專利名稱：遺傳改良大豆品系gts40－3－2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
基因工程技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開(kāi)辟了一個(gè)全新的發(fā)展時(shí)代。1994年，Calgene公司利用基因工程技術(shù)研制的遺傳改良番茄品系“FLAVR SAVR”在美國(guó)首次被批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)。到2006年，全球遺傳改良作物種植面積已達(dá)1億多公頃。與此同時(shí)，大量的遺傳改良農(nóng)產(chǎn)品涌入我國(guó)市場(chǎng)。我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室于2004和2005年分別為境外18種遺傳改良作物頒發(fā)了安全生產(chǎn)許可證，以用于進(jìn)口加工原料，其中包括遺傳改良大豆品系GTS-40-3-2。隨著遺傳改良作物的廣泛種植，其安全性問(wèn)題引起了全球公眾的普遍重視，國(guó)際組織和國(guó)家紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強(qiáng)遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對(duì)遺傳改良植物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。
為了應(yīng)對(duì)遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，建立高效、快速、特異的檢測(cè)技術(shù)十分必要，它是各國(guó)際組織和國(guó)家管理遺傳改良作物的有力技術(shù)支撐?；诤怂岬木酆厦告湻磻?yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)因具有高靈敏度和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的遺傳改良作物及其產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。PCR檢測(cè)方法建立的主要依據(jù)是特異性的擴(kuò)增遺傳改良植物的外源基因片段。針對(duì)擴(kuò)增的外源DNA片段差異，PCR檢測(cè)策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測(cè)、基因特異性PCR檢測(cè)、構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)和品系特異性PCR檢測(cè)。品系特異性PCR檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的。由于每個(gè)遺傳改良作物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，因此品系特異性檢測(cè)方法具有較篩選、基因特異性和構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)方法更高的特異性和準(zhǔn)確性，能夠特異的檢測(cè)專一的遺傳改良作物品系。目前品系特異性PCR檢測(cè)方法已成為各國(guó)研究的重點(diǎn)。
在實(shí)際檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分重要。然而，由于專利權(quán)和現(xiàn)有技術(shù)的限制，遺傳改良作物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的獲得相對(duì)較難，其缺乏已成為檢測(cè)方法建立和應(yīng)用的瓶頸，阻礙了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施。并且，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是利用遺傳改良作物材料研制生產(chǎn)的，其難于保存，材料來(lái)源也比較有限，到目前為止僅得到十幾種遺傳改良作物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，日本科學(xué)家Hino等在《Journal of AOACInternational》(國(guó)際官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志)2002年第85卷第1077-1089頁(yè)上發(fā)表的“Novel Reference Molecules for Quantitation of GeneticallyModified Maize and Soybean(用于遺傳改良玉米和大豆定量檢測(cè)的新型標(biāo)準(zhǔn)分子)”，該文中提出利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子代替標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于遺傳改良作物檢測(cè)的理念和方法，并構(gòu)建了含有外源檢測(cè)目的片段和內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)粒分子，成功的用于遺傳改良大豆和玉米的檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是很好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代物，具有基因組制備容易、擴(kuò)增效率高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。然而，其不足之處在于該質(zhì)粒分子是針對(duì)外源目的基因片段構(gòu)建的，只能用于遺傳改良作物的基因特異性檢測(cè)，與檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)相脫節(jié)，因此不能滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及構(gòu)建方法，使其可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于遺傳改良大豆品系特異性的定性、定量PCR檢測(cè)。根據(jù)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列，利用重疊PCR反應(yīng)的原理設(shè)計(jì)特異PCR引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin一段序列的重組DNA片段。利用分子克隆技術(shù)將重組DNA片段克隆到pMD18-T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子pMD-RRS。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2原有的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測(cè)，徹底解決遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，以替代遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測(cè)。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子同時(shí)含有遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的一段序列。
