專利名稱：：太空誘變高效糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及空間誘變優(yōu)良微生物菌種，具體說是一種太空誘變高效糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微生物是與人類關(guān)系密切的一類微小生物體，具有種類的多樣性和功能的復(fù)雜性.在藥物的研發(fā)中某些微生物發(fā)揮了十分重要的作用，微生物藥物的研發(fā)主要環(huán)節(jié)包括菌種的選育，發(fā)酵工藝優(yōu)化，提取與精制工藝的研究等。早在十九世紀人們就發(fā)現(xiàn)被溶血性鏈球菌感染的癌癥患者腫塊自然消退的現(xiàn)象，人們先后發(fā)現(xiàn)很多微生物及其制劑有一定的藥理活性。浩瀚的太空疆域無垠，有著地面上難以想像的環(huán)境條件，在太空環(huán)境里，生物的變異與進化要比地面快成千上萬倍。因此，太空為發(fā)展新物種、新醫(yī)藥等提供了理想的實驗場所和生產(chǎn)基地。微生物空間誘變育種是制藥工業(yè)培育新菌種的一種有效方法。一個優(yōu)良的菌種可以在不增加或很少增加成本情況下大幅度提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。長期以來，我國采取自然選擇和理化因素進行微生物育種，得到的育種方法遠遠不能滿足制藥工業(yè)生產(chǎn)的需要，目前與國際上同類高產(chǎn)菌種相比，其生產(chǎn)效價有很大的差距。該菌種生產(chǎn)周期及發(fā)酵周期長，用于工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)量低，價格昂貴，使用范圍小，有效成份含量低。運用空間技術(shù)進行微生物誘變育種是培育新生物菌種的一種有效方法，其原理是通過外層空間特殊的物理化學(xué)環(huán)境，即微重力、強輻射、高能粒子、交變磁場及高真空的環(huán)境中，引起菌種DNA分子的變異和重組，菌種遺傳性狀發(fā)生改變，從而獲得生命力旺盛、生長速度快、代謝產(chǎn)物得率高、品質(zhì)優(yōu)良并可穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)高效菌種。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種太空誘變高效糞腸球菌的篩選制備方法，它利用太空特殊環(huán)境，將糞腸球菌菌林送入太空，遨游一定時間后安全返回，淘汰負向變異菌抹，選出性質(zhì)優(yōu)良的正向變異菌林進行復(fù)篩，最終得到生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、多肽含量高、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、生產(chǎn)適應(yīng)性強、具有空間累加效應(yīng)的優(yōu)良微生物菌種太空誘變高效糞腸球菌。本發(fā)明的另一目的是提供一種采用太空誘變高效糞腸球菌的發(fā)酵液在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的生產(chǎn)菌種，具有產(chǎn)量高、用途廣、成本低、有效成份含量高等特點。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明的技術(shù)方案是篩選一種經(jīng)過空間搭載，運用空間技術(shù)進行微生物誘變育種，通過外層空間特殊的物理化學(xué)環(huán)境，即微重力、強輻射、高能粒子、交變磁場及高真空的環(huán)境中，導(dǎo)致糞腸球菌菌林遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，引起菌種DNA分子的變異和重組，從而獲得生命力旺盛、生長速度快、品質(zhì)優(yōu)良的菌種，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種，以及它的制備與應(yīng)用。該菌種已于2007年10月19曰由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2221。一、太空誘變高效糞腸球菌的篩選1.經(jīng)太空搭栽的菌林返回地面后，立即對搭栽菌抹和對照菌林同時進行分離，避免太空誘變菌抹優(yōu)良性狀的丟失。菌林培養(yǎng)過程中嚴格控制培養(yǎng)溫度、濕度、通氣量與培養(yǎng)時間等條件，保證搭栽菌株與對照菌抹在同一條件下生長，仔細觀察菌落長出的時間，對于最先長出的菌落進行標記。為了增加菌種初篩量，每次分離需使用300400套平板，控制每個平板上的有效菌落數(shù)在60~70個。通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)搭栽菌林的生長速度明顯快于對照菌抹，而且菌落成熟較早，菌落生長飽滿，形態(tài)更規(guī)則，菌落平均直徑也大于對照菌抹。我們根據(jù)經(jīng)驗挑選20003000個生長良好的菌落，通過對其菌落特征、細胞形態(tài)的比較與鑒定，再挑選20%~30%接入斜面培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)成熟后，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進行深層靜置培養(yǎng)。每隔四小時取樣檢測發(fā)酵液PH、生物量、總糖含量、還原糖含量、活性物質(zhì)含量以及菌抹生長情況等，發(fā)現(xiàn)搭載菌抹在發(fā)酵液中的生長速度也明顯快于對照菌株，而且具有對原材料利用速度快、目的產(chǎn)物出現(xiàn)早等特點。根據(jù)測定結(jié)果篩選出高產(chǎn)菌株進行小試與中試，并且經(jīng)過對其遺傳穩(wěn)定性考察，確定了用于生產(chǎn)的太空誘變高效糞腸球菌。