專利名稱：：使用包括經(jīng)間隔子附著于大分子的底物的修飾的底物的酶測量分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及修飾的底物以及使用該修飾的底物來測定相對于結(jié)合的蛋白實(shí)體的游離的蛋白實(shí)體的分析和方法。
背景技術(shù)：
：a-2-巨球蛋白(A2M)與相關(guān)的蛋白均具有作為分子陷阱(moleculartrap)起作用的功能。多種類型的化合物，諸如激素、生長因子、細(xì)胞因子和蛋白，能夠被A2M"誘捕"。A2M能夠結(jié)合宿主的和異體的肽和顆粒。因?yàn)锳2M能夠與廣泛多種的蛋白酶相互作用，有時(shí)其被稱為全蛋白酶抑制劑(panproteinaseinhibitor)。當(dāng)?shù)鞍酌?皮A2M捕獲時(shí)，蛋白酶凈皮保護(hù)而免于大的蛋白酶抑制劑和大底物，但其仍能與小的抑制劑和底物相互作用。已充分研究的一種A2M-蛋白酶結(jié)合是在A2M中誘捕凝血酶。凝血酶是凝血級聯(lián)的關(guān)鍵酶(2、3),因?yàn)槌似渌乱酝?，還能夠活化纖維蛋白原以形成纖維蛋白(4、5)，反々赍以活化XI因子、VIII因子和V因子在凝血級聯(lián)中升高以及活化血小板(2)。對凝血酶的控制部分地經(jīng)過來自血漿蛋白抗凝血酶(AT)、肝素輔因子II和A2M的抑制作用而發(fā)生。與AT的反應(yīng)通常是控制成人中凝血酶活性的主要抑制性機(jī)理。然而，在新生兒和兒童中，由于比成人更高的A2M血漿濃度，與A2M的反應(yīng)被認(rèn)為是顯著的(6、7、8)。通過A2M多肽鏈的切割，導(dǎo)致A2M三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化而形成凝血酶被捕獲到所述A2M分子中的產(chǎn)物，從而使凝血酶的活化被A2M位阻(9、10、11)。在該凝血酶-A2M復(fù)合物中，通過凝血酶氨基基團(tuán)與A2M上的硫內(nèi)酯基團(tuán)的進(jìn)一步反應(yīng)，凝血酶還可共價(jià)地與A2M連接(9、12)。由于凝血酶在凝血系統(tǒng)中的重要性，日益需要開發(fā)測量患者的血漿或血液中的凝血酶生成潛能的系統(tǒng)以評價(jià)患者的止血狀態(tài)。先前測量凝4血酶生成的方法涉及對活化血漿的二次抽樣以檢測凝血酶活性(13、14、15)或者連續(xù)使用與所述凝血酶生成活化血漿混合的底物檢測凝血酶(16、17、18)。先前測定凝血酶生成的方法的主要缺點(diǎn)在于用于檢測凝血酶活性的試劑檢測與A2M結(jié)合的凝血酶以及未與A2M結(jié)合的凝血酶。在二次抽樣方法的情況中，從對總凝血酶活性的分析中減去對凝血酶-A2M與底物反應(yīng)的分析中的活性(用添加的AT+肝素中和游離的未結(jié)合的凝血酶之后檢測)以獲得游離的生理活性的凝血酶的濃度。然而，這些實(shí)驗(yàn)是費(fèi)力的并且需要在每一血漿樣品上進(jìn)行兩種凝血酶生成分析。此外，不能在凝結(jié)的血漿或血液中完成二次抽樣分析。可選擇地，使用添加至活化的凝血酶生成系統(tǒng)(血漿、血液等)中的凝血酶底物連續(xù)測量凝血酶生成不能直接測量未與A2M結(jié)合的凝血酶的生成。在連續(xù)分析中，通過從測量的凝血Sl+凝血酶-A2M數(shù)據(jù)減去計(jì)算的凝血酶-A2M生成的假想曲線來測定生理活性的凝血酶的理論量。已進(jìn)行了多種嘗試以開發(fā)能夠測量血漿和血液中凝血酶潛能的分析。例如，Hemker等人的美國專利第5,192,689號涉及測定血漿和血液的內(nèi)源性凝血酶潛能的方法。然而，該專利方法測量總凝血酶活性，包括單獨(dú)的凝血酶以及與A2M結(jié)合的凝血酶。使用小的生色/熒光底物測量凝血酶活性，接著通過計(jì)算估計(jì)與A2M結(jié)合的凝血酶，隨后將其從總凝血酶活性中減去以給出游離的生理活性的凝血酶的估計(jì)值。澳大利亞專利申請第2003248589號涉及測量凝血酶潛能的另一方法。然而，該方法也包含從總凝血酶活性減去通過小底物檢測的凝血酶畫A2M復(fù)合物。美國專利申請/〉開第US2005/0221414號涉及用于測量患者血液或血漿樣品中的凝血酶生成潛能的試劑盒。在該公開所描述的試劑盒中，諸如活化劑、底物、CaCl2等的全部試劑，在容器是以干燥的混合物形式等4寺加入血漿或血液以分析。然而，該試劑盒還是會(huì)測量游離凝血酶以及與A2M結(jié)合的凝血酶兩者。Hemker的美國專利第6，740，496號描述了空間位阻的底物系統(tǒng)，該系統(tǒng)相較于對游離的蛋白水解酶，對蛋白酶-A2M復(fù)合物具有降低的反應(yīng)性。然而，要求的底物發(fā)明完全限于具有最小10kDa大小的水溶性底物分子。通過該水溶性的位阻的底物測定游離凝血酶限于凝結(jié)的血漿或血液，這是由于很多問題，諸如歸因于通過蛋白或細(xì)胞的摔滅的對報(bào)告分子的有問題的檢測；所述底物在細(xì)胞或聚合纖維蛋白上的潛能吸收或聚集；以及由極大分子的表面位阻產(chǎn)生的所述底物與游離凝血酶自身反應(yīng)能力的喪失。盡管在該領(lǐng)域有很多進(jìn)展，但仍未滿足對與測量游離凝血酶和與A2M結(jié)合的凝血酶相對照的，能夠測量游離凝血酶的分析的需求。本發(fā)明解決了對這樣的方法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供評估出血傾向或高凝傾向以及評價(jià)抗出血?jiǎng)┖涂鼓獎(jiǎng)┑臉?biāo)準(zhǔn)化方法和試劑。在本發(fā)明的一方面，能夠?qū)⑽磁cA2M結(jié)合的凝血酶(游離凝血酶)和與A2M結(jié)合的凝血酶(凝血酶-A2M復(fù)合物)區(qū)別開。在本發(fā)明的一方面，提供了能夠與游離酶反應(yīng)而不與結(jié)合于分子陷阱中的酶反應(yīng)的修飾的底物。