專利名稱：：月季RcHsp17.8編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生理學(xué)以及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種在月季中表達(dá)的RcHsp17.8(月季熱激蛋白,RosachinensisHeatshockprotein,RcHspl7.8)的克隆，拷貝數(shù)分析，基因表達(dá)模式分析，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因菌株的獲得及其耐熱、耐冷性能鑒定。
背景技術(shù)：
：由于"溫室效應(yīng)"現(xiàn)象日益明顯，全球氣溫持續(xù)升高，夏季高溫已成為制約植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子，植物生長(zhǎng)發(fā)育面臨高溫逆境的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。熱激蛋白(heatshockprotein,HSPs)是HSPs—類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的蛋白，根據(jù)分子質(zhì)量大小將其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子熱激蛋白(smHSPs)。smHSPs包括細(xì)胞質(zhì)I類smHSPs、細(xì)胞質(zhì)II類smHSPs、葉綠體smHSPs、線粒體smHSPs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)smHSPs。熱激蛋白是植物對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。有機(jī)體在受到逆境脅迫后，體內(nèi)變性蛋白急劇增加，熱激蛋白可以與變性蛋白結(jié)合，維持它們的可溶狀態(tài)，在有Mg"和ATP的存在下使解折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成有活性的構(gòu)象。已有研究證明HSPs的主要功能是參與新生肽的折疊以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性、降解，維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，起分子伴侶(molecularchaperones)的作用。雖然植物熱激蛋白的研究起步較晚，但已成為當(dāng)今分子生物學(xué)，蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，其中心問題是HSPs的生物學(xué)功能。許多研究表明，HSPs的生成量與生物耐熱性呈正相關(guān)。也有研究表明HSPs與植物的抗冷性相關(guān)，Collins等(1995)首先證實(shí)了HSPs和耐冷性的直接關(guān)系；Adnan等(1998)證明熱激下產(chǎn)生的smHSP能夠減輕番茄冷傷害。Alvaro等(1999)實(shí)驗(yàn)證明，將栗子(Castaneasativa)CsHSP17.5基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌顯著提高轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)高溫(50°C)及低溫(4°C)的耐受性。隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來越受到人們關(guān)注，研究觀賞植物對(duì)溫度逆境抗性的遺傳機(jī)制有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明研究了一種從月季中克隆小分子熱激蛋白基因，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌后提高轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)高溫、低溫抗性的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)不僅可以提高原核生物的溫度抗性，而且預(yù)期可以提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中提及的月季RcHspl7.8序列及其核酸序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的月季基因ic他^7.S(SEQIDNO.l)，該基因是一個(gè)胞質(zhì)ClassI小分子熱激蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供這種月季熱激蛋白R(shí)cHspl7.8編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大腸桿菌對(duì)高溫、低溫耐受性的應(yīng)用。本發(fā)明一方面從月季分離出了一種DNA分子，其核苷酸序列見SEQIDNO.l所示。它是一種小分子熱激蛋白基因，該基因長(zhǎng)度為465bp。本發(fā)明另一方面得到了一種蛋白質(zhì)分子，它編碼具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽，由154個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為17885.33道爾頓，pi為8.876。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)JcH^J7.SmRNA表達(dá)模式的方法，其步驟如下(1)耐熱性能差異顯著的兩個(gè)月季品種二年生嫁接苗于25'C常溫及38'C熱激處理3小時(shí)，分別提取它們嫩葉的總RNA(RNAplant，市售)。(2)利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)ic/^^7.S的開放讀框的第1-20，446-465的特異序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR。本發(fā)明還提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼月季熱激蛋白R(shí)cHSP17.8的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到大腸桿菌以提高其溫度耐受性的方法，其步驟如下(1)將icf/S/V7.S基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達(dá)載體，形成含有該基因的原核表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞，將含表達(dá)載體的大腸桿菌在液體LB(Amp+，終濃度為100mg/L)振蕩培養(yǎng)G7。