2.培養(yǎng)特征的研究通過培養(yǎng)，研究了太空誘變高效糞腸球菌對培養(yǎng)基在碳氮比、營養(yǎng)成分、pH、溫度、氧需求、發(fā)酵周期等方面的適應(yīng)情況變化，并根據(jù)變化及時進行相關(guān)生長參數(shù)的調(diào)整。確定太空誘變高效糞腸球菌的培養(yǎng)基成分、運行參數(shù)、pH、發(fā)酵周期等。3.生理生化反應(yīng)對經(jīng)航天搭載、太空誘變、地面篩選出的菌抹進行細胞形態(tài)特征觀察及其與地面對照菌林相關(guān)生理生化指標的對比觀察。生產(chǎn)菌林通過太空搭載，細胞的活性物質(zhì)增加，細胞生長豐茂飽滿，利用糖產(chǎn)酸現(xiàn)象比地面對照菌株有所改變，而地面對照菌林在某些糖的發(fā)酵中已失去產(chǎn)酸的能力。4.代謝產(chǎn)物的測定用化學(xué)法和儀器測試它的主要化學(xué)組分及結(jié)構(gòu)有無變化。通過實驗檢測:發(fā)現(xiàn)太空誘變高效糞腸球菌不僅發(fā)酵周期大大縮短，而且其發(fā)酵產(chǎn)物比對照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上。5.遺傳性狀及蛋白表達的研究DNA是決定遺傳的主要物質(zhì)，基因是遺傳的基本單位。由于基因突變會致使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，最后導(dǎo)致個體性狀的差異。因此，我們進行了菌抹的全細胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和菌抹的基因組DNA限制性酶切分析。菌抹培養(yǎng)后，用超聲波、溶菌酶、化學(xué)試劑等進行破壁，全細胞蛋白提取并制備DNA。通過聚丙烯酰胺凝膠分析得到的蛋白指紋圖鐠可見太空誘變高效糞腸球菌和地面對照菌株培養(yǎng)72h的蛋白圖譜存在差異，①在97KD分子量附近有三條帶有差異；②在66KD分子量附近有一條帶有差異；③在2031KD分子量之間有一條帶有差異?；蚪MDNA限制性酶切/PFGE圖譜，其中SmaI的酶切指紋圖諳比較有一備帶的差異。6.對選出的太空誘變高效糞腸球菌進行穩(wěn)定性分析連續(xù)傳代試驗，發(fā)現(xiàn)該菌林發(fā)酵周期縮短及發(fā)酵產(chǎn)物含量提高兩項指標穩(wěn)定，是可穩(wěn)定遺傳的變異。7.在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進行小試和中試在統(tǒng)計的十批實驗測定中，太空誘變高效糞腸球菌對數(shù)生長期大都提前至24小時左右，而地面對照菌的對數(shù)生長期則仍在48小時左右。發(fā)酵產(chǎn)物含量比對照組高出3-5倍(表l)。表1太空誘變高效糞腸球菌發(fā)酵周期及多肽含量情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>篩選出的太空誘變高效糞腸球菌與地面對照菌的對比特征是1、革蘭氏染色地面對照菌菌抹革蘭氏染色呈陽性"G+"，太空誘變高效糞腸球菌菌抹革蘭氏染色呈陽性"G+"2、形態(tài)特征太空誘變高效糞腸球菌菌株細胞呈球形或卵圓形，細胞大小為0.7~1.8inm，在液體培養(yǎng)基中以成對或鏈狀出現(xiàn)，無鞭毛，不生芽孢，細胞生長飽滿豐茂；地面對照菌菌林細胞呈球形或卵圓形，細胞大小為0.6~0.7inmx1.6~1.8ym,細胞生長中度，不太飽滿。3、培養(yǎng)特征太空誘變高效糞腸球菌菌抹在血平板或有機物平板上生長飽滿豐茂，菌落圓形，有突起，表面光滑，杏仁黃色，有光澤，略有粘性，半透明，菌膜生長有厚度，無色素產(chǎn)生；地面對照菌菌林在血平板或有機物平板上菌落有圓形，也有小顆粒狀，有突起，有光澤，略有粘性，半透明，生長中度，菌膜較薄，乳脂色，無色素產(chǎn)生。4、生理生化特征見下圖表_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>45TC生長354NaCL生長5%NaCL生長6.5WaCL生長接觸酶反應(yīng)牛奶凝固牛奶胨化明膠液化膽鹽V-P反應(yīng)吲味反應(yīng)七葉靈反應(yīng)精氨酸水解酶產(chǎn)生B-葡萄糖酸苷酸酶產(chǎn)生表3太空誘變高效糞腸球菌與地面對照菌菌林的糖利用試驗太空誘變高效糞腸球菌地面對照"5_糖類4長產(chǎn)酸生長產(chǎn)酸甘露糖++++甘露醇+++-麥*糖++++果糖++++_纖維二糖++++苦杏仁+++++鼠李糖++++_棉子糖+-+-密二糖+++-松三糖+_+_木糖+-++乳糖++++水楊苷++++阿拉伯糖++_+_海藻糖++++山梨醇++++核糖+++-<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5.太空誘變高效糞腸球菌與地面對照菌菌林的全細胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析和基因組DM限制性酶切分析結(jié)果全細胞蛋白SDS-PAGE分析SDS-PAGE得到的蛋白指紋圖譜(10%分離膠)。兩個測定菌林培養(yǎng)72h的蛋白圖譜存在差異，①在97KD分子量附近有三條帶有差異；②在66KD分子量附近有一條帶有差異；③在2031KD分子量之間有一條帶有差異?；蚪MDM限制性酶切分析Smal的酶切指紋圖語T-F與D-F比較有一條帶的差異。(二)太空誘變高效糞腸球菌的發(fā)酵制備工藝l.發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.1-0.9°/。，氯化鈉0.2-0.6%;經(jīng)滅菌溫度105-125。C，時間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用。