該修飾的底物優(yōu)選包括通過間隔子附于大分子的底物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述間隔子包括3個(gè)至50個(gè)原子，優(yōu)選9個(gè)至15個(gè)原子，更優(yōu)選12個(gè)原子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶是蛋白酵，優(yōu)選凝血酵。所述大分子可以選自瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、達(dá)可綸、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大分子為瓊脂糖珠。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大分子為聚苯乙烯。另一方面，本發(fā)明提供修飾底物的方法。該方法包括修飾所述底物以致所述底物不能與結(jié)合酶相互作用。在一種實(shí)施方案中，該方法包括將所述底物與諸如瓊脂糖珠的大分子相連接。在另一實(shí)施方案中，該方法包括改變所述底物的電荷、疏水性或親水性以致所述底物被與所述酶結(jié)合的分子排斥。在另一實(shí)施方案中，所述底物被修飾為與所述酶結(jié)合分子的遠(yuǎn)離所述結(jié)合酶的暴露活性部位的區(qū)域具有親和力。本發(fā)明還提供了檢測樣品中相對于結(jié)合酶的游離酶的方法。該方法包括獲得如上定義的修飾的底物；將該底物與所述樣品結(jié)合；以及檢測生色信號、焚光信號或化學(xué)發(fā)光信號。在另外的方面，本發(fā)明還提供了包括被修飾為僅與游離酶反應(yīng)的底物的測量酶活'性的試劑盒。本發(fā)明的概述沒有必要描述本發(fā)明的全部特征。附圖的簡要描述本發(fā)明的這些和其它特征將由對附圖提供參考的以下說明變得更明顯，其中圖1是說明現(xiàn)有技術(shù)的分析的示意圖2說明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的修飾的底物可以如何結(jié)合；圖3說明所述間隔子的長度可以如何影響結(jié)合；圖4i兌明本發(fā)明的一方面的分析；以及圖5說明凝血酶生成分析的結(jié)果。詳細(xì)說明以下說明屬于優(yōu)選實(shí)施方案。本發(fā)明提供可以用于檢測相對于結(jié)合分子的游離分子的新的方法和試劑。特別地，可以將游離蛋白酶和與A2M結(jié)合的蛋白酶區(qū)別開。該方法和試劑還可以用于檢測相對于"結(jié)合"態(tài)的"游離"態(tài)的各種功能的其它蛋白。本文使用的術(shù)語"游離的"是指不在復(fù)合物中的部分。術(shù)語"游離的凝血酶，，是指未與A2M結(jié)合的凝血酶，盡管所述凝血酶可以與其它分子結(jié)合。本文使用的術(shù)語"結(jié)合"是指已形成復(fù)合物的部分。術(shù)語"結(jié)合的凝血酶"是指被誘捕于A2M中的凝血酶。本文自由使用的術(shù)語"底物"和"酶"是指相互作用的組分。"底物，，是指可以與可以被分子陷阱螯合的另一部分反應(yīng)的任一部分。雖然本文描述具體關(guān)于凝血酶及其底物的發(fā)明，但很明顯本發(fā)明可以應(yīng)用于很多其它蛋白-蛋白反應(yīng)、受體-配體反應(yīng)、酶-底物反應(yīng)。使用能夠與所述游離化合物反辟但與所述結(jié)合化合物的反應(yīng)被位阻的信號試劑檢測相對于所述結(jié)合化合物的所述游離化合物。能夠直接或間接地標(biāo)記該信號試劑。信號試劑的一種實(shí)例是能夠靠近游離酶上的活性部位但不能靠近結(jié)合酶的活性部位的化學(xué)發(fā)光的底物。在本發(fā)明的一方面，提供了修飾的底物。修飾該底物以致其能夠與游離酶反應(yīng)但不與被j秀捕于分子籠(molecularcage)中的酶反應(yīng)。這可以通過將所述底物與大的載體偶聯(lián)、通過改變所述疏水性或親水性、或通過改變所述親和力來達(dá)到。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將小的底物與大分子偶聯(lián)，所述大分子諸如瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、達(dá)可綸、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。當(dāng)?shù)孜锔接诖蠓肿訒r(shí)，所述底物受到空間位阻而不能靠近螯合于分子陷阱中的酶的活性部位。本發(fā)明還提供了測定活躍地游離的酶的量和/或活性的方法與分析。該方法包括如上所述修飾底物并測定其與溶液中的酶反應(yīng)的能力?？梢酝ㄟ^^r測生成信號的切割產(chǎn)物來測量該酶-底物反應(yīng)。還提供了測量酶活性的試劑盒。該試劑盒包括僅與游離酶反應(yīng)的修飾的底物。該試劑盒還可以包含反應(yīng)緩沖液及諸如標(biāo)準(zhǔn)化酶對照的其它試劑或諸如組織因子的其它反應(yīng)物。該試劑盒可以包含諸如微量滴定板孔或類似物的表面，所述表面用修飾的底物包被。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了受位阻而無法靠近被A2M誘捕的凝血酶的凝血酶-反應(yīng)性底物。所述A2M(含有結(jié)合的凝血酶)物理地阻止、排斥或限制底物與結(jié)合A2M的凝血酶的活性部位相互作用。在一種實(shí)施方案中，這是通過構(gòu)建過大的底物或?qū)τ谒龅孜锏哪?可切割區(qū)域過短的間隔子，從而不能在凝血酶-A2M復(fù)合物的A2M部分的周圍突出并且不能靠近(接觸)#:A2M捕獲的凝血酶的活性部位來完成的。在另一實(shí)施方案中，可以將基團(tuán)結(jié)合至凝血酶-可切割底物，所述基團(tuán)為A2M上的區(qū)域所排斥(通過電荷、疏水性/親水性等)，從而防止所述底物向凝血酶-A2M復(fù)合物中的凝血酶移動(dòng)。在另外的實(shí)施方案中，可以將對凝血酶-A2M的A2M組分的一處或多處區(qū)域具有親和力的基團(tuán)工程化至凝血酶-8可切割底物，以致由于與A2M上遠(yuǎn)處的吸引位點(diǎn)結(jié)合而使所述底物的凝血酶-可切割部分遠(yuǎn)離A2M-結(jié)合的凝血酶的活性部位。