，變體包括具有這樣的多核苷酸，其具有在5'和/或3'端的缺失(即，截短)；一個(gè)或多個(gè)核苷酸在天然多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)的缺失和/或添加；和/或一個(gè)或多個(gè)核普酸在天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的替換。如本文所用的，"天然"多核苷酸或多肽分別包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸，保守變體包括因?yàn)檫z傳密碼的簡并性而編碼VSP多肽，如SEQIDNO:2的ZmLox6的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因變體，如可以利用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的這些變體，例如，借助聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，如，例如通過利用位點(diǎn)-引導(dǎo)的誘變或"改組(shuffling)，，產(chǎn)生的那些。通常，特定多核苷酸(例如SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列，或者SEQIDNO:1的核普酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列)的變體具有與那個(gè)特定多核苷酸至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，如通過本文其它地方描述的序列對準(zhǔn)程序和參數(shù)確定的。還可以通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參考多核苷酸編碼的多肽之間的百分比序列同一性評估特定多核普酸(即，參考多核苦酸)的變體。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，VSP多核苷酸的變體是編碼具有與SEQIDNO:2的ZmLox6多肽具有給定的百分比同一性的VSP多肽的分離的多核苷酸。任何兩個(gè)多肽之間的百分比序列同一性可以利用本文其他地方所述的序列對準(zhǔn)程序和參數(shù)計(jì)算。當(dāng)任何給定的用于實(shí)施本發(fā)明的多核普酸對通過比較它們編碼的兩個(gè)多肽分享的百分比序列同一性來評估時(shí)，所述兩個(gè)編碼的多肽之間的百分比序列同一性為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、990/0或更多的序列同一性。"變體"蛋白意圖意味著通過以下從天然和/或原始蛋白獲得的蛋白通過在所述蛋白的N-末端和/或C-末端缺失(所謂的截短)一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在所述蛋白中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在所述蛋白中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本發(fā)明包括的變體蛋白是生物活性的，即，它們繼續(xù)具有本文所述的希望的VSP性質(zhì)。VSP多肽(例如SEQIDNO:2所示的ZmLox6蛋白)的生物活性變體，將具有與天然蛋白的氨基酸序列至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90o/o、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性，其通過本文其他地方所述的序列對準(zhǔn)程序和參數(shù)確定。VSP多肽(例如，ZMLox6蛋白)的生物活性變體，可以不同于那個(gè)多肽，不同之處為少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)、如6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2、或甚至1個(gè)氨基酸殘基。用于實(shí)施本發(fā)明的單子葉植物-來源的VSP多肽可以以各種途徑一皮改變，所述途徑包括氨基酸替換、缺失、截短、和插入。用于這樣的操作的方法在本領(lǐng)域是公知的。例如，可以通過編碼多核苦酸中的突變制備SEQIDNO:2的ZmLox6蛋白的氨基酸序列變體和片段，所述編碼多核苷酸如SEQIDNO:1中陳列的序列，或者SEQIDNO:1的核普酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的編碼序列。用于誘變和多核普酸改變的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見，例如，Kunkel(1985)尸racA^/.y4cac/.S".82:488-492;Kunkel,"《(1987)A/"/z^'力154:367-382;美國專利No.4,873,192;WalkerandGaastra,eds.(1983)rec/zmgwe^M/ecw/orAo/ogy(MacMillanPublishingCompany,NewYork)及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響感興趣的蛋白的生物活性的氨基酸替換的指導(dǎo)可以在Dayhoff,a/.,(1978)^//oso/尸to"/"Segi/ewcetmdS&wc/we(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到，其以引用方式并入本文?？梢赃M(jìn)行保守的替換，如一個(gè)氨基酸用另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸交換。單子葉植物-來源的VSP多肽，例如ZMLox6蛋白，或其生物活性片段和變體，還可以通過修飾編碼多核普酸而#1改變，以表達(dá)富含必需氨基酸的VSP多肽(相對于在天然蛋白中這樣的氨基酸的平均水平)，所述必需氨基酸包括賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、及異亮氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼ZMLox6蛋白、或其生物活性片段或變體的多核苦酸被修飾以便所述蛋白的賴氨酸含量豐富。用于改變蛋白的營養(yǎng)氨基酸含量的方法是已知的(參見，例如，美國專利No.6,905,877,其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中)。因此這樣的方法提供這樣的應(yīng)用提高本文所述的VSP多肽的營養(yǎng)價(jià)值、以及提高植物或其植物部分的營養(yǎng)價(jià)值、表達(dá)這樣的營養(yǎng)提高的VSP多肽。用在本發(fā)明的方法中的變體VSP多核苷酸和VSP還包括從誘變和重組過程如DNA改組獲得的序列和蛋白。采用這樣的過程，一個(gè)或多個(gè)不同的VSP多肽編碼序列可以一皮處理以形成具有希望的性質(zhì)的新的VSP多肽。以這種方式，可以從包含具有基本的序列同一性并且可以在體外或體內(nèi)被同源重組的序列區(qū)的相關(guān)序列多核苷酸群產(chǎn)生重組多核香酸的文庫。例如，利用這個(gè)方法，編碼感興趣的結(jié)構(gòu)域的序列基序可以在SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的ZMLox6序列和其它已知的Lox基因之間被改組，以獲得編碼具有改進(jìn)的感興趣的性質(zhì)(如提高的必需氨基酸的含量)的VSP蛋白的新的基因。用于這樣的DNA改組的策略在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，Stemmer(1994)尸toc.Ato/.Jcm/.Sc/.V&491:10747-10751;Stemmer(1994)A^w"370:389-391;Crameri,Wa/.,(1997)A^m"B,o/ec/z.15:436-438;Moore,"(1997)A/o/.S/o/.272:336-347;Zhang,"a/.,(1997)尸rac.Ato/.爿cat/.V&494:4504-4509;C腿eri,"a/"(1998)Atore391:288-291;以及美國專利Nos.5,605,793和5,837,458。用在本發(fā)明的方法中的ZmLox6多核苷酸可以用于從其它植物(包括其它單子葉植物)分離相應(yīng)的VSP序列。以這種方式，如PCR、雜交等方法可以用于基于它們與SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列、或SEQIDNO:1的核普酸62-2470中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列的序列同源性鑒定這樣的序列?；谂c本文陳述的完整ZmLox6核普酸序列或與其變體和片段的它們的序列同一性分離的序列被本發(fā)明包括。這樣的序列包括作為所披露的序列的直系同源體(orthologs)的序列。"直系同源體"意圖意味著從共同的祖先基因獲得并且由于物種形成在不同的物種中發(fā)現(xiàn)的基因。在不同的物種中發(fā)現(xiàn)的基因，當(dāng)它們的核苷酸序列和/或它們的編碼的蛋白序列分享至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性時(shí)，被認(rèn)為是直系同源體。直系同源體的功能在物種中通常是高度保守的。因此，編碼VSP多肽，并且在嚴(yán)格條件下雜交到SEQIDNO:1的ZmLox6序歹廿、或SEQIDNO:1的核普酸62畫2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或其變體或片l殳的分離的多核苷酸可以用于實(shí)施本發(fā)明。在PCR方法中，寡核苷酸引物可以被設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)以擴(kuò)增來自cDNA或從任何感興趣的植物提取的基因組DNA的相應(yīng)DNA序列。用于設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法通常在本領(lǐng)域是已知的，并且拔:露在Sambrook,"(1989)A</o/ecw/arC7owz'wg..」Z^6ona^or_yA/awi/<a/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)中。還參見,Innis,"a/.,eds.(1990)尸CT^尸rc^oco/s:爿Gm't/etoA/e/zo<isawe/々/7//ca"'0朋(AcademicPress,NewYork);InnisandGelfand,eds.(1995)尸CR5Vr她g/es(AcademicPress,NewYork);以及InnisandGelfand,eds.(1999)尸CATW^/zoAA^mwa/(AcademicPress,NewYork)中。PCR的已知方法包括而不限于利用配對引物、巢式引物(nestedprimer)、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配的引物等的方法。在雜交技術(shù)中，全部或部分的已知的多核苷酸被用作探針，其選擇性地雜交到來自所選有機(jī)體的克隆的基因組DNA片段或cDNA片段的群(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它相應(yīng)多核苷酸。雜交探針可以為基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核普酸，并且可以用可檢測的基團(tuán)如32P,或任何其它可4企測的標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，用于雜交的一笨針可以通過標(biāo)記基于SEQIDNO:1的ZmL0x6核普酸序列、或SEQIDNO:1的核苦酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmL0x6編碼序列的合成寡核苷酸來制備。用于制備用于雜交和用于cDNA和基因組文庫的構(gòu)建的探針的方法通常在本領(lǐng)域是已知的，并且才皮露在Sambrook,e/1a/.,(1989)Mo/ecw/orC7om'wg..爿丄aZ)c^a/10^7Mmwa/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)中。例如，SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737、或SEQIDNO:3中4皮露的完整ZmLox6多核香酸、或其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能夠特異性雜交到相應(yīng)VSP多核苷酸和信使RNA的探針。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，這樣的探針包括這樣的序列，其在VSP多核苷酸序列中是獨(dú)特的，最佳為約10個(gè)核香酸的長度、最佳為至少約20個(gè)核普酸的長度。這樣的探針可以用于通過PCR擴(kuò)增來自所選植物的相應(yīng)VSP多核苷酸。這個(gè)技術(shù)可以用于從希望的植物分離另外的VSP編碼序列或者作為診斷試樣(assay)以確定植物中VSP編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括平鋪的(plated)DNA文庫的雜交篩選(斑塊或集落；參見，4列^口，Sambrook,"a/.,(1989)Mo/ecw/a廣C/om力g..jZ^0raf0/7A/"w認(rèn)/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。這樣的序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。"嚴(yán)格的條件"或"嚴(yán)格的雜交條件，，指的是這樣的條件，在這樣的條件下探針將以比其它序列更大的可檢測地程度雜交到其耙序列(例如，至少2倍于背景)。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的并且在不同的情況下將是不同的。通過控制雜交和/或沖洗條件的嚴(yán)格性，100%互補(bǔ)于所述探針的耙序列可以被鑒定(同源探測)?？蛇x地，可以調(diào)整嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，以便檢測較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針為少于約1000個(gè)核苷酸的長度，最佳為少于500個(gè)核苷酸的長度。典型地，嚴(yán)格的條件將是那些條件，其中鹽濃度少于約1.5MNa離子，通常約0.01-1.0MNa離子濃度(或其它鹽類)，pH為7.0-8.3,對于短探針(例如，10到50個(gè)核普酸)，溫度為至少約30。C,對于長探針(例如，大于50個(gè)核苦酸)，溫度為至少約60。C。嚴(yán)格地條件還可以通過加入去穩(wěn)定劑如曱酰胺實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括用30-35%的曱酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37。C雜交，以及在50-55。C的lX-2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中沖洗。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括在40-45%甲酰胺、l.OMNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在55-60°C的0.5X-1XSSC中沖洗。示例性的高度嚴(yán)格性條件包括在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在60-65。C在0.1XSSC中沖洗。可選地，沖洗緩沖劑可以包括約0.1%到約1%的SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間通常少于約24小時(shí)，通常約4到約12小時(shí)。沖洗時(shí)間的持續(xù)時(shí)間將為至少足以達(dá)到平衡的時(shí)間長度。特異性通常為雜交后沖洗的功能，關(guān)鍵因素為最終沖洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可以為接近來自于MeinkothandWahl(1984)^"a/.Aoc/^m.138:267-284的等式Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%形(form))-500/L;其中M為單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形為雜交溶液中甲酰胺的百分比，以及L為堿基對中雜交體的長度。Tm為(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)50%的互補(bǔ)靶序列雜交到完全匹配的探針的溫度。對于每個(gè)1%的錯(cuò)配，Tm降低約l。C;因此，可以調(diào)整Tm、雜交、和/或沖洗條件以雜交到希望的同一性的序列。例如，如果尋求具有^90%同一性的序列，Tm可以降低10。C。通常，在限定的離子強(qiáng)度和pH時(shí)，對于特異性序列及其互補(bǔ)體，選擇的嚴(yán)格的條件比熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，極其嚴(yán)格的條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低l、2、3或4。C的雜交和/或沖洗；中等嚴(yán)格的條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9或10。C的雜交和/或沖洗；低嚴(yán)格性條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低11、12、13、14、15或2(TC的雜交和/或沖洗。利用所述等式、雜交和沖洗組分、及希望的Tm,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解雜交和/或沖洗溶液的嚴(yán)格性中的變化被內(nèi)在的描述。如果希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低于45。C(水溶液)或32°C(曱酰胺溶液)，最好是提高SSC濃度以便可以利用更高的溫度。對于核酸的雜交的更廣泛的指導(dǎo)存在于Tijssen(1993)丄a6orafory!Tec/zm々wesi^'oc/ze,'Wrycmt/Mo/ecw/arS/o/ogy-外6n'cfc加'onvWf/zAAwc/"'c/Vo6es,PartI,Chapter2(Elsevier:NewYork);及Ausubel,"a/.,eds.(1995)Cwrew/1/Vwoco/sM/ecw/arChapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)中。參見，Sambrook,"a/.,(1989)A/o/ecw/arC7om'"g:爿Z^60ra,07她鼎a/(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。下面的術(shù)語用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a)"參考序列"，(b)"比較窗"，(c)"序列同一性"，及(d)"序列同一性的百分比"。(a)如本文所用的，"參考序列，，是用作序列比較的基礎(chǔ)的限定的序列。參考序列可以為特定的序列的亞組或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的節(jié)段，或者完全的cDNA或基因序列。(b)如本文所用的，"比4交窗"涉及多核苷酸序列的相鄰和特異性節(jié)段，其中所述比較窗中的多核普酸序列可以包括相較于參考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，間隙)，用于所述兩個(gè)多核苷酸的最佳對準(zhǔn)。