(1)一級發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10%接種量接入滅菌后的一級發(fā)酵罐。罐壓不超過O.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌，在25-40。C恒溫培養(yǎng)10-50小時；(2)二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20%接種量接入滅菌后的二級發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa,通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌；在25-35。C恒溫培養(yǎng)50-100小時。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達到70-120°C,保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐。2.提純過程(l)發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1:15-25，控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液。(2)濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0%及活性炭2-4.0%加入進行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液。(3)濃縮液加入80-99%乙醇，體積量比控制在1:1.5-1:5.5或酌情而定。充分攪拌靜置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5,0,得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準確量取上清液體積，按上清液體積計算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分攪拌，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH,離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時，即得到太空誘變高效糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。所述的菌種是太空誘變高效糞腸球菌。所述的發(fā)酵液的制備方法是優(yōu)選普通糞腸球菌進行太空搭載，經(jīng)過空間誘變精心篩選培育出太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級發(fā)酵和二級發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純得到的。所述的發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干細胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善記憶功能、緩解視疲勞功能、促進排鉛功能、清咽功能、降血壓功能、改善睡眠功能、促進泌乳功能、緩解體力疲勞功能、提高缺氧耐受力功能、對輻射危害有保護功能、減肥功能、改善生長發(fā)育功能、增加骨密度功能、改善營養(yǎng)性貧血功能、對化學(xué)性肝損傷有保護功能、祛痤瘡功能、祛黃褐斑功能、改善皮膚水分功能、改善皮膚油份功能、調(diào)節(jié)腸道菌群功能、促進消化功能、通便功能、對胃粘膜損傷有保護功能等多方面的作用。本發(fā)明的特點是將普通糞腸球菌菌林進行太空搭載，利用航天器的工藝余量及它在太空中處于微重力、宇宙射線、交變磁場、高真空、高熱深冷、劇烈溫差、超潔凈等太空獨有的特殊環(huán)境的綜合作用，使菌株的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)斷裂，基因組發(fā)生重排，其變異幅度較大，有益變異增多，并可以獲得在地面誘變中較難得到的有效的微生物變異。返回地面后，對經(jīng)過太空搭載的菌株進行培養(yǎng)和篩選，通過研究其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達、遺傳穩(wěn)定性、中試生產(chǎn)指標等內(nèi)容，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳特性穩(wěn)定的太空誘變高效糞腸球菌菌抹，并形成規(guī)模化生產(chǎn)。附件材料l:2份中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏菌種保藏受理通知書復(fù)印件。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2007年10月19日，保藏編號2221,分類命名糞腸球菌Enterococcusfaecalis。附件材料2:搭載菌及地面菌的檢測鑒定報告；具體實施方案一、空間搭栽菌林的準備及搭載采用濾紙條、浸入介質(zhì)、砂土管等方法，將糞腸球菌進行了封裝，遨游太空一定時間后安全返回。返地后對搭載菌種進行了反復(fù)的培養(yǎng)和篩選，優(yōu)選出極少量的正變異菌抹。為使這種正向變異更加穩(wěn)定的遺傳，并且能夠出現(xiàn)累加優(yōu)化效應(yīng)，我們連續(xù)多次將該菌種進行太空搭載。在外層空間飛行的菌抹被置于一個與地球上生態(tài)環(huán)境完全不同的特殊環(huán)境中(微重力、高真空、高輻射、交變磁場等)，誘發(fā)菌林發(fā)生變異。變異后產(chǎn)生的新菌抹，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達等均發(fā)生明顯的變化。二、菌種選育1.