專利名稱：作為疾病的生物標志的生脂腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生脂腺病毒如腺病毒-36 (Ad-36)的感染與肥 胖癥和肥胖癥相關(guān)癌癥及其它疾病的病因之間的關(guān)系。更具體的i兌， 本發(fā)明涉及預(yù)測受試者是否傾向于發(fā)展乳腺癌或前列腺癌的方法。另 外，本發(fā)明涉及測定受試者的Ad-36狀態(tài)和使用Ad-36狀態(tài)作為癌癥 存在的標志，以預(yù)測發(fā)展這種癌癥的未來風(fēng)險和/或預(yù)測癌癥的侵襲性 和預(yù)后。 相關(guān)技術(shù)肥胖癥和某些類型的癌癥的流行率同時出現(xiàn)了劇烈的增 加。大約從1980年起，肥胖癥的全'球流行率劇烈加速。在美國，從 1980年到2000年這20年里成人肥胖癥的流行率已翻倍(A人15%到 31%),而在1960年到1980年的前20年里其流行率只稍有增加(從 13.5%到15%)。從大約1970年到2000年，兒童爿巴胖癥的流行率增至 三倍。同樣，在最近幾年里，乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肝臟癌的 流行率也快速增加。已提出肥胖癥中生殖激素的變化在乳腺和前列腺癌(還有 其它癌癥)的關(guān)系中及在這些癌癥的侵襲性中起到作用。但是，生殖激 素的變化不能解釋諸如結(jié)腸癌、腎癌或胰腺癌的不在激素控制下的癌癥。肥胖癥和癌癥之間的聯(lián)系的另 一種可能性是肥胖個體中
所見到的免疫功能下降。肥胖的人對乙型肝炎疫苗接種的抗體應(yīng)答比 不月巴胖的人要低。免疫系統(tǒng)在抑制腫瘤的生長方面至關(guān)重要，因此如 果這是肥胖癥中多種類型的癌癥增加的機制的話就不足為奇了 。但 是，腺病毒已知能夠使免疫功能降低，這是增強它們在宿主(包括人宿 主)當(dāng)中的復(fù)制的一種方式。更相關(guān)的是，據(jù)報道能引起肥胖癥的
SMAM-I禽腺病毒是通過降低小雞的免疫功能而具有重大影響。因此， 腺病毒在引起肥胖癥和同時削弱免疫功能之間存在直接關(guān)系。本發(fā)明 人已報道了 SMAM-I與人肥胖癥有關(guān)，這又為腺病毒與人肥胖癥之間 增加了一重聯(lián)系。 —些人腺病毒血清型已知具有致瘤性，會在大鼠或倉鼠中 引起腫瘤。腺病毒血清型是分族的。A族腺病毒(例如Ad-12、 Ad-18) 具有高度致瘤性，在大多數(shù)動物中4個月內(nèi)引起腫瘤；B族腺病毒(例 如Ad-3、 Ad-7)具有弱致瘤性，在大多數(shù)動物中4-18個月內(nèi)引起腫瘤； D族腺病毒據(jù)認為致瘤性較低，但血清型-9能有效地在2-5個月內(nèi)引 起乳腺腫瘤。在腺病毒引起的癌癥方面已作了大量的工作，但到目前 為止仍沒有證據(jù)證明腺病毒會？}起人類癌癥。如果腺病毒會引起人類癌癥，很可能它們是通過改變宿主 中能讓不受調(diào)節(jié)的細胞生長發(fā)生的基因的表達來進行。許多這種腫瘤 標志已得到鑒定。有一些是因為遺傳變異所致。已將遺傳性乳腺癌與 高外顯率易感性基因如BRCA1、 BRCA2、 CHEK 2、 TP53或PTEN 的一個等位基因的種系突變關(guān)聯(lián)起來。有可能的是腺病毒感染促進了 這些遺傳上易感個體中的癌癥。但是，腺病毒可通過誘導(dǎo)宿主的各種 癌基因的表達或者抑制宿主的腫瘤抑制基因的表達來促成自發(fā)癌發(fā) 生。由腺病毒所致的據(jù)認為會促成癌癥的變更，包括DNA依賴性蛋 白激酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、mTOR、 p16、 p53、 PDZ蛋白、磷脂酰肌 醇3-激酶、PML、胸苷激酶和Zip激酶的變化。特別值得關(guān)注的是被
腺病毒E4區(qū)域改變的那些肺瘤相關(guān)因素，具體的說是E4orfl基因。 E4癌基因包括DNA依賴性蛋白激酶、p53、 PDZ蛋白、磷脂酰肌醇 3-激酶、PML、胸普激酶和Zip激酶。下文會描述到，已證實Ad-36 E4orfl基因通過對脂肪細胞代謝的直接作用參與產(chǎn)生肥胖癥。人腺病 毒-5的E4orfl區(qū)域已證實是癌基因，最近有文章報道說Ad-5在小鼠 中產(chǎn)生肥胖癥。這些發(fā)現(xiàn)證實了肥胖癥與癌癥的直接關(guān)系，即兩者都 因人腺病毒所致，并且提出了通過病毒基因的可能機制。癌癥研究領(lǐng)域許多研究人員的一般共識是，腺病毒不構(gòu)成 人癌癥的病因。因此，要是證明生脂腺病毒如Ad-36與肥胖癥相關(guān)癌 癥如乳腺癌和前列腺癌有關(guān)，這將會是個重大的技術(shù)進步。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面涉及預(yù)測受試者是否傾向于發(fā)展生脂 A泉病毒相關(guān)疾病的方法。該方法包括/人受試者獲得樣品，通過篩選樣 品中對生脂腺病毒有特異性的抗體的存在確定受試者是否感染生脂 腺病毒，和確定樣品中對生脂腺病毒'有特異性的抗體的存在。所述抗 體可對一個或多個由核酸序列SEQ ID NO.:5、 SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7編碼的肽具有特異性。此外，篩選步驟可通過使用選自血清中 和測定和ELISA的方法來進行。在又一個方面，生脂腺病毒可包括腺病毒5型、腺病毒36 型和腺病毒37型。另外，生脂腺病毒相關(guān)疾病可包括癌癥、前列腺 癌、乳腺癌、胰腺功能異常、胰腺疾病、糖尿病、肺病、大腦和神經(jīng) 系統(tǒng)功能異常及腎上腺功能異常。在還又一個方面，受試者可以是人或動物。此外，樣品可 以是生物樣品如體液、組織樣品、器官樣品、糞便、血液、唾液和它 們的任何組合。本發(fā)明的另一個方面涉及通過給予受試者抗生脂腺病毒 疫苗來在受試者中預(yù)防生脂腺病毒相關(guān)疾病的方法?？股俨《疽?br> 苗可包括有效劑量的活性成分，如殺死的腺病毒36型、滅活腺病毒 36型、編碼腺病毒36外殼蛋白或其片段的蛋白質(zhì)或肽序列、編碼腺 病毒36外殼蛋白或其片段的核酸序列、腺病毒36型E1A蛋白、遺傳 ^"飾的非致病性病毒及非致病性病毒。在又一個方面，可將疫苗鼻內(nèi)、口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下和/或腹膜內(nèi)給予受試者。受試者可以是人或動物。生脂疾病可包 括癌癥、前列腺癌、乳腺癌、胰腺功能異常、胰腺疾病、糖尿病、肺 病、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及腎上腺功能異常。本發(fā)明的另 一個方面步友確定受試者中的癌癥侵襲性的 方法。該方法包括從受試者獲得樣品，通過篩選樣品中對生脂腺病毒 有特異性的抗體的存在確定受試者是否感染了生脂腺病毒，和確定樣 品中對生脂腺病毒有特異性的抗體的存在，使得生脂腺病毒的存在與 侵襲性癌癥相關(guān)聯(lián)。所述抗體可對一個或多個由核酸序列SEQ ID NO.:5、 SEQIDNO.:6和SEQIDNO.:7編碼的肽具有特異性。此外， 篩選步驟可通過Y吏用選自血清中和測定和ELISA的方法來進行。在又一個方面，生脂腺病毒可包括腺病毒5型、腺病毒35 型和腺病毒37型。另外，癌癥可包括乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、 卵巢癌、腎癌、胰腺癌和肺癌。在還又一個方面，受試者可以是人或動物。此外，樣品可 以是生物樣品如體液、組織才羊品、'器官樣品、糞<更、血液、唾液和它 們的任何組合。本發(fā)明另外的特征、優(yōu)點和實施方案由以下詳細描述、附 圖和權(quán)利要求書得到闡明或變得顯見。此外還應(yīng)認識到，前面的發(fā)明 概迷和后面的發(fā)明詳述都是示例性的，是旨在提供更多的解說而又不 限制所提出權(quán)利要求的本發(fā)明范圍。
附圖簡述所包括的用以提供對本發(fā)明的進一步理解的附圖，是納入
本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，是說明本發(fā)明的各個實施方案 并與發(fā)明詳述一起用以解釋本發(fā)明的原理。并沒有試圖將本發(fā)明的結(jié)
構(gòu)細節(jié)(structural details)更加詳細顯示到超過為對本發(fā)明和可能實施 本發(fā)明的各種方式進行基本理解所必需的詳細程度。