通常，比較窗為至少20個(gè)相鄰核苷酸的長度，可選地可以為30、40、50、IOO個(gè)的長度或更長。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解為了避免由于多核苷酸序列中包含間隙導(dǎo)致與參考序列的高度相似性，通常虧1入間隙罰分并且從匹配的數(shù)量被減去。用于比較的序列的對準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域是熟知的。因此，任何兩個(gè)序列之間的百分比序列同一性的確定可以利用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是MyersandMiller(1988)OWOS4:11-17的算法；Smith,"a/.,(1981)A/v.柳/.2:482的局部對準(zhǔn)算法；Needl函nandWunsch(1970)丄M/.腸/.48:443-453的全局對準(zhǔn)算法(globalalignmentalgorithm);PearsonandLipman(1988)尸rac.Ato/.Jem/.S".85:2444-2448的才企索局部(search-for-local)對準(zhǔn)方法；KarlinandAltschul(1990)A^/.爿catZ.t/&487:2264-2268的算法，在KarlinandAltschul(1993)尸亂淑/.JcW.f/&490:5873-5877中改良。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施可以用于序列的比較以確定序列同一性。這樣的實(shí)施包括而不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可以從Intelligenetics,MountainView,California獲得)；ALIGN程序(Version2.0)和GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage,Version10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA(可以從AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA獲得)?？梢岳萌笔?shù)進(jìn)行利用這些程序的對準(zhǔn)。CLUSTAL程序由Higgins,W"/.,(1988)73:237-244(1988);Higgins,"a/.,(1989)5:151-153;Corpet,e,a/.,(1988)7Vwc/e/c爿"A16:10881-90;Huang,a/.,(1992)8:155畫65;及Pearson,a/.,(1994)Me仇Mo/.歷o/.24:307-331充分描述。ALIGN程序是基于上文MyersandMiller(1988)的算法。PAM120權(quán)重殘基表，12的間隙長度罰分，4的間隙罰分在比較氨基酸序列時(shí)可以與ALIGN程序使用。Altschul，"a/.,(1990)丄Mo/.AW.215:403的BLAST程序是基于上文的KarlinandAltschul(1990)的算法。BLAST核苷酸檢索可以借助BLASTN程序進(jìn)行，得分=100,字長=12,以獲得與編碼本發(fā)明的方法中所用的VSP的核苷酸序列同源的核香酸序列。BLAST蛋白檢索可以借助BLASTX程序進(jìn)行，得分=50,字長=3，以獲得與本發(fā)明的方法中所用的VSP同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的間隙對準(zhǔn)(gappedalignment),可以使用間隙BLAST(BLAST2.0中)，如Altschul,"a/.,(1997)/"'d/Ato.25:3389中所述?？蛇x地，PSI-BLAST(BLAST2.0中)可以用于進(jìn)行檢測分子之間的遙遠(yuǎn)關(guān)系的反復(fù)檢索。參見，上文Altschul,""/.,(1997)。當(dāng)利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時(shí)，可以使用各個(gè)程序的缺省參數(shù)(例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)。BLAST軟件在NCBI網(wǎng)站上是公眾可獲得的。對準(zhǔn)還可以通過檢查手動進(jìn)行。除非另外說明，本文提供的序列同一性/相似性值指的是利用GAPVersion10利用下列參數(shù)獲得的值利用50的GAP權(quán)重和3的長度權(quán)重，以及nwsgapdna.cmp計(jì)分矩陣，用于核苷酸序列的％同一性和％相似性；利用8的GAP權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及BLOSUM62計(jì)分矩陣，用于氨基酸序列的％同一性和％相似性；或者其任何等效程序。"等效程序"指的是任何序列比較程序，對于任何兩個(gè)所討論的序列，產(chǎn)生在與由GAPVersion10產(chǎn)生的相應(yīng)的對準(zhǔn)比較時(shí)，具有相同的核苦酸或氨基酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性的對準(zhǔn)。GAP利用Needl函nandWunsch(1970)丄M/.腸/.48:443-453的算法，以發(fā)現(xiàn)最大化匹配的數(shù)量和最小化間隙的數(shù)量的兩個(gè)完全序列的對準(zhǔn)。GAP考慮所有可能的對準(zhǔn)和間隙位置并形成具有最大數(shù)量的匹配石咸基和最少的間隙的對準(zhǔn)。它允許^見定匹配的石咸基的單位中的間隙形成罰分和間隙擴(kuò)展罰分。GAP必須利用對于它插入的每個(gè)間隙的匹配的間隙形成罰分?jǐn)?shù)量。如果所選的間隙擴(kuò)展罰分大于零，那么GAP必須，另外，利用插入的每個(gè)間隙的間隙長度乘以間隙擴(kuò)展罰分。用于蛋白序歹寸的GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的Version10中擊夾省間隙形成罰分值和間隙擴(kuò)展罰分值分別為8和2。對于核香酸序列，缺省間隙形成罰分為50,而缺省間隙擴(kuò)展罰分為3。間隙形成和間隙擴(kuò)展罰分可以被表達(dá)為選自由從O到200組成的整數(shù)的組的整數(shù)。因此，例如，間隙形成和間隙擴(kuò)展罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。GAP表示最佳配準(zhǔn)的家族的一個(gè)成員?？梢源嬖谶@個(gè)家族的許多成員，但是沒有其他成員具有更好的質(zhì)量。GAP顯示四個(gè)用于配準(zhǔn)的品質(zhì)因數(shù)質(zhì)量、比率、同一性、及相似性。質(zhì)量是為了對準(zhǔn)序列最大化的量度。比率是質(zhì)量除以較短節(jié)段中的堿基數(shù)量。百分比同一性是實(shí)際上匹配的符號的百分比。百分比相似性是相似的符號的百分比。從間隙穿過的符號被忽略。當(dāng)對于成對記號的計(jì)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，相似性被計(jì)分。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的Version10中所用的計(jì)分矩陣是BLOSUM62(參見，HenikoffandHenikoff(1989)尸廠oc.A^/.JcaJ.89:10915)。(c)如本文所用的，在兩個(gè)多核香酸或多肽序列的上下文中的"序列同一性，，或"同一性，，指的是兩個(gè)序列中當(dāng)在特定的比較窗上對準(zhǔn)用于最大的相應(yīng)性時(shí)相同的殘基。當(dāng)使用的序列同一性的百分比涉及蛋白時(shí)，認(rèn)識到不相同的殘基位置通常由保守的氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被另外的具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基替換，并因此不改變所述分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列在保守的替換方面不同時(shí)，百分比序列同一性可以被向上調(diào)整以校正替換的保守性質(zhì)。由于這樣的保守替換而不同的序列被稱為具有"序列相似性，，或"相似性"。用于進(jìn)行這樣的調(diào)整的方式對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。典型地，這涉及將保守替換作為部分而不是全部錯(cuò)配計(jì)分，由此提高百分比序列同一性。因此。例如，當(dāng)相同的氨基酸被給予1的得分時(shí)，非保守的替換被給予0的得分，保守的替換被給予O和1之間的得分。當(dāng)在例如程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California)中實(shí)施時(shí)，計(jì)算保守替換的計(jì)分。(d)如本文所用的，"序列同一性的百分比"指的是通過在比較窗上比較兩個(gè)最佳對準(zhǔn)的序列確定的值，其中比較窗內(nèi)多核苦酸序列的部分與參考序列相比(其不包括添加或缺失)可以包括添加或缺失(即，間隙)，用于兩個(gè)序列的最佳對準(zhǔn)。百分比通過如下計(jì)算確定兩個(gè)序列中存在的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配的位置的數(shù)量、匹配的位置的數(shù)量除以比較窗中位置的總數(shù)、結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列同一性的百分比。術(shù)語"多核苷酸"的應(yīng)用不意圖限于包含DNA的多核普酸。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到多核苦酸可以包括核糖核香酸和核糖核苷酸與脫氧核糖核苦酸的組合。這樣的脫氧核糖核苷酸和核糖核苦酸包括天然存在的分子和合成類似物。因此，多核苷酸還包括所有形式的序列，包括而不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)卡式、莖-和-環(huán)結(jié)構(gòu)等。VSP多核苦酸，例如，ZmLox6多核苷酸或其片段或變體，可以在表達(dá)盒中提供，用于在感興趣的植物中的表達(dá)。所述盒將包括可操作地連接到VSP多核苷酸的5，和3'調(diào)節(jié)序列。"可操作地連接的"意圖指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間的功能性連接。例如，感興趣的多核苷酸和調(diào)節(jié)序列(即，啟動子)之間的可操作的連接是允許感興趣的多核普酸的表達(dá)的功能性連接?？刹僮鞯剡B接的元件可以是相鄰的或不相鄰的。當(dāng)用于指兩個(gè)蛋白編碼區(qū)之間的接合時(shí)，"可操作地連接的"指的是編碼區(qū)是在相同的閱讀框中。所述盒可以另外包含至少一個(gè)要被共轉(zhuǎn)化入植物中的另外的基因?？蛇x地，所述另外的基因可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供。這樣的表達(dá)盒設(shè)置有多個(gè)限制性位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，用于VSP多核苷酸的插入，以在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下。所述表達(dá)盒可以另外地包含其它基因，包括其它可選的標(biāo)記物基因。所述表達(dá)盒在轉(zhuǎn)錄的5'-3'方向上將包括植物中功能性的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動子)、VSP多核苷酸(例如，SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737、SEQIDNO:3、或其片段或變體)、及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即，終止區(qū))。所述調(diào)節(jié)區(qū)(即，啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、及翻譯終止區(qū))和/或VSP多核苷酸可以是對于宿主細(xì)胞或者對于彼此是天然的/類似的。可選地，調(diào)節(jié)區(qū)和/或VSP多核芬酸可以是對于宿主細(xì)胞或?qū)τ诒舜耸钱愒吹摹Ｈ绫疚乃玫?，關(guān)于序列的"異源的"是起源于外來物種的序列，或者，如果起源于相同的物種，通過故意的人類介入而在組成和/或基因組基因座中從其天然的形式充分地修飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸的啟動子是來自不同于所述多核苷酸來源的物種的物種，或者，如果來源于同樣的/類似的物種，一個(gè)或兩個(gè)均從它們起源形式和/或基因組基因座被充分地修飾，或者所述啟動子對于可操作地連接的多核普酸不是天然啟動子。雖然利用異源啟動子表達(dá)VSP多核苷酸是最佳的，但是可以使用天然啟動子序列。這樣的構(gòu)建體可以改變植物或植物細(xì)胞中編碼的多肽的表達(dá)水平。因此，所述植物或細(xì)胞的表型可以被改變。所述終止區(qū)可以是與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的，可以與可操作地連接的感興趣的VSP多核苷酸是天然的，可以與植物宿主是天然的，或者可以源自對于啟動子、感興趣的VSP多核苷酸、植物宿主、或其任何組合的另外的來源(即，外來或異源的)。本發(fā)明所用的方便的終止區(qū)包括那些可以從A^me/""e朋的Ti-質(zhì)粒獲得的終止區(qū)，如肉堿合酶和胭脂堿(nopaline)合酶鄉(xiāng)冬止區(qū)。還參見，Guerineau,"a/.，(1991)A^/.262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon,""/.，(1991)Gew^Dev.5:141-149;Mogen,"a/.,(1990)尸/"WCe〃2:1261-1272;Munroe,W(1990)91:151-158;Ballas,efa/.,(1989)A^c/w'cJcz^fe17:7891-7903;及Joshi,Wa/.,(1987)A^c/e/c^c^s尺饑15:9627-9639。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒包括可操作地連接到感興趣的VSP編碼序列的液泡類別信號的編碼序列，所述VSP例如SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體。將蛋白分類到蛋白貯藏液泡的類別信號是特別有趣的。參見，例如，NeuhausandRogers(1998)尸/aWA/o/.說o/.38:127-144,及Holwerda,"a/.,(1992)77zeCe〃4:307-318,以引用方式并入本文中。這樣的用于液泡類別信號的編碼序列的實(shí)例在本領(lǐng)域是已知的，并且包括而不限于玉蜀黍proaleurain液泡類別信號。例如，來自煙草幾丁酶和南瓜2S白蛋白的C-末端前肽(propeptide)均已經(jīng)一皮成功地用于將可溶蛋白革巴向液泡。參見，Mistubishi,Wa/.,(2000)尸/"WCe〃尸/z;wo/.41(9):993國1001;及Tamura,"a/.,(2003)T7ze尸/a""35:545-555。在另外的實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒包括可操作地連接到感興趣的VSP的編碼序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，所述VSP例如SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體，以便將表達(dá)的VSP引導(dǎo)入VSP被表達(dá)的植物細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室內(nèi)。這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)肽在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，VonHeijne,Wa/.，(1991)尸/a"/A/o/.Aep.9:104-126;Clark，"a/.,(1989)丄S/o/.C7ze肌264:17544-17550;Della國Cioppa,"a/.,(1987)尸/awf尸/zjas7'o/.84:965-968;Romer,"(1993)Sz'oc/em.5z'o//z;^.Comm朋.196:1414-1421;及Shah,Wa/"(1986)233:478-481。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(還稱為葉綠體靶向序列)在本領(lǐng)域是已知的并且包括核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亞單位(deCastroSilvaFilho,""/.,(1996)尸/爐嵐腸/.30:769-780;Schnell，"(1991)J.腸/.C/em.266(5):3335-3342);5-(烯醇式丙酮)莽草酰-3-磷酸合酶(5-(enolpyruvyl)shikimate-3-phosphatesynthase)(EPSPS)(Archer,"a/.,(1990)J.Aome"6.22(6):789-810);色氨酸合酶(Zhao,"a/.,(1995)丄祝o/.C/z置270(11):6081-6087);質(zhì)體藍(lán)素(Lawrence,"(1997)J.C7ze肌272(33):20357-20363);chorismatesynthase(Schmidt"a/.,(1993)J.S/o/.C/zew.268(36):27447-27457);以及捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(lightharvestingchlorophylla/bbindingprotein)(LHBP)(Lamppa,e,a/.，(1988)J.C/zem.263:14996-14999)。還參見VonHeijne,Wa/.，(1991)尸/a^Mo/.AW.A印.9:104-126;Clark,Wa/.，(1989)丄Ao/.CAew.264:17544-17550;Della誦Cioppa,a/.,(1987)尸/a^尸/zjwo/.84:965-968;Romer,"a/.,(1993)腸c/z離腸p—.C麵m肌196:1414-1421;及Shah,""/.,(1986)233:478-481。用于提高感興趣的多肽在植物或植物細(xì)胞中的表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如，通過將緊鄰于起始蛋氨酸ATG密碼子并且在其下游的一個(gè)或兩個(gè)富含G/C的密碼子(如GCG或GCT)插入多肽編碼序列。當(dāng)合適時(shí)，VSP多核苷酸可以被最優(yōu)化用于提高在轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)。參見，例如，CampbellandGowri(1990)尸/"W尸/z;wo/.92:1-11中對于宿主-優(yōu)選的密碼子選擇(codonusage)的討論。用于合成植物-優(yōu)選的基因的方法在本領(lǐng)域中是可獲得的。參見，例如，美國專利Nos.5,380,831和5,436,391,以及Murray,"a/.,(1989)M/c/dc爿c^s"仏17:477-498,以引用方式并入本文中。包括這樣的修飾的實(shí)施方式也是本發(fā)明的特征。