專利名稱：利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物能源領(lǐng)域，涉及一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N—乙酰 葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
21世紀全球最大的挑戰(zhàn)之一就是如何持續(xù)不斷地提供經(jīng)濟發(fā)展和人民生活需要的能源， 能源安全已經(jīng)被各個國家提高到了戰(zhàn)略的高度。由于化石燃料的短缺和污染問題，人們早己 把目光集中在了可再生能源的開發(fā)上，而生物質(zhì)能源的開發(fā)與利用更是受到極大的重視 (Arthur J.Ragauskas et al.， 2006)。歐盟委員會計劃在2020年采用可再生燃料代替化石燃料使 用量的20%，他們的中期目標是2010年達到5.75%; 2005年美國能源政策法案要求全美在 2012年之前使用75億加侖的燃料乙醇(約2243萬噸/年)(Gray, K.A. et al.，2006);巴西已 經(jīng)成為世界上第一個在國內(nèi)不供應(yīng)純汽油的國家。2006年，美國總統(tǒng)布什在國情咨文報告中 稱，美國將在2025年之前使用可再生燃料代替75^的進口化石燃料(Herrera, S.,2006)。生物 能源逐漸代替化石燃料已經(jīng)成為未來趨勢，因此開發(fā)更多的可再生生物能源物質(zhì)已成為迫切 需要解決的問題。生物能源物質(zhì)主要有燃料乙醇、生物柴油、生物制氫、沼氣和生物電池，其中燃料乙醇 的研究最為成熟。目前，燃料乙醇巳經(jīng)在巴西、美國以及一些歐洲國家廣泛采用，在未來的 20年，它將成為占統(tǒng)治地位的可再生生物能源。但是，目前用于生產(chǎn)燃料乙醇的原料主要來 自于人和動物賴以生存的糖(巴西)和淀粉(美國)(B. Hahn-Ha gerdal et al.,2006)。這些原 材料還要為動物和人提供食品，我國現(xiàn)已禁止或限制這一產(chǎn)業(yè)的投資。采用纖維素生產(chǎn)燃料 乙醇的方法今年取得很大進展，并逐步走向工業(yè)化。但問題依然存在，據(jù)美國農(nóng)業(yè)部與能源 部估計，每年美國生物量的潛在生產(chǎn)能力是10億噸，如果全部用來生產(chǎn)工業(yè)能源，也只能夠 代替目前使用的30%的化石能源(Kevin A Gray et al., 2006)。而且，釆用纖維素生產(chǎn)乙醇同樣
會占用日益減少的耕地面積。因此， 一方面需要進一步加強纖維乙醇的生產(chǎn)開發(fā)，同時還要 尋找更多的可再生能源前體物質(zhì)用于代替化石能源。幾丁質(zhì)是一種天然N—乙酰葡萄糖胺多聚物，是一種潛在的生物能源物質(zhì)。除陸地生物 以外，在海洋生物中有著更為廣泛和大量的分布。通過生物技術(shù)手段，利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)能源 物質(zhì)是完全可能的。首先，自然界中的許多生物體都存在將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖的生 理機制，由6-磷酸果糖可以進一步通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物能源物質(zhì)如乙醇。 一些沙雷菌 (Hildgund Schrempf et al .,2001)和生活在海洋中的弧菌目微生物(Nemat 0. Keyhani et al.,1999)可以直接利用幾丁質(zhì)作為碳源生長，它們體內(nèi)存在一系列代謝幾丁質(zhì)的酶系，能夠?qū)?幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖。大腸桿菌中也存在能夠代謝GluNAc的酶系(Laura I. A lvarez-Anorve, et al.,2005)。生物體中的這一轉(zhuǎn)化過程己經(jīng)清楚，首先幾丁質(zhì)在解聚蛋白CBP 的幫助下解聚(Gustav Vaaje-Kolstad et al., 2005)，之后通過四歩酶促反應(yīng)將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷 酸果糖(Meibom,K丄et al., 2004 )。1、 幾丁質(zhì)水解酶(Chitinase， p-N-acetylglucosaminidase)催化chitin—n N-acetyl-D-glucosamine 幾丁質(zhì)水解酶是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷水解酶，包括可以分為幾丁質(zhì)內(nèi)切酶 (endochitinase, EC 3.2.1.14)和幾丁質(zhì)外切酶(p-N-acetylglucosaminidase, EC 3.2.1.52)，它們 的主要作用是將幾丁質(zhì)降解為單糖和幾丁二糖(chitobiose) (Parketa1.,1997)。2、 N-乙酰葡萄糖氨激酶(N-acetylglucosamine kinase, EC 2.7.1.59)催化 ATP + N-acetyl-D-glucosamine = ADP+N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate N-乙酰葡萄糖氨激酶(GlcNAc kinase, EC 2.7丄59)屬于N—乙酰己糖激酶家族，能夠?qū)luNAc磷酸化，生成GluNAc-6-P。酶活性中心含有兩個保守的半胱氨酸，還有一個ATP結(jié) 合位點(MarkusBergereta1.,2002)。小鼠N-乙酰葡萄糖氨激酶分子量約為39kD，以二聚體的