提供了使用所述修飾的底物測量凝血酶活性的方法和分析以及實(shí)施該方法的^式劑盒。目前可獲得的測定凝血酶活性的商業(yè)分析使用與游離凝血酶以及結(jié)合在A2M內(nèi)部的凝血酶發(fā)生反應(yīng)的底物。這在圖1中說明。已表明游離凝血酶IO和在A2M14中結(jié)合的凝血酶12均與底物16反應(yīng)。因此，為了獲得對所述游離凝血酶的估計(jì)，必須減去理論凝血酶-A2M活性量。如圖2示意說明，通過將凝血酶特異底物連接至大基質(zhì)上解決了現(xiàn)有技術(shù)的問題。凝血酶顯示為游離凝血酶10和A2M14中的結(jié)合凝血酶12。所述凝血酶包含可以與底物16反應(yīng)的活性部位15。當(dāng)將底物16連接至大基質(zhì)18時(shí)，所述底物16受空間位阻無法靠近被誘捕于A2M的凝血酶。為了達(dá)到游離凝血酶10與結(jié)合凝血酶12之間的最適區(qū)分，應(yīng)仔細(xì)控制所述底物16與所述基質(zhì)18的表面鍵合。如果使用很短的間隔子20，該基質(zhì)的表面甚至可以位阻所述游離酶與所述底物反應(yīng)(參見圖3A)。如果所述間隔子20太長，所述底物可以足夠自由而靠近所述結(jié)合酶(參見圖3B)。為了檢測游離凝血酶，優(yōu)選約5個(gè)至15個(gè)原子的間隔子20。該間隔子足夠長以允許所述底物與所述游離酶反應(yīng)，但沒有長到允許其靠近所述結(jié)合酶(參見圖3C)。8個(gè)至14個(gè)原子的，優(yōu)選12個(gè)原子的間隔子特別可用于將底物偶聯(lián)至瓊脂糖珠。圖4說明本發(fā)明的修飾的底物可以怎樣用于分析。微量滴定板的孔30用基質(zhì)修飾的化學(xué)發(fā)光的凝血酶底物32包被。將血漿或血液34加入該孔。來自活化的血液或血漿的凝血酶與該底物反應(yīng)并且信號被產(chǎn)生且由光度計(jì)檢測。雖然優(yōu)選使用化學(xué)發(fā)光的檢測器，但是明顯無疑地，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測裝置來檢測所述修飾的底物與所述游離酶的結(jié)合。顯然，還可以將修飾的底物包被在諸如試管和管的其它表面上。同樣地，應(yīng)理解包被修飾的底物可以是通過與表面的共價(jià)連接或非共價(jià)連接。圖5說明本發(fā)明可以如何用于測量凝血酶生成。結(jié)果說明本發(fā)明的修飾的底物可以區(qū)分游離凝血酶和凝血酶-A2M復(fù)合物。本發(fā)明提供了直接測量未與A2M結(jié)合的凝血酶而在凝血酶-A2M復(fù)合物存在下不檢測凝血酶-A2M的新的方法。本發(fā)明提供了在不必做任何另外的操作或數(shù)學(xué)推導(dǎo)以測定生成的游離凝血酶水平的情況下測量游離凝血酶的簡單方法。本發(fā)明的修飾的底物限制與結(jié)合至A2M的凝血酶的反應(yīng)。然而，位于一些表面的凝血酶可以與受空間位阻而無法接近保持在A2M復(fù)合物內(nèi)凝血酶的底物反應(yīng)。這可以由本發(fā)明的特定特征來完成，借此使用最適長度的間隔子將所述空間位阻大分子連接至所述反應(yīng)性底物。可以與表面上的凝血酶(諸如纖維蛋白或血小板)反應(yīng)但不與結(jié)合至A2M的凝血酶反應(yīng)的底物可以模擬纖維蛋白原(或其它生物大分子/體系)與體內(nèi)生成的凝血酶的反應(yīng)性。本發(fā)明的底物的另一優(yōu)勢在于，當(dāng)所述凝血酶-反應(yīng)性底物結(jié)合至大至足以被沉淀、手工除去、離子地提取或疏水地吸收的分子時(shí)，可以將該底物與該反應(yīng)凝血酶分離。本方法允許人使用單一分析(一步)在凝血酶-A2M存在下測定未與A2M結(jié)合的凝血酶。當(dāng)在凝結(jié)的血漿或血液中進(jìn)行連續(xù)的凝血酶生成分析時(shí)，前述方法依靠在所述血漿/血液中反應(yīng)的熒光凝血酶底物。然而，在這些實(shí)驗(yàn)中的熒光產(chǎn)物遭受來自所述血漿或血液中的分子和細(xì)胞的激發(fā)干擾和發(fā)射猝滅。本發(fā)明通過將凝血酶底物附于所述容器壁以致可以通過直接觀察穿過所述容器壁遠(yuǎn)離(而不是穿過)所述血漿/血液環(huán)境的產(chǎn)物光來測量來自所述凝血酶-可切割產(chǎn)物的任何信號，從而克服對在所述液相中檢測熒光的這種干擾。本發(fā)明可用于直接測量體外隨時(shí)間的血漿或血液中的凝血酶生成而不必提取凝血酶-A2M的污染測量結(jié)果。該直接凝血酶活性檢測底物允許血漿或血液中凝血酶潛能的簡單的簡化分析并且提供出血傾向或高凝傾向的標(biāo)準(zhǔn)測量以及用于常規(guī)臨床實(shí)踐的抗出血?jiǎng)┗蚩鼓獎(jiǎng)┑脑u價(jià)。受空間位阻而無法通過共價(jià)/非共價(jià)結(jié)合至透明容器內(nèi)表面與凝血酶-A2M反應(yīng)的底物實(shí)現(xiàn)4金測所述凝血酶底物切割產(chǎn)物(即，生色產(chǎn)物、熒光產(chǎn)物或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物)而無所述反應(yīng)混合物中其它分子(諸如血漿/血液蛋白)的任何干擾。此外，當(dāng)對凝血酶具有高親和力的基團(tuán)被固定在空間上妨礙結(jié)合至與A2M結(jié)合的凝血酶的表面時(shí)，這種物質(zhì)可以用于從所述培養(yǎng)基中分離非-A2M結(jié)合的凝血酶。這有助于免疫學(xué)研究、精細(xì)結(jié)構(gòu)研究及其它研究。此夕卜，當(dāng)修飾的底物結(jié)合液相中的凝血酶并通過大小、電荷或?qū)2M的單獨(dú)區(qū)域的親和力抑制A2M結(jié)合時(shí)，可以研究隨后的依賴其它結(jié)合機(jī)理的凝血酶相互作用，包括在多種情況下結(jié)合至血小板或血管內(nèi)皮表面的凝血酶的定4立。