專利名稱：家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)、生物工程領(lǐng)域，特別是涉及一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基 因方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中的一項(xiàng)重要的技術(shù)，在功能基因研究、生物新產(chǎn)品開 發(fā)、生物素材創(chuàng)新、現(xiàn)代遺傳育種等方面發(fā)揮著重要的作用。
家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物。隨著家蠶基因組測序工作的完成，利 用高效穩(wěn)定的技術(shù)大規(guī)模地研究重要基因的功能成為家蠶功能基因組時代的重要課題，同 時，家蠶是理想的"昆蟲工廠"，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)開發(fā)絲腺生物反應(yīng)器具有巨大的 市場前景。而家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)是探索家蠶生長發(fā)育奧秘、拓展蠶業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈、促進(jìn)科技成果 實(shí)用化的有利武器。
自2000年日本科學(xué)家報道首次成功培育轉(zhuǎn)基因家蠶以來，國內(nèi)外已陸續(xù)報道轉(zhuǎn)基因家 蠶成功的消息。但是迄今為止的報道中，所有轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)都是利用家蠶多化性品系的非滯 育卵，主要是因?yàn)槎嗷约倚Q品種所產(chǎn)的卵為生種卵，其不需要任何的人工處理便能夠在 適當(dāng)?shù)臏貪穸认逻B續(xù)發(fā)育直至孵化，這個特點(diǎn)極大地方便了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中的操作控制和轉(zhuǎn) 基因后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。但這些多化性家蠶品系與滯育性的生產(chǎn)上的家蠶實(shí)用品種比 較，具有絲量少，絲質(zhì)差等經(jīng)濟(jì)性狀差的特點(diǎn)。故利用多化性家蠶品種作為轉(zhuǎn)基因的材料
具有以下兩個方面的明顯缺陷①多化性家蠶品種經(jīng)濟(jì)性狀差，利用轉(zhuǎn)基因所創(chuàng)造的附加
性狀在產(chǎn)量和質(zhì)量上都無法達(dá)到直接推廣應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，以多化性蠶種為原始材料的轉(zhuǎn)基因 品系只能作為育種原始材料，作為某一相關(guān)優(yōu)良性狀的原始載體的角色運(yùn)用于漫長而艱辛 的傳統(tǒng)育種之中。②多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續(xù)的飼養(yǎng)繁 殖，這樣需要浪費(fèi)大量的人力和物力對獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品系進(jìn)行維持和繼代，同時也大 大增加了獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品種資源丟失的風(fēng)險。因此，利用多化性家蠶品種不但不利于 進(jìn)行大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，而且很難使研究成果快速轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)實(shí)際中去。
家蠶滯育品種為一化或二化性品系，在產(chǎn)卵以后便進(jìn)入一個比較漫長的滯育期，這樣 極有利于它們維持和繼代。另外生產(chǎn)上的實(shí)用家蠶品系幾乎都是滯育品系，多為一化或二 化性品系。如利用普通的家蠶滯育品系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究可以克服多化性家蠶品種轉(zhuǎn)基因研 究中所述的第二個缺陷，而利用生產(chǎn)上的實(shí)用家蠶滯育品系原種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究則可以克 服多化性家蠶品種轉(zhuǎn)基因研究中所述的所有缺陷。因此，家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因研究具有 極為重要理論和實(shí)際意義。生產(chǎn)實(shí)際中，滯育卵一般在產(chǎn)卵后約16-20小時左右利用常規(guī) 的即時浸酸法能有效解除它們的滯育。而目前最有效的家蠶轉(zhuǎn)基因顯微注射時間是在產(chǎn)卵 后3-6小時，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因操作后卵上會上留下注射小孔，如果在注射后利用常規(guī)的即時浸 酸法會導(dǎo)致鹽酸滲入蠶卵內(nèi)，從而致死，根本無法實(shí)現(xiàn)家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因研究。因此 家蠶滯育品種卵會發(fā)生滯育，給轉(zhuǎn)基因操作帶來很大的限制。
