專利名稱：一種用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種能夠篩選抗糖尿病藥物的細胞模型。
背景技術：
藥物篩選模型是用于證明某種物質具有藥理活性(生物活性、治療作用)的實驗方法，是 尋找和發(fā)現新藥物的重要條件之一。分子與細胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少，藥物 作用機制明確，可實現高通量篩選等特點，已經成為目前藥物篩選的主要方法。
糖尿病是一種以"三多一少"為典型特征的全身代謝紊亂性疾病。據估計，目前全世界 糖尿病患者已達1.3億人，對于抗糖尿病藥物的需求十分迫切。而目前用于治療II型糖尿病 的藥物均存在一定的副作用，因此目前急需更安全有效的藥物和治療方法。
胰島素信號轉導通路與II型糖尿病有著密切的聯系。胰島素先與細胞膜上的胰島素受體 (IR)相結合。IR是一個跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。胰島素與IR結合后，激活其酪 氨酸激酶活性，并將胰島素受體底物(IRS)磷酸化而激活從而引起細胞內的一系列生理反 應。目前已經鑒定了IR的多種底物分子。信號轉導和轉錄激活物5b(signal transducer and activator of transcription 5b， STAT5b)是最新被鑒定的IRS。 STAT5b通過其SH2序列與 IR e亞基的960位酪氨酸相互作用，能被純化的胰島素受體酪氨酸激酶活性結構域磷酸化。 胰島素能刺激IR高表達的細胞內源性STAT5b的酪氨酸磷酸化(Sawka-Verhelle， D.， Filloux， C.， et al.. Identification of STAT5B as asubstrate of the insulin rec印tor. Eur. [J] Biochem，1997， 250: 411 417)。另外，與其他已經發(fā)現的IRS不同 ，STAT5b是一轉錄激活因子，經胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)激活的STAT5b與核內具有 STAT5響應元件的耙基因調控序列結合，從而激活耙基因的轉錄和表達(Stoecklin， E.， Wissler， M. ， ， et al. Specific DNA binding of Stat5， but not of glucocorticoid receptor is required for their functional cooperation in the regulation of gene transcription. [J] Mol. Cell. Biol. 1997,17: 6708 6716)。
胰島素是IR的天然激動劑。目前，所有I型糖尿病患者和口服糖尿病藥物不能控制血糖 水平的II型糖尿病患者需要采用胰島素治療。但是，由于胰島素是一個多肽分子，口服會被 消化而喪失活性，而依賴注射進行治療，給患者帶來很大的不便和痛苦。而且，長期使用胰 島素可能導致體重增加，嚴重的胰島素抵抗等副作用。因此，尋找可以口服的非肽小分子胰
島素受體酪氨酸激酶(IRTK)激動劑備受關注，但是一直沒有取得突破。
已有文獻報道中篩選IRTK激動劑的方法大多采用免疫化學檢測IR的磷酸水平，或部分分
離IR體外檢測其激酶活性。這些方法費用較高，操作煩瑣、難以實現高通量篩選，本領域急
需建立新的篩選方式。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能高通量篩選抗糖尿病藥物的細胞模型。 解決本發(fā)明技術問題的技術方案為 一種篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，是克隆了IR基
因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、以及由STAT5B應答元件調控的報告基因的編碼序列
的哺乳動物細胞。
其中，上述細胞模型中的IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列和由STAT5B應答元
件調控的的編碼序列均能穩(wěn)定表達。
其中，上述細胞模型中的哺乳動物細胞為H印G2、 293T、 3T3-L1或CH0中的任一種。 其中，上述細胞模型中的3丁八丁58應答元件的序列為5'- TGTGGACTTCTTGGAAT
TAAGGGACTTTTG -3'。
進一步的，上述細胞模型中的報告基因由2-10個STAT5B應答元件串連或重復組成的DNA 調控序列調控。
其中，上述細胞模型中報告基因為LUC基因、CAT基因或GFP基因中的任一種。 本發(fā)明還提供了一種制備上述篩選抗糖尿病藥物的細胞模型的方法，該方法包括以下步
驟
將哺乳動物細胞培養(yǎng)至對數生長期后，將分別裝載有IR基因的編碼序列、STAT5B基因的 編碼序列、2 10個串聯的STAT5B應答元件DNA序列調控的報告基因編碼序列的表達載體共轉 染哺乳動物細胞，經穩(wěn)定篩選后得到本細胞模型。
本發(fā)明同時還提供了一種抗糖尿病藥物的篩選方法，該方法包括以下步驟
a、 取上述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型接種于培養(yǎng)板并分組，加入含待篩選物 質的無血清培養(yǎng)基的為篩選組、加入含胰島素的無血清培養(yǎng)基的為陽性對照、加入無血清培 養(yǎng)基的為陰性對照；
b、 誘導培養(yǎng)各細胞組，測定報告基因的表達量；根據表達量的多少確定待篩選物質是 否被篩出。
進一步的，上述的抗糖尿病藥物篩選方法的報告基因的表達量為報告基因所表達的蛋白 質或酶的量。
根據本發(fā)明的第一個方面，在仔細分析IR介導的信號轉導通路的基礎上，構建了 STAT5b耙控報告基因檢測IRTK活性的細胞模型(其工作原理參見圖l)。本發(fā)明細胞模型中 含有裝載在表達載體上的IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列和由STAT5B應答元件調 控的的編碼序列，且這些序列均能穩(wěn)定表達。該細胞模型通過檢測報告基因表達水平間接監(jiān) 測IRTK活性，尤其適用于治療II型糖尿病藥物的篩選。
根據本發(fā)明的第二個方面，建立了制備上述篩選抗糖尿病藥物的細胞模型的方法。該方 法具體可通過以下步驟實施
將H印G2、 293T、 3T3-L1或CH0中的任一種哺乳動物細胞培養(yǎng)至對數生長期；