雖然已詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但顯然，修飾為與游離酶反應(yīng)但不與結(jié)合酶反應(yīng)的底物將可用于多種分析和應(yīng)用中。以上公開內(nèi)容總體上描述了本發(fā)明。據(jù)信，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用前述說明制備并使用本發(fā)明的組合物并且實(shí)施本發(fā)明的方法。通過參考以下的具體實(shí)施例可以獲得更全面的理解。描述這些實(shí)施例僅僅為了說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案并非旨在限制本發(fā)明的范圍。在條件可能提示或?qū)е掠欣麜r(shí)，涉及形式上的改變和等價(jià)替換。其它一般性配置對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。本文提及的所有期刊文章和諸如專利或?qū)＠暾埖钠渌募?，通過引用并入本文。實(shí)施例雖然在這些實(shí)施例中使用了特定術(shù)語，但這樣的術(shù)語意在描述而不是為了限制的目的。在本公開內(nèi)容和這些實(shí)施例中提及但未清楚描述的公知的。實(shí)施例1.制備S2238-瓊脂糖修飾的底物才艮據(jù)廠商的i兌明，4吏凝血酶底物S2238(Diapharma,WestChester,OH，USA)與環(huán)氧-瓊脂糖(Sigma，Mississauga,Ontario,Canada;具有末端帶反應(yīng)性環(huán)氧化物官能團(tuán)的12原子間隔子的瓊脂糖珠基質(zhì))反應(yīng)以產(chǎn)生S2238-瓊脂糖(通過12原子間隔子基團(tuán)連接至瓊脂糖的S2238)。將一瓶25mg的S2238+來自DiaPharma的其它固體(批號N0548870)溶解于2mL的H20中，并取出1mL的所得溶液用于與1g千燥的環(huán)氧-活化的瓊脂糖(在與S2238混合前溶脹并清洗的珠)偶聯(lián)。使用pH9.0的磷酸鹽進(jìn)行ii偶聯(lián)反應(yīng)(反應(yīng)溶液在23°C下倒轉(zhuǎn)混合16小時(shí))。過量的環(huán)氧基團(tuán)通過與1M的Tris.HClpH9.0反應(yīng)4小時(shí)而被封閉。交替使用由濃HC1滴定至pH4.0的0.1M乙酸Na(乙酸鹽緩沖液)和0.1MH3B030.5MNaClpH8.0清洗來自所述最終反應(yīng)混合物的珠。然后將所述S2238-瓊脂糖珠在4。C以乙酸鹽緩沖液的50%懸浮液儲(chǔ)存。實(shí)施例2.底物和修飾的底物的反應(yīng)性的比較測定凝血酶底物S2238和S2238-瓊脂糖與游離凝血酶和凝血酶A2M復(fù)合物的反應(yīng)性。制備0.05MHEPES0.15MNaClpH7.5(HBS)的溶液。通過40pL的5mgA2M(Sigma)/mL+40jliL的0.2mg凝血酶(EnzymeResearchLaboratories,SouthBend，IN,USA)/mLHBS在23。C反應(yīng)40分鐘至60分鐘來制備凝血酶-A2M(溶液#1)。制備40pL的5mgA2M/mL+40/xLHBS的溶液(溶液#2)和40pL的0.2mg凝血酶/mL+40/iLHBS的溶液(溶液#3)。在96-孔板的孔中進(jìn)行與S2238的以下反應(yīng)。1.將5溶液#1加入10/iL0.5mg抗凝血酶(純化的抗凝血酶III蛋白，AffinityBiologicals，Ancaster,Ontario,Canada)/mLHBS+1/iL100U肝素(LeoLaboratories,Ajax，Ontario,Canada)/mLHBS+74/xLHBS。10分鐘后，加入10pL3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。2.將5/xL溶液#2加入10jiiL0.5mg抗凝血酶/mLHBS+1/xL100U肝素/mLHBS+74HBS。10分鐘后，加入10/aL3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。3.將5jtiL溶液#3加入10/XL0.5mg抗凝血酶/mLHBS+1/iL100U肝素/mLHBS+74/iLHBS。10分鐘后，加入10j^L3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。4.將5aiL溶液弁1加入85/xLHBS。10分鐘后，加入10jliL3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。5.將5/xL溶液#2加入85juLHBS。10分鐘后，加入10pL3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。6.將5j[iL溶液弁3加入85juLHBS。IO分鐘后，加入10jliL3.192mgS2238/mLH20并混合，每10秒測量405nm吸光度讀數(shù)100秒并且記錄隨那段時(shí)間的吸光度的變化(AA)。將S2238-瓊脂糖珠(用等體積的乙酸鹽緩沖液儲(chǔ)存)很好地混合并取0.25mL等分試樣的所得同質(zhì)懸浮液入離心小管。離心并仔細(xì)除去上清液之后，將每一試管中的所述珠與0.5mL0.02MTris.HCl0.15MNaCl0.6%聚乙二醇8000pH7.4(TSP)混合，離心并除去上清液。將所述珠再次與TSP混合，離心并仔細(xì)除去上清液以準(zhǔn)備與多種物質(zhì)反應(yīng)。進(jìn)行與已清洗的S2238-瓊脂糖珠的以下反應(yīng)。1.將30/xL溶液#1與570jtiLHBS混合，并將0.25mL所得溶液與已清洗的珠在離心小管中混合。在23。C下3分鐘或IO分鐘后，將所述管離心1分鐘并將所述上清液迅速(但仔細(xì)地)置于離心小管中。將100]LiL反應(yīng)上清液置于96孔板的孔中并測量405nm處的吸光度(終點(diǎn)讀數(shù))。