C，220rpm)至OD600-0.6;加入IPTG(終濃度為1mmol/L)后在相同條件下振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，OD600達(dá)L0，將菌液作如下處理(1)取菌液稀釋至1000Cell/ml，吸取其中100ul進(jìn)行涂板(LB,Amp+)，4°C，分別暗培養(yǎng)0、2、4、6、8、12天后轉(zhuǎn)至37'C過夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)。將菌液轉(zhuǎn)至50。C搖床，220rpm分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、3、4、5小時(shí)，菌液稀釋至1000Cell/ml，吸取其中100ul進(jìn)行涂板(LB，Amp+)，37。C過夜暗培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)。上述步驟均以轉(zhuǎn)空載菌株作平行對(duì)照。(3)通過篩選(如抗生素篩選)，PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并最終再生轉(zhuǎn)基因菌株。轉(zhuǎn)基因菌株耐熱、耐冷性能增加。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)樣品中月季ic歷p〃.S基因拷貝數(shù)的方法，包括SEQIDNO.l序列中的部分序列與樣品雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合；其中，所述樣品是月季基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸序列。本發(fā)明還提供用于鑒定含重組子的大腸桿菌陽性克隆的核酸分子，包含SEQIDNO.l所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和446-465個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)樣品中是否存在月季ic/^p77.S基因核苷酸序列的方法，包括用包含SEQIDNO.l所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和446-465個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的片段；這里，所述樣品為轉(zhuǎn)基因大腸桿菌菌株。在本發(fā)明中，術(shù)語"月季ic/^^7.S基因的開放閱讀框"指編碼完整的月季RcHSP17.8蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.l中第1一465位的核苷酸序列。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。此外，還可用Southern印跡法技術(shù)分析月季icH^77.S在細(xì)胞中存在的數(shù)量。表l為本發(fā)明的月季icH^77.S與蘋果(Malusdomestica)Md/fo/的核苷酸序列(GenBankAccessionNo.AF161179)的同源性比較(FASTA)表。表2為本發(fā)明的月季RcHspl7.8與蘋果MdHsp的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAF34133.1)的同源性比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用"+"標(biāo)出。圖l為月季icHyp基因的Southernblot鑒定。其中，lanel:Marker;lane2:BglII酶切基因組；lane3:BglII酶切基因組探針顯影；lane4:Dral酶切基因組；lane5:Dral酶切基因組探針顯影。圖2為RT-PCR鑒定月季icHs;p基因的表達(dá)模式。其中，上圖為RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，下圖為相應(yīng)的actin對(duì)照，lanel:'曼海姆'38。C熱激；lane2:'新十全'38。C熱激;lane3:'曼海姆'25'C常溫；lane4:'新十全'25。C常溫。圖3為含重組子和空載的菌株對(duì)4i:低溫的不同耐性。圖4為含重組子和空載的菌株對(duì)5(TC高溫的不同耐性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLabortaryPress,1989)中所敘述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l，月季及dfc/^7.S基因的克隆1.將耐熱性強(qiáng)的月季品種'曼海姆宮殿'(Schlossmannieim)(以下簡(jiǎn)稱'曼海姆')和耐熱性弱的(新十全，(Kordes'Perfecta)進(jìn)行38。C熱激3小時(shí)，提取葉片的可溶性總蛋白，采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，雙向電泳后對(duì)其中差異明顯的l個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜的分析，并檢索不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定與功能預(yù)測(cè)，結(jié)合分析軟件分析的表觀等電點(diǎn)、分子量和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果進(jìn)行綜合分析，初步認(rèn)定此蛋白質(zhì)點(diǎn)為Hsp17.8。2.提取熱激處理后的'曼海姆'嫩葉總RNA，提取試劑盒為RNApIant(市售)，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)其他植物smHsp同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，釆用RT-PCR方法從'曼海姆'cDNA中擴(kuò)增出一條317bp的條帶。