另外的序列修飾已知提高特定植物宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除編碼偽多聚腺噤呤信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)、及其它對于基因表達(dá)可能有害的這樣的充分-表征的序列。所述序列的G-C含量可以被調(diào)整到對于給定的植物宿主的平均水平，其通過參考宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算。在可能時(shí)，所述序列被修飾以避免預(yù)知的發(fā)卡二級mRNA結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可以另外包含5'前導(dǎo)序列。這樣的前導(dǎo)序列可以用于提高翻譯。翻譯前導(dǎo)體在本領(lǐng)域中是已知的并且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)體，例如，EMCV前導(dǎo)體(腦心肌炎5'非編碼區(qū))(Elroy陽Stein,"(1989)TVoc.Ato/.86:6126-6130);potyvirus前導(dǎo)體，例如，TEV前導(dǎo)體(煙草蝕紋病毒(TobaccoEtchVirus))(Gallie,Wa/.,(1995)Ge"e165(2):233-238),MDMV前導(dǎo)體(玉蜀黍矮花葉病毒(DwarfMosaicVirus))(K/ra/ogy154:9-20),及人類免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak,Wa/.,(1991)Atowe353:90-94);來自苜蓿花葉病毒的衣殼蛋白mRNA的未翻譯的前導(dǎo)體(AMVRNA4)(Jobling,"a/.,(1987)W"^re325:622-625);煙草花葉病毒前導(dǎo)體(TMV)(Gallie,"a/.,(1989)inM/ecw/ar祝。/ogyed.Cech(Liss,NewYork),pp.237-256》及玉蜀黍chloroticmottle病毒前導(dǎo)體(MCMV)(Lommel,"a/.,(1991)K/ra/ogy81:382-385)。還參見，Della-Cioppa,"a/.,(1987)尸/虛尸—》/.84:965-968。在制備表達(dá)盒中，可以處理多個(gè)多核苷酸片段，以便提供在正確的方向和適當(dāng)時(shí)正確的閱讀框中的序列。為此，可以采用適配子或連接子質(zhì)，如去除限制性位點(diǎn)、或類似的事情等。為此目的，可以包括體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、重新替換，如轉(zhuǎn)換和顛換。本文所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的并且更充分地描述在，例^口Sambrook,e/1a/.,A/o/ecw/orC7om'wg:jZ^6ora^o^yA/awwa/(ColdSpringHarborLaboratoryPress;Plainview,NewYork)中。大量啟動子可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中，包括感興趣的VSP多核苷酸序列的天然啟動子。所述啟動子可以基于希望的結(jié)果選擇。感興趣的VSP多核香酸可以與組成性、可誘導(dǎo)的、組織-優(yōu)選的、或用于在植物中表達(dá)的其它啟動子組合。這樣的組成性啟動子包括，例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子和WO99/43838和美國專利No.6,072,050中披露的其它組成性啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell,"a/.,(1985)淑,313:810-812);稻米肌動蛋白(McElroy,Wa/.,(1990)尸/a"fCe〃2:163-171);泛素(ubiquitin)(Christensen,"a/.,(1989)尸/滅M/.12:619-632和Christensen,Wa/.,(1992)尸/6mfA^o/.S/o/.18:675-689);pEMU(Last,Wa/.,(1991)T7z亂如/.G緩/.81:58卜588);MAS(Velten,Wa/.,(1984)3:2723-2730);ALS啟動子(美國專利No.5,659,026)等。其它組成性啟動子包括，例如，美國專利Nos.5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680;5,268，463;5,608,142;和6,177,611中披露的那些啟動子。另外，創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子可以用在本發(fā)明的構(gòu)建中。這樣的創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子包括用于下列的啟動子馬鈴薯蛋白酶抑制子(pinII)基因(Ryan(1990)Wev.尸/^topa^.28:425-449;Duan,"a/.,(1996)A^^wreS/o化c/mo/ogy14:494-498);wunl和wun2,美國專利No.5,428,148;winl和win2(Stanford,"a/.,(1989)M/.Ge".Ge組.215:200-208);系統(tǒng)素(systemin)(McGurl,""/，(1992)225:1570-1573);WIP1(Rohmeier,Wa/.,(1993)尸/trn,A/o/.5^/.22:783-792;Eckelkamp,a/.,(1993)F郎Le323:73-76);MPI基因(Corderok,"a/.,(1994)尸/a^6(2):141-150);等等，通過引入方式并入本文。組織優(yōu)選的啟動子可以用于特定植物組織內(nèi)耙向提高的VSP多肽表達(dá)。組織優(yōu)選的啟動子包括Yamamoto,"a/.,(1997)丄12(2):255-265;Kawamata,"a/.,(1997)尸/a"fCe〃尸/z"z'o/.38(7):792畫803;Hansen,Wa/.,(1997)A/o/.GewGewW.254(3):337曙343;Russell,a/.,(1997)Tm^sgemc尺仏6(2):157-168;Rinehart,Wa/.,(19%)尸/z"io/.112(3):1331畫1341;VanCamp,e,a/"(1996)尸/a"/尸/z",W.112(2):525-535;Canevascini,a/.,(1996)尸/aw/1尸/zjas7'o/.112(2):513-524;Yamamoto,a/.,(1994)尸/爐Ce〃尸—/。/.35(5):773-778;Lam(1994)A纖/"7V祝Ce〃D斷r20:181-196;Orozco,W"/.,(1993)M/23(6):1129-1138;Matsuoka,a/.,(1993)尸racA^/.爿cm/.90(20):9586陽9590;及Guevara-Garcia,e/a/.,(1993)丄4(3):495畫505中披露的那些。這樣的啟動子可以被修飾，如果必要，用于弱表達(dá)。葉子優(yōu)選的啟動子在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，Yamamoto,,(1997)尸/"W丄12(2):255-265;Kwon，Wa/.,(1994)尸/"W尸/z"Zo/.105:357-67;Yamamoto,"/，(1994)尸/"wfCe〃尸/^w'o/.35(5):773-778;Gotor,Wa/.,(1993)尸/"W3:509曙18;Orozco,Wa/"(1993)尸/a"/1Mo/.說o/.23(6):1129-1138;及Matsuoka,"(1993)尸廠oc.爿cac/.90(20):9586畫95卯。在一些實(shí)施方式中，VSP多肽，例如，SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體，優(yōu)先在特定的葉子細(xì)胞中表達(dá)，尤其在葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞、或兩者中表達(dá)。提供可操作地連接的異源多核普酸在轉(zhuǎn)基因植物中的葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的表達(dá)的啟動子包括而不限于用于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)和丙酮酸鹽的啟動子；正磷酸二激酶(orthophosphatedikinase)基因(參見,例^t口,MatsuokaandSanada(1991)A^o/.225(3):411陽419;Matsuoka,"a/.,(1993)iVa//.v4c^/.90:9586-9590;Kausch,Wa/.,(2001)尸/a"ftUo/.S/o/.45(1):1-15;Taniguchi,Wa/.,(2000)尸/"WCe〃尸/z;wW.41(1):42-48);用于c"6-/基因的啟動子(參見，例如，用于玉蜀黍c"Z)-m/基因的啟動子，Shiina,a/.，(1997)尸/cmf尸/^wo/.115(2):477-483禾口Bansal,Wa/.,(1992)尸toc.Ato/.Jcm/.89:3654-3658中)；及用于Rubisco小亞單位基因的啟動子(參見，例如，用于番茄和稻米AcS基因的啟動子，Kyozuka,a/.,(1993)尸/"W尸/z",0/.102:991-1000中；以及由用于玉蜀黍Rubisco小亞單位的啟動子提供的在轉(zhuǎn)基因C3植物內(nèi)葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的表達(dá)(參見，侈寸^口，MatsuokaandSanada(1991)Mo/.Gew.Gew".225(3):411-419))。提供可操作地連接的異源多核苷酸在轉(zhuǎn)基因植物中的維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的表達(dá)的啟動子包括而不限于用于C4植物的Rubisco小單位基因的啟動子(參見，例如，玉蜀黍AcS-m3啟動子和為維管束鞘細(xì)胞特異性表達(dá)提供的元件，描述在Viret,W"/.,(1994)A^7.JcadS".91:8577-8581,Bansal,Wa/.,(1992)尸toc.A^/.89:3654-3658中)，及SchaffnerandSheen(1991)0〃3:997-1012。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)表達(dá)盒以便編碼的VSP(例如，SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體)的表達(dá)，由玉蜀黍Rubisco小亞單位(SSU)啟動子驅(qū)動(參見，例如，圖1A;還參見Genbank編號U09743.1)。當(dāng)被引入C4植物如玉蜀黍中時(shí)，這個(gè)構(gòu)建體提供編碼的VSP在葉子組織的維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，這個(gè)構(gòu)建體進(jìn)一步包括用于液泡類別信號(例如，玉蜀黍proaleurain液泡類別信號)的編碼序列，可操作地連接到VSP多核苷酸，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)到維管束鞘細(xì)胞的液泡區(qū)室(參見，例如，圖IB)。ZM-proaleurain信號肽(SP)和液泡輩巴向序列(VTS)對于ZmLox6的Golgi-介導(dǎo)的處理和液泡靶向是必要的。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)所述表達(dá)盒以便編碼的VSP(例如，SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體)的表達(dá)由玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)啟動子驅(qū)動(參見，例如，圖2A;還參見GenBank編號XI5642.1(部分序列))。當(dāng)被引入植物中時(shí)，這個(gè)構(gòu)建體提供編碼的VSP在葉子組織的葉肉細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)。在另外的實(shí)施方式中，這個(gè)構(gòu)建體進(jìn)一步包括液泡類別信號，例如，玉蜀黍proaleurain液泡類別信號的編碼序列，可操作地連接到VSP多核苷酸，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)入葉肉細(xì)胞的液泡區(qū)室(參加，例如，圖2B)。當(dāng)植物為C4植物如玉蜀黍時(shí)，所述表達(dá)盒可以可選地包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)的編碼序列，可操作地連接到VSP多核普酸，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)入葉肉細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)所述表達(dá)盒以便編碼的VSP(例如SEQIDNO:2的ZmLox6或其生物活性片段或變體)的表達(dá)由組成性啟動子，如泛素(UBI)啟動子(例如，玉蜀黍UBI啟動子)驅(qū)動(參見，例如，圖3A;還參見Genbank編號S94464)。在另外的實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒還包括液泡類別信號(例如，玉蜀黍proaleurain液泡類別信號)的編碼序列，可操作地連接到VSP多核苷酸，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)入細(xì)胞的液泡區(qū)室(參見，例如，圖3B)?？蛇x擇的標(biāo)記物基因用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織的選擇。標(biāo)記物基因包括編碼抗生素抗性的基因，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶III(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些基因,以及提供對除草(herbicidal)化合物(如草胺石粦(glufosinateammonium)、；臭苯月青(bromoxynil)、口米p圭;林S同(imidazolinones)、及2,4-二氯苯氧乙酸酉旨(dichlorophenoxyacetate)(2,4-D))的抗性的基因。另外的可選擇的標(biāo)記物包括表型標(biāo)記物，如|3-半乳糖苷酶和熒光蛋白，如綠色熒光蛋白(GFP)(Su,W"/.,(2004)5/o化c/mo/.S,oewg.85:610-9禾口Fetter,W(2004)尸/awfCe〃16:215-28)、氰基焚光(cyanofluorescent)蛋白(CYP)(Bolte,"a/.,(2004)Ce〃Scze"ce117:943-54和Kato,"a/.,(2002)尸/a"r尸/z"/。/129:913-42)、及黃色焚光蛋白(來自Evrogen的PhiYFP,參見,Bolte,Wa/.,(2004)/.Ce〃Sc/e"ce117:943-54)。對于另外的可選擇的標(biāo)記物，通常參見，Yarranton(1992)Cw/r.C^,".S/c^c/z.3:506-511;Christopherson,"/.,(1992)/Voc.Jem/.L/51」89:6314-6318;Yao,"a/.,(1992)Ce〃71:63-72;Reznikoff(1992)A/o/.A//cro6/o/.6:2419-2422;Barkley,Wa/.,(1980)inr/ze(9/^yw,pp.177-220;Hu,Wa/.，(1987)Ce〃48:555-566;Brown,Wa/.,(1987)Ce〃49:603-612;Figge,Wa/.,(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle,"a/.,(1989)尸rac.廳.JcW.Sc,'.園86:5400-5404;Fuerst,Wa/.,(1989)/Voc.A^//.jcac/.Sd.86:2549-2553;Deuschle,Wa/.,(1990)S"e"ce248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Reines,"a/.,(1993)vVa,/.園90:1917-1921;Labow,"a/.,(1990)M/.Ce〃.編.10:3343-3356;Zambretti,"a/.,(1992)尸nc.TV"".Jcat/.f/&489:3952-3956;Baim,Wa/.,(1991)尸rac.TVa".JcadSc/.88:5072-5076;Wyborski,""/，(1991)腸/e,c」c油版19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)ro/〖csA/o/.S/c.S/o/.10:143-162;Degenkolb:Wa/.,(1991)Jw/7脂'croZ.々e她C7ze膨？/er.35:1591-1595;Kleinschnidt,Wa/.,(1988)S/oc/zem^^y27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Gossen,"/.,(1992)尸roc.Jcad.Sc/.89:5547-5551;Oliva,"a/.,(1992)」ge她C/ze腦Aer36:913-919;Hlavka,a/.,(1985)//aw/600A:Exper/mewfa//Vzarmaco/ogy,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin);Gill,"a/.,(1988)7Vc^we334:721-724。這樣的披露內(nèi)容以引用方式并入本文中。上述列出的可選擇的標(biāo)記物基因不意圖是限制性的。任何可選擇的標(biāo)記物基因可以用在本發(fā)明中。本發(fā)明還提供了用于提高植物中VSP多肽(例如，SEQIDNO:2的ZmL0x6蛋白或其生物活性片段或變體)的濃度和/或活性的方法。通常，相對于沒有本發(fā)明的VSP序列被引入的野生型或?qū)φ罩参铩⒅参锊糠?、或?xì)胞，濃度和/或活性提高至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。提高本發(fā)明中VSP多肽的濃度和/或活性可以在植物生長到希望的發(fā)育階段期間和/或隨后存在。在特定的實(shí)施方式中，VSP多肽，如ZmLox6蛋白或其片段或變體，在單子葉植物(包括而不限于玉蜀黍)中提高。VSP多肽的表達(dá)水平可以例如，通過用于植物中VSP多肽的水平的分析直接測量。在特定的實(shí)施方式中，VSP多肽或多核苷酸被引入植物細(xì)胞。如本文其它地方所討論的，用于提供多肽到植物的許多方法在本領(lǐng)域是已知的，包括而不限于多肽直接引入植物和將編碼具有VSP性質(zhì)的多肽的多核普酸構(gòu)建體引入植物(瞬時(shí)地或穩(wěn)定地)。隨后，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法選擇具有引入的本發(fā)明的序列的植物細(xì)胞，所述方法例如，而不限于，DNA印記分析、DNA測序、PCR分析、或表型分析。通過前述實(shí)施方式改良的植物或植物部分在植物形成條件下生長達(dá)到足以提高植物中VSP多肽(例如，ZmLox6蛋白或其片段或變體)的濃度和/或活性的時(shí)間。植物形成條件在本領(lǐng)域是熟知的并且在本文其他地方簡單地討i侖。還認(rèn)識到可以通過采用不能夠引導(dǎo)蛋白或RNA在轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)的多核苷酸提高VSP多肽的水平。例如，VSP多核苷酸(如ZmLox6基因)可以用于設(shè)計(jì)多核苦酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體可以用在用于改變或變異有機(jī)體中基因組核苷酸序列的方法中。