專利名稱：：用于阿特拉津降解的混合細菌培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用來自s-三嗪(s-triazine)污染土壤的專一性生長和分解代謝特性的混合細菌培養(yǎng)物降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的微生物方法。
背景技術(shù)：
：阿特拉津(6-氯-N-乙基-N，異丙基-[1，3,5]三嗪-2，4-二胺)是不僅在農(nóng)用地而且在更廣泛的土地上用于闊葉草控制的s-三嗪除草劑。阿特拉津超過30年的廣泛使用和在土壤中相對較高的流動性已經(jīng)導致其在地表水和地下水中以超過最大允許水平的濃度(在美國為3ppb,在歐洲為l-2ppb)以日益增加的頻率檢測到。這種事實和對其生物毒性和生態(tài)毒性的增加的擔憂已經(jīng)激起了阿特拉津生物降解性的研究，其目的是發(fā)展微生物學方法來加速阿特拉津污染的地方的生物降解過程。迄今為止已經(jīng)出版許多論文來處理來自阿特拉津污染土壤的微生物培養(yǎng)物的分離，它們在轉(zhuǎn)化或者將阿特拉津完全降解成無機化合物方面具有顯示了活性(BehkiRM和KhanSU1986J.Agric.FoodChem.34:746-749;BehkiRM和KhanSU1994J.Agric.FoodChem.42:1237-1241;RadosevichM,HaoY-L，TrainaSJ和T麗inenOH1995Appl.Environ.Microbiol.61:297-302;MandelbaumRT,AllanBH和WackettLP1995Appl.Environ.Microbiol.61:1451-1457;Yanze-KontchouC和GschwindN1995J.Agric.FoodChem.43:2291-2294;BouquardC，0uazzaniJ，P，JC，Miche卜BriandY&PlesiatP1997Appl.Environ.Microbiol.63:862-866;SparlingG，DragtenR，AisabieJ和FraserR1998Aus.J.SoilRes.36:557-570;ToppE，ZhuH,NourSM，HouotS，LewisM和CuppelsD2000Appl.Environ.Microbiol.66:2773—2782;MartinezB，Tomkins,WackettLP,WingR和SadowskyML2001J.Bacteriology19:5684-5697;RalebitsoTK,SeniorE和VerseveldHW2002，Biodegradation13:11-19)。通過所研究的阿特拉津降解培養(yǎng)物，單培養(yǎng)物或者混合培養(yǎng)物，革蘭氏陰性桿狀細菌被報道為最具活性。但是，存在曰益增加數(shù)量的有關(guān)一些革蘭氏陽性菌(特別是那些屬于化"r力'wVw和^r^wfe"er屬的細菌)的報道，它們能夠降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物并顯示在含有這些物質(zhì)作為碳源和氮源的礦物培養(yǎng)基中生長的能力。(StrongLC,RosendahlGJohnsonG，SadowskyMJ和WackettLP2002Appl.Environ.Microbiol.68:5973-5980)。通過純化培養(yǎng)，到目前為止/^eycto/70朋s菌株ADP已經(jīng)成為最廣泛研究的細菌菌種。該菌株是在需氧和厭氧條件下被廣泛研究的阿特拉津分解代謝的參考菌株，具有編碼阿特拉津轉(zhuǎn)化成氰尿酸的被測定分解代謝基因序列(蟲A-deSouzaML，SadowskyMJ,WackettLP1996J.Bacteriol.178:4894-4900;"』-Boundy-Mi1IsK,deSouzaML,MandelbaumRM，WackettLP和SadowskyMJ1997Appl.Environ.Microbiol.63:916-923以及"SadowskyMJ,TongZ,deSouzaML和WackettLP1998Bacteriology180:152-158)以及編碼氰尿酸隨后降解成二氧化碳、銨離子和氯離子的其他三個基因(^力EF)(Garcia-GonzalezV，GovantesF,PerruaO和SanteroE2005J.Bacteriol187:155-167)。在美國專利US5508193中，描述了用于i^ej^o/如w印.