經(jīng)太空搭栽的菌抹返回地面后，立即對搭載菌林和對照菌抹同時進行分離，避免太空誘變菌株優(yōu)良性狀的丟失。菌林培養(yǎng)過程中嚴格控制培養(yǎng)溫度、濕度、通氣量與培養(yǎng)時間等條件，保證搭載菌株與對照菌株在同一條件下生長，仔細觀察菌落長出的時間，對于最先長出的菌落進行標記。為了增加菌種初篩量，每次分離需使用300400套平板，控制每個平板上的有效菌落數(shù)在6070個。通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)搭載菌林的生長速度明顯快于對照菌株，而且菌落成熟較早，菌落生長飽滿，形態(tài)更規(guī)則，菌落平均直徑也大于對照菌林。我們根據(jù)經(jīng)驗挑選20003000個生長良好的菌落，通過對其菌落特征、細胞形態(tài)的比較與鑒定，再4兆選20%~30%接入斜面培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)成熟后，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進行深層靜置培養(yǎng)。每隔四小時取樣檢測發(fā)酵液PH、生物量、總糖含量、還原糖含量、活性物質(zhì)含量以及菌抹生長情況等，發(fā)現(xiàn)搭載菌抹在發(fā)酵液中的生長速度也明顯快于對照菌抹，而且具有對原材料利用速度快、目的產(chǎn)物出現(xiàn)早等特點。根據(jù)測定結(jié)果篩選出高產(chǎn)菌抹進行小試與中試，并且經(jīng)過對其遺傳穩(wěn)定性考察，確定了用于生產(chǎn)的太空誘變高效糞腸球菌。2.培養(yǎng)特征的研究通過培養(yǎng)，研究了太空誘變高效糞腸球菌對培養(yǎng)基在碳氮比、營養(yǎng)成分、pH、溫度、氧需求、發(fā)酵周期等方面的適應(yīng)情況變化，并根據(jù)變化及時進行相關(guān)生長參數(shù)的調(diào)整。確定太空誘變高效糞腸球菌培養(yǎng)基成分、運行參數(shù)、pH、發(fā)酵周期等。(3)生理生化反應(yīng)對經(jīng)航天搭載、太空誘變、地面篩選出的太空誘變高效糞腸球菌進行細胞形態(tài)特征觀察及其與地面對照菌抹相關(guān)生理生化指標的對比觀察。生產(chǎn)菌抹通過太空搭載，細胞的活性物質(zhì)增加，細胞生長豐茂飽滿，利用糖產(chǎn)酸現(xiàn)象比地面對照菌林有所改變，而地面對照菌株在某些糖的發(fā)酵中已失去產(chǎn)酸的能力。(4)代謝產(chǎn)物的測定用化學(xué)法和儀器測試它的主要化學(xué)組分及結(jié)構(gòu)有無變化。通過實驗檢測:發(fā)現(xiàn)太空誘變高效糞腸球菌不僅發(fā)酵周期大大縮短，而且其發(fā)酵產(chǎn)物比對照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上。(5)遺傳性狀及蛋白表達的研究DNA是決定遺傳的主要物質(zhì)，基因是遺傳的基本單位。由于基因突變會致使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，最后導(dǎo)致個體性狀的差異。因此，我們進行了菌抹的全細胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和菌林的基因組DNA限制性酶切分析。菌林培養(yǎng)后，用超聲波、溶菌酶、化學(xué)試劑等進行破壁，全細胞蛋白提取并制備DNA。通過聚丙烯酰胺凝膠分析得到的蛋白指紋圖譜可見太空誘變高效糞腸球菌與地面對照菌抹培養(yǎng)72h的蛋白圖譜存在差異，①在97KD分子量附近有三條帶有差異；②在66KD分子量附近有一條帶有差異；③在20~31KD分子量之間有一條帶有差異?；蚪MDNA限制性酶切/PFGE圖譜，其中SmaI的酶切指紋圖譜太空誘變高效糞腸球菌與地面對照菌林比較有一條帶的差異。(6)對選出的太空誘變高效糞腸球菌進行穩(wěn)定性分析連續(xù)傳代試驗，發(fā)現(xiàn)該菌林發(fā)酵周期縮短及發(fā)酵產(chǎn)物含量提高兩項指標穩(wěn)定，是可穩(wěn)定遺傳的變異。(7)在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進行小試和中試在統(tǒng)計的十批實驗測定中，太空誘變高效糞腸球菌對數(shù)生長期大都提前至24小時左右，而地面對照菌的對數(shù)生長期則仍在48小時左右。發(fā)酵產(chǎn)物含量比對照組高出3-5倍。結(jié)果表明空間誘變及地面篩選出的太空誘變高效糞腸球菌基因有變異。普通糞腸球菌菌林經(jīng)太空搭栽誘變，地面上的篩選、分離和純化后，選育出發(fā)酵單位更高、產(chǎn)量更高的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)菌林太空誘變高效糞腸球菌。該突變菌株在遺傳上穩(wěn)定，有較強的生產(chǎn)適應(yīng)性，發(fā)酵含量比對照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上。三、具體制備工藝(一)太空菌種的制備以經(jīng)過空間誘變育種精心選育的太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種。1.斜面種子制備按配比配制斜面培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%，葡萄糖0.1-0.8%,氯化鈉0.2-0.6%，瓊脂1-5%，綿羊血5-10%;pH7.0-7.4;斜面培養(yǎng)基經(jīng)在溫度105-125°C，時間20-30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后待用；啟封菌種冷凍管，在無菌條件下接入血斜面，接種后置25-40。C恒溫培養(yǎng)24-30小時。2.