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用SP6和T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的小分子熱激蛋白基因序列高度保守。在該片段序列中設(shè)計(jì)3對(duì)反向PCR引物。3.基因組DNA的提取取'曼海姆'嫩葉片，研成液氮粉，立即加入預(yù)熱的提取緩沖液，65'C保溫25min，離心，上清以等體積的氯仿/異戊醇(24/l)抽提2次，以乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗滌兩次，最后用TE溶解DNA;加入RNaseA(0.5lig/ml)，65'C消化RNAlh;用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的質(zhì)量。4.用限制性內(nèi)切酶EcoRI對(duì)基因組DNA進(jìn)行充分酶切，純化并回收酶切后的片段，以T4連接酶催化片段首尾自連成環(huán)。以自連后的片段作反向PCR模板，以上述3對(duì)反向引物進(jìn)行三輪巢式PCR，獲得一461bp片段，回收、純化，連接到T-載體上，測(cè)序，序列分析后獲得基因的5'端序列。5.3'-RACE獲得icHsp77.S基因3，端用3'-RACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒(市售)將'曼海姆'嫩葉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作3'-RACE模板，以上述3對(duì)反式PCR引物的正向引物(5'-3')分別與3'-RACE引物AUAP配對(duì)進(jìn)行三輪巢式PCR;回收獲得的325bp片段，純化，連接到T-載體上，測(cè)序，序列分析后獲得基因的3'端序列。6.全長(zhǎng)基因的克隆根據(jù)基因5'、3'端序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從'曼海姆'cDNA中擴(kuò)增出一條465bp的條帶。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序，其核苷酸序列為SEQIDNO.l。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的小分子熱激蛋白序列高度保守。實(shí)施例2月季及c好印W《基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的月季^￡^^^/7.<5基因長(zhǎng)度為465&，詳細(xì)序列見SEQIDNO.l。該基因編碼的多肽由154個(gè)氨基酸殘基組成，分子量17885.33道爾頓，pi為8.876。詳細(xì)序列見SEQIDN0.2。將月季ic他"77.S全長(zhǎng)基因的編碼區(qū)序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列用BLAST程序再Non—redundantGeneBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non—redundantGeneBankCDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與蘋果M^Z^存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與蘋果M^/^基因的mRNA編碼序列(GeneBankAccessionNo.D63953.1)有一定的同源性(見表l)，在氨基酸水平上，它與蘋果MdHsp蛋白的氨基酸殘基有83X的相似性(見表2)。由上可見，該月季ic他p77.S基因與蘋果M^/^基因存在較高的同源性，實(shí)施例3月季及cfl^/Z《基因的拷貝數(shù)分析以CTAB方法大量抽提月季基因組DNA，取10嗎DNA分別用Dral和BglII酶切，以0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行片段分離，將DNA轉(zhuǎn)到Hybond—N+尼龍膜上，固定；以月季ic/Z印77.S基因中317bp片段為探針進(jìn)行Southern雜交，鑒定它在月季中的拷貝數(shù)，結(jié)果表明，ic/ftp77.S基因?yàn)榈涂截?。?shí)施例4月季及ci^/77Z《表達(dá)模式分析用RT—PCR的方法檢測(cè)分別取25'C(常溫)及38'C熱激3h的'曼海姆'和'新十全，嫩葉提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)ic/ft;^7.《基因特異序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR。電泳之后，用相對(duì)定量軟件(天程公司)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，常溫下，ic/ftp/7.《在兩個(gè)月季品種中均不表達(dá)，熱激后'曼海姆，表達(dá)而'新十全，不表達(dá)。實(shí)施例5月季及cfls/^7J基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)含目的基因(月季ic/^;^7.S)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)月季RcHspl7.8基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增除終止子TAA之外的編碼閱讀框，并在正、反向引物上分別引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)SacI和SalI，以便構(gòu)建原核表達(dá)載體。以實(shí)施例l中獲得的'曼海姆，cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將月季ic/Z^77.S基因正向克隆到原核表達(dá)載體PET32a中，在保證閱讀框架的前提下，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行原核表達(dá)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Query為月季yc〃sp/7.