菌株ADP分離的方法，以及用于其最佳生長和阿特拉津礦化活性的條件。該細菌被顯示在作為少量污染特性的相當?shù)偷陌⑻乩驖舛?"0ppb)下以及高阿特拉津濃度(2000ppb)下(諸如在溢出部位)(來自集約農(nóng)業(yè)流掉的水，除草劑處理位置和農(nóng)業(yè)化學經(jīng)銷位置)或者在來自阿特拉津和其他含有s-三嗪化合物的制備車間的工藝廢水通常發(fā)生的那些)都表現(xiàn)分解代謝活性。/^e/^/7朋^ADP在含有0.4mM阿特拉津作為唯一氮源和15mM合適碳源(檸檬酸鹽琥珀酸鹽)的礦物培養(yǎng)基中顯示了持續(xù)生長。在這些條件下，即在氮限制(碳氮摩爾比C/恥45)下，Aey6to/^/2"ADP顯示了最大分解代謝效率，反之在另外的氮源(硝酸銨、磷酸銨)存在下阿特拉津降解被高度抑制?？紤]到大多數(shù)土壤沒有氮限制；事實上取決于施肥模式它們或多或少富于有機和無機氮，并考慮到生產(chǎn)廢水含有各種氮化合物，尸se;^加o加sA1)P作為生物增效劑以加速阿特拉津礦化過程以及被污染位置補救的使用不能頻繁地提供預期結(jié)果。在美國專利US5429949中描述了以勘/i7朋/s^W/e/w/i"M91-3(GebendingerN和RadosevichM1999Appl.MicrobiolBiotechnol.51:375-381)為特征的革蘭氏陰性菌M91-3的分離和分解代謝活性。與/^e/^/o/7MADP相似，M91-3在存在阿特拉津作為唯一氮源的情況下生長，并在最佳條件下(C/N>30)降解阿特拉津產(chǎn)生最終產(chǎn)物C02和NH/。在阿特拉津濃度為O.lmM(大約21.5mgr1)并添加了葡萄糖(2.2-5.5mM)作為碳源的液體培養(yǎng)基中進行了研究。此外，與使用Aey"朋朋"ADP的情況相似，由M91-3進行的阿特拉津礦化在有機或無機來源的添加氮源存在下被抑制。氮化合物對阿特拉津分解代謝路徑調(diào)節(jié)的影響已經(jīng)被許多研究所聚焦(Garcia-Go腦lezV，GovantesF，Perrua0和SanteroE2005J.Bacteriol.187:155-167),并且氮改善已經(jīng)顯示對由絕大多數(shù)已知的阿特拉津降解細菌進行的阿特拉津降解具有負面影響。因此，阿特拉津分解代謝的氮控制可將具有分解代謝活性的細菌完全限制為有效地被用于由于日常施肥富含有機或無機氮的農(nóng)業(yè)土壤中阿特拉津降解。由于有關(guān)在環(huán)境中引入遺傳修改的微生物的禁止，這種禁止在絕大多數(shù)國家都是強制的，使用具有被調(diào)控阿特拉津分解代謝即不考慮氮控制的細菌突變株作為用于富氮阿特拉津污染的土壤補救的生物增效劑的嘗試也得到了有限的成功。關(guān)于具有分解代謝活性的單個或混合細菌培養(yǎng)物用于處理含有高濃度的這種除草劑的廢水的商業(yè)應(yīng)用都沒有報道?？偠灾m然已經(jīng)認識到微生物，特別是細菌對于阿特拉津和其他s-三嗪化合物的轉(zhuǎn)化來說是非常有效的生物試劑，但迄今為止提供的用于從自然環(huán)境(即用于污染位置補救)中除去這些化合物的微生物學方法在商業(yè)上都是不可靠的。因此，仍然存在對于發(fā)展微生物學方法的需要，在該方法中細菌的分解代謝潛能將被開發(fā)，在變化的常常非常特殊的環(huán)境條件下迅速并完全降解阿特拉津。圖i.通過使用環(huán)標記的["c]-阿特拉津(-▲-)和乙基-鏈標記的-阿特拉津(-■-)的放射呼吸測量法測定的培養(yǎng)物AtzMix1的阿特拉津礦化活性。圖2.在培養(yǎng)物AtzMix1在含有不同s-三嗪化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)開始和7天之后的HPLC-DAD(213nm)色譜CA氰尿酸;DIA-0H羥基去異丙基阿特拉津；DDA去乙基去異丙基阿特拉津；DEA-OH羥基去乙基阿特拉津；DIA去異丙基阿特拉津；AT-0H羥基阿特拉津和DEA去乙基阿特拉津。圖3.在不同溫度下培養(yǎng)物AtzMix1(由600nm的光密度確定)的生長和以降解中間產(chǎn)物的定量分析(通過HPLC法)的阿特拉津降解。圖4.在含有不同阿特拉津濃度(30mgr1-5000mgr1)作為唯一氮源和檸檬酸鈉(1g匸)作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)物AtzMix1生長過程中以降解中間產(chǎn)物的定量分析(通過HPLC法)的阿特拉津降解(圖"C/N=3;圖4BC/N=10.5;圖4CC/N-2.5并且圖4DC/N-l.8)。