搖瓶種子液制備按配比配制搖瓶培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%,蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.8%,氯化鈉0.2-0.6%;pH7.0-7.4;搖瓶培養(yǎng)基經(jīng)在溫度105-125。C，時間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后待用；將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按1-9%接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基內(nèi)，25-40。C恒溫培養(yǎng)10-30小時。(二)發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8%，酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.9%,氯化鈉0.2-0.6%;經(jīng)滅菌溫度105-125°C，時間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用。l.一級發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10%接種量接入滅菌后的一級發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa,通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌，在25-40。C恒溫培養(yǎng)10-50小時；2.二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20%接種量接入滅菌后的二級發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌；在25-35。C恒溫培養(yǎng)50-100小時。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達到70-120°C,保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐。(三)提純過程1.發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1:15-25，控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液。2.濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0%及活性炭2-4.0%加入進行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液。3.濃縮液加入80-99%乙醇，體積量比控制在1:1.5-1:5.5或酌情而定。充分攪拌靜置后，離心去除上清液,沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準確量取清液體積，按上清液體積計算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分攪拌，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時，即得到太空誘變高效糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。四、上述方法得到的太空誘變高效糞腸球菌發(fā)酵物的檢驗[性狀]本品為白色或微黃色無定形粉末；無臭、無味。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。比旋度取本品，精密稱定，加水溶解并稀釋成每lml中約含lOmg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄vlE)，比旋度為+70。C至+80°C。1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a—萘酚乙醇溶液(5-100)lml，搖勻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml,數(shù)分鐘后，界面呈紫紅色。2.取本品，加水制成每lml中含lmg的溶液，取約lOul點于濾紙上，晾干，用無水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸鈉溶液1.5ml與乙醇100ml，混勻即得。置暗處保存，可使用數(shù)月)中浸泡5分鐘，取出，用70%乙醇溶液沖洗，置還原液(取碘化鉀5g，硫代硫酸鈉5g，加水lOOml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L鹽酸液2.5ml，隨加隨攪拌，臨用時配)中浸泡5分鐘，取出，用70%乙醇溶液沖洗，置品紅亞疏酸試液中浸泡約30分鐘，取出，用焦亞碌u酸鈉溶液(取焦亞硫酸鈉0.4g，加鹽酸lml，加水溶解使成lOOml，即得)，沖洗，晾干，在濾紙片點樣處應(yīng)呈紫紅色。3、取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每lml中含lmg的溶液作為供試品溶液和對照品溶液，按免疫原性測定法試驗，供試品和對照品管應(yīng)均無溶血發(fā)生。l、酸度取本品，加水制成每lml中含IOmg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄VIH),pH值應(yīng)為3.0-5.0。2、吸收度取本品，加水制成每lml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VIA)，在260nm的波長處，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波長處，其吸收度不得大于0.20。