這樣的多核苷酸構(gòu)建體包括，而不限于，RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復(fù)載體、混合的雙鏈體寡核苷酸、自身互補(bǔ)的RNA:DNA寡核普酸、及引起重組的寡核酸堿基(oligonucleobases)。這樣的核苷酸構(gòu)建體和使用方法在本領(lǐng)域是已知的。參見，美國專利Nos.5,565,350;5,731,181;5,756,325;5,760,012;5,795,972;及5,871,984;其全部以引用方式并入本文中。還參見WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821、及Beetham，W"/.,(1999)TVoc.A^/.^cm/.f/&496:8774-8778;以引用方式并入本文中。因此，可以通過改變編碼VSP多肽或其啟動子的基因來提高VSP多肽(例如，SEQIDNO:2的ZmLox6蛋白或其片段或變體)的水平和/或活性。參見，例如，Kmiec，美國專利5,565,350;Zarling,W"/.,PCT/US93/03868。因此，提供了攜帶VSP基因中的突變的被誘變的植物，其中所述突變提高VSP基因(例如，ZmLox6基因)的表達(dá)，或者提高編碼的VSP多肽(例如，ZmLox6蛋白)的VSP性質(zhì)。由此認(rèn)識到本發(fā)明的方法不依賴于完整的多核普酸并入基因組，只是所述植物或其細(xì)胞由于多核苷酸引入細(xì)胞而被改變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在將VSP多核苦酸，如SEQIDNO:1的ZmLox6序列、或SEQIDNO:1的核苦酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列引入細(xì)胞后，基因組被改變。例如，所述多核苷酸、或其任何部分，可以并入植物的基因組中。本發(fā)明的基因組的改變包括而不限于核苷酸的添加、缺失、和替換入基因組。雖然本發(fā)明的方法不依賴于任何特定數(shù)量的核普酸的添加、缺失、及替換，但是認(rèn)識到這樣的添加、缺失、或替換包括至少一個(gè)核苷酸。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及將VSP多肽或多核苷酸引入植物中。"引入"意圖意味著將VSP多核普酸或多肽以所述序列通向植物的細(xì)胞的內(nèi)部的方式給予所述植物。本發(fā)明的方法不依賴于用于將序列引入植物的特定方法，只是所述多核苷酸或多肽通向植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。用于將VSP多核普酸或多肽引入植物的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括而不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法、及病毒-介導(dǎo)的方法。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"意圖意味著引入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合入植物的基因組中并且能夠由其后代繼承。"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"意圖意味著多核苷酸被《I入植物中并且不整合入植物的基因組中或者多肽被S1入植物中。轉(zhuǎn)化方案以及將VSP多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以依賴于轉(zhuǎn)化靶向的植物或植物細(xì)胞的類型而變化。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法涉及適于將VSP多肽或多核苷酸序列引入單子葉植物中的轉(zhuǎn)化方案。將VSP多肽和多核苷酸引入植物細(xì)胞中的合適的方法包括顯微注射(Crossway,Wa/.,(1986)j5/c^ec/zm々wes4320-334)、電穿孑L(Riggs,Wa/.:(1986)/Voc.iVa".JcadSc/.83:5602-5606,JgroZ)a"enwm-mediatedtransformation(美國專利No.5,563,055和美國專利No.5,981,840)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski,a/.,(1984)五Affi(9</.3:2717-2722)、以及彈道粒子力口速(ballisticparticleacceleration)(參見,例如,美國專利Nos.4,945,050;美國專利No.5,879,918;美國專利No.5,886,244;以及，5,932,782;Tomes,a/.,(1995)in尸/朋/1Ce〃，T7^we，aw<iCVg朋Fwwc/謂e幽/A^/zo成ed.GamborgandPhillips(Springer誦Verlag,Berlin);McCabe,"a/.,(1988)S/o/^ec/mo/ogy6:923-926);及Lecltransformation(WO00/28058)。還參見，Weissinger,"(1988)J肌/ev.Ge"".22:421-477;Sanford,a/.,(1987)尸ar"cw/a/^Sc/ewceawt/rec/zwo/ogy5:27-37(洋蔥)；Datta,"(1990)A'o^c/z"o/ogy8:736-740(稻米)；Klein:"(1988)尸亂淑/.^c"d"&485:4305-4309(玉蜀黍);Klein,""/.,(1988)A^ec/mo/ogy6:559-563(玉蜀黍)；美國專利Nos.5,240,855;5,322,783;及，5,324,646;Klein,""/.,(1988)尸/a"f尸/z",W.91:440-444(玉蜀黍);Fromm,"(1990)S她c/wo/ogy8:833-839(玉蜀黍);Hooykaas—VanSlogteren,"a/.,(1984)A/""fwre311:763-764;美國專利No.5,736,369(谷類)；Bytebier,"(1987)尸亂扁.Jcm/.固84:5345-5349(百合科(Liliaceae));DeWet,"《(1985)inZ7ze5"jt/en'艦虛/M3/一/a"ow(9vw/e77ww化ed.Chapman,e/1a/.，(Longman,NewYork)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler,"a/.,(1990)尸/虛Ce〃9:415-418和Kaeppler,""/.,(1992)T7zew.y^p/.Gew".84:560-566(頸須畫介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D'Halluin,""/.,(1992)尸/a"/Ce〃4:1495-1505(電穿孔);Li,"a/.,(1993)尸toCe〃鄉(xiāng)o他12:250-255及ChristouandFord(1995)」薩/so/腦，75:407-413(稻米)；Osjoda,"a/.,(1996)7Va^re歷o化c/z"o/ogy14:745-750(玉蜀黍，經(jīng)由Jgro6a"e〃'wwfwme/ac/e朋)；其全部以引用方式并入本文中。在特定的實(shí)施方式中，可以利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，將與野生型或?qū)φ罩参锵啾?，植物或其植物部分的提高的氮貯藏容量、和伴隨的氮含量和/或營養(yǎng)價(jià)值的提高，提供給植物。這樣的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括而不限于將VSP多肽(例如，SEQIDNO:2的ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體)直接引入植物中或?qū)⑥D(zhuǎn)錄物引入植物中。這樣的方法包括，例如，顯微注射或粒子轟擊。參見，例如，Crossway,ef(1986)A/o/Ge".202:179-185;Nomura,"a/.,(1986)尸/爐44:53-58;Hepler,"(1994)尸racA^/.爿o^.Scz'.91:2176-2180及Hush,e/a/.,(1994)T7zeJowma/o/Ce〃Sc/e"ce107:775-784,其全部以引用方式并入本文中?？蛇x地，可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將VSP多核苷酸，例如，SEQIDNO:1的ZmLox6序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼VSP多肽的其片段或變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化入植物中。這樣的技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)和多核苦酸的沉淀，方式為排除隨后的DNA釋放。因此，可以發(fā)生從粒子-結(jié)合的DNA的轉(zhuǎn)錄，但是其被釋放以變得整合入基因組中的頻率大大降低。這樣的方法包括應(yīng)用聚乙基亞胺(polyethylimine)包覆的粒子(PEI;Sigma#P3143)。在另外的實(shí)施方式中，通過將植物與病毒或病毒核酸接觸，VSP多核普酸可以被引入植物中。通常，這樣的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體并入病毒DNA或RNA分子內(nèi)。認(rèn)識到感興趣的VSP多肽可以作為病毒多聚蛋白的部分最初合成，其隨后可以通過體內(nèi)或體外蛋白酶解被處理而產(chǎn)生希望的重組蛋白。此外，認(rèn)識到有用的啟動子可以包括用于通過病毒RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子。用于將多核苷酸引入植物并表達(dá)由其編碼的多肽的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，美國專利Nos.5,889,191;5,889,190;5,866,785;5,589,367;5,316,931和Porta,e,a/.,(1996)A/o/ecw/wS,o"c/z"o/ogy5:209誦221;以引用方式并入本文中。用于將多核苷酸靶向插入植物基因組中的特定位置的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸在希望的基因組位置的插入利用位點(diǎn)-特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。參見，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、和WO99/25853,其全部以引用方式并入本文中。簡短地，多核苷酸可以包含在以兩個(gè)非重組發(fā)生的重組位點(diǎn)為側(cè)翼的轉(zhuǎn)移盒中。所述轉(zhuǎn)移盒被引入植物中，所述植物具有穩(wěn)定的并入其基因組中的耙位點(diǎn)，所述把位點(diǎn)以兩個(gè)相應(yīng)于轉(zhuǎn)移盒的位點(diǎn)的非重組發(fā)生的重組位點(diǎn)為側(cè)翼。提供合適的重組酶并且所述轉(zhuǎn)移盒在靶位點(diǎn)被整合。感興趣的多核普酸由此在植物基因組中特異性染色體位置被整合。如，McCormick,"a/.,(1986)尸/a",Ce〃5:81-84。這些才直物隨后可以被培養(yǎng)，用同樣轉(zhuǎn)化的林系或者與不同的抹系授粉，所獲得的后代具有鑒定的希望的表型特征的表達(dá)，例如，提高的氮貯藏容量、提高的氮含量、和/或提高的營養(yǎng)價(jià)值。兩個(gè)或更多個(gè)世代可以被培養(yǎng)以確保希望的表型特征的表達(dá)被穩(wěn)定的維持和遺傳，隨后收集種子以確保實(shí)現(xiàn)希望的表型特征的表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供了具有本文所述的多核普酸的轉(zhuǎn)化的種子(也稱為"轉(zhuǎn)基因種子")，所述多核苦酸例如包含SEQIDNO:1的ZmLox6序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中或SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼VSP多肽的其片段或變體的表達(dá)盒，穩(wěn)定地并入它們的基因組中。本發(fā)明的植物可以通過任何合適的方法(包括育種(breeding))產(chǎn)生。植物育種可以用于將希望的特征(例如，穩(wěn)定地并入的轉(zhuǎn)基因)引入感興趣的特定植物系中，并且可以以多種不同的方式的任何一種進(jìn)行。系統(tǒng)育種(Pedigreebreeding)起始于兩個(gè)基因型的雜交(crossing),如感興趣的優(yōu)良系(eliteline)與具有一個(gè)或多個(gè)希望的特征(即，具有穩(wěn)定地并入的感興趣的多核普酸、具有感興趣的多肽的調(diào)整的活性和/或水平等)的一個(gè)另外的優(yōu)良自交系(eliteinbredline),其補(bǔ)充感興趣的優(yōu)良植物系。如果兩個(gè)原始親本(originalparent)不提供所有希望的特征，那么另外的來源可以被包括在育種群體中。在系語方法中，上升植物自交(selfed)并且在連續(xù)的子代中被選擇。在連續(xù)的子代中，由于自花傳粉和選擇，雜合情形被同源系取代。典型地，在育種的系譜方法中，實(shí)施五個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的系譜后代的自交和選擇FlF2;F2—F3;F3—F4;F4—F5等。在足夠量的近交后，連續(xù)的子代將用于提高開發(fā)的近交體(inbred)的種子。在特定的實(shí)施方式中，近交系(inbredline)包括約95%或更多的其基因座的純合子等位基因。除了用于形成回交轉(zhuǎn)換，回交還可以與系統(tǒng)育種一起使用，以改良感興趣的優(yōu)良系和利用改良的優(yōu)良系制備雜種。如前所述，回交可以用于將一個(gè)或多個(gè)特別希望的性狀從一個(gè)系(供體親本)轉(zhuǎn)移到稱為輪回親本(recurrentparent)的近交體，所述輪回親本具有全部的優(yōu)良農(nóng)藝學(xué)特征，但缺乏希望的一個(gè)或多個(gè)性狀。然而，相同的過程可以用于朝向回歸親本的基因型移動后代但是同時(shí)通過停止早期的回交和繼續(xù)進(jìn)行自交和選擇保留非輪回親本的許多成分。例如，形成Fl,如商業(yè)雜種。這個(gè)商業(yè)雜種可以;故回交到其親本系之一以形成BC1或BC2。后代被自交和選擇以便新開發(fā)的近交體具有輪回親本的許多屬性和許多非輪回親本的希望的屬性。這個(gè)方法影響了(leverages)用在新的雜交體和育種中的輪回親本的價(jià)值和力量(strengths)。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式是制備感興趣的近交系的回交轉(zhuǎn)換(backcrossconversion)的方法，包括下述步驟將來自感興趣的近交系的植物與包含提供希望的性狀(如，提高的氮貯藏容量)的至少一個(gè)突變基因或轉(zhuǎn)基因的供體植物雜交、選擇包含提供希望的性狀的突變基因或轉(zhuǎn)基因的Fl后代植物、以及將選擇的Fl后代植物回交到感興趣的近交系的植物。這個(gè)方法可以進(jìn)一步包括下述步驟獲得感興趣的近交系的分子標(biāo)記物性質(zhì)及利用所述分子標(biāo)記物性質(zhì)選擇具有希望的性狀和感興趣的近交系的分子標(biāo)記物性質(zhì)的后代植物。同樣地，這個(gè)方法可以用于通過加入下述最后步驟產(chǎn)生Fl雜種種子將感興趣的近交系的希望的性質(zhì)轉(zhuǎn)換與不同的植物雜交，以制備包含提供希望的性狀的突變基因或轉(zhuǎn)基因的Fl雜種種子。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的單子葉植物-來源的VSP多核苷酸可以與感興趣的多核苷酸序列的任何組合堆疊，以形成具有希望的性狀的植物。本文所用的性狀指的是源自特定的序列或序列的組的表型。例如，本發(fā)明的VSP多核苷酸可以與編碼具有VSP性質(zhì)的多肽的任何其它多核苷酸堆疊，如堿性磷酸酶(Dewald,""/.，(1992)J.Ao/.C/^肌267:15958-15964)、淀粉酶(Noquet,"a/.,(2001)vtora/,""J.尸/耐尸/z"zW.28:279-287)、幾丁酶(Peumans,"a/.,(2002)尸/"W尸/z",W."oc&,〃e130:1063-1072)、凝集素(Van,"《(2002)尸/尸—o/.■M/e130:757-769)、另外的脂加氧酶(Tranbarger,e,(1991)尸/滅CW/3:973-988)等。產(chǎn)生的組合還可以包括感興趣的多核苷酸的任何一個(gè)的多個(gè)拷貝。本發(fā)明的多核苷酸還可以與任何其它基因或基因的組合堆疊以產(chǎn)生具有多個(gè)希望的性狀組合的植物，包括而不限于對于動物飼料希望的性狀如高油基因(highoilgenes)(例如,美國專利No.6,232,529);平衡的氨基酸(例如hordothionins(美國專利Nos.5,990,389;5,885,801;5,885,802;及5,703,409);大麥高賴氨酸(Williamson,e,a/.,(1987)U.&oc/zew.165:99-106;及WO98/20122)和高蛋氨酸蛋白(Pedersen，Wa/.,(1986)J.BzW.C/zem.261:6279;Kirihara,Wa/.,(1988)Gewe71:359;及Musumura,(1989)/7s/tUo/.12:123));提高的可消化性(例如，改良的貯藏蛋白(美國申請系列No.10/053,410,于2001年11月7日提交)；及硫氧還蛋白(美國申請系列No.10/005,429，于2001年12月3日提交));其披露的內(nèi)容以引用方式并入本文中。本發(fā)明的多核苷酸還可以堆疊有疾病或除草劑抗性的希望的性質(zhì)(例如，伏馬菌素(fumonisin)解毒基因(美國專利No.5,792,931);無毒性和疾病^元性基因(Jones,"a/.,(1994)Sc/ewce266:789;Martin,"a/.,(1993)262:1432;Mindri畫,""/.,(1994)Ce〃78:1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase)(ALS)突變體，如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑如草丁膦(phosphinothricin)或basta(例如，bar基因)；及甘草膦抗性(例如，EPSPS基因和GAT基因；參見，例如，美國公開No.20040082770和WO03/092360));及用于加工或處理產(chǎn)品的希望的性狀，如高油(例如，美國專利No.6,232,529);改良的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國專利No.5,952,544;WO94/11516));改良的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、及淀粉脫枝酶(SDBE));及聚合物或原生質(zhì)體(例如，美國專利No.5.602,321;(3-酮硫解酶(ketothiolase)、聚羥基丁商臾合酶(polyhydroxybutyratesynthase)、及乙酰乙酰國CoA還;^、酶(Schubert,"(1988)J.5"c&no/.170:5837-5847),促進(jìn)聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表達(dá))；其披露的內(nèi)容以引用方式并入本文。人們還可以結(jié)合本發(fā)明的多核苷酸與提供農(nóng)藝學(xué)性狀或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸，所述農(nóng)藝學(xué)性狀如雄性不育(例如，參見美國專利No.5,583,210)、莖稈強(qiáng)度(stalkstrength)、開花時(shí)間，所述轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因耙向(例如，WO99/61619,WO00/17364,和WO99/25821);,其4皮露的內(nèi)容以引用方式并入本文中。