圖1是MDI處理后5天對3T3-L1細胞的BODIPY染色。 這個圖顯示了體外感染Ad-36與不感染Ad-36的3T3-L1細胞中的甘 油三酯。對照細胞顯示中度的BODIPY脂肪染色，而Ad-36感染細胞 有約兩倍之多的甘油三酯，表明脂肪細胞生化已有變化。圖2這個圖顯示了在隨意喂食的獼猴中Ad-36自發(fā)感染的 影響。與獼猴受感染之前的時期相比， 一旦發(fā)現(xiàn)到感染(標示為個)，體 重即穩(wěn)步上升，在約18個月時還在上升。圖3這個圖顯示了感染Ad-36的猴子中體重的增力口。與未 受感染的猴子相比，受感染猴子在約7個月時間里增加約四倍重量。圖4這個圖顯示了感染Ad-36的狨猴中血清膽固醇的下 降。血清膽固醇在感染后立即開始下降， 一直到大約10周。這與受 感染猴子的基線值顯著不同。在未受感染的猴子中沒有變化。圖5是用巢式PCR測定法顯示Ad-36 DNA在受感染狨壞吳 脂肪組織中的存在的凝膠。泳道l是Ad-36 DNA，泳道24顯示未受 感染猴子的脂肪中沒有Ad-36 DNA,泳道5-7顯示Ad-36 DNA在所 有受感染猴子中的存在。圖6是用巢式PCR測定法顯示受感染狨猴的肝臟組織(上 方泳道)和肌肉組織(下方泳道)中的Ad-36 DNA的凝月交。來自受感染 猴子的Ad-36 DNA在肝臟組織和肌肉組織的泳道7-9中見到，而在未 受感染的猴子的泳道4-6中不存在。泳道2是來自培養(yǎng)物的Ad-36, 泳道3是標志。圖7是用巢式PCR測定法顯示受感染動物的大腦和M^肉 組織中的Ad-36 DNA的凝膠。上方泳道是來自狨猴的大腦組織，下 方泳道力幾肉組織。來自受感染狨猴的Ad-36 DNA在泳道8-9中清楚
看到，在泳道7中較微弱看到。Ad-36 DNA在非感染狨猴的泳道4-6 中不存在。泳道2是來自Ad-36培養(yǎng)物的陽性對照。圖8是用巢式PCR測定法顯示人脂肪組織中的Ad-36 DNA的凝膠(下方泳道)。這個凝膠顯示了上方泳道中狨猴脂肪組織中 的Ad-36DNA(重復(fù)圖5的數(shù)據(jù)泳道4-6為對照狨猴陰性，泳道7-9 為受感染狨猴Ad-36 DNA)，下方泳道中，在獲自解剖尸體的人內(nèi)臟 脂肪組織的6個樣品中有2個樣品看到Ad-36 DNA (泳道2為陽性對 照，泳道6-7為Ad-36陽性，泳道4、 5、 8、 9為陰性)。圖9這個圖顯示了多種人腺病毒對小雞的總體脂肪的影 響。Ad-2和Ad-31沒有增加體脂肪，而Ad-37具有明顯的影響。圖10這個圖顯示了多種人腺病毒對小雞的內(nèi)臟脂肪的影 響。Ad-2和Ad-31沒有增加內(nèi)臟脂肪，而Ad-37具有明顯的影響。圖11這個圖顯示了暴露于多種人腺病毒的動物的食物攝 取量。各組在累計食物攝取量上沒有差異，但感染Ad-37的個體變得 肥胖，而感染Ad-2或Ad-31的個體則沒有肥胖。圖12這個表格顯示了人Ad-5在小鼠中產(chǎn)生肥胖癥。同時， 體脂肪增加至幾乎三倍。圖13這個表格顯示了抗人Ad-36的血清抗體在三個美國 城市人群中的存在。肥胖人中平均約30%感染了 Ad-36，而非肥胖人 中約11%感染了 Ad-36。圖14這個圖顯示了三個美國城市的502個人中根據(jù)Ad-36 的感染狀態(tài)的體重指數(shù)。總體上，受感染的人的BMI比未受感染的人 高出約9個單位(p乂OOOl)。肥胖組和非肥胖組的受感染個體都顯著地 比每組的未受感染個體要重。圖15這個表格顯示了 Ad-36感染情況不一致的多對雙胞 胎的比較。在89對雙胞胎中有26對不一致。雙胞胎中Ad-36感染者 比其未受感染的雙胞胎另 一方更重和更胖。圖16是顯示Ad-36 6NA在前列腺癌組織中的存在的凝 膠。圖17是顯示Ad-36 DNA在猴子中的存在的凝膠。
發(fā)明詳述應(yīng)認識到，本發(fā)明并不限于本文所述的具體方法、方案、 裝置、器械、材料和試劑等，因為這些東西可以變動。還應(yīng)認識到， 本文所用的方法是只出于描述具體實施方案的目的來使用，并不意在 限制本發(fā)明的范圍。必須指出的是，本文和所附權(quán)利要求書中用到的 單數(shù)形式的名詞包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此 例如提到"病毒顆粒，，時是提到一個或多個病毒顆粒及本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的其對等物，依此類推。本文用到的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語其含義與本發(fā)明所屬技 術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同，除非另有定義。描述了優(yōu)選的 方法、裝置和材料，不過任何類似于或等同于本文所述方法和材料的 方法和材料都可用于本發(fā)明的實施或試驗。本文引述的所有參考文獻 通過引用整體結(jié)合到本文中。本文所述的任何數(shù)值，倘若任何下方值和任何上方值之間 相隔至少兩個單位的話，包括從下方值到上方值以 一個單位遞增的所 有數(shù)值。舉例說，如果規(guī)定某成分的濃度或者某方法變量(如劑量、稀 釋等)的數(shù)值是例如1-90、具體的說20-80、更具體的說30-70，則認 為諸如15-85、 22-68、 43-51、 30-32等等的數(shù)值明確在本說明書中列 舉。對于小于l的數(shù)值， 一個單位酌情認為是0.0001、 0.001、 0.01或 0.1。這些僅僅是所專門規(guī)定的數(shù)值的一些實例，所列舉的下方值和上 方值之間的數(shù)值的所有可能組合都認為以類似的方式明確在本"i兌明 書中規(guī)定。此外，緊接的下文是"定義"部分，其中為清楚起見對某些 與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語進行了專門定義，但所有的定義都與技術(shù)人員對 這些術(shù)語的理解是一致的。描述了具體的方法、裝置和材料，不過任
何類似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料都可用于本發(fā)
明的實施或試驗。
定義 Ad-2指腺病毒2型 Ad-5指腺病毒5型 Ad-31指腺病毒31型 Ad-36指腺病毒36型 Ad-37指腺病毒37型 BMI指體重指凄t FAS指脂肪酸合成酶 PPAR指過氧物酶體增殖物激活受體 CEBP指CCAAT增強子結(jié)合蛋白本文所用的術(shù)語"生脂腺病毒，，一般指能夠刺激細胞、組織 和/或器官增加脂質(zhì)產(chǎn)生的腺病毒，刺激的方式是通過開啟受感染宿主 中的細胞機制，以啟動宿主的生脂酶的產(chǎn)生，然后生脂酶產(chǎn)生出過量 的脂肪酸和促進受感染細胞的脂肪儲藏。生脂腺病毒包括但不限于 Ad-5、 Ad-36和Ad-37。本文所用的術(shù)語"BMI"—般指按身高比例換算的人體重的 統(tǒng)計測度。BMI可定義為個體的體重除以身高的平方，可以以單位 kg/r^表示。BMI可用作篩選工具用來鑒別成人和兒童的可能體重問 題。但是，為了確定體重過量是否成健康風(fēng)險，醫(yī)療保健提供者可能 需要進行進一步的評估，如皮膚褶厚度測量、膳食評價、體育活動、 家族史、腰臀比、生脂腺病毒感染情況和其它適當(dāng)?shù)慕】岛Y選。對于 20歲及以上的成人，BMI可用對所有年齡和對男女兩性都適用的標準 體重狀態(tài)類別來解釋。而對于兒童和少年，BMI的解釋要分年齡和性 另'j。例如，(i) BMI小于約18.5%的成人可認為是體重不足，(ii) BMI 在約18.5至約24.9之間的成人可認為是正常體重，(m) BMI在約25 至約29.9之間的成人可認為是超重，而(iv)BMI大于約30.0的成人可
認為是肥胖。術(shù)語"腰臀比"指可用來幫助確定肥胖癥的測量值。脂肪的
分布是通過將腰圍除以臀圍進行評估。例如，腰圍大約30英寸和臀 圍大約40英寸的個體其腰臀比會為約0.75,腰圍大約41英寸和臀圍 大約39英寸的個體其腰臀比會為約1.05。腰臀比越高，心臟疾病和 其它肥胖癥相關(guān)疾病的風(fēng)險越高。"生物樣品"指人或動物的組織或體液的樣品及體外細胞培-養(yǎng)成分的樣品，所述組織或體液包括〗旦不限于血漿、血液、脊髓液、 淋巴液、皮膚外部部分、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、淚液、唾液、 血細胞、腫瘤、器官。"分離(的)"或"基本上純(的)"核酸(例如DNA、 RNA或混合 聚合物)(以核酸為例)，是基本上與天然伴隨著天然人或動物序列或蛋 白質(zhì)(例如核糖體、聚合酶、許多其它人或動物基因組序列和蛋白質(zhì)) 的其它細胞成分相分開的核酸。該術(shù)語涵蓋已從其天然環(huán)境取出的核 酸序列或蛋白質(zhì)，包括重組或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成的類似 物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。術(shù)語"免疫原性(的)，，一般指這樣的抗肥胖癥疫苗，它具有 在被免疫動物中引起免疫應(yīng)答的能力，該免疫應(yīng)答能產(chǎn)生抵抗在給予 該疫苗后可能會感染該被免疫動物的致肥胖癥活病毒的中和性抗體。術(shù)語"抗體"指抗體及其消化片段、指定部分和變體，包括 抗體模擬物或者包含有模擬抗體或其指定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功
能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。本發(fā)明涵蓋能夠結(jié)合生物分 子(如抗原或受體)的抗體和抗體片段，所述生物分子例如腺病毒(具體 的說是Ad-36)的纖維外殼蛋白或其部分。術(shù)語"核酸序列，，包括寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及它們 的片段，涉及可為單鏈或雙鏈的、基因組來源或合成來源的DNA或 RNA，代表有義鏈或反義鏈，涉及狀核酸(PNA)，或者涉及天然來源 或合成來源的〗壬何DNA樣或RNA拜材料。