形式存在并發(fā)揮作用(Hinderlich, S.， et al.,1998)。3、 N-乙酰葡萄'塘氨陽6-磷酸去乙酰化酶(N陽acetylglucosamine-6隱phosphatedeacetylase， EC 3.5丄25)催化N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate+H20=D-glucosamine 6- phosphate十a(chǎn)cetate細菌中的N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙?；?GlcNAc-6Pdeacetylase， EC3.5丄25)分子 量約41kD，以四聚體的形式存在。它的作用是將GluNAc-6P脫乙?；蒅luN-6P Gos6 M. Souzaetal"1997)。4、 6-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase, EC 3.5.99.6)催化 D-glucosamine 6-phosphate + H2O = D-fructose 6-phosphate + NH36-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶(GlcN-6P deaminase, EC 3.5.99.6)屬于谷氨酰氨依賴的氨基轉(zhuǎn) 移酶家族，分子量約31kD，以同聚體的形式存在。催化GluN-6P脫氨基生成6-磷酸果糖(Takeshi Tanaka,etal"2005)。雖然幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的生物代謝途徑普遍存在，但是直接利用現(xiàn)有生物體生產(chǎn) 6-磷酸果糖還不能達到產(chǎn)業(yè)化的要求，因為幾丁質(zhì)在生物體內(nèi)的代謝途徑網(wǎng)絡(luò)繁復(fù)，以幾丁 質(zhì)為起始物，可以生成除6-磷酸果糖外至少10余種中間或最終產(chǎn)物 (http:〃www.genome,jp/kegg/pathwav.html)，例如chitosan、N-acetyl-D -glucosamine、D-Glucosamine、 N-acetyl-D-Mannosamine、 chitobiose、 D-glucos-amine國6-phosphate等。N-acetyl-D-glucosamine 可以脫乙?；纬蒁-Glucosamine，然后被磷酸化為D-glucosamine-6-phosphate; N-acetyl-D陽 glucosamine可以通過變位酶的作用生成N-acetyl-D-Mannosamine，進入甘露糖的代謝網(wǎng)絡(luò)等。隨著生物技術(shù)的進步，通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段，實現(xiàn)幾丁質(zhì)生成6-磷酸果糖的高效率轉(zhuǎn) 化是完全可能的。利用基因工程手段將這些酶進行體外表達具有活性的生物酶，已經(jīng)能夠在 體外條件下將GluNAc幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖(Chen Yang et al.,2006)。表i部分物種的兒r質(zhì)含量
生物種類幾丁質(zhì)含量(％)生物種類幾丁質(zhì)含量(％)甲殼類昆蟲類鰲蟹72.1 (器官外殼重)蟑螂10 (千體重)金蟹35 (干體重)雙翅蟲54.8 (器官外殼重)沙蟲下28 (外殼總千重)蝴蝶64 (器官外殼重)龍蝦69.8 (器官外殼重)蠟蟲33.7 (器官外殼重)軟體動物類真菌類蛤殼6.1 (外殼總干重)黑麥霉42 (細胞壁干重)烏賊41(軟骨總干重)點青素8.5 (細胞壁干重)南極蟲下40 52 (外殼總干重)奇異青霉20.1(細胞壁干重)另夕卜，幾丁質(zhì)(chitin)在地球上的含量豐富，年產(chǎn)超過100億噸(Lepri L et a1.,1977)，總量僅次于纖維素；同時它來源豐富(表l)，容易獲得，不需要占用耕地，僅全球貝類廢物中 幾丁質(zhì)總含量就有1.2xl()S噸。大量的幾丁質(zhì)由于得不到合理得利用，被作為廢物處理，造成 近海污染。綜上所述，采用幾丁質(zhì)作為可再生能源在能源開發(fā)和生物代謝角度都是可行的，隨著生 物工程領(lǐng)域的飛速發(fā)展，幾丁質(zhì)作為自然界存在的含量僅次于纖維素的可再生多聚物，將其 轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)是具有很大的現(xiàn)實意義的，而更多前體能源物質(zhì)的開發(fā)還需要引起更多 的重視。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N—乙酰葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的思路，首次提出幾丁質(zhì)作為能源物質(zhì)的概念，并提供了利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法。本發(fā)明是利用天然可再生多聚物幾丁質(zhì)為原料生產(chǎn)生物能源物質(zhì)(如燃料乙醇)，為人類提供更多的可再生資源用于能量的產(chǎn)生，解決人類面臨的日益嚴重