這些堆疊的組合可以通過任何方法形成，所述方法包括而不限于通過任何常規(guī)或TopCross方法或遺傳轉(zhuǎn)化雜交育種植物。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化植物堆疊所述序列，感興趣的多核普酸序列可以在任何時(shí)間，以任何順序被組合。例如，包含一個(gè)或多個(gè)希望的性狀的轉(zhuǎn)基因植物可以用作靶標(biāo)通過隨后的轉(zhuǎn)化引入另外的性狀。所述性狀可以在利用由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供的感興趣的多核香酸的共轉(zhuǎn)化方案中被同時(shí)引入。例如，如果將引入兩個(gè)序列，所述兩個(gè)序列可以被包含在分離的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在同樣的轉(zhuǎn)化盒上(順式)。所述序列的表達(dá)可以由相同的啟動子或者由不同的啟動子驅(qū)動。在一個(gè)實(shí)施方式中，希望引入將導(dǎo)致感興趣的多核苷酸過度表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其它過度表達(dá)盒的任何組合結(jié)合以在植物中產(chǎn)生希望的性狀的組合。進(jìn)一步認(rèn)識到利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，多核普酸序列可以在希望的基因組位置堆疊。參見，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、及WO99/25853,其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。如本文所用的，術(shù)語"才直物"包4舌才直物細(xì)胞、才直物protoseanasts、植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物(植物可以從其再生)、植物愈傷組織(calli)、植物叢(clumps)、及qnd植物細(xì)胞，其在植物或植物的部分(如胚胎、花粉、胚珠、種子、葉子、花、枝、果實(shí)、仁、耳穗、穗軸(cobs)、外殼、莖稈(stalks)、根、根尖、花藥等)中是完整的。谷粒(grain)意圖意味著由商業(yè)種植者生產(chǎn)的用于種植或再生物種之外的目的的成熟種子。再生的植物的Pgeny、變體、和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些部分包括引入的多核普酸。因此，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。"主題(subject)植物或植物細(xì)胞"是其中遺傳改變，如轉(zhuǎn)化，已經(jīng)由于感興趣的VSP基因而被影響的植物或植物細(xì)胞，或者起源于這樣改變的植物或細(xì)胞并且包括改變的植物或植物細(xì)胞。"對照"或"對照植物"或"對照植物細(xì)胞"提供了用于測量主題植物或植物細(xì)胞的表型改變的參考點(diǎn)。對照植物或植物細(xì)胞可以包括，例如(a)野生型纟直物或細(xì)胞，即，與用于導(dǎo)致主題植物或細(xì)胞的遺傳改變的起始材料相同的基因型；(b)與起始材料相同基因型的植物或植物細(xì)胞，但是其已經(jīng)用零(null)構(gòu)建體(即，用對于感興趣的性狀沒有已知影響的構(gòu)建體，如包含標(biāo)記物基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化；(c)作為主題植物或植物細(xì)胞的后代中的未轉(zhuǎn)化的分離體(segregant)的植物或植物細(xì)胞；(d)與主題植物或才直物細(xì)胞遺傳相同的植物或植物細(xì)胞，但是其不暴露于將誘導(dǎo)感興趣的基因的表達(dá)的條件或刺激；或(e)主題植物或植物細(xì)胞本身，在其中感興趣的VSP基因不被表達(dá)的條件下。本發(fā)明可以用于任何植物物種的轉(zhuǎn)化，包括而不限于單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物物種的實(shí)例包括而不限于玉米(Ze"wa，)、Sra^7'c<2sp.(例如,S.W(3/ws、S.ra/(3、S.7'w"cea)、尤其是那些用"f乍種子油來源的蕓苔物種，苜蓿(A^^cagoM"va)、稻米(OyzaM"va)、黑麥(Seca/ecem2/e)、高粱(Sorg/z謂hco/or、/Sorg/z謂vw/gare)、黍(例如、J舍珠;f夏(尸ewi^efw附g/awcw附)、prosomillet(尸aw/cwmmz7/acewm)、谷子(foxtailmillet)(Setor/a/to//ca)、fingermillet(￡7eus7'wecoraca》、向曰蔡(T/e/Zaw/1//!^a朋冊力、紅花(Gar/7zamw51〃'w"o"'w力、小麥(7W〃'c應(yīng)"eWz'vww)、大豆(G(yc/力emax)、》因草(A^/co"awafa6acwm)、馬鈴薯(5"o/aw謂？w6emv畫)、花生(Jrac/^/^/wgaea)、棉花(Go，p/應(yīng)6ar^t/erae、G(wvs，/謂/n'r虛謂)、甘菩(//omoea6a加w力、木菩(A/am7zofescw/ewto)、咖口非(Coj^eas//.)、浙卩子(Cocas1wwcz/en2)、鳳梨(Jwtmtwcomosw力、牙甘橘杉十(Ousspp.)、可可(77zeoZraW(3cacao)、茶(Came〃z'(3w'"eww、)、香;^、(A/wsaspp.)、魚夢梨"wer/ca"a)、無花果(F/cwscos7'ca)、番石才留(尸Wc/z'wmgwayava)、芒果(^/""^//6廠/wc//c<2)、揪攬(O/ea、番木瓜(Cahca腰果(y4"(3caWwocc/t/ewto/e)、澳大利亞堅(jiān)果(A/acac/"m/a/"/egnybZ/a)、杏才對a，g(ia/—、糖甜菜(Betovw/gw7、)、甘蔗(Sacc/zor謹(jǐn)spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物、及球果植物。蔬u菜包4舌番^S(Z^co/eAS7'cowe^w/e",w附)、萵宜(例^!口、Z^2"WC"犯"va)、青豆(尸/zaeo/wsvw/garz力、利馬豆(尸/ztweo/z^//me"w力、5宛豆(jLfl^yn/sspp.)、及Q/cwm/s屬的成員,如黃瓜(C.ra〃'vws)、香瓜(C.c(2",a/wpe肌力、及甜瓜(C.腿/o)。觀賞植物包括杜鵑(朋c^O(ie"(ira"spp.)、八仙花(A^ro//z_y〃(2/z少(irawge(3)、芙蓉(W^cw訂omswze觸力、玫瑰(Aoraspp.)、郁金香(7W0aspp.)、水仙(M3tc^mspp.)、矮牽?；?尸由m'aAj^油)、荷蘭石竹(Dz'awf/zusc"/^yop/^〃—、猩猩木/7w/c/2ern>7a)、及菊花?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的球果植物包括，例如，+>樹如如火炬木〉fae(ia)、〉'召'澤木〉(尸/ww51e〃/o/7/)、美車西吾卩黃+〉(尸z力ws/owtiferosa)、黑木〉(尸z力wscowfoWa)、及輻射^>(尸/"1ra^/ato);花》真+〉(尸化wc/o&wgame"&ew'0;美國西部4失杉(7^wgacaw"(iem7's);北美云杉(尸/ceag/awca);纟工片》(iSe《"o/asem;erw>e">s*);truefirs^口4艮片》(^4Z^esam"Z)z7&)禾口香月旨,令片鄉(xiāng)(v4&m^Araf77ecO;及雪松，如大側(cè)柏(772^/a;"cato)和阿拉斯加黃檜(C7^m"eqy/7"〃'《wooA"/e朋,力。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物為農(nóng)作物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、黍、煙草等)。在其它實(shí)施方式中，感興趣的植物為單子葉植物，例如，玉米(Zeama")、稻米sa/7'va)、黑麥(&ca/ecerea/e)、高粱(5brg/zww6/co/or、Sorg/mwvw/gare)、黍(侈'J:i口,J介珠;f夏(尸ewm's"wmg/awcww)、prosomillet(尸^m'c謂m/Z/ace謂)、foxtailmillet(5Wan'"/to//ca)、fingermillet(57ew^s7'wecorac^ma))、'J、麥(7>z77'cwmaes/7vwm)、甘嚴(yán)(Sacc/z^rwmspp.)、燕麥、及大麥。感興趣的其他植物包括提供感興趣的種子的谷類植物(grainplants)、含油種子植物、及豆科植物。感興趣的種子包括谷類種子，如玉米、小麥、大麥、稻米、高粱、黑麥等。含油種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆(guar)、槐豆(locustbean)、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。通過示意的方式而非限制的方式提供了下面的實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)已知植物積聚VSP,作為在它們的營養(yǎng)細(xì)胞中截留過量氮的機(jī)制，尤其是在再生庫(reproductivesink)為限制性時(shí)(Staswick(1994)Jm2.Tev.尸/"W尸/2，/。/.尸/aWA/0/.S,'o/.45:303-322)。落葉樹的葉子在它們在秋天脫落前再循環(huán)它們的氮。再循環(huán)的氮以VSP的形式儲存在樹皮中。當(dāng)需要的氮超出細(xì)胞中可獲得的量時(shí)，例如，在再生庫發(fā)育期間或春天生長期間，VSP被再流通(Staswick(1994)J朋.Wev.尸/a"f尸/z",。/.Mo/.腸/.45:303-322)。VSP,大小的范圍從15到~100kDa,已經(jīng)被鑒定為堿性磷酸酶(Dewald,"a/.,(1992)J.腸/.C/z綴267:15958-15964)、淀粉酶(Noquet,e/a/.,(2001)^us^a"aw丄尸/am1尸/z少&o/.28:279-287)、幾丁酵(Peumans,W(2002)尸—W.130:1063-1072)、凝集素(Van,"(2002)■。/.130:757-769),或脂加氧酶(Tranbarger,""/.,(1991)尸/WCe〃3:973-988)。它們的存在已經(jīng)在范圍廣泛的一年生和多年生植物物種中才艮道大豆(Staswick(1988)尸/""f尸/z",。/.87:250-254;Tranbarger,"a/.,(1991)尸/朋,Ce〃3:973-988);三葉草(7>(/b/,ww)(CorreX(1996)Ex/.47:1111-1118);A/e力cago(苜蓿)(Avice,"a/.,(1997)C廠o/5"c/.37:1187-1193;Noquet,"(2001)Jz^/>Yz/^m</.尸/awf尸/z少w'o/.28:279-287);爿ra6/cfo/w^(Utsugi,Wa/.,(1998)尸/^z/yVfo/.5"/.38:565-576);卡i若4立(canola)(Rossato,a/.,(2002)丄So^f"y53:265-275);楊樹(Lawrence,"a/.,(1997)尸/,to服郝erg203:237-244);黑桑(blackmulberry)(Van,"a/.,(2002)尸/朋f尸/z;wo/.130:757-769);和桃樹(Gomez&Faurobert(2002)丄Exp.53:2431-2439)。然而，VSP在單子葉植物中的存在至今還沒有被建立(Mackown,"a/.,(1992)尸/朋/尸/z，/q/.99:1469-1474)。已知在一個(gè)物種中為VSP的蛋白還可以在另外的物種中(其中它們通常不被表達(dá))以高水平表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的大豆VSP在煙草中積聚到可溶蛋白的~5Q/o的水平(Guenoune,"(1999)尸/145:93-98;Guenoune,(2002)Soto，53:1867-1870)。不同的VSP蛋白可以采用不同的用于細(xì)胞內(nèi)靶向的機(jī)制。例如，VSP-a遵循用于靶向到液泡的ER-Golgi途徑，而脂加氧酶(Lox),也稱為VLX(營養(yǎng)脂加氧酶)，遵循不同的、未知的途徑到達(dá)液泡區(qū)室(KlauerandFranceschi(1997)尸rato/7/wma200:174-185)。不同的VLX蛋白積聚在大豆中分離的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中VLXA、B、和C積聚在細(xì)胞溶膠中；VLXD被截留在維管束鞘和側(cè)脈(paraveinal)細(xì)胞的液泡中(Fischer,a/.,(1999)尸/a"fJ纏ma/19:543-554)。VLX蛋白甚至在低N下積聚。然而，表明它們扮演除了只是作為VSP之外更廣泛的角色(Grimes,Wa/.,(1993)尸/朋f尸/z，Zo/.103:457-466)。植物明顯感知應(yīng)激作為用于組織和由此的氮流失的信號。為了解釋這個(gè)，已知在植物暴露于水應(yīng)激和茉莉酮酸甲酯(應(yīng)激激素)時(shí)，VSP積聚(MasonandMullet(1990)Ce〃2:569誦580;Rossato,e,"/.,(2002)丄五W.53:1131-1141)。其它應(yīng)激，如創(chuàng)傷、食草動物損傷、衰老、及臭氧也已知導(dǎo)致它們的積聚(Utsugi,"a/.,(1998)尸/耐M/.38:565-576;Berger,"a/.,(2002)尸—油一尸/a幽r廳114:85-91;Mira,ef(2002)尸/awtoS^^力214:939-946)。當(dāng)前的實(shí)施例集中在表現(xiàn)出VSP的特征的玉蜀黍中十一個(gè)脂加氧酶基因之一。結(jié)果表明在生長培養(yǎng)基中供應(yīng)高水平的N后，玉蜀黍脂加氧酶ZmLox6被誘導(dǎo)，并在葉子中最高表達(dá)，正如大豆VSPVLXD(Tranbarger,Wa/"(1991)尸/"WCe〃3:973-988)。實(shí)施例1:由生長培養(yǎng)基中的氮誘導(dǎo)蛋白玉米幼苗被測試由生長培養(yǎng)基中硝酸鹽或硝酸鹽與銨的組合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)。在缺乏施加的氮的溫室中的蛭石中生長的兩周大的植物表明從葉子的泛黃判斷的氮缺乏跡象。甚至在生長培養(yǎng)基中l(wèi)mM硝酸鹽時(shí)觀察到葉子的一些泛黃。為了鑒定氮-可誘導(dǎo)的蛋白，在生長培養(yǎng)基中供應(yīng)過量的氮以誘導(dǎo)與任何內(nèi)源性氮貯藏機(jī)器相關(guān)的蛋白的表達(dá)。在應(yīng)用100mM硝酸鹽(氮的僅有來源)后，應(yīng)激(葉子巻曲)癥狀明顯。當(dāng)供應(yīng)50mM硝酸銨U00mM的總氮)時(shí)，植物看起來比lmM或100mM硝酸鹽時(shí)更健康。硝酸銨處理被包括以確定是否相對于僅硝酸鹽處理有任何不同的蛋白被誘導(dǎo)。來自在不同的氮水平生長的植物的不同組織在緩沖溶液中被均勻化并在超速離心機(jī)中以IOO，OOOxg離心。對沉淀(pellet)和上清液均進(jìn)行SDS-PAGE。在較高水平的氮時(shí)-100kDa的多肽帶在可溶部分中被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)(參見圖4)。所述誘導(dǎo)在葉子組織中最強(qiáng)。這個(gè)多肽在根組織中是不可檢測的。當(dāng)硝酸銨作為營養(yǎng)源供應(yīng)時(shí)，60kDa的另一多肽似乎在莖組織中被誘導(dǎo)。實(shí)施例2:用于蛋白質(zhì)組(Proteomic)分析的蛋白加工來自實(shí)施例1中可溶葉子蛋白部分的98kDa蛋白帶(其表達(dá)水平隨著漸增的硝酸鹽補(bǔ)充而提高)從Tris-甘氨酸-SDS凝膠切離并粗糙地切碎。凝膠塊(約200^iL體積)在500(aL的lOOmM碳酸氬銨中沖洗，隨后逐漸在漸增的乙腈％(15%、50%、100%)中脫水。干燥的凝膠塊在包含15。/。乙腈/100mM碳酸氫銨中約4pg胰蛋白酶的250pL胰蛋白酶(Roche1418025)溶液中在水上再水合1小時(shí)。吸出未^皮吸收的流體并在4。C保存。加入200nL緩沖劑，在37。C進(jìn)行凝膠中消化16小時(shí)。在37。C在200^L的15%乙腈/100mM碳酸氬銨中沖洗凝膠塊30分鐘，收集流體并匯集。通過在漸增的乙腈％(15%,50%和100%)中沖洗凝膠塊收集蛋白水解肽，并匯集抽吸的流體。匯集的抽吸物(aspirant)在真空下完全干燥，將殘余物重新溶解在20包含0.1%曱酸的H20中。將完整樣品注入1pL環(huán)中，所述肽隨后在聚合捕獲柱(polymerictrapcolumn)中被捕獲。利用C18硅石柱，75|nmx100mm,進(jìn)行反相色譜，流速為200nL/min,乙腈梯度為3畫85%。在LCQClassic四極(quadrapole)粒子捕獲質(zhì)語儀上建立重復(fù)數(shù)據(jù)依賴的MS實(shí)驗(yàn)，以獲得在運(yùn)行(run)的整個(gè)持續(xù)時(shí)間的最豐富的先驅(qū)離子的一個(gè)全掃描MS，隨后三個(gè)MS/MS掃描。隨后利用MS/MS軟件檢索獲得的數(shù)據(jù)以鑒定用于單獨(dú)的肽片段的序列信息。鑒定屬于同樣的脂加氧酶多肽(ZmLox6)的十二個(gè)不同的肽(參見圖5)。所述覆蓋全部是所述蛋白，強(qiáng)烈地表明鑒定的蛋白確實(shí)是ZmLox6。除了ZmLox6,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶，~110kDa)、丙酮酸正石岸酉臾二i:敫酶(pyruvateorthophosphatedikinase)(PPDK,Mr~120kDa)、烏頭酸水合酶(aconitatehydratase)C(ACH，Mr~116kDa)、以及已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)性地注釋為細(xì)胞分裂蛋白的假定蛋白(Mr90kDa)被生長培養(yǎng)基中的高N誘導(dǎo)。顯然，預(yù)定的90kDa蛋白被糖基化，因?yàn)槠渥鳛椤?00kDa蛋白移動。最初的三個(gè)酶，PEP羧化酶、PPDK和ACH,均為C4酶。實(shí)施例3:ZmLox6與其它蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析在針對公眾數(shù)據(jù)庫的BLAST分析后，ZmLox6蛋白表現(xiàn)出與稻米Loxl蛋白最高的同源性(43%同一性，57%相似性)。不限于理論，這個(gè)相當(dāng)?shù)偷耐葱员砻鱖mLox6獨(dú)立地進(jìn)化為可能攜帶一些物種-特異性的功能。在利用來自多種其它植物物種及來自玉蜀黍的Lox蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析后，發(fā)現(xiàn)ZmLox6蛋白最接近大豆Lox蛋白(參見圖6)。大豆Lox蛋白已經(jīng)被先前展示為在圍繞葉子的葉脈的葉肉細(xì)胞的液泡中積聚的營養(yǎng)貯藏蛋白(Tranbarger,"a/.,(1991)尸/Ce〃3:973-988)。這些結(jié)果表明ZmLox6還可以為營養(yǎng)貯藏蛋白，其可以具有與大豆Lox蛋白直系同源的功能。實(shí)施例4:氮-誘導(dǎo)的蛋白在充分?jǐn)U展的葉子中積聚最高來自從在0.1mM或50mMNH4N03中生長的16天大的玉蜀黍植物收集的單獨(dú)的葉子的蛋白遭受SDS-PAGE，以便鑒定具有在-100-110kDa的多肽帶的最高表達(dá)的葉子。在~100kDa的多肽帶在葉子4中最豐富，其是充分?jǐn)U展的，從缺乏亮綠基礎(chǔ)部分和缺乏任何衰老部分可以判斷，如在較老葉子1、2和3中可以看到的。