片段包括異源肽或核列的任何部分。異源肽片段保 持受試者異源多肽的至少一個結(jié)構(gòu)或功能特性。核酸序列片段其長度 大于約60個核香酸，最優(yōu)選包括長度至少約100個核苷酸、至少約 1000個核普酸和至少約10,000個核苷酸的片段?；パa的或互補性本文所用的這兩個術(shù)語包括多核普酸在 允許的鹽和溫度條件下通過堿基配對發(fā)生的自然結(jié)合。例如，序列 "A-G-T"能結(jié)合互補序列"T-C-A"。兩個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的，，，即其中只有 一些核酸發(fā)生結(jié)合，或者當(dāng)兩個單鏈分子之間存在完全互補性時該互 補性可以是完全的。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間的雜交的 效率和強度具有顯著影響。這在取決于核酸鏈之間的結(jié)合的擴增反應(yīng) 中和在分子的設(shè)計和使用中特別重要。.功能等同物具有基本上類似于異源蛋白質(zhì)、多肽、酶或 核酸的功能或結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)或核酸分子。蛋白質(zhì)的功能等同物可 含有修飾，這取決于這種修飾對特定功能的執(zhí)行的必要性。術(shù)語"功能 等同物"意在包括分子的"片段"、"突變體"、"雜交體"、"變異體"、"類 似物"或"化學(xué)衍生物"。蛋白質(zhì)純化廣義上指任何根據(jù)電荷、分子量或結(jié)合親和 性使蛋白質(zhì)與其它成分或化合物相分離的過程?；旧霞兓谋疚乃玫倪@個術(shù)語包括這樣的核酸或氨 基列，它們從其天然環(huán)境取出:，處于分離的或隔離的狀態(tài)，至少 60%、優(yōu)選至少75%、最優(yōu)選至少90%不含與其天然結(jié)合在一起的其 它成分。抑制本文所用的這個術(shù)語指所測量的參數(shù)(不管是病毒36型生長還是存活力)的下降。這種下降的量是相對于標準(對照) 測量的。"下降，，在本文中定義為相對于對照減少至少25%左右，優(yōu)選 至少50%左右，最優(yōu)選至少75%左右。本發(fā)明的抗生脂腺病毒疫苗(其中免疫原性成分是活的、活病毒、殺死的病毒、外殼蛋白本身、含表位的外殼蛋白區(qū)段或者 用非致病性遺傳修飾載體病毒(如痘苗病毒或禽痘病毒)來提供的外殼 蛋白(或其含表位區(qū)段))，是用本領(lǐng)域公知的方法來制備。因此，疫苗 會包括本領(lǐng)域所公知的載體、賦形劑、佐劑、抗微生物劑、防腐劑等。 因此，除了活性成分外，疫苗還會具有合適的組合物，通常是含水纟爰 沖液如磷酸緩沖鹽水等(活性成分在該緩沖液中會任選地與人疫苗制 劑中所用的各種免疫系統(tǒng)刺激佐劑中的任何一種一起懸浮)、抗微生物 組合物和其它用以使制劑穩(wěn)定化的組合物。疫苗制劑中包括的所有組 合物要適于給予人類。疫苗制劑可以以凍干形式儲藏，在要給予時將 其與溶液進行組合。對于口服給藥，疫苗制劑可以為溶液劑、片劑或 丸劑形式，任選有腸溶衣，這是本領(lǐng)域知道的。活性的(免疫原性的或
ng至約1 mg/ml之間。本發(fā)明的抗生脂腺病毒疫苗要鼻內(nèi)給予、口服給予或者通 過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射給予。本發(fā)明疫苗的給予要在 醫(yī)師的指導(dǎo)下進行?？股俨《疽呙绲倪m當(dāng)給藥(dosing)是在執(zhí)業(yè)醫(yī)生的技 能范圍內(nèi)，它要取決于多個因素，包括所治療個體的年齡、該個體發(fā) 展保護性免疫的緊迫性、該個體的免疫系統(tǒng)的狀態(tài)和其它為技術(shù)認為 所熟知的因素。疫苗通常要分幾個步驟給予，以在被接種個體中引起 和維持對致肥胖癥病毒的保護性免疫。因此，在初次接種后，通常還 要有一次至大約十次加強接種，每次相隔約1個星期到IO年的時間。本發(fā)明抗肥胖癥疫苗的單劑量在溶液劑形式下會有約0.1 ml-10 ml的體積，在任何形式下會有約1 ng-10 mg的殺死或滅活生脂 病毒、約1 ng-10mg的遺傳修飾非致病性病毒或者約1 ng-10mg的外 殼蛋白(例如纖維蛋白)或6-30個氨基酸的肽(為經(jīng)修^飾具有免疫原性 的形式)。其中活性成分為核酸的本發(fā)明抗生脂腺病毒疫苗，也將是
該類疫苗的標準制劑。對于這類疫苗，核酸不具有免疫原性，^f旦它在 疫苗給予后在體內(nèi)被表達成肽或蛋白質(zhì)，后者則有免疫原性。這類疫 苗要通過本領(lǐng)域公知的針對這種疫苗的技術(shù)(例如肌肉內(nèi)注射)來給 予。給藥還要根據(jù)本領(lǐng)域公知的程序進行，以在被接種個體中引起和 維持對病毒性肥胖癥的保護性免疫。要注意的是，本發(fā)明的抗生脂腺病毒可包括基于超過一種 生脂病毒(或者外殼蛋白(例如纖維蛋白)或外殼蛋白的表位區(qū)段)的活 性成分。在又一個方面，本發(fā)明是在易感病毒的人中預(yù)防由病毒引 起的生脂腺病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給予該人一定量的能 有效引起和維持對生脂腺病毒的保護性免疫應(yīng)答的本發(fā)明抗生脂腺 病毒疫苗。本發(fā)明主要涉及人生脂腺病毒如Ad-5、 Ad-36和Ad-37的 感染與肥胖癥病因和細胞、組織和/或器官功能異常的之間的關(guān)系，所 述功能異常如癌癥、胰腺功能異常、骨骼肌和心血管肌肉功能異常、 肺功能異常、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及腎上腺疾病和功能異常。此 外，本發(fā)明涉及利用生脂腺病毒狀態(tài)作為疾病狀態(tài)、預(yù)后、治療結(jié)果 及感染和疾病的預(yù)防的預(yù)報因子(predictor)。生脂腺病毒相關(guān)疾病的主要機制是細胞當(dāng)中脂質(zhì)的產(chǎn)生。 生脂腺病毒能夠改變受感染受試者中的細胞機制，以啟動宿主的生脂 酶的產(chǎn)生。結(jié)果，生脂酶制造出過量的脂肪酸，促進脂肪在多個器官 的細胞當(dāng)中的儲藏。身體的很多細胞已知具有在其當(dāng)中制造脂肪酸的能力。脂 肪酸合成酶(FAS)是最重要的生脂酶之一，在許多的成人和胎兒細胞 中都有表達，這提示這些組織能夠產(chǎn)生脂肪酸。例如，F(xiàn)AS在成人細 胞中表達，這些成人細胞例如十二指腸和胃上皮細胞、造血細胞、闌 尾、消化道神經(jīng)節(jié)細胞、肝細胞、肥大細胞、精嚢、膀胱傘細胞、腎 上腺束狀帶細胞、脂肪細胞、前垂體細胞、小腦籃狀細胞、大腦皮層
神經(jīng)元、蛻膜、子宮內(nèi)膜蛻膜化基質(zhì)細胞(decidualized stromal cell)、 頂漿分泌腺上皮細胞、乳腺和前列腺和皮脂腺的導(dǎo)管和腺泡、黃體細 胞(letein cell)和肺II型肺泡細胞。另外，F(xiàn)AS還在胎兒細胞中表達，所述胎兒細另包如前垂體 細胞、氣管支氣管壁軟骨細胞、血管和心臟內(nèi)皮、支氣管上皮細胞、 食道胃腸道、肺、胰腺、前列腺、甲狀腺、舌、氣管、腎近端小管、 成纖維細胞、淋巴結(jié)淋巴細胞、腎上腺髓質(zhì)成神經(jīng)細胞、胸腺細胞、 舌橫紋肌細胞、唾腺和氣管支氣管腺上皮細胞、造血細胞、肝細胞、 絨毛膜絨毛Lanhans細胞、造骨細胞、纟#周成纖維細胞、交感神經(jīng)節(jié) 和歐氏神經(jīng)叢施旺細胞、腎上腺嚢下細胞、脂肪細胞、睪丸Leidig細 胞、肥大細胞、尿道尿路上皮和上層(upperlayer)腎上腺皮質(zhì)細胞。雖然脂肪酸對于許多生化過程的胞內(nèi)環(huán)境是至關(guān)重要的， 但細胞當(dāng)中的過量脂肪酸會深遠地改變細胞生物化學(xué)。細胞當(dāng)中過量 的脂肪酸可導(dǎo)致許多胞內(nèi)過程的異常功能行使。例如，胰腺組織中的 過量脂肪酸會降低胰島素分泌，癌細胞中的脂肪酸會給癌生長提供主 要的能量來源。此外，肺細胞當(dāng)中的脂肪酸會刺激巨噬細胞吸引到該 區(qū)域，并與哮喘和肺氣腫有關(guān)聯(lián)。因此，當(dāng)細胞暴露于過量的脂肪酸 時會出現(xiàn)不利結(jié)果。根據(jù)一個實施方案，生脂腺病毒可能是細胞和組織中產(chǎn)生 過量脂肪和甘油三酯的機制。研究證明，生脂腺病毒能改變脂肪組織 中和肝臟中的生脂酶。例如，其它研究已證實，生脂腺病毒Ad-36的 感染會刺激3T3-L1細胞中包括甘油-3-磷酸脫氫酶、PPAR-y、 CEBP-a 和P及脂蛋白脂肪酶在內(nèi)的分化因子的快速出現(xiàn)。由于多個組織會積 累生脂腺病毒DNA，過量的生脂酶可能會存在于能夠產(chǎn)生這些酶的所 有受感染組織中。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，可將生脂腺病毒感染用來 確定肥胖癥相關(guān)癌癥的存在。在又一個實施方案中，可將生脂腺病毒 感染用來確定受試者是否傾向于發(fā)展肥胖癥相關(guān)癌癥。在肥胖人群中多種類型的癌癥的流行率在增加。