的能源短缺問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，該方法包括以下歩驟 ①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理；②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法，利用天然或重組的幾丁質(zhì)代謝 酶系，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法，將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖；③ 以6-磷酸果糖作為碳源，采用生物轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)酵生產(chǎn)生物能源物質(zhì)。原料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法、物理方法，或微生物進行預(yù)處理，或利用幾丁質(zhì)結(jié)合 蛋白(CBP)促進幾丁質(zhì)水解酶對幾丁質(zhì)的水解作用，促進其水解增溶。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的過程，可以利用篩選的微生物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，或利 用分離純化獲得的幾丁質(zhì)代謝酶系在體外催化實現(xiàn)。微生物包括人工馴化的菌種，或人工改 造的工程菌。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)前體6-磷酸果糖所用的酶系，可以是分離純化提取的天然酶，也可以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達，或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程獨立 或組合進行。利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，還包括幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中副產(chǎn)物蛋白 質(zhì)、碳酸鈣、乙?；?、氨基的生產(chǎn)和利用。本發(fā)明可以將上述步驟的具體過程進行合并或偶聯(lián)，最終實現(xiàn)幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物 質(zhì)的目的。下面詳細介紹利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的這一過程。 1、原料的預(yù)處理原料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法進行預(yù)處理，如采用酸或堿除去幾丁質(zhì)中夾雜的蛋白質(zhì) 和碳酸鈣等成分，得到幾丁聚糖；或采用物理方法進行粉碎預(yù)處理，如球研磨或錘研磨、幾 丁質(zhì)固體的蒸汽爆炸或蒸汽膨脹等；還可利用微生物，如乳酸菌和產(chǎn)生檸檬酸的菌株等，對 原料進行預(yù)處理，利用微生物產(chǎn)生的蛋白酶降解幾丁質(zhì)中含有的蛋白質(zhì)，同時產(chǎn)生的酸可以 溶解碳酸鈣。此外，在含有幾丁質(zhì)的溶液中加入一定量的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP)能夠促進
幾丁質(zhì)水解酶對其的水解作用，促使其水解增溶。2、將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖；將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，這一過程可以通過人工改造的微生物進行體內(nèi)轉(zhuǎn)化或重組 酶的體外催化兩種不同的方法實現(xiàn)。利用人工改造的微生物進行生物轉(zhuǎn)化的方法將幾丁質(zhì)的轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，其過程包括: 以幾丁質(zhì)作為唯一碳源，加入無機鹽等必要的營養(yǎng)物質(zhì)配制發(fā)酵液，加入合適的微生物進行發(fā)酵，該微生物存在代謝GluNAc的酶系，能夠?qū)luNAc逐步代謝為6-磷酸果糖，使發(fā)酵 液中積累6-磷酸果糖。發(fā)酵產(chǎn)生的6-磷酸果糖可以通過離心出除菌體，收集獲得的上清液即為含有6-磷酸果糖 的溶液，經(jīng)過濃縮處理，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)化過程。微生物轉(zhuǎn)化所用的菌種可以是經(jīng)過改造的工程菌。改造過程可以是通過誘變篩選或基因 工程手段控制細胞的代謝途徑，阻斷旁路途徑或?qū)氡匾南嚓P(guān)基因，產(chǎn)生專門用于生物轉(zhuǎn) 化的菌種。同樣也可以對細胞體內(nèi)的現(xiàn)有的相關(guān)酶進行改造，從而提高細胞轉(zhuǎn)化底物的能力。 參與轉(zhuǎn)化的微生物可以是大腸菌目的大腸桿菌(&c/2^/c^a co//)或沙雷氏菌(5Wr"Z/a ma/rescms)，弧菌目的霍舌L弧菌(附rio c/io/erae)以及鏈霉菌(5^epto呼cey 。/ivaceovi^fo)。