3、總氮量取本品，照氮測定法(中國藥典2000年版二部附錄WD第二法)測定.按干燥品計算，含總氮量應(yīng)為0.8-2.0%。4、免疫原性取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每lml中含lOmg的溶液，再分別用磷酸鹽緩沖液制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的稀釋液作為供;式品溶液和對照品溶液，依法檢查(附免疫原性測定法)，供試品不溶血管的最低濃度應(yīng)不得高于對照品相應(yīng)濃度的一倍以上。5、干燥失重取本品，在105。C干燥至恒重，減失重量不得過5.0%(中國藥典2000年版二部附錄VEIL)。6、重金屬取本品，在l.Og，依法檢查(中國藥典2000年版VIH)含重金屬不得過百萬分之二十。7、異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每lml中含0.5mg的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版附錄XIC).按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定(供注射用)。五、發(fā)酵物中有效成分含量測定1.對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105"C干燥至恒重的D""甘露糖對照品O.lg置lOOml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度.搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻.每lml中含甘露糖50ug。2.供試品溶液備取本品適量，精密稱定，加水溶解制成每lml中含40ug的溶液。3.標準曲線的制備精密稱取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml，分別置具塞試管中，各加水至l.Oml，再加3%苯酚溶液l.Oml，搖勻，沖入硫酸4.5ml，搖勻，放置于室溫，以O(shè)管為空白.照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)在490nm的波長處測定吸收度。以甘露糖ug數(shù)對相應(yīng)的吸收度，計算回歸方程。3.測定法精密量取供試品溶液1.Oml,照標準曲線制備項下自"再加3%苯酚溶液l.Oml"起，依法操作，測定吸收度，由回歸方程計算甘露糖的含量。六、免疫原性測定法(補體結(jié)合法)；1、試液A.酸鹽緩沖液(pH7.2)取氯化鈉8.5g、磷酸氫二鈉0.565g及磷酸二氫鉀0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10%硫酸鎂溶液lml，搖勻。8.1%羊紅細胞懸液羊血紅細胞的制備由綿羊頸靜脈無菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸鈉8.0g、氯化鈉4.2g,枸椽酸5.5g,加水至1000ml使溶解，100。C滅菌30分鐘)的無菌容器中，4""C保存。1%羊血紅細胞懸液的制備取上述羊血紅細胞適量，用氯化鈉注射液洗滌三次，每次離心5分鐘(2000轉(zhuǎn)/分)，取壓積羊血紅細胞，用氯化鈉注射液制成1%羊血紅細胞懸液。取懸液，用氯化鈉注射液稀釋20倍制成供試品溶液，另取等量懸液加水稀釋20倍作為空白溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)，在541nm的波長處測定，其吸收度應(yīng)為0.65-0.70，如超出限度應(yīng)調(diào)節(jié)1%羊紅細胞懸液的濃度。C.溶血素及致敏羊血紅細胞溶血素的制備取上述壓積羊血紅細胞，用氯化鈉注射液制成25%羊血紅細胞懸液.取家兔1只，靜脈注射上述羊血紅細胞懸液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分離血清，56°C.30分鐘滅活，分裝，0。C以下保存。溶血素單位的測定取溶血素適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000的稀釋液，各取0.1ml置試管中，力卩1%羊血細胞懸液0.1ml,搖勻，加稀釋度為1:30的豚鼠血清(補體)0.2ml及磷酸鹽緩沖液0.2ml，搖勻，37。C保溫30分鐘，完全溶血管的最高稀釋度為1單位溶血素。致敏羊血紅細胞的制備臨用前，將2%的羊血紅細胞懸液與2單位溶血索等體積混合，37。C保溫15分鐘即得。補體:取三只以上的豚鼠，心臟采血，離心分離血清，0。C以下保存。補體單位的測定取補體適量，加磷酸鹽緩沖液，分別制成1:40、1:60、1:80、1:100、1:120、1:140、1:160、1:180的稀釋液，各取0.2ml置試管中，加0.2ml磷酸鹽緩沖液，搖勻，37。C保溫30分鐘后，分別加致敏羊血紅細胞0.2ml,搖勻，37。C再保溫30分鐘.完全溶血管的最高稀釋度為1單位的補體。抗體取對照品適量，加氯化鈉注射液制成每lml中含10mg的對照品溶液免疫家兔，隔日采用耳靜脈注射對照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射l.Oml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，離心分離血清，56。C下30分鐘滅活，分裝，0。C以下保存(臨用前，需56。C30分鐘再次滅活)?？贵w單位的測定取抗體適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32.1:64、1:128的稀釋液，各取0.1ml置試管中，加對照品溶液0.1ml及2單位補體O.2m]，搖勻，于4-8。