這些癌癥 包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌、 胰腺癌和肺癌。也可將肝細胞癌與肥胖癥和代謝綜合征關(guān)聯(lián)起來。另 外，可將肥胖癥與 一 些類型的癌癥的侵襲性和與較差的預(yù)后關(guān)聯(lián)起 來。例如，可將肥胖癥與較高級的前列腺癌和根治性前列腺切除術(shù)后 的較高復(fù)發(fā)率聯(lián)系起來。同樣，在非西班牙裔白種女性中，乳腺腫瘤 大小與肥胖癥有關(guān)聯(lián)。具體的說，這對于腰圍的最高四分位數(shù)(quartile) 來說最顯著，這種情況下的比值比(oddsration)為2.76。研究證實，脂肪酸是癌細胞中的能量消耗底物，阻斷FAS 能阻斷癌生長。此外，還證實FAS在許多肥胖癥相關(guān)癌癥中有增加， 且FAS有利于肺瘤生長。癌細胞中的生脂腺病毒感染可刺激細胞中的 脂肪酸，從而通過給癌細胞提供能源而促進癌生長。已在多種腫瘤中檢測到FAS表達，并將其與組織學(xué)亞型、 組織病理學(xué)等級和腫瘤侵襲性關(guān)聯(lián)起來。研究證明，F(xiàn)AS在人腫瘤如 乳腺、前列腺、卵巢、結(jié)腸直腸和子宮內(nèi)膜癌癥中高度表達。已確定 FAS (OA-519)是前列腺癌的預(yù)測因子。觀察到在99個受檢查的原發(fā) 性前列腺癌中有56個(57%)存在OA-519免疫反應(yīng)性。OA-519癌比非 OA-519癌更可能會發(fā)展。確實，在61%的人前列腺癌組織中證實了 Ad-36的存在， 且觀察到乳腺癌患者和前列腺癌患者分別有50%和51%具有抗Ad-36 抗體，而正常人群有13.8%的比例。因此，前列腺癌患者中有FAS在前列腺癌組織中的存在 的患者數(shù)與觀察到感染Ad-36的患者數(shù)大約相同，這一點結(jié)合生脂腺 病毒能增加細胞中的FAS和對FAS的抑制可抑制癌癥的這些發(fā)現(xiàn)， 提示生脂腺病毒的感染會在受試者中同時引起肥胖癥和肥胖癥相關(guān) 癌癥。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，Ad-36感染的流行率在乳腺 癌和前列腺癌患者中要比在無癌癥個體中統(tǒng)計學(xué)上更高。在又一個實
施方案中，Ad-36狀態(tài)可當(dāng)作乳腺癌和前列腺癌的標志。還又一個實 施方案涉及到在其組織中具有Ad-36 DNA的乳腺癌或前列腺癌患者 會比無Ad-36 DNA的患者具有更具侵襲性的癌癥和/或更差的預(yù)后。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，可將生脂腺病毒感染用作 疾病預(yù)后、治療預(yù)后的預(yù)測因子，或者用作肺瘤侵襲性的預(yù)測因子。 在乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌中，高水平的FAS往往與預(yù)后差有關(guān)系。 FAS表達與腫瘤大小或腫瘤細胞增殖活性標志之間的關(guān)系，可提示到 FAS與這些惡性腫瘤的生長和增殖有關(guān)。例如，研究已證實FAS的過量表達增加了大鼠的肝癌發(fā) 生。其它研究也已證實患早期乳腺癌的患者中有大約30。/。表達FAS。 表達FAS的乳腺癌患者具有顯著更高的胂瘤級別、更大的腫瘤體積、 進行中的臨床階段和Gleason分數(shù)(最強大的預(yù)測因子之一)。還在卵巢 腫瘤中研究了 FAS表達，發(fā)現(xiàn)該表達與組織學(xué)腫瘤級別和存活期較短 有關(guān)聯(lián)。此外，研究還證實超重和肥胖個體因各種類型的人類癌癥的 死亡率顯著提高。 FAS與結(jié)腸癌及其嚴重性有關(guān)聯(lián)。研究已證實43例有4氐 級別發(fā)育異常的腺瘤中只有2例(5。/。)顯示對FAS的反應(yīng)性。但是，在 40例有中等級別發(fā)育異常的腺瘤中有7例(17。/。)發(fā)現(xiàn)陽性FAS免疫染 色，在17例有高級別發(fā)育異常的腺瘤中有9例(53%)發(fā)現(xiàn)陽性FAS免 疫染色，在81。/。的腺癌中發(fā)現(xiàn)陽性FAS免疫染色(p0.0001)。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及針對受試者中的生脂腙^ 病毒感染的存在的診斷性篩選試驗。如果受試者生脂腺病毒試驗陽 性，癌細胞中的FAS表達可能發(fā)生提高，導(dǎo)致出現(xiàn)更具侵襲性的癌癥 和/或更差的預(yù)后。其它將Ad-36與癌癥相關(guān)聯(lián)的信息是聚合酶鏈式反 應(yīng)試驗(PCR)發(fā)現(xiàn)的肥胖癥相關(guān)癌癥(如前列腺癌)組織中Ad-36 DNA 的獨特序列。在18個前列腺癌組織樣品中有11個^f企測出Ad-36纖維 蛋白的DNA的獨特序列(這些序列在受讓人較早的美國專利6,664,050 和6,127,113中描述)。示例性的篩選技術(shù)在下文描述。
生脂腺病毒試驗會以兩種方式有用處。如果有乳腺腫塊或 前列腺肥大的受試者生脂腺病毒試驗陽性(通過例如陽性血清試驗或 陽性PCR組織試驗進行試驗)，則該受試者患上癌癥的風(fēng)險較高，應(yīng) 當(dāng)進行試驗以評估癌癥(例如活組織檢查)而不是"觀察等待"。相反， 如果受試者生脂腺病毒試驗陽性，則該受試者應(yīng)當(dāng)比Ad-36試驗陰性 受試者更頻繁地進4亍癌癥篩選。已用殺死的病毒在兔子中開發(fā)出抗Ad-36疫苗。兔血清含 有這樣的抗體，它進行了多達17次系列稀釋(原始濃度1:131,072稀釋) 還能防止組織培養(yǎng)物中的Ad-36生長。已知的是，只有有效的抗腺病 毒生長的抗體是靶向各種腺病毒(中和性病毒)的纖維蛋白的各區(qū)段。 Ad-36抗體不會與任何其它腺病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，因此Ad-36纖維蛋 白中的獨特DNA序列是這一特異性的原因所在。已在Ad-36纖維蛋 白中鑒定出三個為Ad-36所獨有的序列。使用本領(lǐng)域的標準技術(shù)，得 自這些序列的肽將可用來制備高度純化的疫苗，該疫苗應(yīng)當(dāng)具有最小 的變態(tài)反應(yīng)。該肽要與常用于疫苗以增強有效性的佐劑進行結(jié)合。這 些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個具體的實施方案中，可制備出抗生脂腺病毒如 Ad-36以預(yù)防癌癥的疫苗。由于生脂腺病毒與癌癥有關(guān)聯(lián)，抗生脂腺 病毒疫苗可用來預(yù)防癌癥。例如，可用纖維蛋白DNA中所含的獨特 DNA序列來制備肽可開發(fā)抗Ad-36疫苗。這個技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的。在又一個實施方案中，可執(zhí)行這樣一個新概念對所有生 脂腺病毒的纖維蛋白DNA進行測序，以測定它們的結(jié)構(gòu)。在測序后， 要用本領(lǐng)域常用的DNA比較數(shù)據(jù)庫對在許多或所有的纖維蛋白中存 在的DNA序列進行鑒定。這可通過例如采用GenBank鑒定Ad-36纖 維蛋白DNA中的獨特序列來實現(xiàn)。然后選出編碼約10-25個氨基酸 的肽的約30-75個石威基對的DNA序列。已知纖維蛋白的隆突部分(knob portion)中的肽是有效的，因此這些序列要進行檢查。鑒定后，將肽與
佐劑偶聯(lián)以制備出能防止任何人腺病毒的感染的疫苗。生脂腺病毒的 普通疫苗的有用性在于預(yù)防肥胖癥、癌癥和其它因生脂腺病毒所致的 人類疾病。例如，4艮大一部分的軍隊新兵在基礎(chǔ)訓(xùn)練過程中會感染腺 病毒。還有，出生后兩年發(fā)燒、感,冒、腹瀉或結(jié)膜炎相關(guān)的輕度疾病 中有許多是因腺病毒所致。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可將生脂腺病毒感染用作肥 胖癥和因肥胖癥并發(fā)癥所致的疾病的發(fā)展及影響體重的治療方案的 結(jié)果的預(yù)測因子。肥胖癥的并發(fā)癥可包括諸如糖尿病、高血壓、高脂 蛋白血癥、心臟病如動脈粥樣硬化疾病和充血性心臟衰竭、肺疾病如 睡眠呼吸中止癥和哮喘、腦血管意外、癌癥如乳腺癌、子宮癌、結(jié)腸 癌和前列腺癌、膽嚢膀胱疾病如結(jié)石和感染、懷孕過程中的血毒癥、 手術(shù)過程中的風(fēng)險、痛風(fēng)、生育能力下降、退化性關(guān)節(jié)炎和早死。本發(fā)明受讓人已證明，人Ad-36會在小鼠前脂肪細胞 (3T3-U細胞)(圖l)中和人前脂肪細胞中刺激脂肪儲藏和新脂肪細胞 形成。另夕卜，本發(fā)明受讓人在美國專利6，127，113和6,664,050 (通過引 用整體結(jié)合到本文中)中已證明，Ad-36感染與肥胖癥有關(guān)聯(lián)。例如， 在小雞中進行了四次實驗，在小鼠中進行了一次實驗，在猴子中進行 了兩次實驗，所有實驗都證實Ad-36感染增加了體脂肪和降低了血清 膽固醇和甘油三酯。最顯著的是，小雞、小鼠和大鼠在感染組和對照 組之間沒有測量到食物攝取上的差異，表明能量消耗是不同的。Ad-36 的機制對脂肪細胞增加生脂酶和分化因子具有直接影響。感染Ad-36 的細胞在第5天顯示儲藏的甘油三酯量的約兩倍高。還對生脂腺病毒Ad-36進行了大量的研究。自發(fā)感染 Ad-36的獼猴在感染后18個月顯示顯著的體重增加(圖2)。也使狨猴 (marmoset)感染上Ad-36,與未受感染的狨猴相比，在受感染的狨猴中 觀察到四倍體重增加(圖3)。此外，在感染后體脂肪增加約70%，血 清膽固醇下降約35 mg/dl (圖4)。值得注意的是，AdJ6DNA在初次 感染后7個月在猴子的多個組織(如大腦、肝臟、肺、肌肉和脂肪細胞 組織)中觀察到，在兩個月后不再能夠從受感染猴子的血液或糞便生長