將分別裝載有IR基因的編碼序列，STAT5B基因的編碼序列、3 6個串聯的STAT5B應答元 件DNA序列調控的報告基因編碼序列的表達載體pSTAT5b3-TK-LUC ， pCMV-hIR， pBS-SK-STAT5b在lipofectin2000的介導下共轉染哺乳動物細胞；
經穩(wěn)定篩選后得到本細胞模型。
根據本發(fā)明的第三個方面，建立起了以本發(fā)明細胞模型為基礎的抗糖尿病藥物篩選方法 ，步驟如下
a、 取上述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型接種于培養(yǎng)板并分組細胞接種數目按 96孔板的為10， 000/孔 20， 000/孔，優(yōu)選15， 000/孔。分組為加入含待篩選物質的無血清培 養(yǎng)基的為篩選組、加入含胰島素的無血清培養(yǎng)基的為陽性對照、加入無血清培養(yǎng)基的為陰性 對照；待細胞完全貼壁后，血清饑餓24h;
b、 加入胰島素誘導培養(yǎng)各細胞組8h后，孵育時間為6 10h，優(yōu)選為8h，熒光素酶試劑 盒測定報告基因的表達信號，根據表達量的多少確定待篩選物質是否被篩出。
其中，上述方法步驟b中加入的胰島素的用量為10—9 M 10—5 M，優(yōu)選為10—7M，用 promega公司的熒光素酶試劑盒測定時LAR試劑的濃度為不小于4倍稀釋。
本發(fā)明中涉及的常規(guī)細胞培養(yǎng)及常規(guī)分子生物學的試驗操作，都是本領域普通技術人員 參考現有的相關試驗指南或儀器、試劑的使用說明能夠完成的。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明細胞模型通過檢測報告基因表達水平間接監(jiān)測IRTK活性 ，能夠高通量、低成本地準確篩選抗糖尿病藥物；本發(fā)明細胞模型的制備方法簡單可控，成 本低廉；本發(fā)發(fā)明抗糖尿病藥物篩選方法步驟簡單，成本低廉，準確性高，可實現高通量的 篩選，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。為抗糖尿病藥物的篩選提供了新的思路，具有很好的市 場前景。


圖l為本發(fā)明細胞模型的工作原理圖。
圖2為對陽性克隆的鑒定圖，其中CH0 9tt克隆的LUC值與細胞對照的LUC值的比值達3倍 ，為構建成功的細胞模型。圖中縱坐標為熒光素酶相對亮度(Luminescence)，單位為RLU ，橫坐標為細胞克隆序號(Cell Clone)。
圖3胰島素對Luc誘導表達及細胞活力的影響。A為不同濃度胰島素對誘導表達率的影響 ，縱坐標為誘導表達率(Induction Fold)，橫坐標為胰島素濃度(Insulin concentration) 。 B為不同濃度胰島素對細胞活力的影響，縱坐標為雙波長測定的光度吸收 值(0D570-490 570nm/490nm)，橫坐標為胰島素濃度(Insulin concentration)。
圖4為AG1024對Luc誘導表達及細胞活力的影響。A為不同濃度AG1024對誘導表達率的影 響，縱坐標為誘導表達率(Induction Fold)，橫坐標為AG1024濃度(AG1024 concentration) 。 B為不同濃度AG1024對細胞活力的影響，縱坐標為雙波長測定的光度吸收 值(0D570-490 570nm/490nm)，橫坐標為AG1024濃度(AG1024 concentration)。
圖5 GH對Luc誘導表達及細胞活力的影響。A為不同濃度GH對誘導表達率的影響，縱坐標 為誘導表達率(Induction Fold)，橫坐標為生長激素濃度(GH concentration) 。 B為不 同濃度GH對細胞活力的影響，縱坐標為雙波長測定的光度吸收值(0D570-490 570nm/490nm)，橫坐標為生長激素濃度(GH concentration)。
圖6不同細胞接種數目對報告基因檢測的影響，縱坐標為熒光素酶相對亮度( Luminescence)，單位為RLU，橫坐標為每孑L細胞數(Cell number per well)。
圖7不同誘導時間對報告基因檢測的影響，縱坐標為熒光素酶相對亮度( Luminescence)，單位為RLU，橫坐標為誘導時間，單位為小時(h)。
圖8 LAR試劑用量對報告基因檢測的影響，縱坐標為熒光素酶相對亮度(Luminescence )，單1立為RLU，橫坐標為胰島素濃度(Insulin concentration)。
圖9基于該細胞模型的藥物篩選方法的評估，縱坐標為熒光素酶相對亮度( Luminescence)， 單位為RLU， 橫坐標為樣品類女(Sample Number)。
具體實施例方式
藥品與試劑限制性內切酶，T4連接酶購自TaKaRa公司；質粒小量提取試劑盒購自 Qiagen公司；轉染試劑lipof ectin2000購自Invitrogen公司；DMEM， 1640培養(yǎng)基和胎牛血清 購自Gibco公司；其它試劑均為進口和國產分析純試劑；胰島素、AG1024、生長激素購自 Sigma公司；熒光酶測定試劑盒購自promega公司。
儀器熒光強度檢測儀Infinite F200 TECAN公司本發(fā)明的高效表達細胞模型可同時穩(wěn)定表達兩種與糖尿病密切相關的蛋白胰島素受體 IR和胰島素受體底物STAT5B，以及便于檢測的由STAT5B響應元件耙控的報告基因所編碼的蛋白。
實施例一 胰島素受體(IR)基因表達載體的選擇
IR是位于細胞膜上的跨膜受體，是一種重要的信號傳遞途徑。當結構基因中或表達過程 中發(fā)生突變時可以導致胰島素耐受，導致II型糖尿病的發(fā)生。IR是一個異四聚體蛋白，廣泛 分布于全身各組織細胞膜，每個細胞約有l(wèi)， 000 300， 000個受體，包括兩個細胞外的a亞
基和兩個跨膜的e亞基，當胰島素結合到iR的a亞基時，e亞基的酪氨酸激酶的活性得到了
激活。廣泛的研究表明IR的自我磷酸化以及磷酸化細胞內底物的能力對于介導胰島素復雜的
細胞反應是至關重要的。
本發(fā)明中使用克隆有人IR cDNA序列的質粒pCMV-hlR，制備方法使用現有的公知技術， 在其中人IR的cDNA序列為SEQ ID NO. l所示。
實施例二表達載體STAT5b基因表達載體的選擇