圖5.在以阿特拉津(100mgI—1)作為唯一氮源(圖5A)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過程中和在添加了不同氮化合鉤(2.3mM):尿素(圖5B);(NH4)2S04(圖5C)和KN03(圖5D)的同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)物AtzMix1的生長和阿特拉津降解(通過HPLC法測定)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了被標記為AtzMix1的混合細菌培養(yǎng)物，所述AtzMix1來自天然環(huán)境(被s-三嗪化合物污染的土壤)并表現(xiàn)降解阿特拉津以及其他s-三嗪化合物的能力，諸如西瑪津(6-氯-N，N，-二乙基-[1，3,5]三吖嗪-2，4-二胺),撲滅津(6-氯-N，N，-二異丙基-[1，3，5]三吖嗪-2,4-二胺)，terbutilazine(6-氯-N-叔丁基-N，-乙基-[l，3，5]三吖嗪-2,4-二胺)，去乙基阿特拉津(6-氯-N-異丙基-[l，3，5]三吖嗪-2，4-二胺)，去異丙基阿特拉津(6-氯-N-乙基-[1,3,5]三吖嗪-2，4-二胺)，羥基阿特拉津(6-羥基-N-乙基-N，異丙基-[l，3，5]三吖嗪-2，4-二胺),羥基去異丙基阿特拉津(6-羥基-N-乙基-[1,3，5]三吖嗪-2，4-二胺)，羥基去乙基阿特拉津(6:羥基-N-異丙基-[1，3,5]三吖嗪-2，4-二胺)，羥基去異丙基去乙基阿4;拉津(6-羥基-[1，3，5]三吖嗪-2，4-二胺)和氰尿酸(2，4，6-三羥基-1，3,5-三吖嗪)。本發(fā)明還提供了用于阿特拉津和其他s-三嗪化合物的微生物方法，其以培養(yǎng)物AtzMix1的特定分解代謝和其他特征為基礎(chǔ)。到本發(fā)明之前，沒有其他混合或者純凈的細菌培養(yǎng)物被報導在與那些在殺蟲劑污染的土壤(碳限制、優(yōu)先氮源的存在、低C/N比，低溫、高阿特拉津濃度)中常常發(fā)生的情況類似的條件下迅速或者完全降解阿特拉津。培養(yǎng)物成分的互補分解代謝活性提供了阿特拉津的完全降解(礦化)，而分解代謝的普遍性和培養(yǎng)物成分之間的相互作用可有助于更好地使混合培養(yǎng)物AtzMix1適于改變環(huán)境條件和不利于分解代謝活性細菌生長和分解代謝活動的條件下分解代謝活性細菌的存活。培養(yǎng)物AtzMix1本發(fā)明的混合培養(yǎng)物已經(jīng)存放在NationalCollectionofAgriculturalandIndustrialMicroorganisms,Budapest,Hungary,保藏號NCAIM(P)B0013292005-12-09。培養(yǎng)物AtzMix1已經(jīng)通過在含有阿特拉津作為唯一碳源和氮源的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)而從暴露在被s-三嗪化合物長期污染的土壤中富積。阿特拉津礦物質(zhì)培養(yǎng)基的成分和連續(xù)培養(yǎng)條件在例1中描述。培養(yǎng)物AtzMixl在不同條件下培養(yǎng)過程中(例如存在或不存在輔助碳源，在各種阿特拉津濃度和各種溫度下)顯示了持續(xù)生長和阿特拉津降解活性。在阿特拉津降解過程中的平板計數(shù)檢查表明，混合培養(yǎng)物的結(jié)構(gòu)基于條件而變化；但是存在最頻繁的四個形態(tài)學上不同克隆類型。培養(yǎng)物AtzMix1的其他特征顯示阿特拉津礦化是培養(yǎng)物成分的互補分解代謝活動的結(jié)果，其中一些成分將阿特拉津降解成氰尿酸(經(jīng)鑒別屬于Arthrobacter屬)，一部分其他成分繼續(xù)將氰尿酸降解產(chǎn)生C02和NH4+。培養(yǎng)物AtzMix1在l(TC到3(TC即在并不總是利于其生長的條件下的范圍內(nèi)表現(xiàn)出阿特拉津降解活性。最快的培養(yǎng)物生長和阿特拉津降解率被記錄為在溫度為3(TC的時候；但是，雖然生長率在更低溫度下明顯降低，諸如在自然環(huán)境下常常發(fā)生的那些情形，但培養(yǎng)物AtzMixl保持了其顯著的專一性降解活性，即便在溫度為l(TC時也是如此。證明溫度對培養(yǎng)物AtzMix1的生長和分解代謝活性的影響的實驗在例2中顯示，而不同初始阿特拉津濃度下(不同碳氮比)的生長動力學和阿特拉津降解實驗在例3中顯示。