雖然不清楚這個(gè)帶的什么比例可以通過ZmLox6解釋，但是非常清楚這個(gè)帶中的蛋白在較嫩的葉子7和8中沒有存在到任何可感知的程度。這個(gè)變化與這個(gè)假定一致，即，細(xì)胞僅在可以獲得過多的氮時(shí)將氮截留入VSP,可能在充分?jǐn)U展的葉子中而不是在幼嫩的、迅速擴(kuò)展的葉子中發(fā)生的情況。實(shí)施例5:通過LynxMPSS研究的ZmLox6的表達(dá)才莫式玉蜀黍Lox基因在近交系A(chǔ)63的不同組織中的表達(dá)模式從MPSS數(shù)據(jù)庫搜集。抽樣用于每個(gè)組織的文庫的數(shù)量如下分生組織，14;根，33;莖稈，ll;葉，35;耳穗，15;外殼，1;整個(gè)仁，2;胚胎，8;胚乳，19;果皮,6;須(silk),7;雄穗(tassel),14;花藥，2;花粉，1。如表1所示，雖然在大量的組織中較低水平的表達(dá)，但是ZmLox6在葉子組織中表達(dá)最高。表l:玉米Lox基因的表達(dá)模式。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>在葉子組織中高度表達(dá)的另外的基因?yàn)閆mLox10。然而，在來自葉子組織的氮-可誘導(dǎo)的多肽帶的蛋白質(zhì)組分析期間，沒有檢測到由ZmLox10編碼的蛋白的單獨(dú)的肽(參見實(shí)施例1和2)。ZmLox6(SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列)和ZmLoxl0(SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列)的預(yù)測的分子質(zhì)量分別為約97和102kDa，并且所述兩個(gè)多肽僅分享34%的同一性(參見圖7)。這兩個(gè)蛋白十分地不同，如果ZmLox10在~100kDa多肽帶中以可檢測的水平存在，那么它可以通過蛋白質(zhì)組分析被看到。這表明ZmLoxlO在所用的實(shí)驗(yàn)條件下不被誘導(dǎo)，留下ZmLox6為僅有的VSP樣蛋白。隨后研究在V5玉米葉子和在V5發(fā)育階段的玉米節(jié)根(nodalroot)中創(chuàng)傷后ZmLox6基因表達(dá)的誘導(dǎo)。在創(chuàng)傷后隨時(shí)間在0、3、12和24小時(shí)以ppm測量表達(dá)的誘導(dǎo)。結(jié)果表明ZmLox6在葉子和根組織中均由創(chuàng)傷誘導(dǎo)(參見圖8和9),一個(gè)由來自其它植物物種的VSP展現(xiàn)的特4正(Utsugi,e,a/.,(1998)尸/awfA^/.S/o/.38:565-576;Berger,Wa/.，(2002)尸/yAS7'o/og7a尸Aa7tonw7114:85-91;Mira,W"/.,(2002)尸'/awtoSeW/w214:939-946)。Illinois高蛋白(IHP)和Illinois低蛋白(ILP)系已經(jīng)通過一百個(gè)循環(huán)被選擇分別用于高或低谷粒蛋白(Uribelarrea,"a/.,(2004)CVo/44:1593-1600)。雖然IHP谷粒包含>25%的蛋白，但是ILP的那些具有<5%。IHP的谷粒中對氮的高需求通過其營養(yǎng)組織中較大量的氮滿足，因?yàn)槭熘獱I養(yǎng)組織中大部分氮到成熟時(shí)重新流通到谷粒。這些系的MPSS分析表明與在IHP中相比，ZmLox6在ILP中以非常低的水平表達(dá)，暗示了這個(gè)蛋白在營養(yǎng)組織中的氮貯藏中的角色(圖10)。總體地，這些發(fā)現(xiàn)支持上述來自氮-誘導(dǎo)和蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果，表明ZmLox6是玉米中的VSP并在葉子組織中高度表達(dá)。實(shí)施例6:ZmLox6在E.co//中的表達(dá)通過PCR從表達(dá)的-序列-標(biāo)記的克隆擴(kuò)增全長ZmLox6，以產(chǎn)生ATG的上游的框架內(nèi)EcoRI限制性位點(diǎn)，以及緊隨編碼序列的框架內(nèi)Xhol限制性位點(diǎn)，以產(chǎn)生2,676bp的產(chǎn)物。擴(kuò)增引物序列上游，5'-GTTACCGAATTCGCCCTTCCCGGTACCATGATG-3'(SEQIDNO:5)和下游，5'-CGCCTCCCTCGAGAACGGTGAGGCTGTTG畫3'(SEQIDNO:6)。PCR產(chǎn)物帶從溴乙非啶-染色的0.5xTBE瓊脂糖凝膠切離，利用Bio-Rad's"Freeze&Squeeze"離心斗主(spincolumns)洗才是，用EcoRI+XhoI過夜消化。利用QiaQuick離心柱(Qiagen)從反應(yīng)混合物純化受限制的PCR產(chǎn)物，并通過蒸發(fā)在真空下濃縮。表達(dá)載體pET-28a(Novagen)用EcoRI+XhoI過夜消化、凝膠-純化、洗提、及濃縮，如上所述。利用從制造商(來自Roche的RapidDNALigationKit;來自Invitrogen的OneShotChemicallyCompetentTOP10Cells)供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行連接(ligation)和轉(zhuǎn)化。通過EcoRI-XhoI限制分析來自卡那霉素-抗性的集落的質(zhì)粒DNA,以證明克隆的ZmLox6的存在。利用供應(yīng)者的標(biāo)準(zhǔn)方案將pET-28a/ZmLox6載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主Rosetta(DE3)pLacI(Novagen)。通過在2-mL測試培養(yǎng)基中IPTG-談導(dǎo)的蛋白表達(dá)篩選氯霉素-抗性的和卡那霉素-抗性的轉(zhuǎn)化體。一個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)化體被選擇用于可溶性研究。利用下面的洗滌劑裂解緩沖劑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解和溶解50mM磷酸鈉pH7.7、2%(w/v)TritonX-IOO、+/-200pg/mL溶菌酶。發(fā)現(xiàn)重組ZmLox6蛋白積聚在不溶的包涵體中，借助8M尿素僅部分從這個(gè)部分(fraction)釋放。表達(dá)培養(yǎng)物被放大到2L(4x500mL)。細(xì)胞被沉淀(pelleted)并在-80。C冷凍。通過用滴管吸取(pipetting),隨后有力地渦旋(vortexing),將融解的細(xì)胞沉淀重新懸浮在裂解緩沖劑中。裂解物被沉淀并再次重新懸浮在具有溶菌酶的裂解緩沖劑中。加入過量1:10稀釋裂解緩沖劑，不溶裂解物被沉淀。不溶的裂解物被重新懸浮在如上的1:10稀釋裂解緩沖劑中，通過離心收集包涵體。包涵體在1:10稀釋裂解緩沖劑中被沖洗一次并重新沉淀。純化的包涵體沉淀通過用滴管吸取直接溶解在LiDS樣品緩沖劑中、加熱到100°C、并在Tris-甘氨酸10%丙烯酰胺預(yù)備凝膠上運(yùn)行。凝膠在純水中大面積地沖洗并在含水Coomassie(SimplyBlueSafeStain,Invitrogen)中非常簡單地染色。重組ZmLox6蛋白作為95-98kDa之間的寬帶被溶解(參見圖10;SeeBluePlus2MW標(biāo)記物，Invitrogen)。帶從24預(yù)備的凝膠切離；蛋白被電洗提(Elutmp,Schleicher&Schuell)并濃縮/脫鹽(Centriprepspincolumns,3,000MWCO,Millipore)?？偦厥樟?，如從與染色的BSA標(biāo)準(zhǔn)物凝膠內(nèi)比較估計(jì)的，為約2mg。實(shí)施例7:抗-ZmLox6抗體的產(chǎn)生及其用于研究這個(gè)蛋白的表達(dá)和定位電洗提的蛋白被注入兔中以通過StrategicBiosolutions(www.strategicbiosolutions.com)產(chǎn)生^i血:^青(antisera),主要長口前戶斤述(DhuggaandRay(1994)EJ.B/oc/^m.220:943-953)。如此產(chǎn)生的抗體公認(rèn)在抗體稀釋500,000-倍時(shí)在玉米葉子提取物的蛋白印記(blots)上的~100kDa單一多肽帶。當(dāng)來自B73,IHP,和ILP的葉子提取物用這個(gè)抗體探測時(shí)，觀察到顯著類似于在基因表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)的那樣的結(jié)果，在IHP葉子中具有非常低的蛋白表達(dá)水平(圖10和12A)。為了確定ZmLox6的細(xì)胞-類型定位，用于進(jìn)行上面的Western分析的來自同樣的葉子的葉鞘被切開為維管束和葉肉層。利用源自這些組織的蛋白blots的抗ZmLox6抗體的蛋白質(zhì)印記分析表明這個(gè)蛋白在葉肉細(xì)胞中表達(dá)并且不在維管束中表達(dá)(圖12B)。實(shí)施例8:轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化和再生用包含可操作地連接到玉蜀黍Rubisco小亞單位(SSU)啟動子(圖1A)、玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC1)啟動子(圖2A)、或玉蜀黍泛素-1(UBI1)啟動子(圖3A)、以及可選4奪的標(biāo)記物基因PAT(Wohlleben,Wa/.,(1988)70:25-37)(其提供對于除草劑雙丙氨膦的抗性)的SEQIDNO:1的ZmLox6序列或SEQIDNO:3的ZmLox6編碼序列的質(zhì)粒轟擊來自溫室供體植物的未成熟ZmLox6胚胎?？蛇x地，可選擇的標(biāo)記物基因在分離的質(zhì)粒上提供。圖1A中所示的構(gòu)建體提供了編碼的VSP在ZmLox6葉子組織的維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)。可選地，這個(gè)構(gòu)建體進(jìn)一步包括可操作地連接到VSP多核苦酸(參見圖IB)的玉蜀黍proaleurain液泡類別信號的編碼序列，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)到維管束鞘細(xì)胞的液泡區(qū)室。圖2A中所示的構(gòu)建體提供了編碼的VSP在玉蜀黍葉子組織的葉肉細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先表達(dá)?？蛇x地，這個(gè)構(gòu)建體進(jìn)一步包括可操作地連接到VSP多核普酸(參見圖2B)的玉蜀黍proaleurain液泡類別信號的編碼序列，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)入葉肉細(xì)胞的液泡區(qū)室，或者可操作地連接到VSP多核苷酸的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，例如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以便表達(dá)的VSP被引導(dǎo)入葉肉細(xì)胞的質(zhì)體區(qū)室。圖3A所示的構(gòu)建體提供了編碼的VSP的組成性表達(dá)?？蛇x地，這個(gè)構(gòu)建體進(jìn)一步包括可操作地連接到VSP多核苷酸(圖3B)的玉蜀黍proaleurain液泡類別信號，以便表達(dá)的VSP#皮引導(dǎo)入其中它一皮組成性表達(dá)的細(xì)胞的液泡區(qū)室。轉(zhuǎn)化如下進(jìn)4于。介質(zhì)配方遵循下文。耙組織的制備耳穗;故脫殼并在30%Clorox漂白劑加0.5%微洗滌劑中表面除菌20分鐘，用無菌水漂洗兩次。未成熟的胚胎被切離并胚軸側(cè)向下放置(盾片側(cè)向上)，每個(gè)板25個(gè)胚胎，在560Y培養(yǎng)基上4小時(shí)，隨后在制備用于轟擊的2.5cm靶區(qū)域內(nèi)對準(zhǔn)。制備圖1A、1B、2A、2B、3A或3B中所示的選擇的質(zhì)粒載體。利用如下的CaCl2沉淀過程將這個(gè)質(zhì)粒DNA沉淀到l.lpm(平均直徑)鴒球(tungstenpellet)上100pl制備的水中鴒粒、TrisEDTA緩沖劑中10(il(1pg)DNA(1pg總DNA);100pi2.5MCaCl2;及10pi0.1M亞精胺。順序地將每個(gè)試劑加入鴒粒懸浮液，同時(shí)維持在多管渦旋器(vortexer)上。最終混合物被簡單地聲波處理并允許在恒定的渦流中孵育10分鐘。在沉淀期后，所述管被簡短地離心、液體去除、用500pi100%乙醇沖洗、以及離心30秒。再次去除液體，將105^11100%乙醇加到最終鴒粒球。對于基因槍轟擊，鴒/DNA粒子被簡單地聲波處理并且10|iil點(diǎn)到(spottedonto)每個(gè)微載體的中心并允許在轟擊前干燥約2分鐘。在基因槍中水平#4轟擊樣品板。所有的樣品接受650PSI處的單射擊(shot),從制備的粒子/DNA的每個(gè)管采集總計(jì)十個(gè)等分試樣。轟擊后，將胚胎保持在560Y培養(yǎng)基中2天，隨后轉(zhuǎn)移到包含3mg/L雙丙氨膦的560R選擇培養(yǎng)基中，并每2周傳代培養(yǎng)。在選擇約10周后，將抗選擇的愈傷組織克隆轉(zhuǎn)移到288J培養(yǎng)基以開始植物再生。在體細(xì)胞胚成熟后(2-4周)，充分發(fā)育的體細(xì)胞胚被轉(zhuǎn)移到用于萌發(fā)的培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到光亮的(lighted)培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育中的小植物轉(zhuǎn)移到272V試管中無激素的培養(yǎng)基中達(dá)7-10天，直到小植物被充分確立。隨后將植物轉(zhuǎn)移到包含盆栽土壤(pottingsoil)的平面的插入物(相當(dāng)于2.5"盆(pot))并在生長室中培養(yǎng)l周，隨后在溫室中培養(yǎng)另外的l-2周，隨后轉(zhuǎn)移到經(jīng)典600盆U.6加侖)中并被培養(yǎng)至成熟。植物被監(jiān)測并對總氮含量計(jì)分(全植物和葉子、莖、及種子)。轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0g/1N6基礎(chǔ)鹽(basalsalts)(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1硫胺素HCl、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D、及2.88g/1L-脯氨酸(在用KOH調(diào)整到pH5.8后，用D-IH20加到體積(broughttovolume));2.0g/1Gelrite(在用D-I1120加到體積后加入)；及8.5mg/1硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌后加入并冷卻到室溫)。選擇培養(yǎng)基(560R)包括4.0g/1N6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson'sVitaminMix(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1硫胺素HCl、30.0g/1蔗糖、及2.0mg/12,4-D(在用KOH調(diào)整到pH5.8后，用D-IH20加到體積)；3.0g/1Gelrite(在用D-IH20加到體積后加入)；以及0.85mg/1硝酸銀和3.0mg/1雙丙氨膦(bialaphos)(在將培養(yǎng)基滅菌后加入并冷卻到室溫)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包括4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素類儲備溶液(0.100g煙酸、0.02g/1硫胺素HCL、0.10g/1吡哆醇HCL、及0.40g/1甘氨酸，用精制的(polished)D-IH20加到體積)(MurashigeandSkoog(1962)尸/z;^0/.尸/a"/，15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖、及1.0ml/1的0.1mM脫落酸(在調(diào)整到pH5.6后用精制的D-I&0加到體積)；3.0g/1Gelrite(在用D-I&0加到體積后加入)；及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/1雙丙氨膦(在將培養(yǎng)基滅菌后加入并冷卻到60°C)。無激素培養(yǎng)基(272V)包括4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素類儲備溶液(0.100g/1煙酸、0.02g/1硫胺素HCL、0.10g/1吡。多醇HCL、及0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20加到體積)、0.1g/1肌醇、及40.0g/1蔗糖(在調(diào)整到pH5.6后用精制的D-I&0加到體積);及6g/1細(xì)菌瓊脂(在用精制的D-IH20加到體積后加入)，滅菌并冷卻到60。C。實(shí)施例9:土壤桿菌(yJgro^cfen"m)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對于借助包含SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列、SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列的玉蜀黍的土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，采用Zhao的方法(美國專利No.5,981,840,以及PCT專利申請W098/32326;其內(nèi)容以引用方式并入本文中)。簡單地，未成熟胚胎從玉蜀黍分離并且胚胎與土壤桿菌的懸浮液接觸，其中細(xì)菌能夠?qū)琒EQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到未成熟胚胎的至少一個(gè)的至少一個(gè)細(xì)胞中(步驟1:感染步驟)。在這個(gè)步驟中，將未成熟的胚胎浸入土壤桿菌懸浮液中用于接種的起始。將胚胎與土壤桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。感染步驟后在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟胚胎。在這個(gè)共培養(yǎng)期后，最佳"靜止(resting)"步驟被預(yù)期。在這個(gè)靜止步驟中，胚胎在至少一個(gè)已知抑制土壤桿菌的生長的抗生素的存在下被孵育而不添加用于植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3:靜止步驟)。未成熟的胚胎在具有抗生素而沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用于消除土壤桿菌，并用于靜止期用于感染的細(xì)胞。其次，將接種的胚胎在包含選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并且回收生長的轉(zhuǎn)化的愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。在具有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟胚胎，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇性生長。隨后愈傷組織被再生入植物中(步驟5:再生步驟)，在選擇性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以再生植物。實(shí)施例10:大豆胚胎轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件將大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(cv.Jack)維持在旋轉(zhuǎn)振蕩器上35ml液體培養(yǎng)基SB196中(參見下面的配方)、150rpm,26°C，伴隨冷白色熒光，16:8小時(shí)白天/夜晚光周期，光強(qiáng)度為60-85^E/m2/s。