本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS構(gòu)建方法，包括如下步驟①利用GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點(diǎn)。
所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列。
②設(shè)計(jì)PCR特異性引物。
所述的PCR特異性引物，指的是長(zhǎng)度為28±10nt的寡核苷酸鏈，其與大豆Lectin基因或者遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列完全相同或者互補(bǔ)。
③特異性擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
所述的特異性擴(kuò)增，指的是利用設(shè)計(jì)的PCR引物特異性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的一段序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
④大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的拼接。
所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術(shù)將大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列兩個(gè)獨(dú)立的DNA片段連接融合成一個(gè)重組的新DNA片段。
⑤含有新的重組DNA片段的質(zhì)粒分子克隆。
所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段按照設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS。
⑥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的定性和定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證。
所述的定性PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS構(gòu)建的品系特異性片段只能在遺傳改良大豆品系GTS40-3-2基因組DNA中擴(kuò)增獲得，而不能在其他大豆品系，和其他遺傳改良作物基因組中擴(kuò)增得到。
所述的定量PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS在進(jìn)行定量PCR分析時(shí)的特異性、靈敏度、重復(fù)性和重演性等特性，以鑒定該標(biāo)準(zhǔn)分子替代遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力，以及實(shí)際應(yīng)用于定量PCR檢測(cè)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的測(cè)定有效性。
本發(fā)明的有益效果在于，利用重疊PCR和分子亞克隆的方法首次構(gòu)建了含有大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS。本發(fā)明中明確提出此標(biāo)準(zhǔn)分子可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于該品系特異性定量PCR檢測(cè)，很好的解決了該品系檢測(cè)過(guò)程中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的問(wèn)題。此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS對(duì)實(shí)際樣品分析的結(jié)果比較準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果的偏差在ISO遺傳改良食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)允許的0-0.25范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全適用于對(duì)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品及其加工產(chǎn)品中的遺傳改良成分進(jìn)行定量分析。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的示意圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，如可參照Sambrook等編著分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建一、實(shí)驗(yàn)試劑限制性內(nèi)切酶Nco I、Xba I，以及限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)緩沖液購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；pMD18-T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物由上海博亞生物工程有限公司合成。
其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
二、實(shí)驗(yàn)儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(MJ Research Inc.)DNA電泳分析系統(tǒng)，包括暗箱、數(shù)碼照相機(jī)、計(jì)算機(jī)、掃描儀、噴墨打印機(jī)、光敏打印機(jī)、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其他儀器包括離心機(jī)，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，天平等。
三、試驗(yàn)方法和過(guò)程1、在GenBank中搜索大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin；通過(guò)查閱遺傳改良作物的相關(guān)資料，獲得遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體在遺傳改良作物中的具體插入方式和拷貝數(shù)，并查閱外源插入載體中主要元件的序列信息。
2、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的PCR引物序列設(shè)計(jì)根據(jù)獲得的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體旁鄰基因序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)兩對(duì)定性PCR引物，一對(duì)用于擴(kuò)增遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)特異性序列，兩條引物一條位于大豆基因組上，另一條位于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體上；另一對(duì)引物用于擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性序列。具體的引物序列見(jiàn)表1。
表1.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的PCR引物序列