2.將30pL溶液#3與570jhLHBS混合，并將0.25mL所得溶液與已清洗的珠在離心小管中混合。在23°C下3分鐘或10分鐘后，將所述管離心1分鐘并將所述上清液迅速(但仔細(xì)地)置于離心小管中。將100/aL反應(yīng)上清液置于96孔板的孔中并測量405nm處的吸光度(終點(diǎn)讀數(shù))。3.將30jliL溶液#3與60jtiL0.5mg抗凝血酶/mLHBS+6jiiL1000U肝素/mLHBS+504pLHBS混合，并將0.25mL所得溶液與已清洗的珠在離心小管中混合。在23°C下3分鐘或10分鐘后，將所述管離心1分鐘并將所述上清液迅速(但仔細(xì)地)置于離心小管中。將IOO/xL反應(yīng)上清液置于96孔板的孔中并測量405nm處的吸光度(終點(diǎn)讀數(shù))。4.將0.25mLHBS與已清洗的珠在離心小管中混合。在23。C下3分鐘或IO分鐘后，將所述管離心1分鐘并將所述上清液迅速(但仔細(xì)地)置于離心小管中。將100反應(yīng)上清液置于96孔板的孔中并測量405nm處的吸光度(終點(diǎn)讀數(shù))。所述反應(yīng)的結(jié)果如下表1和表2所示。表l.與可溶的S2238反應(yīng)。_反應(yīng)#添加至S2238的反應(yīng)物AA1凝血酶-A2M+抗凝血酶+肝素0.82A2M+抗凝血酶+肝素03凝血酶+抗凝血酶+肝素04凝血酶-A2M0.85A2M06凝血酵0.95表2.與S2238-瓊脂糖反應(yīng)。反應(yīng)#添力p至珠的反應(yīng)物反應(yīng)3分鐘后反應(yīng)10分鐘后的吸光度的吸光度1凝血酶-A2M0.0560.0671凝血酶-A2M0.0580細(xì)2凝血酵0.4640.7412凝血酵0.4720.7353凝血^+抗凝血酶+肝素0.0470.0493凝血酶+抗凝血酶+肝素0.0470.0464緩沖液0.0460,0444緩沖液0.0430.045以上表1和表2所示的數(shù)據(jù)表明當(dāng)S2238與游離凝血酶或凝血酶-A2M容易地反應(yīng)時(shí)，所述S2238-瓊脂糖珠與游離凝血酶顯著地反應(yīng)但不與凝血酶-A2M反應(yīng)。實(shí)施例3.進(jìn)一步比較反應(yīng)性將凝血酶和凝血酶-A2M加入S2238和S2238-瓊脂糖的樣品中。檢測吸光度的變化且結(jié)果如下表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果表明修飾的底物S2238-瓊脂糖與游離的凝血酶強(qiáng)烈地反應(yīng)但不與結(jié)合的凝血酶反應(yīng)。實(shí)施例4.通過S2238與CNBr-活化的瓊脂糖凝膠的反應(yīng)而固定的S2238與凝血酶的反應(yīng)為了證實(shí)在底物和位阻大分子表面之間的間隔子中所需原子的最小數(shù)量，測試通過小CNBr活化基團(tuán)與瓊脂糖凝膠珠連接的S2238與凝血酶的反應(yīng)。制備S2238-瓊脂糖凝膠珠將一瓶含有25mgS2238的未懸浮的(干燥的)粉末(Chromogenix批號N0526873)懸浮于2mLH20中。移出1mL該懸浮液并置于含有0.75mL的1.75mL0.2MNaHC031MNaClpH8.0的50mL有蓋塑料離心管中。將1gCNBr-活化的瓊脂糖凝膠(AmershamBiosciences批號299594)懸浮(溶脹)于10mL0.001MHC1中，然后用200mL0.001MHC1在燒結(jié)的玻璃濾器上清洗。將已清洗的CNBr-活化的瓊脂糖凝膠與所述S2238溶液置于管中，并在23。C下在搖板上孵育2小時(shí)，然后在4。C下在搖板上孵育18小時(shí)。反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物中的珠在燒結(jié)的玻璃濾器上用100mL0.1MNaHC030.5MNaClpH8.0清洗。將清洗過的珠加入含有15mL0.1MTris.HClpH8.0的有蓋塑4+離心管，并在23°C下在搖板上孵育2小時(shí)。然后在燒結(jié)的玻璃濾器上用10mL0.1MTris.HCl0.5MNaClpH8.0清洗珠，接著用20mL0.1M乙酸鈉0.5MNaClpH4.0清洗珠。用Tris.HCl/NaCl和乙酸鈉/NaCl的這在后的清洗被再重復(fù)5次。最后，在4°C將該珠與等體積(與壓緊的珠等體積)的0.1M乙酸鈉0.5MNaClpH4.0儲(chǔ)存在有蓋的塑料管中。這批儲(chǔ)存的珠命名為S2238-瓊脂糖凝膠。S2238-瓊脂糖凝膠珠懸浮液的小的子樣品與等體積的4MNaOH的混合物在液相中發(fā)出強(qiáng)的黃色(在405nm吸收)，證實(shí)完整的S2238底物附著于所述瓊脂糖凝膠珠。與凝血酶的反應(yīng)將0.5mL重懸的S2238-瓊脂糖凝膠珠置于2個(gè)微量離心管(1.5mL容量)的每一個(gè)中，然后以12000g離心1分鐘并除去所得的上清液。將每一管中的珠重懸于0.5mL0.02MTris-HCl0.15MNaCl0.6%聚乙二醇8000pH7.4(TSP)中，離心1分鐘并棄去所得上清液。制備溶于TSP的100nM的人a凝血酶(EnzymeResearchLaboratories)溶液。將0.5mL凝血酶加入壓緊的S2238-瓊脂糖凝膠珠的一個(gè)管(管1),并將0.5mLTSP加入S2238-瓊脂糖凝膠珠的另一管(管2)。在單獨(dú)空管中加入0.05mL游離的(未與珠偶連的)S2238儲(chǔ)液(12.5mgS2238/mLH20)+0.15mLTSP+0.5mL100nM凝血酶(管3)。最后，在單獨(dú)的空管中加入0.05mL游離的S2238儲(chǔ)液+0.65mLTSPCf4)。將所有的管蓋上，并將管+內(nèi)容物在23。C通過用手工翻轉(zhuǎn)輕輕搖動(dòng)IO分鐘。翻轉(zhuǎn)混合后，將管以12000g離心1分鐘并將來自每管的0.2mL的上清液迅速移至96孔微量滴定板的單獨(dú)的孔，并在405nm下測量吸光度。