到目前為止，滯育性家蠶品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在國內(nèi)外還未見報道，更沒有一種成熟可 靠的方法實(shí)現(xiàn)家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因，因此，探索家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因的方法，是簡化 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)、加速科技成果實(shí)用化的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因蠶的制作路線方法。該路線方法利 用在蠶卵胚胎發(fā)育至胚帶形成之前的一定時間內(nèi)，即產(chǎn)卵后2個半小時之前對家蠶滯育卵 進(jìn)行鹽酸的浸泡處理(本說明書稱為早期浸酸法)，隨后對處理解除滯育的蠶卵進(jìn)行胚胎 顯微注射，催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養(yǎng)至化蛾，它們的自交或回交產(chǎn)生G1代，通過 熒光標(biāo)記篩選，從而有效制作轉(zhuǎn)基因家蠶。
本發(fā)明首次建立了家蠶滯育品種胚胎早期浸酸法，并獲得了早期浸酸解除滯育的最佳 條件，并將這項(xiàng)技術(shù)與家蠶胚胎顯微注射技術(shù)，熒光檢測與分子生物操作技術(shù)相結(jié)合，成 功地突破了家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的瓶頸，建立了一種可靠的家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因技 術(shù)路線方法。
本發(fā)明家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，依次通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1) 家蠶滯育品種進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)；
(2) 在25'C的種繭保護(hù)溫度下收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25"C、弱光的條件下交配 4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環(huán)境中產(chǎn)卵，每間隔lh收集一次 蠶卵，并將收集的蠶卵置于25'C的環(huán)境中保護(hù)備用；
(3) 以蠶卵收集時間為起點(diǎn)開始記時，于收集后2hl5min-2h30min,將上述收集的蠶卵 連同蠶連紙片一并浸入46。C恒溫、比重1. 075的HC1中處理lmin30s-3min30s，及時取出 在流水中漂洗至酸脫盡，解除滯育蠶品種的滯育；
(4) 將脫盡酸的蠶卵用鑷子轉(zhuǎn)移至用75%酒精消毒的載玻片上，并按照蠶卵腹面向右的 標(biāo)準(zhǔn)將其排列整齊，排列好的蠶卵置于35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min;
(5)以收集的時間開始記時，于收集后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度 400ng/ul的piggyBac質(zhì)粒轉(zhuǎn)座載體從蠶卵腹面中央注入已經(jīng)消毒的蠶卵中，并用無毒的 膠水封閉卵殼注射留下的小孔；
(6)將注射完成的蠶卵在35-37%的甲醛蒸氣中消毒5min后置于25°C、相對濕度85% 以上的濕度條件下，進(jìn)行催青直到孵化，詞養(yǎng)孵化出來的蟻蠶，將當(dāng)代(GO)的蠶蛾進(jìn)行 自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉(zhuǎn)基因個體；最后，獲得的轉(zhuǎn)基因個 體詞養(yǎng)、傳代，即完成家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因蠶的制作。
h表示小時，min表示分鐘。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