3、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因序列和品系特異性序列的擴(kuò)增根據(jù)表1的引物，以遺傳改良大豆品系GTS40-3-2基因組DNA為模板，對(duì)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和品系特異性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系和條件見(jiàn)表2、3)，得到大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的一段378bp片段和一個(gè)349bp的外源插入載體旁鄰基因序列片段。對(duì)擴(kuò)增得到的條帶進(jìn)行回收純化，通過(guò)測(cè)序分析表明獲得的序列與目的擴(kuò)增片段序列一致。
表2.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的PCR擴(kuò)增體系

表3.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的PCR擴(kuò)增條件

4、利用重疊PCR方法對(duì)上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接用上述PCR得到的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和品系特異性序列為模板，以Lectin基因的上游引物和品系特異性序列的下游引物作為重疊PCR的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)片段的重組拼接。
5、重組DNA片段克隆進(jìn)入pMD18-T載體利用分子克隆的方法將上述連接獲得的重組片段連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上，連接反應(yīng)體系見(jiàn)表4。42℃ 90秒熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到質(zhì)粒分子。
表4.目的DNA片段連接反應(yīng)體系

構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的簡(jiǎn)要圖譜如附圖1所示。圖中pMD-18T表示構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的載體；Xba I表示該位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶Xba I的酶切位點(diǎn)；Nco I表示該位點(diǎn)含有限制性內(nèi)切酶Nco I的酶切位點(diǎn)；“Lectin”表示大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的一段特異性序列；“品系特異性序列”表示遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的一段DNA序列；兩段序列實(shí)現(xiàn)拼接后，通過(guò)重組序列兩端的Xba I和Nco I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接到pMD-18T載體上，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS。
實(shí)施例2構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)材料遺傳改良大豆品系GTS40-3-2。
常規(guī)大豆品種。
其他遺傳改良作物品系油菜GT73、棉花MON531、棉花MON1445、玉米GA21、華番一號(hào)番茄、玉米NK603品系。
二、酶與試劑植物基因組DNA提取及純化采用上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和上海出入境檢驗(yàn)檢疫局聯(lián)合研制的食品DNA抽提試劑盒。
質(zhì)?；蚪MDNA提取及純化采用捷瑞生物工程(上海)有限公司研制的質(zhì)粒小量制備試劑盒。
pMD18-T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000 Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；TaqMan探針及引物由上海博亞生物工程有限公司合成。
其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
三、實(shí)驗(yàn)儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(MJ Research Inc.)BECKMAN公司的DUR 640核酸和蛋白分析儀DNA電泳分析系統(tǒng)，包括暗箱、數(shù)碼照相機(jī)、計(jì)算機(jī)、掃描儀、Tanon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖像分析軟件(上海天能公司)其他儀器包括離心機(jī)，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，天平等。
四、實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程1、基因組DNA提取與檢測(cè)1)植物基因組DNA提取a、取適量大豆樣品，加入液氮于研缽中研磨成粉末，稱取約70-100mg磨碎的樣品轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；b、視材料量的多少，加入600-700μl已預(yù)熱的Buffer A，輕輕混勻后，65℃水浴保溫1小時(shí)，期間間或振蕩混勻；c、在管中加入等體積酚/氯仿(600-700μl)溶液，上下顛倒充分混勻，常溫靜置抽提10分鐘；d、12000rpm離心10分鐘，吸取上清到一新離心管中；e、加入與上清等體積的異丙醇(約600μl)，混勻，常溫放置10分鐘后，12000rpm離心10分鐘，去上清，保留沉淀；f、在沉淀中加入60μl TE，37℃放置2分鐘后用槍頭將其充分混勻，于37℃放置約1小時(shí)；g、取出后補(bǔ)加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混勻，靜置片刻；h、12000rpm離心5分鐘，取上清(約180μl)，加入1/10體積3M NaAc和2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃放置30分鐘；i、12000rpm離心10分鐘，去上清，加入75％乙醇200μl，12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀于室溫下晾干，后溶于50μl無(wú)菌ddH2O中。