出病毒(圖5-7)。由圖8可見，在人月旨肪細胞組織中也觀察到了 Ad-36 DNA。其它的研究已證明Ad-37在小雞中引起肥胖癥，但Ad-2 和Ad-31則沒有引起(圖9-11)。在所研究的各組中累積食物攝取并沒 有差異。此外，研究還證明Ad-5在小鼠中引起肥胖癥(圖12)。這些 研究證實，生脂酶的刺激和肥胖癥并不是所有腺病毒感染的非特異性 效果，但多種腺病毒可能是這樣。本發(fā)明的另 一個實施方案包括使用生脂細胞來預(yù)測糖尿 病和其它胰腺功能異常。另外，另一個實施方案涉及到可預(yù)防胰腺疾 病(包括一些糖尿病病例)的抗腺病毒疫苗。胰島卩細胞能制造脂質(zhì)，(3細胞中的脂質(zhì)代謝對于胰島素 分泌的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的。與脂質(zhì)合成或氧化有關(guān)的酶會造成所產(chǎn)生 和分泌的胰島素的量下降。研究已證明卩細胞中SREBP-1的過量表達 會降低胰島素合成。SREBP-1是FAS的直接前體，已發(fā)現(xiàn)它因肝細 胞中體外或體內(nèi)腺病毒感染而增加。其它研究已證明，結(jié)合脂肪酸合 酶基因和L型丙酮酸激酶基因的碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白 (ChREBP)受胰腺卩細胞中的葡萄糖的刺激。P細胞中較高的肉堿棕櫚 酰轉(zhuǎn)移酶I (CPT I)蛋白水平會造成響應(yīng)葡萄糖的胰島素分泌的下降。 生脂腺病毒可能會引起糖尿病，因為它們會增加肥胖癥和產(chǎn)生胰島素 抗性，但胰腺病毒感染所致的生脂"的改變也可能起到作用。本發(fā)明的另 一 個實施方案涉及使用生脂腺病毒狀態(tài)來預(yù) 測肝臟疾病、肝硬化和其它肝臟功能異常。同樣，抗腺病毒疫苗也可 用來預(yù)防生脂腺病毒所致的肝臟疾病。肥胖癥與肝臟疾病有關(guān)。肝臟疾病加肥胖癥的病譜是乂人肝 臟的脂肪浸潤開始，發(fā)展到脂肪性肝炎(非酒精性脂肪性肝炎-NASH)，有相當(dāng)一部分NASH患者繼續(xù)發(fā)展隱源性肝硬化。肝臟脂肪 浸潤的頻率和嚴重程度隨著體重的增加而上升，在大多數(shù)病態(tài)肥胖癥
患者中存在。已報道在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中有約30%至約 100°/。的病例存在肥胖癥。其它研究已證明，患嚴重肥胖癥的受試者中， 有超過約95%具有不同程度的肝臟脂肪浸潤，約65%有NASH。生脂腺病毒會使生脂酶水平提高，造成肝臟脂肪積累。 前面提到，肝臟脂肪浸潤可導(dǎo)致肝硬化。肝臟脂肪浸潤有許多原因， 對肝臟的額外傷害會增加肝硬化發(fā)生的機會。具有肝臟疾病危險因素 或者肝臟功能試驗異常的個體應(yīng)當(dāng)進行生脂腺病毒試驗，因為他們可 能需要特別的關(guān)注以防止脂肪肝發(fā)展成肝硬化?？股俨《疽呙缈?減少或預(yù)防許多脂肪肝和肝硬化病例。本發(fā)明的又一個實施方案包括使用生脂腺病毒來預(yù)測肌 肉功能異常。同樣，抗腺病毒疫苗可用來預(yù)防肌肉功能異常。已知肌肉有生脂酶存在，能儲藏胞內(nèi)脂質(zhì)。肥胖癥與肌 肉內(nèi)脂質(zhì)的異常脂質(zhì)代謝和積累有關(guān)。研究已證實硬脂?；?CoA去 飽和酶1 (SCD1)基因這一種生脂基因在極端肥胖者的骨骼肌中被上 調(diào)。高肌肉內(nèi)脂肪與肥胖人群中的肌肉功能低下有關(guān)，且與胰島素抗
性和糖尿病有關(guān)。其它研究已證實，胰島素抗性和n型糖尿病是由不 適合進行脂肪儲藏的組織(如骨骼肌和肝臟)中發(fā)生脂質(zhì)積累所致。
FFAs刺激了神經(jīng)酰胺和鞘氨酸這兩種之前證明能抑制胰島素作用的 鞘脂的從頭合成。不能夠從脂肪轉(zhuǎn)為葡萄糖作為主要能源可能與胰島 素抗性、代謝調(diào)節(jié)異常和心血管風(fēng)險有關(guān)。由于已證實瘦蛋白在感染 Ad-36的脂肪細胞中下降，這可能會產(chǎn)生胰島素抗性。肥胖人抱怨說鍛煉時會疼痛。其原因未明，但肥胖個體 具有更多的肌肉內(nèi)脂質(zhì)和較低的鍛煉能力。肌肉內(nèi)脂質(zhì)會改變骨骼肌 的底物利用。由生脂腺病毒所致的肌肉內(nèi)脂質(zhì)增加會限制鍛煉能力， 增加疼痛和改變底物利用。這在表演或耐力用動物如賽馬或賽狗中會 特別重要。感染生脂腺病毒的動物(或人)可能不能夠達到與未感染者 同樣好的表現(xiàn)，因此生脂腺病毒試驗可用作表現(xiàn)質(zhì)量的預(yù)測因子。最后，心臟肌肉中肌肉內(nèi)脂質(zhì)的增加會改變心臟功能，
引起心肌病和充血性心力衰竭。研究已證實，心臟肌肉當(dāng)中過量脂肪 酸和甘油三酯的積累與心臟胰島素抗性和心功能不全有關(guān)。本發(fā)明的又一個實施方案涉及使用生脂腺病毒狀態(tài)來預(yù) 測肺功能異常。同樣，抗腺病毒疫苗將會預(yù)防肺功能異常。多年來已知道肥胖癥與肺部疾病如譯喘和肺氣腫有關(guān)。 這一關(guān)系的機制未明。已知肺能產(chǎn)生FAS和合成脂質(zhì)。因此，可將生 脂腺病毒能引起肺部疾病的這一發(fā)現(xiàn)與腺病毒所致的肺中FAS的產(chǎn) 生關(guān)聯(lián)起來。研究表明，Ad-5感染會使豚鼠肺中的巨噬細胞數(shù)量加倍。 吸煙加Ad-5會使巨噬細胞的數(shù)量增至四倍。在哮喘和肺氣腫患者中 存在潛在的病毒感染，肺中的Ad-5 E1A蛋白與哞喘和肺氣腫患者中 的炎癥相關(guān)。本發(fā)明的一個實施方案涉及使用生脂腺病毒狀態(tài)來預(yù)測 大腦和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。同樣，抗腺病毒疫苗可用來預(yù)防大腦和神 經(jīng)系統(tǒng)功能異常。生脂病毒會感染大腦組織。神經(jīng)和大腦能產(chǎn)生FAS是眾 所周知的。肥胖癥與包括認知機能減低和阿爾茲海默病在內(nèi)的不利神 經(jīng)認知后果有關(guān)聯(lián)。研究已證明，BMI與所有認知試驗的成績呈逆相 關(guān)，而沒有證據(jù)表明BMI與年齡的相互關(guān)系。在肥胖癥中阿爾茲海默 病的流行率增加。A(342這一類在阿爾茲海默病患者中沉積的淀粉樣 蛋白與BMI相關(guān)。肥胖人出現(xiàn)癡呆的機會可能要高出約74%。其它 研究已證明，已在基因療法中使用的Ad-5載體會引起大腦炎癥。已 報道野生型Ad-5能引起肥胖癥，我們已注意到，用于基因轉(zhuǎn)移的Ad-5 載體保持其刺激肝細胞中的SREBP-I和FAS合成的能力。因此，這 些數(shù)據(jù)支持了這樣的觀念，即生脂腺病毒會增加大腦和神經(jīng)中的生脂 酶，產(chǎn)生過量的脂肪酸和甘油三酯，導(dǎo)致功能異常。本發(fā)明的一個方面是，可用生脂腺病毒試驗來預(yù)測腎上 腺功能異常。同樣，抗腺病毒疫苗可用來預(yù)防腎上腺功能異常。肥胖癥已知會顯箸影響腎上腺功能。醛甾酮的分泌增力口，
但沒有可能與高血壓有關(guān)的腎素。研究已證明肥胖婦女的腎上腺功能 不正常，但腹部脂肪分布不同。腎上腺激素采用膽固醇作為產(chǎn)生底物， 且由于胞內(nèi)脂肪酸和膽固醇代謝中生脂腺病毒的變化，可使用生脂腺 病毒試驗作為腎上腺功能異常的預(yù)測因子。示例性的篩選免疫分析技術(shù)包括但不限于本領(lǐng)域公知的 標準病毒中和測定技術(shù)或酶免疫測定技術(shù)。用以產(chǎn)生和純化抗這些病 毒或其片段(例如纖維蛋白或其片段)的抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的， 或者可通過常規(guī)技術(shù)從這些病毒制備用于這些免疫測定技術(shù)的蛋白 質(zhì)(或其片段)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，抗體會與溶液中的 腺病毒或腺病毒蛋白發(fā)生免疫沉淀，還會在蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡或 聚丙烯酰胺凝膠上與這些蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。在另一個具體的實施方案 中，使用免疫細胞化學(xué)技術(shù)，抗體會檢測出冷凍組織切片中的腺病毒 或腺病毒蛋白的存在。涉及到檢測腺病毒或腺病毒蛋白的方法的具體