STAT5b是最新被鑒定的胰島素受體底物(IRS)。它通過其SH2序列與IR的f3亞基的酪氨 酸相互作用，STAT5b能被純化的胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)的活性結構域磷酸化。胰島 素能通過刺激IR磷酸化來激活IRTK活性，從而使細胞內源性STAT5b的酪氨酸磷酸化而被激活 。與其他已經發(fā)現的IRS不同，STAT5b是一轉錄激活因子，經激活的STAT5b與核內具有 STAT5響應元件的耙基因調控序列結合，從而激活耙基因的轉錄和表達。因此，STAT5B耙控 報告基因可以被用來檢測IRTK活性，避免了傳統(tǒng)的測定方法中費力和成本高昂的受體分離程 序，從而可能實現高通量的檢測。
本發(fā)明中使用克隆有STAT5B的cDNA序列的質粒pBS-SK-STAT5B，制備方法使用現有的公知 技術，在其中STAT5B的cDNA序列為SEQ ID NO. 2所示。
實施例三表達載體pSTAT5b3-TK-LUC的建立
在本領域可以使用的多種報告基因中，熒光素酶(LUC)具有靈敏度高、檢測方便、易 于定量的特點。在本發(fā)明的一個實例中以表達LUC的質粒pTK-LUC為基礎。在其啟動子上游以 Nhel/EcoRI內切酶位點插入人工合成的含有3個串連STAT5B響應元件的DNA片段(SEQ ID NO. 3):
^ _ GCGCCTAGC TGTGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTT TGTGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTT TGTGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTTTGGGATCCGGCCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGMTTCGCG-3'
其中TGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTT (SEQ ID NO. 4)為STAT5B響應元件，GCTAGC:、 GMTTC分別為NheI和EcoRI的酶切位點。
將上述序列轉入pTK-LUC即得到pSTAT5B3-TK-LUC。小量提取重組質粒DNA，以 Nhel/EcoRI內切酶酶切重組質粒，電泳檢測得到141bp大小的插入片段。挑取有插入片段的 重組質粒進行測序，將測序結果正確的重組質粒擴增培養(yǎng)，提取質粒，純度要求達到 OD26o/OD280=l. 8 2. 0以備進行轉染。
實施例四本發(fā)明細胞模型的建立
在本實例中以中國倉鼠卵巢細胞(CH0)為受體細胞進行細胞模型的建立。 使用pSTAT5b3-TK-LUC ， pCMV-hIR， pBS-SK-STAT5b為表達載體。
為篩選出穩(wěn)定轉染pSTAT5b3-TK-LUC ， pCMV-hIR， pBS-SK-STAT5b的單克隆，以neo為篩 選標記，由于pCMV-hIR上已含有neo抗性標記，故將三種質粒的用量(U g)按pCMV-hIR: pSTAT5b3-TK-LUC: pBS-SK-STAT5b=l: 10:10共轉染CH0細胞。試驗過程如下
(1) 細胞培養(yǎng)
用不含抗生素含10%血清的培養(yǎng)液接種細胞于24孔板，細胞濃度為10X10"孔。待細胞 完全貼壁后，用陽離子脂質體法進行轉染。
(2) 轉染過程
DNA和脂質體(Lipofectacnine 2000)混合物的配制(24孔板) A溶液
pSTAT5b3-TK-LUC 0. 50 y g/孑L
pBS-SK-STAT5b 0. 50 y g/孔
pCMV-hIR 0. 05 y g/孑L
無血清無抗生素培養(yǎng)基補充至25y 1/孔 A溶液混合，室溫放置5min。 B溶液
Lipofectacnine 2000 2. 1 y 1/孑L
無血清無抗生素培養(yǎng)基補充至25y 1/孔
B溶液混合，室溫放置5min。 將A液與B液混合，室溫放置20min，然后將混合液按50 y 1/孔加入到細胞中。 37°C5% C02的二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6h后，換為含血清含抗生素培養(yǎng)基。
(3) 陽性克隆篩選
轉染24h后的CH0細胞按l:10密度傳代再培養(yǎng)48h，以含800yg/ml G418的MEM選擇性培養(yǎng) 基進行選擇性篩選培養(yǎng)，每3天用選擇性培養(yǎng)基換液一次，持續(xù)l周可見陽性克隆出現。用克 隆環(huán)將陽性克隆挑出，接種至24孔板在含400 y g/ml G418的培養(yǎng)液中擴增傳代，得到穩(wěn)定轉 染的陽性克隆細胞模型。
(4) 陽性克隆鑒定
由于外源基因隨機整合到宿主細胞染色體上，依據整合位點的不同，可能存在對信號刺激 反應弱和背景較高的細胞模型。故將所有挑出的陽性克隆細胞富集到一定程度后，按l. 5X 104/孔接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，用PBS清洗3次，換上新鮮的無血清培養(yǎng)液血清饑 餓24h，加入10—、的胰島素(以無血清培養(yǎng)基配制)進行刺激，同時設置細胞對照，誘導8h后 ，用熒光素酶試劑盒對細胞內Luc進行檢測，。以挑選出背景低而對信號刺激反應強的細胞模 型，擴增培養(yǎng)和凍存，用于以后的實驗。
在本實例中共篩選得到了37個陽性克隆。對這37個陽性克隆細胞用胰島素進行鑒定，結 果表明其中有31個克隆測不到或測出的Luc值過低，另有5個克隆的LUC值胰島素刺激組與細 胞對照的比值〈1.5，只有1個克隆即CH0 9tt克隆的比值達3倍以上，滿足進一步試驗的要求， 故選擇該克隆為所需要的穩(wěn)定轉染細胞模型(圖2)。
試驗例一 考察本發(fā)明細胞模型用于藥物篩選的特異性
為檢測該細胞模型用于藥物篩選的特異性，確保報告基因的表達是由IRTK的活性變化所 調控。選用IRTK的天然激動劑胰島素，IRTK特異性不可逆酪氨酸磷酸化抑制劑Tyrphostin AG1024，根據文獻報道可以激活STAT5b的物質生長激素(GH)，分別以不同的濃度處理細胞 模型并通過檢測Luc確定其誘導表達率，通過MTT法確定細胞活力。
誘導表達率的計算公式為
誘導表達率4合藥孔的Luc發(fā)光值/不含藥對照孔的Luc發(fā)光值 (1)胰島素對Luc誘導表達及細胞活力的量效關系
將細胞接種于96孔板中過夜，待細胞完全貼壁后，換上新鮮的無血清培養(yǎng)液血清饑餓 24h，分別加入濃度為0、 10—U、 10—1Q、 10—9、 10—8、 10—7、 10—6、 10—5M的胰島素進行刺激，每 組設8個重復。誘導8h后，用熒光素酶試劑盒檢測其中4個重復的Luc，計算誘導表達率;另4 個重復用MTT檢測細胞活力。