2)質(zhì)?；蚪MDNA提取a、將37℃過(guò)夜1-2ml菌培養(yǎng)物于6000rpm離心1分鐘，徹底棄上清；b、加入菌液0.25倍體積的預(yù)冷STE溶液，將菌體重新充分懸浮，后6000rpm離心1分鐘，徹底棄上清；c、加入100μl Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌；d、加入200μl Solution II，立即上下顛倒溫和混勻，室溫放置2分鐘，使細(xì)菌充分裂解；e、加入350μl Solution III，立即上下顛倒數(shù)次，使之充分混勻、中和，室溫放置2分鐘后13000rpm離心5分鐘；f、將上清轉(zhuǎn)移到套放于2ml收集管內(nèi)的GenClean柱中，于室溫8000rpm離心15秒；g、取出GenClean柱，倒掉收集管中廢液，將GenClean柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，于室溫10000rpm離心30秒；h、重復(fù)步驟g，用Wash Solution洗1-2次；i、棄廢液，于12000rpm室溫離心1分鐘，以徹底去除Wash Solution；j、將GenClean柱放入干凈1.5ml離心管中，打開(kāi)管蓋室溫放置5分鐘使殘余的乙醇揮發(fā)，后在結(jié)合柱膜中央加入50μl Elution Buffer，37℃放置2分鐘；k、于室溫12000rpm離心2分鐘洗脫膜上的DNA。
3)DNA檢測(cè)取3μl提取的DNA樣品，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)其亮度和擴(kuò)散程度判斷DNA的質(zhì)量。
利用紫外分光光度法測(cè)定所提DNA的濃度與純度。
2、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物的特異性分析優(yōu)化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件，并分別以其他遺傳改良植物為檢測(cè)模板定性擴(kuò)增遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性的目的片段，確定針對(duì)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2設(shè)計(jì)的定量PCR引物特異性。
3、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS用于定量PCR檢測(cè)的檢測(cè)極限(LOD)和定量極限(LOQ)優(yōu)化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件，分別以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子基因組DNA樣品(如2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl)作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試建立的定量PCR檢測(cè)方法的LOD和LOQ。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次，根據(jù)定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增熒光信號(hào)間的線性關(guān)系，確定利用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS代替陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)方法的LOD和LOQ。
4、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS定量PCR檢測(cè)體系的重復(fù)性和重演性優(yōu)化遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件，分別以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS基因組DNA樣品(2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl和2×101copies/μl)進(jìn)行重復(fù)性和復(fù)現(xiàn)性測(cè)試，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。根據(jù)定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應(yīng)的可重復(fù)性和重演性。
5、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS定量PCR檢測(cè)校正系數(shù)測(cè)定在利用標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行定量分析時(shí)，必須考慮質(zhì)粒DNA和大豆基因組DNA在PCR反應(yīng)中的效率差異，這一差異可以通過(guò)校正系數(shù)(Coefficient Values，CVs)進(jìn)行校正。CVs值的測(cè)定方法是用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子建立定量PCR檢測(cè)體系，對(duì)純合的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性材料進(jìn)行定量分析，通過(guò)比較定量分析的結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的校正系數(shù)CVs。CVs值可通過(guò)公式1計(jì)算得到。在獲得CVs值后，通過(guò)公式2可以分析獲得待測(cè)遺傳改良樣品中遺傳改良成分的含量。
公式1CVs＝純合的遺傳改良植物外源檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)/純合的遺傳改良植物內(nèi)源基因拷貝數(shù)公式2遺傳改良成分含量％＝(樣品外源檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)×100)/(樣品內(nèi)源基因拷貝數(shù)×CVs)6、應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子對(duì)實(shí)際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的校正系數(shù)和繪制的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對(duì)4個(gè)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品(遺傳改良成分含量分別為0.5％、1.0％、3.0％和5.0％)進(jìn)行分析，確定構(gòu)建的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是否可以有效地應(yīng)用于實(shí)際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量檢測(cè)。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性PCR檢測(cè)體系和PCR擴(kuò)增條件分別見(jiàn)表5和表6。
表5.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性PCR檢測(cè)體系