實施方案，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免 疫放射測定(IRMA)和免疫酶測定(IEMA),后者包括使用單克隆和/或 多克隆抗體的夾心測定。同樣，用于本發(fā)明這些方法的核酸探針雜交測定技術(shù)將 是標準的技術(shù)(任選在對從血液、其它體液、糞便、組織或器官的樣品 提取的DNA或RNA進行擴增后)，該標準技術(shù)使用由所鑒定的致肥 胖癥病毒得出的和由本發(fā)明得出的核酸4笨針(和引物，如果采用擴增的 話)。 一旦按常規(guī)分離出這些病毒，可通過標準技術(shù)測定這些病毒的特 征性核酸的序列，而對這些病毒有特異性的、為可用于針對這些病毒 的基于核酸的測定的核酸探針和？ 1物提供基礎(chǔ)的探針和引物，根據(jù)這 些序列用常規(guī)技術(shù)進行制備。例如，為了檢測使人容易得肥胖癥的腺病毒的存在，制 備生物樣品如血液并分析是否存在腺病毒蛋白如Ad-36纖維外殼蛋白 序列。將這些試驗的結(jié)果和解釋信息返回醫(yī)療保健提供者，以與受試 個人進行溝通。這種診斷可由診斷實驗室進行，或者可制造診斷試劑
盒并出售給醫(yī)療保健提供者或給個人進行自我診斷。在開始，篩選涉及相關(guān)的腺病毒序列的擴增。在本發(fā)明 的一個具體實施方案中，篩選方法涉及到非基于PCR的策略。這種篩
選方法包括本領(lǐng)域公知的兩步標記擴增方法。基于PCR和非基于PCR
的篩選策略都能以高靈壽文度水平4企測靶標序列。本發(fā)明的一個實施方案涉及靶標擴增。在這里，耙標核 酸序列用聚合酶進行擴增。使用聚合酶驅(qū)動的擴增的一個具體方法是 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。聚合酶鏈式反應(yīng)和其它聚合酶驅(qū)動的擴增測 定，通過使用聚合酶驅(qū)動的擴增循環(huán)，能實現(xiàn)拷貝數(shù)增加超過100萬 倍。 一旦擴增，所得的核酸可進行測序或者用作DNA探針的底物。當(dāng)將探針用于檢測靶標序列的存在時，如需要提取核酸， 可將待分析的生物樣品如血液或血清加以處理。樣品核酸可通過多種 方式進行制備以促進靶標序列的檢測，所述方式例如變性、限制酶切 消化、電泳或斑點印跡法。核酸分析物的被耙向區(qū)域通常必須至少部 分上是單鏈的，以與探針的靶向序列形成雜交體。如果序列天然是單 鏈的，則將不需要進行變性。但是，如果序列是雙鏈的，則序列將可 能需要進行變性。變性可通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)進行。將核酸分析物和探針在能促進分析物中的靶標序列形成 穩(wěn)定雜交體的條件下進行溫育?？墒固结樦杏脕砼c分析物結(jié)合的區(qū)域 與目的腺病毒被靶向區(qū)域完全互補，該區(qū)域具體的說是纖維外殼蛋 白。因此，宜采取高嚴格條件以防止假陽性。但是，只有當(dāng)探針與腺 病毒的區(qū)域互補時才使用高嚴格條件。雜交的嚴格性由雜交過程中和 洗滌程序中的許多因素決定，這些因素包括溫度、離子強度、堿基組 成、探針長度和曱酰胺濃度。所得的雜交體如果要進行檢測的話，通常是用標記探針 來完成。不過探針也可以是未標記的，^旦它可通過與直接或間接標記 的配體的特異性結(jié)合而可3皮檢測出。合適的標記及標記探針和配體的 方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如放射性標記(其可通過公知的方法如切
口平移、隨機引物法(priming)或激發(fā)法(kinasing)來摻入)、生物素、焚 光基團、化學(xué)發(fā)光基團(例如二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體、金納米顆粒 等。這個基本方案的各種變化方案;是本領(lǐng)域公知的，包括能促進待檢 測雜交體與外部物質(zhì)的分離和/或能從標記部分擴大信號的變化方案。
上文提到，本發(fā)明還設(shè)想到非基于PCR的篩選測定。這 個程序能使核酸探針(或者是例如膦酸甲酯骨架替代正常的磷酸二酯 的類似物)與低水平的DNA靶標雜交。這個探針可共價連接有酶，而 該共價連^t不會干擾雜交的特異性。然后可將酶-探針-綴合物-靶標核 酸復(fù)合物與游離的探針綴合物分離，加入底物進行酶4企測。酶促活性 以導(dǎo)致靈敏度增加約103至約106的顯色或發(fā)光輸出上的變化的形式 進行觀察。兩步標記擴增方法是本領(lǐng)域Z^知的。這些測定法的工作 原理在于將小配體(如地高辛配基(digioexigenin)、生物素等)與能夠特 異性結(jié)合目的腺病毒序列區(qū)域的核S交探針連接。在一個實例中，與核 酸探針連接的小配體被抗體-酶綴合物特異性識別。在這個實例的一個 實施方案中，將地高辛配基與核酸探針連接。雜交是通過能轉(zhuǎn)化化學(xué) 發(fā)光底物的抗體-堿性磷酸酶綴合物來檢測。在第二個實例中，小配體 被能夠與第一配體特異性復(fù)合的第二配體-酶綴合物識別。這個實施例 的一個公知實施方案是生物素-親和素類型的相互作用。在本發(fā)明的范圍當(dāng)中還設(shè)想到，本發(fā)明的核酸探針測定 會采用到能夠檢測各種腺病毒種類的核酸探針混合物(cocktail)。因此， 在例如檢測生物樣品中的Ad-36、 ad-37和/或ad-5的一個實例中，可 采用一個以上的與各種類型腺病毒的目的被靶向區(qū)域互補的探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道，可在供按照本發(fā)明試驗病毒的 基于免疫學(xué)或核酸的測定方法中，-同時試驗一個以上的致肥胖癥病毒 毒林，可裝配出試劑盒供對特定的病毒或多種病毒執(zhí)行所述方法。上文已結(jié)合代表性的實施方案對本發(fā)明作了廣泛公開和 說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可不偏離本發(fā)明的精神和范圍，對
本發(fā)明作出各種修改方案。我們認為本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用前面的描述 內(nèi)容，不用做更多的努力，就能將本發(fā)明應(yīng)用到極至。以下實施例只 是說明性的，并不以任何方式限制本公開內(nèi)容的剩余部分。
實施例
具體實施例1:從美國威斯康星州Madison市、佛羅里達州Naples市和 紐約州紐約市這三個城市的不同人群中選出502人抽耳^ik液樣品，測 定樣品的Ad-36感染情況。肥胖癥的定義是BMI大于約30kg/m2，將 這些人分成肥胖受試者和非肥胖受試者。Ad-36抗體在肥胖受試者血 清中的流行率為約30%,在非肥胖受試者中為約11% (即3:1的比例) (圖13)。當(dāng)將受試者分成抗體陽性者和抗體陰性者時，觀察到抗 體陽性者重出約9個BMI單位(即大于約S0磅)(p《001)(圖l4)。此外，抗體陽性者中血清膽固醇和甘油三酯較低(小于約 -3 5 mg/dl， p<.001)，與在預(yù)期受感染的猴子中觀察到的下降正好相同。 抗Ad-2或Ad-31抗體與人體中身體組成或者血清膽固醇和甘油三酯 之間沒有相關(guān)性，這暗示Ad-36的作用是特異性的，并不是所有的人 腺病毒共有的。在28對AcW6抗體不一致的雙胞胎中進行另一個研究。 通常雙胞胎的體重和BMI非常接近，但雙胞胎中Ad-36抗體陽性者比 其Ad-36抗體陰性的雙胞胎另一方更胖(p〈04)(圖15)。總之，這些發(fā)現(xiàn)顯示Ad-36會在動物和人類中引起月巴胖癥。
具體實施例2:在威斯康星大學(xué)(University of Wisconsin)進行的研究得 出了 Ad-36與癌癥的關(guān)系的才及有力證據(jù)。獲得了 128個乳&泉癌受試者 和37個前列腺癌受試者的入庫血清(banked serum),用血清中和測定 法測定Ad-36抗體。觀察到51%的前列腺癌患者和50%的乳腺癌患者 呈Ad-36抗體陽性。但是，由于樣品是匿名的，沒有有關(guān)肥胖癥、癌 癥類型或階段或者是否存在轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)。由肥胖個體和非肥胖個體的 Ad-36抗體數(shù)據(jù)估計出， 一般人群中約有14%的人有Ad-36抗體。因 此，在乳腺癌患者和前列腺癌患者中Ad-36抗體的流行率幾乎是增至 四倍。
具體實施例3:獲得了 18個患者的前列腺癌組織，用針對Ad-36纖維蛋 白基因組中的獨特DNA序列制備的引物，通過巢式聚合酶鏈式反應(yīng) 測定法(PCR)測定Ad-36 DNA。 18個人中有11個或者有61%在癌組 織中有Ad-36 DNA。圖16顯示的PCR凝膠證明了前列腺癌組織中 Ad-36DNA的存在。前面提到，用從Ad-36纖維蛋白基因組中的獨特 DNA序列制備的引物進行巢式PCR，發(fā)現(xiàn)在實驗動物的多個組織中 有Ad-36DNA，特別是在脂肪組織中。圖17顯示從感染Ad-36的猴 子的脂肪組織提取的DNA的PCR凝膠。所有三只受感染猴子都有病 毒DNA存在，但對照組一個都沒有。
具體實施例4:這個實施例顯示Ad-36實驗室試驗作為鑒定有癌癥發(fā)展 風(fēng)險的個體的標志的用途?；加邪┌Y的人其陽性Ad-36實驗室試驗的 流行率要比非癌癥患者高的多。我們試驗了 128個乳腺癌婦女和37 個前列腺癌男人，并將結(jié)果與502個非癌癥患者進行比較。在總共165 個癌癥患者中，有83個(50%)呈Ad-36試驗陽性(50。/。的乳腺癌患者和 51%的前列腺癌患者)。基于肥胖癥在美國人群中的流行率，該502個 非癌癥受試者的數(shù)據(jù)顯示17%的非癌癥受試者呈Ad-36試驗陽性。如 果只考慮來自威斯康星州的非癌癥受試者(由于所有的癌癥患者都來