試驗結果參見圖3，由試驗結果可見胰島素作為IRTK的天然激動劑，對IRTK的激活作 用效果明顯。在本實例中，胰島素濃度在10—、時誘導表達率達3.6倍且在10—U 10—、上Luc
的誘導表達率與胰島素濃度成劑量依賴關系。而通過MTT檢測可知，當胰島素濃度在10—u 10—7M上時，細胞活力隨胰島素濃度的增加不超過1.2倍。這說明胰島素對Luc的誘導表達作 用與胰島素促進細胞增殖或增加細胞活力無關，而是由于胰島素激活IRTK后，引起的一系列 細胞內生理反應的結果。
(2) Tyrphostin AG1024對Luc誘導表達及細胞活力的量效關系 將細胞接種于96孔板中過夜，待細胞完全貼壁后，換上新鮮的無血清培養(yǎng)液血清饑餓
24h，以濃度為O、 10、 50、 100yM的AG1024刺激lh后，換成10—、的胰島素誘導8h。同時設 置細胞對照，每組設8個重復。用熒光素酶試劑盒檢測其中4個重復的Luc，計算誘導表達率 ;另4個重復用MTT檢測細胞活力。
Tyrphostin (酪氨酸磷酸化抑制劑)AG1024是IRTK的特異性抑制劑，它可以與IR結合 從而選擇性的抑制IR的自身磷酸化，使其構象不能改變從而阻止其酪氨酸激酶活性的激活。 所以AG1024可以在細胞膜上就阻斷胰島素信號通路(M Parrizas， A Gazit， A Levitzki， et al. Specific Inhibition of Insulin-Like Growth Factor-1 and Insulin Receptor Tyrosine Kinase Activity and Biological Function by Tyrphostins [J] Endocrinology. 1997 Apr;138(4):1427-33)。
在本實例中，只需10yM的AG1024即可將胰島素對Luc的誘導表達率下調至1.32倍，隨著 AG1024濃度的增加誘導表達率下降至1以下并且變化不大。而細胞活力在AG1024濃度為10 50 y M時反而有所增加，只有在100 y M時細胞活力才下降。這說明AG1024下調胰島素對Luc誘 導表達率的原因是對IRTK的特異性抑制作用，而不是由于AG1024能抑制細胞增殖或降低細胞 活力。從而進一步證明了IRTK的活性變化與Luc的表達密切相關(結果參見圖4)。
(3) 生長激素(GH)對Luc誘導表達及細胞活力的量效關系 將細胞接種于96孔板中過夜，待細胞完全貼壁后，換上新鮮的無血清培養(yǎng)液血清饑餓
24h，分別加入濃度為0、 1、 10、 100 ng/ml的生長激素進行刺激，每組設8個重復。誘導8h 后，用熒光素酶試劑盒檢測其中4個重復的Luc，計算誘導表達率;另4個重復用MTT檢測細胞 活力。
由于本發(fā)明是通過STAT5b介導來實現報告基因對IRTK活性的檢測。因而需考察通過其它 途徑激活STAT5b的物質對Luc誘導表達率的影響。GH能夠促進JAK2同GH受體的結合，并磷酸 化GH受體和JAK2自身。自身磷酸化的JAK2和磷酸化的GH受體蛋白形成了1個高親和位點，能 夠同STAT5b結合并將其磷酸化而激活(He K， Wang X， Jiang J， et al. Janus Kinase 2 Determinants for Growth Hormone Receptor Association, Surface Assembly, and
Signaling [J]. Molecular endocrinology, 2003， Nov;17(11):2211-27)。
在本實例中發(fā)現GH對Luc的誘導表達率均不超過l. 5倍，且試驗條件下對細胞活力影響不
大。這說明其它信號轉導途徑對STAT5b的激活作用對于Luc的誘導表達率無明顯影響。證明
該模型有很好的特異性(圖5)。
試驗例二基于上述細胞模型的藥物篩選方法的確定
(1) 96孔板的細胞接種數目 無論是自動還是人工接種細胞于96孔板，每孔中的細胞數目都不會完全相同。為了檢驗
不同細胞數目對篩選結果的影響，尋求一個最適的細胞接種密度。分別接種數目為5， 000、 10， 000、 15,000、 20,000、 25， 000/孔的細胞于96孔板，每組設4個重復。待細胞完全貼壁 后，血清饑餓24h，換成濃度為10— 的胰島素誘導8h。用熒光素酶試劑盒檢測細胞數目對報 告基因表達的影響。
在本實例中發(fā)現(結果見圖6)，細胞密度過大(超過20，000/孔)或過小(小于 10，000/孔)時，熒光素酶的信號值很低，差異不顯著。而在這范圍之內，熒光素酶的信號 值隨著細胞數目的增加而增加。綜合考慮各因素，在實驗中均采用15，000/孔的細胞密度。
(2) 熒光素酶的表達時間 激動劑與受體作用后，會啟動一系列生理反應，才能引發(fā)熒光素酶表達。為了確定報告
基因在細胞中的合適表達時間，按15，000/孔將細胞接種于96孔板中過夜，待細胞完全貼壁 后，血清饑餓24h，以濃度為10— 的胰島素進行刺激，用熒光素酶試劑盒分別測定誘導4、 6、 8、 10、 12h后LUC的表達量。
在本實例中發(fā)現(結果見圖7)，在一定濃度(10—7M)的胰島素作用下。孵育時間為 4h和12h時熒光素酶表達量較低，孵育時間為6 10h時表達量較高。綜合考慮選擇篩選實驗 的表達時間為8h。
(3) 熒光素酶檢測試劑Luciferase Assay Reagent (LAR)的用量 由于LAR試劑昂貴，為了降低篩選成本，有必要在實驗條件下將LAR試劑的稀釋使用。為此
，需比較不同稀釋倍數的LAR試劑對熒光素酶信號的影響。按15， 000/孔將細胞接種于96孔板 中過夜，待細胞完全貼壁后，血清饑餓24h，以濃度為0、 10—9、 10—7、 10—5] 的胰島素對細胞 進行刺激8h后，分別用不同劑量的LAR (原濃度、2倍稀釋、4倍稀釋、8倍稀釋)對細胞內 Luc的表達量進行檢測。
在本實例中發(fā)現隨著LAR試劑稀釋倍數的增加，熒光素酶信號值有所降低;但2倍稀釋和 4倍稀釋的讀數與原濃度的讀數相差很小，而8倍稀釋的讀數明顯降低。由熒光素酶檢測的原
理可知，給熒光素酶加入超量底物，在一定時間間隔內測定的光閃爍總數是與樣品中存在的 熒光素酶活性總量成正比的。在2倍稀釋、4倍稀釋時，由于底物仍然過量，所以熒光素酶的 表達量與胰島素濃度仍具有劑量依賴關系。而8倍稀釋的讀數明顯降低且與胰島素濃度的劑 量依賴關系不明顯。因此實驗中采用4倍稀釋后的LAR試劑檢測熒光素酶信號(圖8)。
在上述試驗的基礎上，建立起了以本發(fā)明細胞模型為基礎的抗糖尿病藥物篩選方法，步 驟如下