表6.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性定性PCR擴(kuò)增條件


2、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物的特異性分析根據(jù)表1中的引物序列，對(duì)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其它遺傳改良作物如GT73油菜和MON531棉花等基因組樣品進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，只有在遺傳改良大豆品系GTS40-3-2中，擴(kuò)增得到了大小為85bp的目的片段條帶，而在其它遺傳改良作物中沒(méi)有檢測(cè)到該條帶。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)的GTS40-3-2大豆品系的定量PCR引物具有高度特異性。
3、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化和建立根據(jù)定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化方法，尋找最適宜的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR引物和探針的濃度，保證定量PCR的反應(yīng)效率達(dá)到90％以上。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，當(dāng)引物和探針的終濃度為400nM和200nM時(shí)，PCR擴(kuò)增曲線的效率最高，熒光信號(hào)最強(qiáng)。因此該濃度用于建立遺傳改良大豆品系的定量PCR反應(yīng)體系，其它成分量詳見(jiàn)表7，PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表8。
表7.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性定量PCR檢測(cè)體系


表8.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)擴(kuò)增條件

4、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS進(jìn)行定量PCR檢測(cè)的檢測(cè)極限(LOD)和定量極限(LOQ)利用優(yōu)化好的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應(yīng)體系，分別以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子基因組DNA樣品(如2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試本發(fā)明建立的定量PCR檢測(cè)體系的LOD和LOQ。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定該體系的LOD為2個(gè)拷貝，LOQ為20個(gè)拷貝。說(shuō)明構(gòu)建的pMD-RRS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子可以代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測(cè)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其加工產(chǎn)品遺傳改良成分含量。
以濃度為2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl和2×100copies/μl的pMD-RRS大豆標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子基因組DNA樣品為標(biāo)準(zhǔn)品繪制遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及該體系的LOD和LOQ結(jié)果可以認(rèn)為，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏度，完全可以用于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2及其加工產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)。
5、利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS建立的定量PCR檢測(cè)體系的重復(fù)性和重演性測(cè)定在優(yōu)化的遺傳改良大豆品系特異性定量PCR反應(yīng)條件下，分別以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS基因組DNA樣品(2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl和2×101copies/μl)進(jìn)行重復(fù)性和可復(fù)現(xiàn)性的測(cè)試，3個(gè)平行反應(yīng)間和3次不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)間獲得的Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差基本上都小于0.2，說(shuō)明根據(jù)構(gòu)建的pMD-RRS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子建立的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR反應(yīng)的重復(fù)性和重演性好，可以用于實(shí)際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的進(jìn)一步定量分析。
6、利用大豆標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS建立的定量PCR檢測(cè)體系校正系數(shù)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS代替遺傳改良大豆品系GTS40-3-2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用于定量PCR檢測(cè)時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子建立了定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)純合的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性材料進(jìn)行定量分析，通過(guò)比較定量分析的結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的校正系數(shù)，為0.92，見(jiàn)表9。
表9.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS用于定量PCR分析的校正系數(shù)測(cè)定

7、應(yīng)用pMD-RRS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子對(duì)實(shí)際遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS的校正系數(shù)和繪制的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對(duì)4個(gè)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品(遺傳改良成分含量分別為0.5％、1.0％、3.0％和5.0％)進(jìn)行了分析，定量分析結(jié)果顯示4個(gè)遺傳改良大豆品系GTS40-3-2混合樣品的含量分別為0.429％、1.168％、3.327％和5.246％，與真實(shí)值的偏差分別為14.2％、16.8％、10.9％和4.92％，定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.12-0.18范圍內(nèi)(具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表10)。檢測(cè)結(jié)果表明利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS對(duì)實(shí)際樣品分析的結(jié)果比較準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果的偏差在ISO轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)允許的0-0.25范圍內(nèi)，表明本發(fā)明構(gòu)建的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS完全可以代替該品系的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全適用于遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的品系特異性定量PCR分析和檢測(cè)。
表10.遺傳改良大豆品系GTS40-3-2樣品的定量分析結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于，含有遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征是，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin，指的是大豆凝集素基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征是，所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列。
4.一種如權(quán)利要求1所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟①利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin、遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列；②設(shè)計(jì)PCR特異性引物；③特異性擴(kuò)增大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列；④大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列的拼接；⑤含有新的重組DNA片段的質(zhì)粒分子克隆，得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征是，所述的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin，指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點(diǎn)；所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是遺傳改良大豆品系GTS40-3-2外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的一段DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征是，所述的PCR特異性引物，指的是長(zhǎng)度為28±10nt的寡核苷酸鏈，其與大豆Lectin基因或者遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列完全相同或者互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征是，所述的特異性擴(kuò)增，指的是利用設(shè)計(jì)的PCR引物特異性擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的一段序列和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2的品系特異性序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征是，所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術(shù)將大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和遺傳改良大豆品系GTS40-3-2品系特異性序列兩個(gè)獨(dú)立的DNA片段連接融合成一個(gè)重組的新DNA片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳改良大豆品系GTS40-3-2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征是，所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段按照設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMD-RRS。
全文摘要
一種遺傳改良大豆品系GTS40－3－2檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法，所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子包含遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的品系特異性片段和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段；通過(guò)對(duì)遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的外源插入載體旁鄰基因序列分析，設(shè)計(jì)品系特異性PCR引物擴(kuò)增獲得遺傳改良大豆品系GTS40－3－2的品系特異性片段，以及大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性序列；通過(guò)分子克隆的方法構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒分子中而成的人工重組質(zhì)粒分子pMD－RRS。本發(fā)明中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全可以代替遺傳改良大豆品系GTS40－3－2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子完全適用于對(duì)遺傳改良大豆品系GTS40－3－2樣品的品系特異性定量PCR分析和檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101063171SQ20071004112
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者張大兵, 楊立桃, 張海波, 李想, 郭金超 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)