自威斯康星州，這樣比較更好)，14%的非癌癥受試者呈Ad-36試驗陽 性。因此，癌癥患者與非癌癥患者相比陽性率增加至幾乎4倍。
具體實施例5:獲得了在威斯康星大學(xué)醫(yī)院(University of Wisconsin Hospital)進行尸體解剖的9個人的脂肪組織，并進行Ad-36 DNA測定。 9人中有7人在脂肪組織中有Ad-36 DNA。這些數(shù)據(jù)證明，Ad-36 DNA 可從人或動物脂肪組織分離，且更童要的是，Ad-36 DNA在組織中的 存在是Ad-36感染后的標志。由于Ad-36 DNA出現(xiàn)在受感染動物的 多個組織中，似乎可確知，初始的病毒血癥導(dǎo)致身體大部分組織受到 感染。因此，如在以下具體實施例6中所述的方法一節(jié)中所述，可A人 患者獲得癌組織或癌的脂肪組織，以測試Ad-36 DNA的存在。
具體實施例6:測定癌癥患者和非癌癥患者的乳腺和前列腺組織的樣品 中的Ad-36 DNA,以確定Ad-36感染的流行率在癌癥患者中是否較高。 Ad-36狀態(tài)可與癌癥的存在關(guān)聯(lián)起來，且可與癌癥的階段、轉(zhuǎn)移的存 在和癌癥受害者的預(yù)后關(guān)聯(lián)起來?？笰d-36疫苗可預(yù)防Ad-36誘導(dǎo)的 癌癥。 實驗設(shè)計從NCI資源庫、NCI Cooperative Human Tissue Network (CHTN)和NCI Cooperative Breast Cancer Tissue Resource (CBCTR)獲 得匿名的組織樣品和完全的醫(yī)療信息。樣品通過如下所述的巢式PCR 測定法進行Ad-36 DNA測定?；蛘?，如果DNA樣品沒有得到，可進 行定購。如果DNA沒有從樣品進行提取，它可如下所述進行。為評估乳&,癌，將100個癌癥婦女的乳^_癌組織或乳腙_ 附近的脂肪組織的樣品與50個進行乳腺手術(shù)但沒有癌癥的婦女的乳 腺組織或脂肪組織進行比較。前文提到，如果乳腺癌組織沒有得到，
乳腺附近的脂肪組織是可接受的。實際的乳腺組織并不是關(guān)4定的，因
為Ad-36 DNA在感染后出現(xiàn)在所有的組織中，因此脂肪組織是適合 的。為評估前列腺癌，將100個男人的前列腺癌樣品與進行 良性前列腺肥大(BPH)手術(shù)的男人的前列腺組織進行比較。前述兩個NCI組織庫都有如下信息年齡、女性患者的 絕經(jīng)狀態(tài)、身高、體重、乳腺癌或前列腺癌的家族史、癌癥的類型和 階段、轉(zhuǎn)移的存在及存活時間(在一些情況中)。由于與肥胖癥有關(guān)的 乳腺癌在絕經(jīng)后婦女中更加流行，因此對非癌癥受試者盡可能進行年 齡上的匹配?？梢灶A(yù)期，我們從中獲得樣品的前列腺癌患者將會在較 大年齡組(>50歲)中，因為這是前列腺癌和BPH發(fā)生的人群。很不可 能的是我們會從小兒科患者獲得任何組織，因為他們極少發(fā)生乳腺癌 和前列腺癌。實驗室技術(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道，這個方案所需的 程序在醫(yī)療文獻中有公布。以下給出每個程序的簡述 Ad-36的培養(yǎng)使用A549人支氣管癌細胞，如前所述在 組織培養(yǎng)物中生長病毒制品。A549細胞獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC, Rockville， MD)。使用極限必需培養(yǎng)基Eagle (MEM)(目錄號 M-0643, Sigma Chemicals)加非必需氨基酸、Earle鹽和L-谷氨酰胺來 生長A549細胞。工作原種(worR stock)是用MEM加10。/。胎牛血清(FBS) 和2.9% NaHC03 (v/v) pH 7.4下在A549中生長。空斑形成單位測定Ad-36病毒的滴度是用A549細胞 通過這個測定法來測定。從100 (il的病毒懸浮液和900 ul的培養(yǎng)基開 始，進行系列IO倍稀釋。使A549細胞在6孔板中生長至鋪滿，每個 稀釋使用3個孔。有3個孔用作空白對照，不感染病毒懸浮液。除去 每個孔中的培養(yǎng)基，用移液管將100ul的系列稀釋病毒懸浮液移取到 各孔中。將各板在37。C下溫育，每隔15分鐘輕輕加以振搖。溫育1 小時后，除去各孔中的病毒懸浮液并棄去。將各個孔每孔覆蓋上約3 ml
的含1%瓊脂的培養(yǎng)基，力P lx抗生素-抗真菌素溶液。將各板倒置于
37。C下溫育8天，直到出現(xiàn)空斑。8天后，將各個孔用每孔約lml的 結(jié)晶紫染色過夜。第二天除去瓊脂后，計數(shù)所形成的空斑的數(shù)量。所 形成的空斑的數(shù)量乘以所用的病毒懸浮液的稀釋度得出所用的接種 物的PFU/100 uL。 PFU/100 uL乘以10則表示PFU/mL。組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)(66-72》計算出在50%的含 A549細胞的孔中引起致細胞病變效應(yīng)(CPE)的工作原種的滴度，以組 織培養(yǎng)感染劑量(TCID-50)單位/ml表示。工作原種的TCID-50是用 病毒工作原種的系列十倍稀釋液進行測定。TCID50是這樣計算系 列稀釋病毒儲備溶液(stock solution),用各稀釋液接種細胞，找出在 50%的被接種細胞中引起致細胞病變效應(yīng)(CPE)的病毒最高稀釋度的 倒數(shù)。滴度是在接種了病毒稀釋液的細胞在37。C下溫育8天后進行計 算。巢式PCR測定巢式PCR能檢測生物樣品中的Ad-36 DNA。如前所述，設(shè)計了四個針對Ad-36纖維蛋白基因的獨特區(qū)域的 引物，供用于巢式PCR測定來檢測病毒DNA。各引物的序列
外側(cè)正向引物(5'-GTCTGGAAAACTGAGTGTGGATA) (SEQ ID No: 1)、
外側(cè)反向引物(5=- ATCCAAAATCAAATGTAATAGAGT) (SEQ IDNo:2)、
內(nèi)側(cè)正向引物(5-畫TTAACTGGAAAAGGAATAGGTA) (SEQ ID No. 3)、
內(nèi)側(cè)反向引物(5; GGTGTTGTTGGTTGGCTTAGGATA) (SEQ ID No. 4)。 DNA是用QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA;目錄號29304)從人乳腺組織和前列腺組織分離。陰性PCR對 照是水和來自A549細胞的DNA。陽性PCR對照是來自感染Ad-36 的A549細胞的DNA。將DNA在95。C下變性2分鐘，進行35個循
環(huán)的PCR (94°C 1分鐘，55° C 1分鐘，72°C 2分鐘)，然后在72。C下 溫育5分鐘。將PCR產(chǎn)物在帶大小標志的1%瓊脂糖凝膠上進行顯現(xiàn)。這個測定是在威斯康星大學(xué)開發(fā)的，在當(dāng)時優(yōu)化了由動 物和人組織組成的和由3T3-L1細胞組成的樣品中的溫度、鎂濃度和 循環(huán)次數(shù)的條件。將PCR產(chǎn)物的樣品從凝膠提取出來，送到威斯康星 大學(xué)生物技術(shù)中心(BiotechCenter)進行測序，以確保擴增的DNA序列 是來自被靶向的區(qū)域。生物技術(shù)中心確認了他們的準確性。重復(fù)了這 些質(zhì)量控制程序，以符合CLIA規(guī)范和良好實驗室規(guī)范。對一個乳腙^ 癌樣品和一個前列腺癌樣品這兩個陽性樣品及A549陽性對照DNA樣 品進行DNA測序，以確保擴增的準確性。統(tǒng)計學(xué)分析和功效計算(Power calculation): 從弗吉尼亞 聯(lián)邦大學(xué)(Virginia Commonwealth, University)的統(tǒng)計學(xué)和運籌學(xué)研究 系(Department of Statistical Sciences and Operations Research)獲得統(tǒng)計 學(xué)方面的幫助。功效計算功效分析是用一般人群與威斯康星州Madison 市癌癥患者的Ad-36抗體流行率的初步數(shù)據(jù)進行的。證實威斯康星大 學(xué)醫(yī)院的乳腺癌患者和前列腺癌患者中分別有50%和51%具有抗 Ad-36抗體。在來自 一般人群和威斯康星大學(xué)肥胖癥治療計劃(Obesity Treatment Program)的志愿者的樣品中，評估了 247個受試者，其中 183個肥胖，64個非肥胖。Ad-36抗體的流行率分別為20%和11%。 CDC數(shù)字顯示，成年美國人中大約31%肥胖，69。/。非肥胖。用這些數(shù) 字估算到Ad-36抗體在威斯康星州Madison市一般人群中的流行率為 13.8%。因此，Ad-36在癌癥患者中的流行率幾乎是高至四倍。使用這 些數(shù)字進行的功效計算揭示，每組需要32個受試者來實現(xiàn)在0.05水 平下的80%功效，以確定癌癥患者與非癌癥患者的Ad-36流行率差異。 根據(jù)初步數(shù)據(jù)，乳腺癌患者和前列腺癌患者中都有約50%可預(yù)期是 Ad-36抗體陽性。但是，有可能在來自NCI組織庫(或Asterand組織 庫)的入庫樣品中Ad-36流行率會較低，而這會顯著影響功效。因此，100個癌癥受試者和50個非癌癥受試者可以確信具有足夠的功效。統(tǒng)計學(xué)分析可使用卡方分析來確定癌癥受試者中的 Ad-36 DNA流行率是否大于非癌癥受試者。受試者的數(shù)量對于多元回 歸分析而言是相對較少的，我們不預(yù)期看到顯著的相關(guān)性，除非效果 是強大的。