通過將約35mg的組織接種入35ml新鮮液體SB196中，每7天到2周傳代培養(yǎng)培養(yǎng)物(優(yōu)選的傳代培養(yǎng)間隔為每7天)。通過基因槍轟擊的方法(Klein,""/.,(1987)AWwre,327:70)用下面的實(shí)施例描述的質(zhì)粒和DNA片段轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)起始大豆培養(yǎng)物每個(gè)月被起始(initiated)兩次，在每個(gè)起始之間5-7天。摘取來自種植后45-55天的可獲得的大豆植物的具有未成熟種子的豆莢、去除它們的殼、并置入無菌品紅盒中(sterilizedmagentabox)。大豆種子通過在具有1滴象牙皂(95ml的熱壓處理的蒸鎦水加5ml次氯酸鈉和1滴的皂)的5%次氯酸鈉溶液中搖動它們達(dá)15分鐘以無菌化。充分混合。利用21-升瓶的無菌蒸餾水漂洗種子，那些小于4mm的種子被置于單獨(dú)的顯微鏡載物片上。切除種子的小端。子葉被壓出種皮。子葉被轉(zhuǎn)移到包含SB1培養(yǎng)基的板(每個(gè)板25-30個(gè)子葉)。用纖維帶(tape)包裹板，并儲存8周。這個(gè)時(shí)間后，第二胚胎被切除并置入SB196液體介質(zhì)中7天。用于轟擊的DNA的制備將包含可操作地連接到感興趣的啟動子和可選擇的標(biāo)記物基因的SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列、SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或者編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的完整質(zhì)粒或DNA質(zhì)粒片段用于轟擊。利用PromegaTMProtocolsandApplicationsGuide,SecondEdition(106頁)中描述的方法常規(guī)制備用于轟擊的質(zhì)粒DNA并純化。通過雙消化的質(zhì)粒的凝膠分離獲得攜帶連接到感興趣的啟動子和可選沖奪的標(biāo)記物基因的SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列、SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒的片段。在每個(gè)情況中，100ng的質(zhì)粒DNA在適于感興趣的質(zhì)粒的0.5ml的特異性酶混合物中消化。通過在1%SeaPlaqueGTG瓊脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)上凝膠電泳分離所獲得的DNA片段，從瓊脂糖凝膠切下包含可操作地連接到感興趣的啟動子和可選擇的標(biāo)記物基因的SEQIDNO:1中陳列的ZmLox6序列、SEQIDNO:3中陳列的ZmLox6編碼序列、或編碼SEQIDNO:2中陳列的ZmLox6蛋白的核苷酸序列的DNA片段。利用GELase消化酶，遵循制造商的方案，從瓊脂糖純化DNA。將包含3mg的金粒的50^等分試樣的無菌蒸鎦水加入到5(il的1liig/^ilDNA溶液(如上所述制備的完整質(zhì)?；駾NA片段)、50pl2.5MCaCb和20的0.1M亞精胺?；旌衔镌跍u旋振蕩器的水平3上搖動3分鐘，在臺式微量離心機(jī)(benchmicrofuge)中離心(spun)10秒。在用400|nl100%乙醇沖洗后，沉淀物通過聲波處理被懸浮在40pi的100%乙醇中。5|iilDNA懸浮液被分配到BiolisticPDS1000/HE儀器盤的每個(gè)飛盤(flyingdisk)。每次轟擊(即，每個(gè)盤)每個(gè)5jil等分試樣包含約0.375mg金。組織制備和用DNA的轟擊將約150-200mg的7天大的胚胎懸浮培養(yǎng)物置于空的、無菌60x15mm培養(yǎng)皿中，所述皿覆蓋有塑料篩孔(plasticmesh)。每個(gè)板組織被轟擊1或2槍(shot),膜破裂壓設(shè)置在1100PSI,所述室被抽吸為水銀的27-28寸的真空。組織從保留/停止篩被放置約3.5寸。轉(zhuǎn)化的胚胎的選擇利用潮霉素(當(dāng)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，HPT，基因用作可選擇的標(biāo)記物時(shí))或氯磺隆(chlorsulfuron)(當(dāng)乙酰乳酸合酶，ALS,基因被用作可選擇的標(biāo)記物時(shí))選擇轉(zhuǎn)化的胚胎。潮霉素(HPT)選擇轟擊后，組織被放置入新鮮SB196介質(zhì)并如上所述培養(yǎng)。轟擊后6天，SB196與包含30mg/L潮霉素的選擇劑的新鮮SB196交換。選擇介質(zhì)每周更換。選擇后4到6周，可以觀察到綠色、轉(zhuǎn)化的組織從未轉(zhuǎn)化的、壞死胚胎發(fā)生集簇生長。分離的、綠色組織被去除并接種到多孔板中，以產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。氯磺隆(ALS)選擇在轟擊后，組織被分在2個(gè)具有新鮮SB196介質(zhì)的燒瓶中，并如上所述培養(yǎng)。轟擊后6到7天，用包含100ng/ml的氯磺隆的選擇劑的新鮮SB196交換SB196。選擇培養(yǎng)基每周更新。選擇后4到6周，可以觀察到綠色、轉(zhuǎn)化的組織從未轉(zhuǎn)化的、壞死胚胎發(fā)生集簇生長。去除分離的、綠色組織并接種到包含SB196的多孔板中，以產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。大豆體細(xì)胞胚再生入植物中為了從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物獲得全植物，組織必須被再生。胚胎成熟在冷白色熒光(PhillipscoolwhiteEconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)燈泡(40瓦)下在SB196中在26。C培養(yǎng)胚胎4-6周，16:8小時(shí)光周期，光強(qiáng)度90-120^E/m2s。這個(gè)時(shí)間后，將胚胎簇去除到固體瓊脂培養(yǎng)基SB166,達(dá)l-2周。隨后集簇被傳代培養(yǎng)到培養(yǎng)基SB103達(dá)3周。在此期間，從集簇去除單獨(dú)的胚胎并篩選與野生型或?qū)φ障啾忍岣叩牡?。?yīng)當(dāng)注意任何可檢測的表型，從感興趣的基因的表達(dá)產(chǎn)生，可以在這個(gè)階段被篩選。胚胎干燥和萌發(fā)成熟的個(gè)體胚胎通過將它們置入空的、小培養(yǎng)皿(35x10mm)中約4-7天而被干燥(desiccated)。用纖維帶密封板(形成小的潮濕室)。將干燥的胚胎植入SB71-4培養(yǎng)基，其中它們被放置以在上述相同的培養(yǎng)條件下萌發(fā)。從萌發(fā)培養(yǎng)基去除萌發(fā)的小植物并用水徹底漂洗，隨后植入24-細(xì)胞packtray中的Redi-Earth中，用透明的塑料圓頂覆蓋。2周后，去除圓頂，將植物露天培養(yǎng)(hardenedoff)另外的一周。如果小植物看起來強(qiáng)壯，它們被移植入10"盆的Redi-Earth,每個(gè)盆最多3個(gè)小植物。10到16周后，收獲成熟的種子，切片并分析蛋白。介質(zhì)配方SB196-FN低鹽液體繁殖培養(yǎng)基(每升)-MSFeEDTA-100x儲備液(stock)110mlMS石克酸鹽-10(^儲備液210mlFN低鹽卣化物-lOOx儲備液310mlFN低鹽P、B、Mo-100x儲備液410mlB5維生素(lml/L)1.0ml2,4-D(10mg/L終濃度)1.0mlKN032.83gm(NH4)2S040.463gm天冬酰胺1.0gm蔗糖(1%)10gmpH5.8FN低鹽儲備溶液儲備#1000ml500ml1MSFeEDTA100x儲備液Na2EDTA*3.724g1.862gFeS04-7H202.784g1.392g首先加入，溶解在黑瓶中同時(shí)攪拌2MS硫酸鹽100x儲備液MgS04-7H2037.0g18.5gMnS04-H201.69g0.845gZnS04-7H200.86g0.43gCuS04-5H200.0025g0週25g3FN低鹽卣化物lOOx儲備液CaCl2-2H20KICoCl2-6H2030.0g15.0g0.083g0.0715g0.0025g0.00125g4FN低鹽P、B、MolOOxKH2P04H3B03Na2Mo04-2H20儲備液18.5g9.25g0.62g0.31g0.025g0.0125gSB1固體培養(yǎng)基(每升)包括1pkg.MS鹽(Gibco/BRL-Cat#11117-066);1mlB5維生素類1000X儲備液；31.5g蔗糖；2ml2,4-D(20mg/L終濃度)；pH5.7;及，8gTC瓊脂。SB166固體培養(yǎng)基(每升)包括1pkg.MS鹽(Gibco/BRL-Cat#11117-066);1mlB5維生素類IOOOX儲備液；60g麥芽糖；750mgMgCl2六水合物；5g活化的木炭；pH5.7;及，2g凝膠劑(gelrite)。SB103固體培養(yǎng)基(每升)包括1pkg.MS鹽(Gibco/BRL-Cat#11117-066);1mlB5維生素類1000X儲備液；60g麥芽糖；750mgMgCl2六水合物；pH5.7;及，2g凝膠劑。SB71-4固體培養(yǎng)基(每升)包括1瓶Gamborg，sB5鹽w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat#21153-036);pH5.7;及，5gTC瓊脂。2,4-D儲備液從Phytotechcat#D295預(yù)先制備獲得-濃度為1mg/ml。B5維生素儲備液(每100ml)(其被儲存在-2(TC等分試樣中)包括10g肌醇；100mg煙酸；100mg吡。多醇HC1;及，1g硫胺素。如果所述溶液不能足夠快速的溶解，經(jīng)由熱攪拌板施加低水平的熱。氯磺隆儲備液包括0.01N氫氧化銨中l(wèi)mg/ml。實(shí)施例11:檢測ZmLox6、硝酸還原酶、PEP-羧化酶、以及Rubisco最優(yōu)化的高通量ZmLOX蛋白提取技術(shù)的分析方法的發(fā)展(來自植物葉子組織)1.將六片葉子punches收集在大滴定(megatiter)管中，在液氮中冷凍，放置在大滴定架(megatiterrack)中。2.每管加入1顆不銹鋼珠并隨后加入400ul蛋白提取緩沖液。3.在Genogrinder儀器中(來自BT&C/OPSDiagnostics,672Rt.,202-206NorthBridgewater,NJ,USA的Geno/Grinder2000)，在1x700設(shè)置研磨樣品30秒，兩次。如果所述樣品沒有被完全研磨，研磨另外的30秒。4.在4°C,以4000rpm將megatiterrack離心15分鐘。5.將澄清的上清液仔細(xì)地去除入96孔格式架(formatrack)中并在液氮中冷凍。6.為確定蛋白濃度，稀釋10倍并利用來自Pierce(PierceChemicalCompany,P.O.Box117,Rockford,IL,USA)的BCATM蛋白分析試劑盒。提取緩沖劑試劑Hepes,pH7.5w/KOH甘油EDTAEGTATritonX誦訓(xùn)千脒6-氨基己酸加入800mlRO/di水(到900mL)用5.9ml4MKOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.5,用RO/di水使體積到1L。終濃度50mM20%(v/v)1mM1mM0.1%(v/v)1mM1mMamt.perLU.9g200ml0.292g0.38g10ml(10n/。儲備液)0.12g0.13g在4。C儲存制備的緩沖劑。試劑終濃度儲備溶液儲存位置PMSF1mM250ul中0.0435g(=1M)RT干燥器Leupeptin10uM250ul中0.00115g(=1M)10-20。C干燥器DTT1mM0.154g制備小等分試樣(10ul)并在-20。C儲存*在提取前立即將蛋白酶抑制劑冷凍儲備液加入樣品等分試樣；參見注釋用于檢測ZmLox6、硝酸還原酶、PEP-羧化酶、及Rubisco的ELISA方逸1.來自提取步驟的稀釋蛋白是在25mMTris-Cl、pH9.0、緩沖劑中。2.將上述溶液的等分試樣50ul加入96-孔孩￡滴定板的孔中。3.在37。C孵育所述板2小時(shí)或者在室溫下過夜。沒有抗原加入對照孔中。4.用分散的去離子或蒸餾水漂洗包覆的板。輕輕拂去粘在板上的水并用水漂洗兩個(gè)更多次，在每次漂洗后從板上輕輕拂去水。5.用阻斷緩沖劑(參見下文)填充每個(gè)孔并在室溫下孵育30分鐘。6.重復(fù)步驟4.7.將在阻斷緩沖劑中稀釋的50ul初級抗體溶液加入到每個(gè)包覆的孔中，在塑料包裹中包覆板，并在室溫下孵育2小時(shí)(Lox6的1:15,000稀釋)。沒有初級抗體加入到對照孔中。8.如步驟4在水中將板漂洗三次。9.用阻斷緩沖劑填充每個(gè)孔，并孵育30分鐘。10.如步驟4用水將板漂洗三次。11.將阻斷緩沖劑中的50ul二級抗體溶液(堿性磷酸酶結(jié)合抗體的山羊抗-兔IgG的l:25,000稀釋；SigmaA3687)加入到每個(gè)包覆的孔,在塑料包裹中包覆板，并在室溫下孵育2小時(shí)。12.如步驟4用水將板漂洗三次。13.用阻斷緩沖劑填充每個(gè)孔，并孵育10分鐘。14.如步驟4用水將板漂洗三次。15.將75ul底物溶液加到每個(gè)孔并在室溫下黑暗中孵育1小時(shí)。16.將25ul的0.5MNaOH溶液加到每個(gè)孔以終止反應(yīng)?；旌喜⒃?05nm測量吸光度。10XTBS0.5MTris-Cl，pH8.01.5MNaCl用于一升溶液的阻斷緩沖劑100ml10XTBS30ml0.3%TritonX100C10%V/VO2.5gBSA870ml蒸鎦H20底物磷酸酶底物5mg片(SigmaS0942):1片用于5ml緩沖劑。底物緩沖劑二乙醇胺100g/L4.9M溶液的氯化鎂102ulThimerosal(sigmaT5125)100mg將所有的成分加入900ml去離子水中。用HC1將pH調(diào)節(jié)到9.8并使體積成為一升。轉(zhuǎn)移到無菌1L瓶并用鋁箔覆蓋并儲存在4匸。分析的最優(yōu)化用于包覆孔的最優(yōu)的蛋白量和最佳pH:50ul的10ug/ml蛋白，pH9.0。抗體稀釋的滴定的實(shí)例被給出用于Lox6蛋白，其中在圖13中吸光度為從1:15,000到1:40,000線性稀釋。實(shí)施例12:在不同啟動子的控制下ZmLox6在玉蜀黍細(xì)胞中的過度表逸用六個(gè)不同的構(gòu)建體獲得玉蜀黍的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因事件并在溫室中培養(yǎng)。如先前的實(shí)施例中所述在開花時(shí)開始和隨后10天或一周的間隔收集葉子盤(discs)。利用抗-ZmLox6抗體獲得的ELISA結(jié)果如圖14中所示。可以從這些結(jié)果中獲得兩個(gè)主要結(jié)論首先，在啟動子和LoxORF之間加入液泡靶向信號對于其蛋白的表達(dá)是有害的，其次，用PEPC啟動子獲得最大的表達(dá)，其特異性地在葉肉細(xì)胞中表達(dá)。Ubi-Intron啟動子給出下一最高的表達(dá)，Rubisco小亞單位給出三個(gè)啟動子中最低水平的表達(dá)。平均來說，利用PEPC啟動子獲得野生型的Lox6蛋白的5-8倍的更高表達(dá)。實(shí)施例13:開花后積聚的Lox6蛋白的重新流通在開花時(shí)約80%的總植物N積聚，在成熟時(shí)65%的總N積聚在谷粒中。換句話說，在營養(yǎng)細(xì)胞中積聚的大部分N被重新流通到發(fā)育中的谷粒。從開花向前(floweringonwards)收集的葉子組織的ELISA結(jié)果清楚地表明Lox6蛋白從To轉(zhuǎn)基因植物的葉子重新流通，正如已知被流通的其它蛋白，即，PEP-羧化酶和Rubisco(圖15)。實(shí)施例14:ZmLox6蛋白在來自Tl世代的田地(field)-培養(yǎng)的植物中的積聚和重新流通來自利用PEPC啟動子與對照近交系獲得的、通過定量基因組PCR鑒定的八個(gè)單獨(dú)的拷貝基因插入事件的種子在2006年的夏天在雙行區(qū)(plots)的田地中培養(yǎng)。在開花前對從每行對八種植物進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)事件或?qū)φ?6個(gè)植物。從開花前的兩周開始以每周間隔收集葉子punches并在開花后兩周結(jié)束。當(dāng)與對照植物相比時(shí)，Lox6蛋白的積聚水平是對照事件的5倍(圖16)。其它蛋白(PEPC、Rubisco、NR)的積聚沒有被影響到任何可感知的程度。第二個(gè)主要結(jié)論是來自轉(zhuǎn)基因的積聚的蛋白如其它已知的蛋白(如，PEPC和Rubisco)那樣有效地重新流通(圖16)。這些結(jié)果表明Lox6蛋白如其它營養(yǎng)蛋白那樣作為營養(yǎng)貯藏蛋白^l重新流通到發(fā)育中的谷粒。實(shí)施例15.LOX序列的變體a不攻f薦,^^4差凝^/!/wza^^/y^f沐一才夯凝^/ySEQIDNO:l或3中陳列的LOX核苷酸序列用于產(chǎn)生變體核普酸序列，其具有在與合適的SEQIDNO的起始未改變的ORF核苷酸序列相比時(shí)約70%、76%、81%、86%、92%和97%的核苷酸序列同一性的開放閱讀框的核苷酸序列。利用標(biāo)準(zhǔn)密碼子表產(chǎn)生這些功能性變體。雖然所述變體的核苷酸序列被改變，但是由所述開放閱讀框編碼的氨基酸序列不變。S.丄0\^/{/敎傳郝凝{/產(chǎn)生LOX6序列的變體氨基酸序列。在這個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)氨基酸被改變。具體地，檢查SEQIDNO:3或SEQIDNO:1(62-2737)中陳列的開放閱讀框以確定合適的氨基酸改變。通過參考蛋白對準(zhǔn)(與來自多種物種的其它直系同源體和其它基因家族成員)進(jìn)行要改變的氨基酸的選擇。參見圖7和表2。選擇的氨基酸被認(rèn)為不在高選擇壓力下(不是高度保守的)并且被具有類似的化學(xué)性質(zhì)(即，類似的功能側(cè)鏈)的氨基酸相當(dāng)容易地替換。利用圖7和表2中陳列的蛋白對準(zhǔn)，合適的氨基酸可以被改變。一旦鑒定了靶向的氨基酸，接著進(jìn)行實(shí)施例6A中列出的方法。利用這個(gè)方法產(chǎn)生具有與SEQIDNO:l或3約70%、75%、81%、86%、92%和97%的核酸序列同一性的變體。c.丄ow^f沐^差邀^/y在這個(gè)實(shí)施例中，形成相對于參考蛋白序列具有82%、87%、92%和97%的同一性的人工蛋白序列。這個(gè)后面的努力需要從圖7中陳列的對準(zhǔn)鑒定保守和可變區(qū)并隨后明智的應(yīng)用氨基酸替換表。這些部分將在下面更i羊細(xì);也討i侖。主要地，基于LOX6蛋白中或其它LOX蛋白中的保守區(qū)進(jìn)行那些氨基酸序列被改變的確定。參見圖7。基于序列對準(zhǔn)，可以可能地被改變的LOX序列的變化區(qū)以小寫字體示出，而保守區(qū)以大寫字母示出。認(rèn)識到可以在下面保守區(qū)進(jìn)行保守的替換而不改變功能。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本發(fā)明的LOX序列的功能性變體可以在保守的結(jié)構(gòu)域中具有較小的非保守的氨基酸改變。隨后可以形成人工蛋白序列，其不同于原始序列，間隔為80-85%、85-90%、90-95%和95-100%的同一性。這些間隔的中點(diǎn)祐:輩巴向，例如，具有加或減1%的自由活動范圍。氨基酸替換將被customPerlscript影響。替換表在下面的表2中提供。表2.替換表<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>首先，蛋白中不應(yīng)該被改變的任何保守的氨基酸被鑒定并"區(qū)分"用于與替換隔離。起始蛋氨酸將當(dāng)然被自動地加到這個(gè)列表中。其次，進(jìn)行改變。在任何情況下H、C、和P不應(yīng)該被改變。改變將首先用異亮氨酸發(fā)生，從N-末端掃到C-末端。隨后亮氨酸，等等沿列表向下直到它達(dá)到希望的靶標(biāo)?？梢赃M(jìn)行臨時(shí)數(shù)量的替換以便不造成改變的反轉(zhuǎn)。所述列表被排序1-17,因此在亮氨酸前以如所需的一樣多的異亮氨酸改變開始，等等向下到蛋氨酸。