C放置4小時以上，置37°C保溫30分鐘，不溶血管的最高稀釋度為1單位抗體。同時設(shè)抗原(不加抗體，以O(shè).lml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、補體(不加抗原，抗體，以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管，以上三種對照管應(yīng)全溶血；另設(shè)的致敏羊血紅細胞(不加抗原、抗體和補體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管應(yīng)不溶血。2、免疫原性測定法取對照品與供試品適量，照藥品項下的規(guī)定制成不同濃度的對照品溶液和供試品溶液，各取0.1ml置試管中，加入2單位抗體0.1ml及2單位補體0.2ml.搖勻，于4-8。C放置4小時以上，置37。C保溫30分鐘，加入致敏羊血紅細胞0.2ml，搖勻，37。C再保溫30分鐘。觀察各管的溶血情況，不溶血管的最低濃度代表對照品的免疫原性。同時設(shè)抗原(不加抗體，以O(shè).lml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以O(shè).lml磷酸鹽緩沖液代替)、補體(不加抗原、抗體、以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管，以上三種對照管應(yīng)全溶血另設(shè)的致敏羊血紅細胞(不加抗原、抗體和補體，以o.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管應(yīng)不溶血。權(quán)利要求1、太空誘變高效糞腸球菌的篩選制備方法，其特征在于篩選一種經(jīng)過空間搭載，運用空間技術(shù)進行微生物誘變育種，通過外層空間特殊的物理化學(xué)環(huán)境，即微重力、強輻射、高能粒子、交變磁場及高真空的環(huán)境中，導(dǎo)致于2007年10月19日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2220的糞腸球菌的遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，引起菌種DNA分子的變異和重組，從而獲得生命力旺盛、生長速度快、品質(zhì)優(yōu)良的菌種，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種；該菌種已于2007年10月19日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2221；(一)太空誘變高效糞腸球菌的篩選如下經(jīng)太空搭載的菌株返回地面后，立即對搭載菌株和對照菌株同時進行分離，避免太空誘變菌株優(yōu)良性狀的丟失；菌株培養(yǎng)過程中嚴格控制培養(yǎng)溫度、濕度、通氣量與培養(yǎng)時間等條件，保證搭載菌株與對照菌株在同一條件下生長，仔細觀察菌落長出的時間，對于最先長出的菌落進行標記。為了增加菌種初篩量，每次分離需使用300～400套平板，控制每個平板上的有效菌落數(shù)在60～70個；通過觀察，發(fā)現(xiàn)搭載菌株的生長速度明顯快于對照菌株，而且菌落成熟較早，菌落生長飽滿，形態(tài)更規(guī)則，菌落平均直徑也大于對照菌株；驗挑選2000～3000個生長良好的菌落，通過對其菌落特征、細胞形態(tài)的比較與鑒定，再挑選20％～30％接入斜面培養(yǎng)；斜面培養(yǎng)成熟后，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進行深層靜置培養(yǎng)；每隔四小時取樣檢測發(fā)酵液PH、生物量、總糖含量、還原糖含量、活性物質(zhì)含量以及菌株生長情況等，發(fā)現(xiàn)搭載菌株在發(fā)酵液中的生長速度也明顯快于對照菌株，而且具有對原材料利用速度快、目的產(chǎn)物出現(xiàn)早等特點；根據(jù)測定結(jié)果篩選出高產(chǎn)菌株進行小試與中試，并且經(jīng)過對其遺傳穩(wěn)定性考察，確定了用于生產(chǎn)的太空誘變高效糞腸球菌；(二)太空誘變高效糞腸球菌的發(fā)酵制備工藝1.發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化鈉0.2-0.6％；經(jīng)滅菌溫度105-125℃，時間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用；(1)一級發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10％接種量接入滅菌后的一級發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌，在25-40℃恒溫培養(yǎng)10-50小時；(2)二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20％接種量接入滅菌后的二級發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌；在25-35℃恒溫培養(yǎng)50-100小時。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達到70-120℃，保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐；2.