a、 取上述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型接種于培養(yǎng)板并分組細胞接種數目按 96孔板的為10， 000/孔 20， 000/孔，優(yōu)選15， 000/孔。分組為加入含待篩選物質的無血清培 養(yǎng)基的為篩選組、加入含胰島素的無血清培養(yǎng)基的為陽性對照、加入無血清培養(yǎng)基的為陰性 對照；待細胞完全貼壁后，血清饑餓24h;
b、 加入胰島素誘導培養(yǎng)各細胞組8h后，孵育時間為6 10h，優(yōu)選為8h，熒光素酶試劑 盒測定報告基因的表達信號，根據表達量的多少確定待篩選物質是否被篩出。
其中，上述方法步驟b中加入的胰島素的濃度為10—9 10—5 M，優(yōu)選為10—7M，用 promega公司的熒光素酶試劑盒測定時LAR試劑的濃度為不小于4倍稀釋。 試驗例三基于上述細胞模型的藥物篩選方法的評估
建立篩選模型的目的是篩選活性物質，反映該物質所具有的生物活性，因此，對篩選模 型能否準確地反映受試物的生物活性，必須進行客觀的評價。評價一個篩選模型的優(yōu)劣有很 多指標，如模型的穩(wěn)定性、靈敏性、特異性等。除此之外，為了使模型能夠達到篩選的要求 ，要求對篩選模型進行定量評價，主要分析該模型能否有效地反映樣品的活性。評價藥物篩 選模型的常用的定量技術參數主要如下述
(1) 信號本底比(signal to background, S/B) 信號本底比反映的是藥物篩選模型獲得的數據與本底數據之間的距離。 一般來講，這種
比值越大，信號與本底的距離越大，在反映樣品作用方面有越大的范圍，易于反映樣品作用 。 一般情況下，信號本底比的數值應大于3。當值小于3時，就不能有效的反映樣品的生物活 性。信號本底比的計算公式如下 S/B=M Signal/M Background
(2) 信噪比(signal to noise， S/N) 信噪比是儀器分析中常用的方法評價參數，噪音通常是指在同樣測定條件下，本底所產
生的記錄信號。通常情況下，信噪比要大于10才能認為是可以應用的方法。信噪比的計算公 式如下S/N=( M Signal-M Background)/ SD Background
(3) Z'因子
Z'因子綜合考慮了信號的變化和波動范圍，它只與實驗的重現性與可靠性有關而與實驗
的內容無關，因而在評價高通量藥物篩選模型的穩(wěn)定性和可靠性中得到廣泛的應用，Z'因
子是沒有單位的統(tǒng)計學參數，其值在0 1之間，Z'因子<0.5時穩(wěn)定性差，實驗的可靠性低
，這樣的模型不能用于藥物篩選，Z'因子在0.5 1時，模型穩(wěn)定性高，可以充分確保建立
的模型用于藥物的篩選。公式中SD表示標準方差，Z'因子的計算公式如下 z,=卜[(3xSD一 )+(3xSDBack—)
為了評估本篩選方法是否穩(wěn)定地適用于高通量篩選，在經優(yōu)化所得到的篩選條件下隨機
選取96孔板中60個孔，30個孔為一組，以濃度為10—7 M的胰島素為陽性對照，不加胰島素的 作為陰性對照，根據公式分別計算S/B、 S/N、 Z'因子，以對本方法進行定量評估。
采用的三個評價指標計算結果是S/B二3.37、 S/N=15.96、 Z'=0.52，說明本方法具有很好 的穩(wěn)定性和可靠性(圖9)。
由上述實例可見本發(fā)明細胞模型能夠高通量、低成本地準確篩選抗糖尿病藥物，其制 備方法簡單可控，成本低廉；本發(fā)發(fā)明抗糖尿病藥物篩選方法步驟簡單，成本低廉，準確性 高，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性，可實現高通量的篩選，為抗糖尿病藥物的篩選提供了新的 選擇。
SEQUENCE LISTING
〈110> 西華大學
〈120> —種用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型
〈130> A070332K
〈150> 200710050325.0 〈151> 2007-10-25
〈160> 4
〈170> Patentln version 3.4
〈210> 1
〈211> 4149
〈212> DNA
〈213> Homo sapiens
〈400> 1
atgggcaccg ggggccggcg gggggcggcg gccgcgccgc tgctggtggc ggtggccgcg GO
ctgctactgg gcgccgcggg ccacctgtac cccggagagg tgtgtcccgg catggatatc 120
cggaacaacc tcactaggtt gcatgagctg gagaattgct ctgtcatcga aggacacttg 180
cagatactct tgatgttcaa aacgaggccc gaagatttcc gagacctcag tttccccaaa 240
ctcatcatga tcactgatta cttgctgctc ttccgggtct atgggctcga gagcctgaag 300
gacctgttcc ccaacctcac ggtcatccgg ggatcacgac tgttctttaa ctacgcgctg 360
gtcatcttcg agatggttca cctcaaggaa ctcggcctct acaacctgat gaacatcacc 420
cggggttctg tccgcatcga gaagaacaat gagctctgtt acttggccac tatcgactgg 480
tcccgtatcc tggattccgt ggaggataat cacatcgtgt tgaacaaaga tgacaacgag 540
gagtgtggag acatctgtcc gggtaccgcg aagggcaaga ccaactgccc cgccaccgtc 600
atcaacgggc agtttgtcga acgatgttgg actcatagtc actgccagaa agtttgcccg 660
accatctgta agtcacacgg ctgcaccgcc gaaggcctct gttgccacag cgagtgcctg 720
ggcaactgtt ctcagcccga cgaccccacc aagtgcgtgg cctgccgcaa cttctacctg 780
gacggcaggt gtgtggagac ctgcccgccc ccgtactacc acttccagga ctggcgctgt 840
gtgaacttca gcttctgcca ggacctgcac cacaaatgca agaactcgcg gaggcagggc 900