本發(fā)明關(guān)于家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因蠶的制作方法，首次通過獲得早期浸酸解除滯育的 最佳條件后，采用早期浸酸解除需要注射蠶卵的滯育，最后參照多化性品系轉(zhuǎn)基因家蠶顯 微注射的制作方法，從而有效地突破了家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的瓶頸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是， 利用上述技術(shù)路線，可以有效地實(shí)現(xiàn)家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因。而利用家蠶滯育品種創(chuàng)造的轉(zhuǎn) 基因蠶品系，可以克服多化性品系轉(zhuǎn)基因家蠶的所有缺點(diǎn)，其具有以下的明顯優(yōu)勢①家 蠶滯育品種，尤其是生產(chǎn)上采用的實(shí)用性品種各種經(jīng)濟(jì)性狀都比較良好，外源或內(nèi)源的轉(zhuǎn) 基因目標(biāo)性狀也非常優(yōu)良，在利用這些家蠶品種作為生物反應(yīng)器時，其目的產(chǎn)物的產(chǎn)量與
質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過多化性品系的轉(zhuǎn)基因家蠶；②現(xiàn)今蠶業(yè)生產(chǎn)中所采用的蠶品種多為滯育性的
一化或二化性品種，在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造新的遺傳素材或品種資源時，直接采用生產(chǎn)中 普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利 用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，大大的縮短了育種的周期，也節(jié)
約了大量的人力和物力；③滯育性家蠶在自然條件下一年繁殖一個或兩個世代以后便自動 進(jìn)入一個漫長的滯育期，要保存其品種資源只需要在一年內(nèi)進(jìn)行一次或兩次的飼養(yǎng)和簡單 的蠶種管理即可，對其生產(chǎn)和管理可以根據(jù)計(jì)劃的需要人為地進(jìn)行調(diào)節(jié)，而且實(shí)用性家蠶 品種的各項(xiàng)性狀通過長期育種的選擇，都比較穩(wěn)定，所以利用這些家蠶滯育品種作為家蠶 轉(zhuǎn)基因研究的材料，可以簡化資源保存的工作、降低品種資源丟失的風(fēng)險、增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因工 作的計(jì)劃性、使轉(zhuǎn)基因工作與實(shí)際生產(chǎn)更加緊密地結(jié)合。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
利用家蠶滯育品種"碧波"作為原始材料，將正常飼養(yǎng)并按前述方法交配、收集處理
所得的蠶卵，于產(chǎn)下后2h30min在液溫46。C、比重1. 075的HC1中處理2min30s，用自來
水漂洗干凈后，于產(chǎn)下后3h用E卯endorf顯微注射儀將帶有神經(jīng)和眼睛特異啟動子啟動 的紅色熒光蛋白標(biāo)記的piggyBac載體和輔助載體，共同注射進(jìn)入通過早期浸酸法解除滯 育后的1518粒蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25。C、相對濕度85%的高濕度環(huán)境中催 青孵化，將孵化的70頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養(yǎng)至化蛾，獲得42頭G0代蠶蛾通過 自交或回交共獲得23蛾圈Gl代蠶卵，用Olympu腫電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選并獲得3 個陽性蛾圈，共獲得18頭家蠶滯育品種"碧波"的轉(zhuǎn)基因蠶，轉(zhuǎn)化效率為13.04%。
實(shí)施例2:
利用家蠶滯育品種"秋白"作為原始材料，將正常詞養(yǎng)并按前述方法交配、收集處理 所得的蠶卵，于產(chǎn)下后2h20min在液溫46。C、比重1. 075的HC1中處理3min30s,用自來 水漂洗干凈后，于產(chǎn)下后5h用Eppendorf顯微注射儀將帶有神經(jīng)和眼睛特異啟動子啟動 的紅色熒光蛋白標(biāo)記的piggyBac載體和輔助載體，共同注射進(jìn)入通過早期浸酸法解除滯 育后的2008粒蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25'C、相對濕度90%的高濕度環(huán)境中催 青孵化，將孵化的109頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養(yǎng)至化蛾，獲得72頭G0代蠶蛾通 過自交或回交共獲得34蛾圈G1代蠶卵，用Olympu-電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選并獲 得4個陽性蛾圈，共獲得26頭家蠶滯育品種"秋白"的轉(zhuǎn)基因蠶，轉(zhuǎn)化效率為11.76%。
實(shí)施例3:
利用家蠶滯育品種"大造"作為原始材料，將正常飼養(yǎng)并按前述方法交配、收集處理 所得的蠶卵，于產(chǎn)下后2hl5rain在液溫46'C、比重1. 075的HC1中處理lmin30s，用自來 水漂洗干凈后，于產(chǎn)下后6h用Eppendorf顯微注射儀將帶有神經(jīng)和眼睛特異啟動子啟動 的紅色熒光蛋白標(biāo)記的piggyBac載體和輔助載體，共同注射進(jìn)入通過早期浸酸法解除滯 育后的1623粒蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25。C、相對濕度95%的高濕度環(huán)境中催 青孵化，將孵化的212頭G0代蟻蠶用人工詞料收集飼養(yǎng)至化蛾，獲得153頭G0代蠶蛾通 過自交或回交共獲得71蛾圈G1代蠶卵，用01ympu^電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選并獲 得li個陽性蛾圈，共獲得57頭家蠶滯育品種"大造"的轉(zhuǎn)基因蠶，轉(zhuǎn)化效率為19.29%。
實(shí)施例4:
利用家蠶滯育品種"洞庭"作為原始材料，將正常飼養(yǎng)并按前述方法交配、收集處理 所得的蠶卵，于產(chǎn)下后2h25min在液溫46。C、比重1. 075的HC1中處理lmin30s，用自來 水漂洗干凈后，于產(chǎn)下后4h用E卯endorf顯微注射儀將帶有神經(jīng)和眼睛特異啟動子啟動 的紅色熒光蛋白標(biāo)記的piggyBac載體和輔助載體，共同注射進(jìn)入通過早期浸酸法解除滯 育后的1580粒蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25'C、相對濕度90%的高濕度環(huán)境中催
青孵化，將孵化的86頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養(yǎng)至化蛾，獲得68頭G0代蠶蛾通過 自交或回交共獲得36蛾圈Gl代蠶卵，用0^1!^113@電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選并獲得4 個陽性蛾圈，共獲得32頭家蠶滯育品種"大造"的轉(zhuǎn)基因蠶，轉(zhuǎn)化效率為11.11%。
權(quán)利要求
1、一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于依次通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)家蠶滯育品種進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)；(2)在25℃的種繭保護(hù)溫度下收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25℃、弱光的條件下交配4h后拆對，并將雌蛾投放于上漿的蠶連紙上，在黑暗的環(huán)境中產(chǎn)卵，每間隔1h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25℃的環(huán)境中保護(hù)備用；(3)以蠶卵收集時間為起點(diǎn)開始記時，于收集后2h15min-2h30min，將上述收集的蠶卵連同蠶連紙片一并浸入46℃恒溫、比重1.075的HCl中處理1min30s-3min30s，及時取出在流水中漂洗至酸脫盡，解除滯育蠶品種的滯育；(4)將脫盡酸的蠶卵用鑷子轉(zhuǎn)移至用75％酒精消毒的載玻片上，并按照蠶卵腹面向右的標(biāo)準(zhǔn)將其排列整齊，排列好的蠶卵置于35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min；(5)以收集的時間開始記時，于收集后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的piggyBac質(zhì)粒轉(zhuǎn)座載體從蠶卵腹面中央注入已經(jīng)消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔；(6)將注射完成的蠶卵在35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min后置于25℃、相對濕度85％以上的濕度條件下，進(jìn)行催青直到孵化，飼養(yǎng)孵化出來的蟻蠶，將當(dāng)代(G0)的蠶蛾進(jìn)行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉(zhuǎn)基因個體；最后，獲得的轉(zhuǎn)基因個體飼養(yǎng)、傳代，即完成家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因蠶的制作。h表示小時，min表示分鐘。
全文摘要
一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，利用在蠶卵胚胎發(fā)育至胚帶形成之前的一定時間內(nèi)，即產(chǎn)卵后2個半小時之前對家蠶滯育卵進(jìn)行鹽酸的浸泡處理，隨后對處理解除滯育的蠶卵進(jìn)行胚胎顯微注射，催青孵化獲得的G0代家蠶的飼養(yǎng)至化蛾，它們的自交或回交產(chǎn)生G1代，通過熒光標(biāo)記篩選，從而有效制作轉(zhuǎn)基因家蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大量的人力和物力。
文檔編號C12N15/85GK101195834SQ20071030390
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春, 成 魯 申請人:西南大學(xué);重慶拓桑生物科技有限公司