《基因核苷酸序列Sbjct為蘋果^/〃s;0基因核苷酸序列(GenBankAccessionNo.AF161179)表2月季/fc^印7Z6"編碼的蛋白質(zhì)序列與蘋果MdHsp蛋白的氨基酸序列同源性比較gi|6969974|gb|AAF34133.1|AF16"79Jlowmolecularweightheatshockprotein[MaIusxdomestica]Length-160Score=373bits(872),Expect=9e_102Identities=126/160(78%),Positives=144/160(90%),Gaps=6/160(3%)Query1MSLIPNFRR--NSVFD---LDLWDPFRDFQFPSSS-LSTFPEFPGENSAFINTRIDWKET54MSLIPNRR+SVFDL+LWDPF+DFFPSSSLSFPEFENSAF+NTR+DWKETSbjct1MSLIPNSRRGSSSVFDPFSLNLWDPFKDFPFPSSSSLSAFPEFSRENSAFVNTR麗KET60Query55PEAHVFKADLPGLKKEEVKVEIENDRVLQISGERKIEKEDKNDKWHRVERSSGKFSRRFR114PEAHVFKAD+PGLKKEEVKVE+E+DRVL+ISGER+E+EDKNDKW+RVERSSGKFRRF+Sbjct61PEAHVFKADVPGLKKEEVKVEVEDDRVLKISGERNVEEEDKNDKWYRVERSSGKFLRRFQ120Query115LPENAKLDEIKAAMENGVLRVTVPKAKVKRPDVKAIEISG154LPENAK+D+IKAAMENGVLVTVPKA++KDV+AIEISGSbjct121LPENAKV叫IKAAMENGVLSVTVPKAELKNVDVRAIEISG160Query為月季RcHspl7.8氨基酸序列Sbjct為蘋果MdHsp氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAF34133.1)本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下-(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度465bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核酸(iii)序列描述SEQIDNO.11atgtcgcttatcccaaatttccgacgaaacagcgtcttcgacctcgatctctgggaccca61ttC3ggg3tttccaattcccttcttxatctctctccacattccctgaatttcctggcgag121aattcggctttcatcaacacc已ggatcgactgga鄉(xiāng)卿ccccagaagcccatgtgttc181aaggccgaccttccggggctgaag3a3gsagaggtcaaggttgagattgaaaatgacagg241gtgctgc卿tc鄉(xiāng)gg卿g卿3gg3ggC朋gtggC3C301cgggtcg卿g鄉(xiāng)cagcggcaagttctcc郷aggttcaggcttcctgagaatgcgaag361cttgatgagattaaggctgctatggag犯tggagttctcagggtgactgttcctaaggca421犯ggtga卿ggcctgatgtcaaagccattgaaatttctgggt犯(2)SEQIDNO,2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度154氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型:單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQIDNO.權(quán)利要求1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，是月季RcHsp17.8基因，長(zhǎng)度為465bp，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，其編碼具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列的多肽。3.—種將如權(quán)利要求1所述的DNA分子的核苷酸序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌以提高其溫度耐受性的方法，具體操作步驟為-(1)將編碼具有月季ici/^77.S基因的開放閱讀框可操作地連接于原核表達(dá)載體，形成含有該基因的原核表達(dá)載體；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞；(3)通過篩選，PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因菌株。4.一種用于檢測(cè)樣品中月季ici^^7.S基因拷貝數(shù)的方法，其特征在于包括SEQIDNO.l序列中的部分序列與樣品雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合；其中，所述樣品是月季基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的核苷酸序列。5.用于鑒定含重組子的大腸桿菌陽性克隆的核酸分子，其特征在于包含SEQIDNO.l所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和446-465個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列。6.—種用于檢測(cè)樣品中是否存在月季ic/fc;^7.S基因核苷酸序列的方法，其特征在于包括用包含SEQIDNO.l所示的DNA分子中1-20個(gè)連續(xù)的核苷酸和446-465個(gè)連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列與樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的片段；這里，所述樣品為轉(zhuǎn)基因大腸桿菌菌株。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體提供了一種在月季中表達(dá)的RcHsp17.8編碼序列及其在提高大腸桿菌BL21溫度耐受性的應(yīng)用。本發(fā)明涉及包含上述基因的重組表達(dá)載體。還涉及所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。本發(fā)明將所說基因在原核生物(大腸桿菌BL21)中表達(dá)，所獲得的大腸桿菌BL21耐熱性與耐冷性顯著增高。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101100668SQ200710041158公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日發(fā)明者鳳明,胡永紅,蔣昌華申請(qǐng)人:上海植物園;復(fù)旦大學(xué)