tgccaccaat acgtcattca caacaacaag tgcatccctg agtgtccctc cgggtacacg %0
atgaattcca gcaacttgct gtgcacccca tgcctgggtc cctgtcccaa ggtgtgccac 1020
ctcctagaag gcgagaagac catcgactcg gtgacgtctg cccaggagct ccgaggatgc 1080
accgtcatca acgggagtct gatcatcaac attcgaggag gcaacaatct ggcagctgag 1140
ctagaagcca acctcggcct cattgaagaa atttcagggt atctaaaaat ccgccgatcc 1200tacgctctgg tgtcactttc cttcttccgg aagttacgtc tgattcgagg agagaccttg 1260
gaaattggga actactcctt ctatgccttg gacaaccaga acctaaggca gctctgggac 1320
tggagcaaac acaacctcac caccactcag gggaaactct tcttccacta taaccccaaa 1380
ctctgcttgt cagaaatcca caagatggaa gaagtttcag gaaccaaggg gcgccaggag 1440
agaaacgaca ttgccctgaa gaccaatggg gacaaggcat cctgtgaaaa tgagttactt 1500
aaattttctt acattcggac atcttttgac aagatcttgc tgagatggga gccgtactgg 1560
ccccccgact tccgagacct cttggggttc atgctgttct acaaagaggc cccttatcag 1620
肌tgtgacgg agttcgatgg gcaggatgcg tgtggttcca acagttggac ggtggt卿c 1,
attgacccac ccctgaggtc caacgacccc aaatcacaga accacccagg gtggctgatg 1740
cggggtctca agccctggac ccagtatgcc atctttgtga agaccctggt caccttttcg 1800
gatgaacgcc ggacctatgg ggccaagagt gacatcattt atgtccagac agatgccacc 1860
aacccctctg tgcccctgga tccaatctca gtgtctaact catcatccca gattattctg 1920
aagtggaaac caccctccga ccccaatggc aacatcaccc actacctggt tttctgggag 1980
aggcaggcgg aagacagtga gctgttcgag ctggattatt gcctcaaagg gctgaagctg 2040
ccctcgagga cctggtctcc accattcgag tctgaagatt ctcagaagca caaccagagt 2100
gagtatgagg attcggccgg cgaatgctgc tcctgtccaa agacagactc tcagatcctg 2160
aaggagctgg aggagtcctc gtttaggaag acgtttgagg attacctgca caacgtggtt 2220
ttcgtcccca gaaaaacctc ttcaggcact ggtgccgagg accctaggcc atctcggaaa 2280
cgcaggtccc ttggcgatgt tggg肌tgtg acggtggccg tgcccacggt ggcagctttc 2340
cccaacactt cctcgaccag cgtgcccacg agtccggagg agcacaggcc ttttgagaag 2400
gtggtg肌ca aggagtcgct ggtcatctcc ggcttgcgac acttcacggg ctatcgcatc
gagctgcagg cttgcaacca ggacacccct gaggaacggt gcagtgtggc agcctacgtc 2520
agtgcgagga ccatgcctga agccaaggct gatgacattg ttggccctgt gacgcatgaa 2580
atctttgaga acaacgtcgt ccacttgatg tggcaggagc cgaaggagcc caatggtctg 2M0
atcgtgctgt atgaagtgag ttatcggcga tatggtgatg aggagctgca tctctgcgtc 2了00
tcccgcaagc acttcgctct ggaacggggc tgcaggctgc gtgggctgtc accggggaac 2760
tacagcgtgc gaatccgggc cacctccctt gcgggcaacg gctcttggac ggaacccacc 2820
tatttctacg tgacagacta tttagacgtc ccgtcaaata ttgcaaaaat tatcatcggc 2880
cccctcatct ttgtctttct cttcagtgtt gtgattggaa gtatttatct attcctgaga 2940
aagaggcagc cagatgggcc gctgggaccg ctttacgctt cttcaaaccc tgagtatctc 3000agtgccagtg atgtgtttcc atgctctgtg tacgtgccgg acgagtggga ggtgtctcga 3060
gagaagatca ccctccttcg agagctgggg cagggctcct tcggcatggt gtatgagggc 3120
aatgccaggg acatcatcaa gggtgaggca gagacccgcg tggcggtgaa gacggtcaac 3180
gagtcagcca gtctccgaga gcggattgag ttcctcaatg aggcctcggt catgaagggc 3240
ttcacctgcc atcacgtggt gcgcctcctg ggagtggtgt ccaagggcca gcccacgctg 3300
gtggtgatgg agctgatggc tcacggagac ctg肌gagct acctccgttc tctgcggcca 3加0