具體實施例7: 實施例8將Ad-36基因組的cDNA序列對照所有已知的cDNA序 列進行篩選，發(fā)現(xiàn)了兩個25堿基序列和一個28堿基序列，它們都位 于Ad-36所獨有的纖維編碼序列中。這三個序列如下 SEQ ID NO: 5:
5'國AGTTGAAACAGCAAGAGACTCAAAG SEQ ID NO: 6 5'-GGTACTGGATCAAGTGCACATGGAG SEQ ID NO: 7 5
'-TTGAAACAGCAAGAGACTCAAAGCTAAC將以上序列3在對從四只小雞分離的DNA進行的常規(guī)核 酸探針雜交測定中用作Ad-36的探針，該四只小雞中兩只感染了病毒 而變得肥胖，兩只沒有受感染而不肥胖。只在來自兩只受感染小雞的 DNA中觀察到與探針雜交的DNA。該測定涉及到直接檢測，是用激 光誘導(dǎo)熒光進行毛細管電泳來檢測。更具體的說，在電泳分離和#:測 中采用了可更換的聚丙烯酰胺基質(zhì)，采用雙系統(tǒng)，對緩沖液系統(tǒng)中的 oligo和p塞唑橙嵌入劑進行5'標記。技術(shù)人員會知道，為提供合適的特異性和靈敏度，可有 利地采用長度約15-30個堿基的探針和引物(當(dāng)還使用到擴增時)?？?以采用使用PCR的擴增方法及其變種方法，這同樣是本領(lǐng)域公知的。以上給出的實施例僅僅是示例性的，并不意在作為本發(fā) 明的所有可能實施方案、應(yīng)用方案或修改方案的詳盡目錄。因此，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可不偏離本發(fā)明的范圍和精神，容易想到所描述的本發(fā)
明方法和系統(tǒng)的各種修改方案和變化方案。雖然已結(jié)合具體的實施方 案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)認識到，被要求權(quán)利的本發(fā)明不應(yīng)不適 當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@種具體的實施方案。其實，對分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域4支 術(shù)人員而言顯而易見的各種對所描述的本發(fā)明實施方式的修改方案， 也意在落入所附權(quán)利要求的范圍當(dāng)中。上文引述到的所有參考文獻和出版物的公開內(nèi)容通過引
用特意整體結(jié)合到本文中，引用的程度如同每個文獻和出版物都單獨 地通過引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1. 一種預(yù)測受試者是否傾向于發(fā)展生脂腺病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括以下步驟從受試者獲得樣品；和確定受試者是否感染了生脂腺病毒。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述確定受試者是否感染了生脂腺病 毒的步驟包括以下步驟篩選樣品中對生脂腺病毒有特異性的抗體的 存在；和確定樣品中對生脂腺病毒有特異性的抗體的存在。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生脂腺病毒是一種或多種選自腺 病毒5型、腺病毒35型和腺病毒37型的生脂腺病毒。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述生脂相關(guān)疾病是選自以下的疾 病癌癥、前列腺癌、乳腺癌、胰腺功能異常、胰腺疾病、糖尿病、 肺病、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及腎上腺功能異常。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述受試者是人。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述受試者是動物。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中在所述確定步驟中的抗體對一種或多 種由選自SEQ ID NO.:5、 SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7的核斷歹'J 編碼的肽具有特異性。
8. 權(quán)利要求2的方法，其中所述篩選步驟是用選自血清中和測定 和ELISA的方法進行。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品選自生物樣品、體液、組織 樣品、器官樣品、糞便、血液、唾液和它們的任何組合。
10. —種預(yù)防受試者中的生脂腺病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法 包括給予所述受試者抗生脂腺病毒疫苗。
11. 權(quán)利要求IO的方法，其中所述抗生脂腺病毒疫苗包含有效劑 量的活性成分，該活性成分包含一種或多種選自以下的化合物殺死 的腺病毒36型、滅活腺病毒36型、編碼腺病毒36外殼蛋白或其片 段的蛋白質(zhì)或肽序列、編碼腺病毒36外殼蛋白或其片段的核酸序列、 腺病毒36型E1A蛋白、遺傳修飾的非致病性病毒及非致病性病毒。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中將所述抗生脂腺病毒疫苗鼻內(nèi)、口 服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和/或 內(nèi)給予。
13. 權(quán)利要求10的方法，其中所述受試者是人。
14. 權(quán)利要求IO的方法，其中所述受試者是動物。
15. 權(quán)利要求10的方法，其中所述生脂腺病毒相關(guān)疾病是一種或 多種選自以下的疾病癌癥、前列腺癌、乳腺癌、胰腺功能異常、胰 腺疾病、糖尿病、肺病、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及腎上腺功能異常。
16. —種預(yù)測受試者中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括以下 步驟從受試者獲得樣品；確定受試者是否感染了生脂腺病毒，乂人而 將生脂腺病毒的存在與侵襲性癌癥相關(guān)聯(lián)。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述確定受試者是否感染了生脂腺 病毒的步驟包括以下步驟篩選樣品中對生脂腺病毒有特異性的抗體 的存在；和確定樣品中對生脂腺病毒有特異性的抗體的存在。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述生脂腺病毒是一種或多種選自 腺病毒5型、腺病毒35型和腺病毒37型的生脂腺病毒。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、 子宮癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌、胰腺癌和肺癌。
20. 權(quán)利要求16的方法，其中所述受試者是人。
21. 權(quán)利要求16的方法，其中所述受試者是動物。
22. 權(quán)利要求17的方法，其中在所述確定步驟中的抗體對一種或 多種由選自SEQIDNO.:5、 SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:7的核酸序 列編碼的肽具有特異性。
23. 權(quán)利要求17的方法，其中所述篩選步驟是用選自血清中和測 定和ELISA的方法進行。
24. 權(quán)利要求16的方法，其中所述樣品選自生物樣品、體液、組 織樣品、器官樣品、糞便、血液、'唾液和它們的任何組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及生脂腺病毒如腺病毒-36(Ad-36)的感染與肥胖癥和肥胖癥相關(guān)癌癥及其它疾病的病因之間的關(guān)系。另外，本發(fā)明涉及測定受試者的Ad-36狀態(tài)和使用Ad-36狀態(tài)作為癌癥存在的標志，以預(yù)測發(fā)展這種癌癥(如乳腺癌或前列腺癌)的未來風(fēng)險和/或預(yù)測這些癌癥的侵襲性和預(yù)后。
文檔編號C12Q1/68GK101389768SQ200680053371
公開日2009年3月18日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者R·L·阿特金森 申請人:奧比科技有限責(zé)任公司