清楚地，以這種方式，許多氨基酸將不需要被改變。L、I和V將涉及兩個(gè)可選的最佳替換的50:50替換。變體氨基酸序列將作為輸出寫出。Perlscript用于計(jì)算百分比同一性。利用這個(gè)過程，LOX序列的變體產(chǎn)生具有與相應(yīng)的SEQIDNO的起始未改變的ORF核苷酸序列約82%、87%、92%和97%的氨基酸同一性。冠詞"a"和"an"用在本文中指的是冠詞的語法目標(biāo)的一個(gè)或超過一個(gè)(即，至少一個(gè))。例如，"anelement"意味著一個(gè)或多個(gè)元件。說明書中提及的所有出版物和專利申請表明這個(gè)發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的技術(shù)人員的水平。所有的出版物和專利申請以引用方式并入本文中到同樣的程度，好像每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍痪唧w和逐一地表明以引用方式并入。雖然為了理解清楚的目的，通過闡述和舉例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但是在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以實(shí)施一些變化和變更。權(quán)利要求1.一種用于提高植物的氮貯藏容量的方法，所述方法包括將至少一個(gè)核苷酸構(gòu)建體引入所述植物中，所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到驅(qū)動在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自由下列組成的組:(a)包含SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列的核苷酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2中陳列的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；(d)在嚴(yán)格的條件下雜交到(a)或(b)的核苷酸序列的互補(bǔ)體的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)格的條件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃雜交，并且在0.1XSSC中在60℃-65℃沖洗，其中所述核苷酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；以及(e)編碼與SEQIDNO:2中陳列的序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述植物為C4植物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述啟動子為葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核普酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的液泡類別信號的編碼序列。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核苦酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述啟動子為維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核普酸序列的液泡類別信號的編碼序列。10.根據(jù)權(quán)利要求4到9中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述C4植物為玉蜀黍、高粱、或甘蔗。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的啟動子。14.根據(jù)權(quán)利要求1到3和11到13中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的液泡類別信號的編碼序列。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。22.根據(jù)權(quán)利要求16到21中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。24.—種用于提高草料或青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值的方法，所述方法包括將至少一個(gè)包含可操作地連接到驅(qū)動在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子的核苷酸序列的核苷酸構(gòu)建體引入用于草料或青貯飼料的植物中，其中所述核苷酸序列選自由下列組成的組(a)包含SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列的核普酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2中陳列的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的核普酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；(d)在嚴(yán)格的條件下雜交到(a)或(b)的核苷酸序列的互補(bǔ)體的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)格的條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在0.1XSSC中在60。C-65。C沖洗，其中所述核苷酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；以及(e)編碼與SEQIDNO:2中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的核普酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述(e)的核苷酸序列編碼富含必需氨基酸的營養(yǎng)貯藏蛋白。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述必需氨基酸包括選自由賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、及異亮氨酸組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。27.根據(jù)權(quán)利要求24到26中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植物為C4植物。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述啟動子為葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的液泡類別信號的編碼序列。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述啟動子為維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核普酸序列的液泡類別信號的編碼序列。35.根據(jù)權(quán)利要求29到34中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述C4植物為玉蜀黍、高粱、或甘蔗。36.根據(jù)權(quán)利要求24到26中任何一項(xiàng)所迷的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。37.根據(jù)權(quán)利要求24到26中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所迷可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。39.根據(jù)權(quán)利要求24到28和36到38中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所迷單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。41.根據(jù)權(quán)利要求24到26中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核普酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核普酸序列的液泡類別信號的編碼序列。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所迷可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。47.根據(jù)權(quán)利要求41到46中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。49.一種用于提高植物或其植物部分的氮含量的方法，所述方法包括將至少一個(gè)包括可操作地連接到驅(qū)動在植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子的核苷酸序列的核苷酸構(gòu)建體引入所述植物中，其中所述核苷酸序列選自由下列組成的組(a)包含SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列的核苷酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2中陳列的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苦酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；(d)在嚴(yán)格的條件下雜交到(a)或(b)的核苷酸序列的互補(bǔ)體的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)格的條件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在0.1XSSC中在60。C-65。C沖洗，其中所述核普酸序列編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽；以及(e)編碼與SEQIDNO:2中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有營養(yǎng)l&藏蛋白性質(zhì)的多肽。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述(e)的核苷酸序列編碼富含必需氨基酸的營養(yǎng)貯藏蛋白。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述必需氨基酸包括選自由賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、及異亮氨酸組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。52.根據(jù)權(quán)利要求49到51中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物或植物部分用于草料或青貯飼料。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中用于草料或青貯飼料的所述植物部分選自由葉子、莖、種子、及其任何組合組成的組。54.根據(jù)權(quán)利要求49到53中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述植物為C4植物。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述啟動子為葉肉細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述核香酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核普酸序列的液泡類別信號的編碼序列。59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核普酸序列的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。60.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述啟動子為維管束鞘細(xì)胞-優(yōu)選的啟動子。61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苷酸序列的液泡類別信號的編碼序列。62.根據(jù)權(quán)利要求56到61中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述C4植物為玉蜀黍、高粱、或甘蔗。63.根據(jù)權(quán)利要求49到53中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。64.根據(jù)權(quán)利要求49到53中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。66.根據(jù)權(quán)利要求49到55和63到65中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。68.根據(jù)權(quán)利要求49到53中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核苷酸構(gòu)建體包括可操作地連接到所述核苦酸序列的液泡類別信號的編碼序列。69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述啟動子為組成性啟動子。72.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。74.根據(jù)權(quán)利要求68到73中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述單子葉植物選自由玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥組成的組。76.—種核香酸構(gòu)建體，包括液泡類別信號的編碼序列和編碼具有營養(yǎng)貯藏蛋白性質(zhì)的多肽的核苷酸序列，其中所述編碼序列和所述核苷酸序列可操作地連接到驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子，并且其中所述核苷酸序列選自由下列組成的組(a)包含SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列的核普酸序列；(b)編碼SEQIDNO:2中陳列的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQIDNO:1中陳列的序列、SEQIDNO:1的核苷酸62-2737中陳列的序列、或者SEQIDNO:3中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；(d)在嚴(yán)格的條件下雜交到(a)或(b)的核普酸序列的互補(bǔ)體的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)^f各的條件包括在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中在37。C雜交，并且在0.1XSSC中在60。C-65。C沖洗；以及(e)編碼與SEQIDNO:2中陳列的序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述(e)的核苷酸序列編碼富含必需氨基酸的營養(yǎng)貯藏蛋白。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述必需氨基酸包括選自由賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、及異亮氨酸組成的組的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。79.根據(jù)權(quán)利要求76到78中任何一項(xiàng)所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述啟動子為組織-優(yōu)選的啟動子。80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述組織-優(yōu)選的啟動子為葉子-優(yōu)選的啟動子。81.根據(jù)權(quán)利要求76到78中任何一項(xiàng)所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述啟動子為組成性啟動子。82.根據(jù)權(quán)利要求76到78中任何一項(xiàng)所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述啟動子為可誘導(dǎo)的啟動子。83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的核苷酸構(gòu)建體，其中所述可誘導(dǎo)的啟動子為創(chuàng)傷-可誘導(dǎo)的啟動子。84.—種植物，包括權(quán)利要求76到83中任何一項(xiàng)所述的核普酸構(gòu)建體。85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的植物，其中所述植物為單子葉植物。86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍、小麥、稻米、大麥、高粱、或黑麥。87.根據(jù)權(quán)利要求84到86中任何一項(xiàng)所述的植物，其中所述核普酸構(gòu)建體被穩(wěn)定的并入所述植物的基因組中。88.權(quán)利要求84到87中任何一項(xiàng)所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子。89.—種確定植物組織中ZmLox表達(dá)的方法，包括a.從所選植物收獲植物組織；b.利用最優(yōu)化的高通量ZmLox蛋白提取技術(shù)提取植物蛋白；以及c.通過ELISA分析所述提取的蛋白以確定ZmLox表達(dá)的水平。全文摘要本發(fā)明提供了制備和利用與野生型植物相比表現(xiàn)出提高的氮貯藏容量的轉(zhuǎn)基因植物的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括誘導(dǎo)單子葉植物-來源的營養(yǎng)貯藏蛋白(VSP)在植物中，尤其是在單子葉植物中的過度表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)包括編碼ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體的核苷酸序列的核苷酸構(gòu)建體被引入植物中。依賴于所述目標(biāo)，所述核苷酸構(gòu)建體可以可選地包括可操作地連接的液泡類別信號或質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，以便引導(dǎo)ZmLox6蛋白或其生物活性片段或變體分別儲存入其中VSP被表達(dá)的細(xì)胞的液泡區(qū)室或質(zhì)體區(qū)室。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于生產(chǎn)具有提高的氮含量和/或提高的營養(yǎng)價(jià)值的植物的方法，其在商業(yè)作物，包括用于草料、青貯飼料、及谷粒生產(chǎn)的那些作物中是希望的。文檔編號C12N15/82GK101379191SQ200680053084公開日2009年3月4日申請日期2006年12月18日優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日發(fā)明者H·K·R·阿巴拉于,K·S·杜加,L·M·阿彭策勒,R·古普塔申請人:先鋒高級育種國際公司