gaggctgaga ataatcctgg ccgccctccc cctacccttc aagagatgat tcagatggcg 3420
gcagagattg ctgacgggat ggcctacctg aacgccaaga agtttgtgca tcgggacctg 3480
gcagcgagaa actgcatggt cgcccatgat tttactgtca aaattggaga ctttggaatg 3540
accagagaca tctatgaaac ggattactac cggaaagggg gcaagggtct gctccctgta 3600
cggtggatgg caccggagtc cctg肌ggat ggggtcttca ccacttcttc tgacatgtgg 加GO
tcctttggcg tggtcctttg ggaaatcacc agcttggcag aacagcctta ccaaggcctg 3720
tctaatgaac aggtgttgaa atttgtcatg gatggagggt atctggatca acccgacaac 3780
tgtccagaga gagtcactga cctcatgcgc atgtgctggc aattcaaccc caagatgagg 3840
ccaaccttcc tggagattgt caacctgctc aaggacgacc tgcaccccag ctttccagag 3900
gtgtcgttct tccacagcga ggagaacaag gctcccgaga gtgaggagct ggagatggag 3%0
tttgaggaca tggagaatgt gcccctggac cgttcctcgc actgtcagag ggaggaggcg 4020
gggggccggg atggagggtc ctcgctgggt ttc肌gcgga gctacgagga acacatccct 棚O
tacacacaca tgaacggagg caagaaaaac gggcggattc tgaccttgcc tcggtccaat 4140
ccttcctaa
4149
〈210〉 2
〈211〉 2355
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 2
atgtggatac aggctcagca gctccagggc gatgcccttc accagatgca ggccttgtac GO
ggccagcatt tccccatcga ggtgcgacat tatttatcac agtggatcga aagccaagcc 120
tgggactcaa tagatcttga taatccacag gagaacatta aggccaccca gctcctggag 180
ggcctggtgc aggagctgca ga卿aggcg gagcaccagg tggggga卿tgggtttttg 240
ctgaagatca agctggggca ctatgccaca cagctccaga gcacgtacga ccgctgcccc 300
atggagctgg ttcgctgtat ccggcacatt ctgtacaacg aacagaggct ggttcgcgaa 360
gccaacaacg gcagctctcc agctggaagt cttgctgacg ccatgtccca gaagcacctt 420
cagatcaacc aaacgtttga ggagctgcgc ctgatcacac aggacacgga gaacgagctg 480
aagaagctgc agcagaccca agagtacttc atcatccagt accaggagag cctgcggatc 540
caagctcagt ttgcccagct gggacagctg aacccccagg agcgcatgag cagggagacg 600
gccctccagc agaagcaagt gtccctggag acctggctgc agcgagaggc acagacactg 660
cagcagtacc gagtggagct ggctgagaag caccagaaga ccctgcagct gctgcggaag 720
cagcagacca tcatcctgga cgacgagctg atccagtgga agcggagaca gcagctggcc 780
ggg肌cgggg gtccccccga gggcagcctg gacgtgctgc agtcctggtg tg卿agctg ,
gccgagatca tctggcagaa ccggcagcag atccgcaggg ctgagcactt gtgccagcag 900
ctgcccatcc caggccccgt ggaggagatg ctggctgagg tcaacgccac catcacggac %0
atcatctcag ccctggtcac cagcacgttc atcatcgaga agcagcctcc tcaggtcctg 1020
aagacccaga ccaagtttgc agccaccgtg cgcctgctgg tgggggggaa gctgaatgtg 1080
cacatgaacc ccccgcaggt gaaggcgacc atcatcagcg agcagcaggc caagtccctg 1140
ctcaagaatg agaacacccg caatgattac agcggcgaga tcctgaacaa ctgttgcgtc 1200
atggagtacc accaggccac tggcacactc agcgcccact tcagaaacat gtccctgaaa 1260
cgaatcaaga ggtctgaccg ccgtggggca gggtcagtaa cggaagagaa gttcacgatc 1320
ctgtttgact cacagttcag cgtcggtgga aacgagctgg tctttcaagt caagaccttg 1380
tcgctcccgg tggtggtgat tgttcacggc agccaggaca acaatgccac agccactgtc 1440
ctctgggaca acgcctttgc agagcctggc agggtgccat ttgccgtgcc tgacaaggtg 1500
ctgtggccgc agctgtgtga agcgctc肌c atga肌ttca aggctg肌gt acagagc肌c
cggggcttga cc肌ggag肌cctcgtgttc ctggcacaga肌ctgttc肌catcagcagc