結(jié)果不同孵育混合物的吸光度讀數(shù)如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>這些數(shù)據(jù)明確地表明，通過CNBr活化基團(tuán)(即-NH-(C-NH)-O-鍵)附于宏觀珠的S2238不允許其自身與凝血酶的反應(yīng)。因此，所述底物和大分子表面通過含有相對小數(shù)量的原子的間隔子的鍵合，不允許對甚至于所述游離酶與所述底物反應(yīng)的空間位阻的足夠緩解。實(shí)施例5.由游離S2238或S2238-瓊脂糖測定的血漿凝血酶生成取血漿，并且通過與安克洛酶反應(yīng)以形成纏繞的纖維蛋白凝塊，來除去纖維蛋白原，從而產(chǎn)生所得的脫纖維蛋白的血漿。在時(shí)間零點(diǎn)，加入組織因子(ThromborelS)+CaCl2以在預(yù)熱的脫纖維蛋白血漿中開始凝血酶生成。在某些時(shí)間點(diǎn)，取反應(yīng)混合物的子樣品加入Na2EDTA中以通過螯合所述Ca^而停止進(jìn)一步的凝血酶生成。然后通過與緩沖液中游離的S2238底物混合或與懸浮于緩沖液中的空間位阻的S2238底物(S2238-瓊脂糖珠)混合以檢測當(dāng)時(shí)樣品(含有游離的凝血酶以及與a-2-巨球蛋白(A2M)結(jié)合的凝血酶)的凝血酶活性。為了測定游離S2238或S2238-瓊脂糖檢測凝血酶-A2M的能力，進(jìn)行與以上方法類似的試驗(yàn)，除了在與底物孵育前通過與抗凝血Sl+肝素混合而首先將全部的游離凝血酶抑制。在血漿凝血酶生成時(shí)間過程期間，首先將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟福蝗缓笸ㄟ^血漿抗凝血酶(對游離S2238沒有生色活性)或A2M(與A2M結(jié)合的凝血酶對小的生色S2238底物保持活性)逐漸抑制游離的凝血酶。因此，早期時(shí)間點(diǎn)的樣品(即60秒)會(huì)含有比凝血酶-A2M多的游離凝血酶，而后期時(shí)間點(diǎn)的樣品(即300秒)會(huì)含有比游離凝血酶多的凝血酶-A2M。血漿中總凝血酶(游離凝血H+凝血酶-A2M)生成的測量血漿凝血酶生成使用12mm(內(nèi)徑)x75mm(長)的聚碳酸酯塑料試管。1.使血漿脫纖維蛋白a.將800iliL血漿與10|uL30U/mL安克洛酶儲(chǔ)液在37。C孵育10分鐘。b.孵育后，形成的纖維蛋白凝塊纏繞于塑料棒上，使上清液成為脫纖維蛋白的血漿。c.將試管置于水上10分鐘。d.IO分鐘的孵育后，使任何更多的凝塊纏繞出。e.將脫纖維蛋白的血漿儲(chǔ)存在冰上。2.將所述活化劑溶液(12.5pLThromborelS+4.0|iL1MCaCl2+183.5HBS)在37。C下于管中溫?zé)?。在單?dú)的管中，150(iL脫纖維蛋白的血漿在37。C溫?zé)帷?.在t-O時(shí)，將150pL活化劑溶液與150(iL脫纖維蛋白的血漿在37。C混合。4.在t=60秒和t=300秒時(shí)，移出25nL所述反應(yīng)混合物并立即在冰上加入475|xL0.005MNa2EDTA。5.—旦全部時(shí)間點(diǎn)均用EDTA中和，用135懸浮于HBS的珠(約75壓緊的珠，所述珠懸浮液中的最終S2238濃度為0.35mM)與50每一EDTA/時(shí)間樣品在37°C下于微量離心管中混合。將時(shí)間樣品等分試樣+珠懸浮液通過翻轉(zhuǎn)在隨后的整個(gè)孵育過程中混合。6.在單獨(dú)的管中，將50|uL的所述EDTA/時(shí)間樣品在37。C加入110|LiL的溶于HBS的0.00016MS-2238。7.與游離S2238底物或S2238-瓊脂糖珠孵育10分鐘后，將40|iL50%的乙酸加入各個(gè)管以阻止底物水解。8.將含有乙酸中和的珠懸浮液的微量離心管微量離心1分鐘。9.將各樣品的200上清液的等分試樣置于96-孔板的孔中并在405nm測量吸光度。測量血漿中生成的凝血酶-A2M除了在步驟4中將25|iL時(shí)間樣品在冰上加入550U抗凝血酶/mLPBS(7.2mg抗凝血酶/mL)+2100U肝素/mL0.15MNaCl,重復(fù)以上所述的實(shí)驗(yàn)。1分鐘后加入468(iL0.005MNa2EDTA并如前繼續(xù)所述程序。在405nm檢測的吸光度本質(zhì)上歸因于底物與凝血酶-A2M單獨(dú)的反應(yīng)(游離的凝血酶已被抗凝血酶+肝素中和)。所述時(shí)間樣品中歸因于游離凝血酶的底物切割的吸光度可以通過從初始實(shí)驗(yàn)中(其中時(shí)間樣品未用抗凝血酶+肝素中和并且含有游離凝血酶+凝血酶-八21\4)的吸光度減去歸因于凝血酶-A2M的吸光度而測定。圖5所示的數(shù)據(jù)說明，在含有生成的游離凝血酶+與A2M復(fù)合的凝血酶的血漿樣品中，在血漿活化后60秒時(shí)通過可溶的(游離的)S2238以及S2238-瓊脂糖珠均檢測到顯著的活性。在血漿活化后300秒時(shí)，使用可溶的S2238測量到顯著的凝血酶底物活性，但S2238-瓊脂糖珠給出相對減少量的凝血酶活性(在405nm的吸光度)。然而，在保留生成的凝血酶-A2M復(fù)合物但未保留游離的凝血酶(游離的凝血酶被抗凝血酶+肝素中和)的血漿樣品中，通過可溶的S2238檢測出顯著的凝血酶活性(尤其是在300秒時(shí)間點(diǎn))而通過空間位阻的S2238-瓊脂糖珠僅測量到基線背景吸光度。對含有生成的游離凝血^+凝血酶-A2M的血漿樣品與僅含有凝血酶-A2M的血漿樣品的比較表明，加入釣+組織因子300秒后，絕大部分可溶的S2238活性歸因于凝血酶-A2M。對于S2238-瓊脂糖珠的情況，在60秒或300秒時(shí)間點(diǎn)僅檢測到游離的凝血酶。所有引用以參考的方式并入本文。已描述關(guān)于一種或多種實(shí)施方案的本發(fā)明。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，在不偏離如權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍的情況下，可以做出很多變形和修飾。