利用酶工程方法將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，是指在體外條件下通過酶催化轉(zhuǎn)化，將幾 丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成為6-磷酸果糖。此過程需要四步酶的催化反應(yīng)，需要四種酶參與，即幾丁質(zhì)水解 酶、N-乙酰葡萄糖氨激酶、N-乙酰葡萄糖氨-6-磷酸去乙?；?、6-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶，可 通過兩種方法實現(xiàn)該過程。 一種方法是將酶的粗提液加入到含有底物的溶液中，在密封的容 器中保溫一段時間進行催化轉(zhuǎn)化。四種酶可以按一定的比例同時加入，也可以每次加一種酶 進行三歩酶催化反應(yīng)，因為四種酶的催化反應(yīng)條件不一定完全相同。另一種方法是通過酶的 固定化技術(shù)，分別將酶固定在固相載體上，實現(xiàn)底物轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物，并回收和重復(fù)利用催 化所用的酶。 將GluNAc轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖過程所用的酶(幾丁質(zhì)水解酶、氮-乙酰葡萄糖氨激酶、氮 -乙酰葡萄糖氮-6-磷酸去乙?；浮?-磷酸葡萄糖氨轉(zhuǎn)氨酶)，可以是分離純化提取的天然酶， 也可以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。改造的酶可以 是通過對活性位點或底物結(jié)合位點的相關(guān)氨基酸殘基進行定點突變，篩選得到高活性的酶。 重組酶可以通過蛋白質(zhì)工程手段進行生產(chǎn)，將改造好的酶基因轉(zhuǎn)移到表達載體上進行表達， 然后對表達產(chǎn)物進行分離純化，用于生產(chǎn)。表達的載體可以是原核表達載體、桿狀病毒表達 載體、酵母表達載體等所有重組表達載體。采用的方法均是本領(lǐng)域熟悉的基因克隆表達和分 離純化的方法。3、 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)6-磷酸果糖通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的過程可以通過發(fā)酵的方法實現(xiàn)，以6-磷 酸果糖作為碳源，按一定比例補充其它營養(yǎng)元素，在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，生產(chǎn)酒精或其它牛 物能源物質(zhì)。具體過程采用的是本領(lǐng)域熟悉的發(fā)酵方法。此過程采用的菌種可以利用現(xiàn)有的高產(chǎn)酒精的菌種進行發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵條件達到高 的收率。這種菌種包括畢赤酵母(戶/c/7&^p/to)、啤酒酵母CSacx/7araw_y￡^ce/"ev&/ae;)。4、 過程偶聯(lián)可以將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程進行偶 聯(lián)。采用合適的細胞在生物體內(nèi)同時進行生物轉(zhuǎn)化，直接將幾丁質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為乙醇或其它生 物能源物質(zhì)。偶聯(lián)過程所采用的菌種可以通過對現(xiàn)有的海洋中存在的能夠代謝幾丁質(zhì)的微生 物進行改造，使之能夠產(chǎn)生乙醇，或在產(chǎn)酒精的微生物中引入代謝幾丁質(zhì)的基因，通過一歩 發(fā)酵就可以實現(xiàn)幾丁質(zhì)的能源化。也可以通過共發(fā)酵的方法，采用一種微生物實現(xiàn)幾丁質(zhì)的 增溶，將幾丁質(zhì)水解為GluNAc，而另一種微生物以GluNAc為唯一碳源生產(chǎn)乙醇或其它生物 能源物質(zhì)，兩種微生物同時存在一個發(fā)酵體系中。5、 副產(chǎn)物的應(yīng)用 副產(chǎn)物的應(yīng)用是指在綜合利用幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的許多副產(chǎn)物。幾丁質(zhì)的水解增溶 過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以作為飼料進行加工，碳酸鈣可以用于工業(yè)生產(chǎn)；GluNAc轉(zhuǎn)化到6-磷酸果糖的過程中脫去的乙?；梢灾苯舆M入三羧酸循環(huán)，為微生物提供能量，或者轉(zhuǎn)化為 乙醇；脫去的氨基可以將其轉(zhuǎn)化為銨鹽，將其變?yōu)橐环N重要的氮源和化工原料。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的作進一步說明。圖h亞洲玉米螟總RNA提取，1: DL 2000 Marker; 2: RNA。圖2:幾丁質(zhì)水解酶基因調(diào)取中5'RACE后PCR鑒定，測序后正確。1: DL2000Marker; 2: PCR產(chǎn)物。圖3:幾丁質(zhì)水解酶基因的PCR擴增。h DL 2000 Marker; 2: PCR產(chǎn)物。圖4:幾丁質(zhì)水解酶連接到pFastBac HT A上之后的酶切鑒定。Ml: DNAMarker DL2000;M2: X-Hind III DNA Marker;1 4:對四個單克隆菌落DNA的酶切鑒定；5:酶切前的質(zhì)粒。圖5:Bacmid質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果。Ml: X國Hind III DNAMarker; M2: DNAMarkerDL2000;1 6:進行鑒定的6個單克隆菌落，發(fā)生轉(zhuǎn)座的bacmid產(chǎn)生約2430的片斷。 圖6:采用SOURCE 30Q對亞洲玉米螟粗酶液進行初步分離。蛋白質(zhì)280nm吸收； -酶活力。圖7:采用羥基磷灰石柱對粗酶液進行再次分離。蛋白質(zhì)280nm吸收；酶活力。 圖8:幾丁質(zhì)水解酶純化后電泳SDS—PAGE圖。1:純化后電泳樣品；M:蛋白質(zhì)Marker。
具體實施方式
實施例1、采用化學(xué)方法對幾丁質(zhì)進行預(yù)處理將原料浸泡到含有0.8 1.2M鹽酸的溶液中1~3小時，處理兩到三次以去除原料中含有 的碳酸鈣及無機鹽。再用40 70g/L的NaOH溶液處理2小時作用，處理三次以出去原料中 含有的蛋白質(zhì)。清洗后即完成了原料的預(yù)處理過程。2、以幾丁質(zhì)水解酶為例說明幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵酶的獲得、生產(chǎn)以及催化轉(zhuǎn)化方法。 2.1亞洲玉米螟幾丁質(zhì)水解酶基因的獲得 根據(jù)同源序列設(shè)計引物 C Fl: 5，-GACATRTTCCAYATGGGMGG-3， C Rl 5，-TCCGMCTGCTCBGACCACAG-3'使用TaKaRaRNAiso Reagent試劑盒從玉米螟中提取總RNA (附圖1)，變性后采用 Reverse Transcriptase M-MLV進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用上述引物，使用TakaraLATaq 進行PCR反應(yīng)，對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，對目的條帶進行回收測序。根據(jù)測序正確的序列和保守序列再進一步設(shè)計引物，通過類似的方法以cDNA為模 板進行PCR，進行獲得更多的序列。最后通過5'RACE和3'RACE獲得基因的5'端3'端， 完成基因的獲得(附圖2)。目的基因克隆到pMT18-T載體上。 2.2幾丁質(zhì)水解酶表達載體的構(gòu)建和體外重組表達1) 將水解酶基因克隆到桿狀病毒表達載體PFastBacTMHTA上 根據(jù)獲得的幾丁質(zhì)水解酶基因序列設(shè)計引物pET F1: 5 ， -TATTCCGGATTATTCATACC-3' pET Rl: 5 ，-TTCAGGTTCAGGGGGAGGTG-3'以含有目的基因的pMT-18T載體為模板，以上述引物進行PCR擴增(附圖3)，對擴 增產(chǎn)物和表達載體pFastBacTMHTA和進行酶切，回收后對相應(yīng)片斷進行連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5ot細胞。過夜培養(yǎng)，挑取但菌落進行PCR鑒定。提取陽性菌落，提取質(zhì)粒，進 一步進行酶切鑒定(附圖4)，最后進行測序。2) 生產(chǎn)重組Bacmid
將測序正確的含有目的基因的pFastBacTMHT A轉(zhuǎn)化Invitrogen MAX E伍ciency DH10Bac Competent Cells,培養(yǎng)48小時，挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定(附圖5)。鑒定正確的bacmid質(zhì)粒可用于感染細胞進行重組酶的生產(chǎn)。 2.3'天然幾丁質(zhì)水解酶(Chitinase)的分離純化得到的初始材料經(jīng)高速離心以及脫鹽柱凈化后，經(jīng)SOURCE 30Q分離(附圖6)。經(jīng) 分管收集洗脫峰并以對硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺pNP-GlcNAc為生色底物檢測，獲得了一 個活力組分。濃縮并脫鹽后，用羥基磷灰石柱(附圖7)， MonoQ進行分離，最后得到了 純酶(附圖8)。2.4采用幾丁質(zhì)酶在體外將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為幾丁單糖以幾丁質(zhì)顆粒為載體，采用戊二醛進行交聯(lián)，將幾丁質(zhì)酶固定在幾丁質(zhì)顆粒上，實現(xiàn) 幾丁質(zhì)酶的固定化。每0.1g幾丁質(zhì)與2mL5X的戊二醒交聯(lián)，酶與載體的比例為20mg/g。 取0.5g固定化酶與10mLl^的幾丁質(zhì)溶液在6(TC保溫，進行酶催化反應(yīng)，將可溶幾丁質(zhì) 轉(zhuǎn)化為幾丁單糖。 2.5幾丁質(zhì)水解酶活力測定方法取5pl酶，加入底物6pl 10mMpNP-P-GlcNAc和49nl5mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)， 30。C反應(yīng)5min,加入60[U 0.5 MNa2C03中止反應(yīng)。405nm下檢測酶活力。底物對硝基苯酚-N-乙酰葡糖胺《A《p-nitrophenyl 2隱acGtamido-2-deoxy-卩-D隱glucopyranoside (pNP-卩-GldSTAc)3、以畢氏酵母通過連續(xù)發(fā)酵將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)乙醇為例介紹微生物生 物轉(zhuǎn)化方法畢氏酵母菌的預(yù)培養(yǎng)從平板上挑取酵母菌落接種于100mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時， 對酵母進行活化。采用活化的酵母菌，以6-磷酸果糖為原料進行生物轉(zhuǎn)化獲得乙醇。每1L發(fā)酵培養(yǎng)基加