aaccacctcg aggactacaa cagcatgtcc gtgtcctggt cccagttcaa ccgggagaat 1680
ttgccaggac ggaattacac tttctggcag tggtttgatg gcgtgatgga agtattgaaa 1740
aaacatctca agcctcactg gaatgatggg gctatcctgg gtttcgtgaa caagcaacag 1800
gcccacgacc tgctcatcaa caagccagac gggaccttcc tgctgcgctt cagcgactcg 1860
gaaatcgggg gcatcaccat tgcttggaag tttgactctc aggagagaat gttttggaat 1920
ctgatgcctt ttaccactag agacttctct atccggtccc tcgctgaccg cctgggggac 1980
ctgaattacc tcatatatgt gtttcctgat cggccaaagg atgaagtata ttctaagtac 2040
tacacaccgg tcccctgtga gcccgcaact gcgaaagcag ctgacggata cgtgaagcca 2100
cagatcaagc aggtggtccc cgagtttgca aatgcatcca cagatgctgg gagtggcgcc 2160
acctacatgg atcaggctcc ttccccagtc gtgtgccctc aggctcacta caacatgtac 2220
ccacccaacc cggactccgt ccttgatacc gatggggact tcgatctgga agacacgatg 2280
gacgtggcgc ggcgggtcga卿gctctta ggccggccca tggacagtca gtggatccct 2340
cacgcacagt catga
2355
〈210> 3
〈211> 143
〈212> DNA
〈213> Artificial
〈220>
〈223> Artificial 〈400> 3
gcggctagct gtgtggactt cttggaatta agggactttt gtgtggactt cttggaatta 60 agggactttt gtgtggactt cttggaatta agggactttt gggatccggc cccgcccagc 120 gtcttgtcat tggcgaattc gcg 143
〈210> 4 〈211> 28 〈212> DNA
〈213> Artificial
〈220>
〈223> Artificial 〈400> 4
tgtggacttc ttggaattaa gggacttt 28
權利要求
1.一種篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征在于所述細胞模型是克隆了IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、以及由STAT5B應答元件調控的報告基因的編碼序列的哺乳動物細胞。
2.根據權利要求l所述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征 在于所述的IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列和由STAT5B應答元件調控的的編碼 序列能穩(wěn)定表達。
3.根據權利要求l所述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征 在于所述的哺乳動物細胞為H印G2、 293T、 3T3-L1或CH0中的任一種。
4.根據權利要求l所述的篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征在于 :所述的STAT5B應答元件的序列為TGTGGACTTCTTGGAATTAAGGGACTTTTG 。
5.根據權利要求4所述的篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征在于 :所述報告基因由210個STAT5B應答元件串連或重復的DNA調控序列調控。
6.根據權利要求l所述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型，其特征 在于所述報告基因為LUC基因、CAT基因或GFP基因中的任一種。
7.一種制備權利要求l-6任一項所述的篩選抗糖尿病藥物的細胞模型 的方法，其特征在于包括以下步驟將哺乳動物細胞培養(yǎng)至對數生長期后，將分別裝載有 IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、2-10個串聯的STAT5B應答元件DNA序列調控的 報告基因編碼序列的表達載體共轉染哺乳動物細胞，經穩(wěn)定篩選后得到本細胞模型。
8 .一種抗糖尿病藥物的篩選方法，其特征在于包括以下步驟a、 取權利要求l-6任一項所述的用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型接種于培養(yǎng)板并分 組，加入含待篩選物質的無血清培養(yǎng)基的為篩選組、加入含胰島素的無血清培養(yǎng)基的為陽性 對照、加入無血清培養(yǎng)基的為陰性對照；b、 誘導培養(yǎng)各細胞組，測定報告基因的表達量；根據表達量的多少確定待篩選物質是否被篩出。
9.根據權利要求8所述的抗糖尿病藥物篩選方法，其特征在于所述報 告基因的表達量為報告基因所表達的蛋白質或酶的量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于篩選抗糖尿病藥物的細胞模型及其制備方法。所要解決的技術問題是提供一種藥物作用機制明確，藥物篩選直接、快速、簡便，適合于高通量藥物篩選的藥物篩選細胞模型及相應的篩選方法。本發(fā)明細胞模型，是克隆了IR基因的編碼序列、STAT5B基因的編碼序列、以及由STAT5B應答元件調控的報告基因的編碼序列的哺乳動物細胞?？赏ㄟ^檢測該細胞模型中報告基因表達水平間接監(jiān)測IRTK活性，在細胞水平高通量的準確篩選抗糖尿病藥物。
文檔編號C12N5/16GK101200707SQ200710203168
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月18日 優(yōu)先權日2007年10月25日
發(fā)明者戴清源, 瀟 楊, 陳祥貴 申請人:西華大學