參考文獻(xiàn)1.SchenoneM,FurieBC,FurieB.Thebloodcoagulationcascade(血液凝血級聯(lián)).CurrOpinHematol.ll(4):272-277，2004.2.WalshPN.'Plateletcoagulation-proteininteractions(血'卜板凝結(jié)-蛋白相互作用).SeminThrombHemost30(4):461-471,2004.3.SuoZ,CitronBA,FestoffBW.Thrombin:apotentialproinflammatorymediatorinneurotraumaandneurodegenerativedisorders(凝血酶神經(jīng)外傷和神經(jīng)退行性狀態(tài)中潛在的促炎介質(zhì)).CurrDrugTargetsInflammAllergy.3(1):105-114，2004.4.StandevenKF，AliensRA,GrantPJ.Themolecularphysiologyandpathologyoffibrinstructure/fimction(纖維蛋白結(jié)構(gòu)/功能的分子生理學(xué)和病理學(xué)).BloodRev.19(5):275-288，2005.5.WeiselJW.Fibrinogenandfibrin(纖維蛋白原和纖維蛋白).AdvProteinChem.70:247-299，2005.6.AndrewM，PaesB，MilnerR,JohnstonM，MitchellL,TollefsenDM,PowersP.Developmentofthehumancoagulationsysteminthefiill-terminfant(足月兒中人凝血系統(tǒng)的發(fā)展)(ZAI).Blood.70(1):165-172，1987.7.AndrewM，PaesB,MilnerR,JohnstonM，MitchellL,TollefsenDM,CastleV，PowersP.Developmentofthehumancoagulationsysteminthehealthyprematureinfant(健康早產(chǎn)兒中人凝血系統(tǒng)的發(fā)展).Blood.72(5):1651-1657，1988.8.AndrewM，VeghP,JohnstonM，BowkerJ,OfosuF，MitchellL.Maturationofthehemostaticsystemduringchildhood(在兒童時(shí)期止血系統(tǒng)的成熟).Blood.80(8):1998-2005，1992.9.Sottrup-JensenL.Alpha-macroglobulins:structure,shape,andmechanismofproteinasecomplexformation(a-巨J求蛋白蛋白酶復(fù)合物形成的結(jié)構(gòu)、形狀和機(jī)理).JBiolChem.264(20):11539-11542，1989.10.NiemullerCA，RandallKJ，WebbDJ，GoniasSL，LamarreJ.Alpha陽2-macroglobulinconformationdetetminesbindingaffinityforactivinAandplasmaclearanceofactivinA/alpha-2-macroglobulincomplex(a-2國巨球蛋白構(gòu)象確定與活化素A的結(jié)合親和性以及活化素A/a-2-巨球蛋白復(fù)合物的血漿清除).Endocrinology.136(12):5343-5349,1995.11.SteinerJP，BhattacharyaP,StricklandDK.Thrombin-inducedconformationalchangesofhumanalpha2-macroglobulin:evidencefortwofunctionaldomains(凝血酶誘導(dǎo)的人a-2-巨^求蛋白的構(gòu)象改變兩種功能性結(jié)構(gòu)域的證據(jù)).Biochemistry.24(12):2993-2300,1985.12.FeinmanRD,YuanAI,WindwerSR，WangD.Kineticsofthereactionofthrombinandalpha2-macroglobulin(凝血酶與0!-2-巨5求蛋白的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)).BiochemJ.231(2):417-423，1985.13.MassicotteP,LeakerM,MarzinottoV，AdamsM，F(xiàn)reedomR，WilliamsW，VeghP,BerryL，ShahB，AndrewM.Enhancedthrombinregulationduringwarfarintherapyinchildrencomparedtoadults(華法林治療兒童期間相較于成人增強(qiáng)的凝血酶調(diào)節(jié)).ThrombHaemost.80(4):570曙574，1998.14.AndrewM,BerryL,O，BrodovichH.Thrombininhibitionbyfetaldistallungepitheliumisdifferentinfetalandadultplasma(通過月臺(tái)兒末柏'肺上皮細(xì)胞的凝血酶抑制在胎兒血漿中和在成人血漿中是不同的).AmJRespirCellMolBiol.11(1):35-41，1994.15.CvirnGGallistlS，KoestenbergerM，KutscheraJ,LeschnikB，MunteanW.Alpha2-服croglobulinenhancesprothrombinactivationandthrombinpotentialbyinhibitingtheanticoagulantproteinC/proteinSsystemincordandadultplasma(a-2-巨球蛋白通過抑制勝血漿和成體血漿中的抗凝血蛋白C/蛋白S系統(tǒng)增強(qiáng)凝血酶原活化及凝血酶潛能).ThrombRes.105(5):433-439,2002.16.HemkerHC,WieldersS，KesselsH，BeguinS.Continuousregistrationofthrombingenerationinplasma,itsuseforthedeterminationofthethrombinpotential(血漿中凝血酶生成的連續(xù)配準(zhǔn)，其測定凝血酶潛能的用途).ThrombHaemost.70(4):617-624，1993.17.KesselsH,WillemsQHemkerHC.Analysisofthrombingenerationinplasma(血漿中凝血酶生成的分析).ComputBiolMed.24(4):277國288，1994.18.HemkerHC,GiesenPL,RamjeeM，WagenvoordR，BeguinS.Thethrombogram:monitoringthrombingenerationinplatelet-richplasma(凝血酶圖監(jiān)測富集血小板的血漿中的凝血酶生成).ThrombHaemost.83(4):589-591,2000.19.StreifW,PaesB，BerryL,AndreasenRB，ChanAK.InfluenceofexogenousfactorVilaonthrombingenerationincordplasmaoffiill誦termandpre-termnewborns(外源性因子VIIa對足月嬰兒和早產(chǎn)嬰兒的臍血漿中凝血酶生成的影響).BloodCoagulFibrinolysis,ll(4):349-357,2000.20.MeddahiS，BaraL,FessiH，SamamaMM.Determinationofprothombinaseactivationafteraddinghumanpurifiedprothrombintohumanclot:comparisonofhirudin,anactivatedfactorIIinhibitor,withDX9065a，anactivatedfactorXinhibitor,onclot-associatedthrombinandonprothrombinactivation(將純化的人凝血酶原加入人凝塊后測定凝血酶原酶的活化作用水蛭素，活化因子II抑制劑與DX9065a,活化因子X抑制劑在凝結(jié)相關(guān)的凝血酶及凝血酶原活化上的比4交).BloodCoagulFibrinolysis.16(2):125-133，2005.權(quán)利要求1.修飾的底物，所述修飾的底物能夠與游離酶反應(yīng)而不與結(jié)合于分子陷阱的酶反應(yīng)，所述修飾的底物包括經(jīng)間隔子附于大分子的底物。2.如權(quán)利要求1所述的修飾的底物，其中所述間隔子包含3至50個(gè)原子。3.如權(quán)利要求2所述的修飾的底物，其中所述間隔子包含9至15個(gè)原子。4.如權(quán)利要求3所述的修飾的底物，其中所述間隔子包含12個(gè)原子。5.如權(quán)利要求1所述的修飾的底物，其中所述底物是肽并且所述酶是蛋白酶。6.如權(quán)利要求5所述的修飾的底物，其中所述酶選自凝血酶、Xa因子、活化的蛋白C、纖溶酶、組織纖溶酶原激活物、尿激酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B。7.如權(quán)利要求6所述的修飾的底物，其中所述酶是凝血酶。8.如權(quán)利要求1所述的修飾的底物，其中所述大分子選自瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、聚苯乙烯珠、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氧化乙烯、聚酰胺、聚酯、聚^5友酸酯、達(dá)可綸、葡聚糖、聚四氟乙烯、蛋白、多糖和多核苷酸。9.如權(quán)利要求8所述的修飾的底物，其中所述大分子是瓊脂糖珠。10.如權(quán)利要求8所述的修飾的底物，其中所述大分子是聚苯乙烯。11.檢測樣品中相對于結(jié)合酶的游離酶的方法，所述方法包括i.獲得如權(quán)利要求1定義的修飾的底物；ii.將所述底物與所述樣品結(jié)合；以及iii.檢測生色信號、熒光信號或化學(xué)發(fā)光信號。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述修飾的底物與容器表面非共價(jià)地結(jié)合。13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述修飾的底物與容器表面共價(jià)地結(jié)合。14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述酶是凝血酶。15.測量游離酶活性的試劑盒，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1定義的修飾的底物。16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，所述試劑盒還包含反應(yīng)緩沖液和組織因子。17.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述修飾的底物與反應(yīng)容器的表面結(jié)合。全文摘要本發(fā)明提供檢測相對于結(jié)合化合物的游離化合物的新的試劑和方法。通過使用因空間位阻不與A2M結(jié)合的凝血酶反應(yīng)的修飾的底物，尤其可用于在所述A2M結(jié)合的凝血酶存在下檢測未與A2M結(jié)合的凝血酶。文檔編號C12Q1/37GK101657545SQ200680053447公開日2010年2月24日申請日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日發(fā)明者保羅·T·莫納格勒,萊斯利·R·貝里,薇拉·伊格尼亞托維奇,陳錦泉申請人:麥克馬斯特大學(xué);墨爾本大學(xué)