入lOOmL活化的酵母菌預(yù)培養(yǎng)液，流加糖濃度為200g/L，流速為20mL/h.控制溫度為30°C，pH7.0，連續(xù)發(fā)酵60小時。酵母預(yù)培養(yǎng)基成分酵母膏3.85g/L;蛋白棟3.0g/L; 6-磷酸果糖20g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基成分酵母膏3.85g/L;蛋白棟3.0g/L;流加糖為6-磷酸果糖。
權(quán)利要求
1、利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理；②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法，利用天然或重組的幾丁質(zhì)代謝酶系，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法，將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖；③以6-磷酸果糖作為碳源，采用生物轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)酵生產(chǎn)生物能源物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的原 料的預(yù)處理包括通過化學(xué)方法、物理方法，或微生物進行預(yù)處理，或利用幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP) 促進幾丁質(zhì)水解酶對幾丁質(zhì)的水解作用，促進其水解增溶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖的過程，可以利用篩選的微生物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，或利用分離純化獲得的幾丁質(zhì)代謝酶系在體外催化實現(xiàn)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的 微生物包括人工馴化的菌種，或人工改造的工程菌，可以是大腸菌目的大腸桿菌(Ewte^^" co/z')或沙雷氏菌(&rraria warcescera)，弧菌目的霍亂弧菌(W6n'o c/w/erae)以及鏈霉菌
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的幾 丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源物質(zhì)前體6-磷酸果糖所用的酶系，可以是分離純化提取的天然酶，也可 以是經(jīng)過基因工程手段進行體外重組表達，或經(jīng)過定點突變改造的重組酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征還在于所述的 幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖和利用6-磷酸果糖生產(chǎn)生物能源物質(zhì)這兩個過程獨立或組合進行。
7、 根據(jù)權(quán)利要求要求1所述的利用幾丁質(zhì)生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征在于，還包 括幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中副產(chǎn)物蛋白質(zhì)、碳酸鈣、乙?；?、氨基的生產(chǎn)和利用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法實現(xiàn)幾丁質(zhì)這種天然N-乙酰葡萄糖胺多聚物生產(chǎn)生物能源物質(zhì)的方法，其特征包括以下步驟①幾丁質(zhì)原料的預(yù)處理；②采用現(xiàn)代生物技術(shù)方法，利用天然或重組或人工改造的幾丁質(zhì)代謝酶系，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或體外催化的方法，將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物能源前體物質(zhì)6-磷酸果糖；③以6-磷酸果糖作為碳源，采用生物轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)酵生產(chǎn)酒精等生物能源物質(zhì)；轉(zhuǎn)化過程還涉及幾丁質(zhì)代謝過程中的其它副產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、碳酸鈣、乙?；?、氨基等的生產(chǎn)和利用。利用本發(fā)明提供的方法可為人類提供更多的可再生資源用于能量的生產(chǎn)，解決人類面臨的日益嚴重的能源短缺問題。
文檔編號C12R1/425GK101130799SQ20071001241
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者田 劉, 屈明博, 君 楊, 青 楊 申請人:大連理工大學(xué)