提純過程(1)發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-25，控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液；(2)濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0％及活性炭2-4.0％加入進行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液；(3)濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分攪拌靜置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準確量取上清液體積，按上清液體積計算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分攪拌，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時，即得到太空誘變高效糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。2.太空誘變高效糞腸球菌的發(fā)酵制備工藝1.發(fā)酵過程所述發(fā)酵過程的發(fā)酵培養(yǎng)基是牛肉膏0.2-0.8%,酵母膏0.2-0.8%，蛋白胨0.3-0.8%,葡萄糖0.1-0.9%,氯化鈉0.2-0.6%;經(jīng)滅菌溫度105-125°C，時間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.13Mpa滅菌后備用;(1)一級發(fā)酵罐將優(yōu)良的搖瓶菌種在無菌條件下按1-10%接種量接入滅菌后的一級發(fā)酵罐。罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌，在25-40。C恒溫培養(yǎng)10-50小時；(2)二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20°/。接種量接入滅菌后的二級發(fā)酵罐，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分攪拌；在25-35。C恒溫培養(yǎng)50-100小時。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達到70-120°C,保溫20-60分鐘，冷卻靜置后放罐；2.提純過程(l)發(fā)酵液濃縮將發(fā)酵后的發(fā)酵液用濃縮器進行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1:15-25,控制pH7.0-7.4制成發(fā)酵濃縮液；(2)濃縮液的精制提純濃縮液按珍珠巖1-2.0%及活性炭2-4.0%加入進行精制提純，攪拌10-20分鐘，過濾后再抽濾提純，制成發(fā)酵精制液;(3)濃縮液加入80-99%乙醇，體積量比控制在l:1.5-1:5.5或酌情而定。充分攪拌靜置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準確量取上清液體積，按上清液體積計算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分攪拌，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH,離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測合格為止，得到的沉淀物真空干燥3-8小時，即得到太空誘變高效糞腸球菌生產(chǎn)的發(fā)酵物。2、太空誘變高效糞腸球菌的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)太空誘變高效糞腸球菌發(fā)酵制備的發(fā)酵液，是將優(yōu)選普通糞腸球菌進行太空搭載，經(jīng)過空間誘變精心篩選培育出太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級發(fā)酵和二級發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純得到的；所述的發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗胂瘤的功能、抗炎功能、刺激骨髓造血干細胞的功能、降血脂功能、降血糖功能、抗氧化功能、改善記憶功能、緩解視疲勞功能、促進排鉛功能、清咽功能、降血壓功能、改善睡眠功能、促進泌乳功能、緩解體力疲勞功能、提高缺氧耐受力功能、對輻射危害有保護功能、減肥功能、改善生長發(fā)育功能、增加骨密度功能、改善營養(yǎng)性貧血功能、對化學(xué)性肝損傷有保護功能、祛痤瘡功能、祛黃褐斑功能、改善皮膚水分功能、改善皮膚油份功能、調(diào)節(jié)腸道菌群功能、促進消化功能、通便功能、對胃粘膜損傷有保護功能等多方面的作用。全文摘要本發(fā)明涉及空間誘變優(yōu)良微生物菌種，具體說是一種太空誘變高效糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用。糞腸球菌為腸球菌屬中最常見的即為代表種，糞腸球菌生活在人體腸道里，通常對人體不僅無害而且有益。但它有時也會引發(fā)嚴重感染，并對抗生素有抵抗力。本發(fā)明優(yōu)選普通糞腸球菌進行太空搭載，經(jīng)過空間誘變精心篩選培育出太空誘變高效糞腸球菌作為生產(chǎn)菌種，其生命力旺盛、生長速度快、發(fā)酵單位高、發(fā)酵周期短、發(fā)酵產(chǎn)物含量高、生產(chǎn)適應(yīng)性強的菌株作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)一級發(fā)酵和二級發(fā)酵，將發(fā)酵液精制提純，其發(fā)酵液具有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤等功能。文檔編號C12N13/00GK101298598SQ20071001899公開日2008年11月5日申請日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者衛(wèi)孫申請人:衛(wèi)孫