動力學實驗結(jié)果顯示盡管在初始阿特拉津濃度為30mgr1和lOOmgr1(碳氮摩爾比C/N=31.1和C/N10.5)時培養(yǎng)物AtzMix1的生長率幾乎相同，但在更高的阿特拉津濃度時阿特拉津降解率更高。此外，當阿特拉津的濃度增加到lOOOmg1(-1)和5000mg1(-1)而不增加碳源(C/N=2.5和C/N1.8)并承受高阿特拉津濃度(高達10g1(-1))時培養(yǎng)物AtzMix1顯示了等同的降解能力(在每小時每克生物量1.4-1.8mM的范圍內(nèi)阿特拉津降解的最大專一性比例)。動力學實驗結(jié)果還顯示，阿特拉津降解不受其他氮源諸如尿素、硫酸銨或者硝酸鉀存在的影響。取決于這些生長和分解代謝特定，可以預期本發(fā)明的混合培養(yǎng)物在阿特拉津和其他三嗪化合物降解方面將比迄今為止描述的阿特拉津降解細菌培養(yǎng)物更為有效，尤其是當存在優(yōu)選氣源(例如含氮豐富的土壤)以及在非常大的污染位置(例如溢出位置)和含有高阿特拉津濃度的生長廢水中時的阿特拉津污染環(huán)境中。還可設(shè)想培養(yǎng)物成分之間的專一性分解代謝、營養(yǎng)和其他合成相互作用可誘導混合培養(yǎng)物成分的變化。出于這種原因，本發(fā)明包括基本上具有培養(yǎng)物AtZMix1的相同分解代謝和其他鑒別特性的所有培養(yǎng)物變體。用于降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的微生物學方法提供用于三嗪化合物的降解，即用于加速被污染環(huán)境(土壤、地下水，地表水等)中這些化合物的生物轉(zhuǎn)化。該方法還提供用于含有s-三嗪化合物農(nóng)用化學和其他工藝廢水的處理。取決于本發(fā)明的混合培養(yǎng)物AtzMix1的分解代謝活性，該方法提供用于在微量污染位置(100-200ppm)和非常高污染位置(1000-5000pPm)處的被污染環(huán)境中s-阿特拉津，優(yōu)選阿特拉津的降解，后者最通常的情況下指的是溢出以及非正規(guī)地處理這些化合物的儲存。取決于培養(yǎng)基和環(huán)境中污染物存在下的條件，本發(fā)明提供了培養(yǎng)物AtzMixl作為液體培養(yǎng)物或者作為固定在足夠載體(例如顆粒狀活性炭或者其他用于細菌附著的固相載體)上的培養(yǎng)物的用途。本發(fā)明的方法涉及在含有相應(yīng)礦物鹽(例如KH2P04，K2HP04,NaCl,MgS04，ZnS04，F(xiàn)eS04，MnSO"CuS04)維生素源和特定養(yǎng)分(例如酵母膏)、合適碳源(例如檸檬酸鹽、葡萄糖、琥珀酸鹽)和一些阿特拉津以提供大約30:1的C/N比的培養(yǎng)基中批量培養(yǎng)培養(yǎng)物AtzMix1。本發(fā)明的混合培養(yǎng)物的分解代謝活性以阿特拉津的特定降解率表示大約為2.5mM每小時每克干重生物量(mMg—'1—1)。為了實現(xiàn)本發(fā)朋的方法的最佳可能效果，即在污染位置最迅速和完全的s-三嗪化合物的降解(這些化合物的完全礦化)，推薦使用確保2.5mMg—i廣阿特拉津降解率的培養(yǎng)物量。例1混合細菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)和特性培養(yǎng)物AtzMix1從持續(xù)暴露在阿特拉津和其他s-三嗪化合物污染20年以上的農(nóng)業(yè)工廠區(qū)域中收集的土壤中富積。培養(yǎng)物的富積在室溫下在以含有阿特拉津作為唯一碳源和氮源的礦物鹽培養(yǎng)基流入的連續(xù)流動單元中在2個月的培養(yǎng)過程中進行。連續(xù)流動單元的描述在HrsakQBosnjakM和JohanidesV1982J.A卯l.Bacteriology53:413-422中給出。阿特拉津培養(yǎng)基(AMS)包括下列礦物鹽(gr1):K2HP041.6;KH2P040.4;MgS04x7H200.2;NaCl0.1;CaCl2x6H200.04，并加入阿特拉津(25mg-1),鹽母液(20mlr。和維生素母液(10mlr1)。鹽母液含有(g"):EDTA2.5;ZnS04x7H2011.1;FeS045.0;MnS04x7H201.54;CuS04x5H200.4;Co(N03)2x6H200.25以及^2840—10}{200.18，維生素母液含有(gl—1):硫胺HC15;生物素2;葉酸2;煙堿10和維生素B6HC110。過程簡單描述如下將連續(xù)流動單元充滿用PH7.0的磷酸緩沖)制備的土壤濾液(100g的土壤加入到1升磷酸緩沖液中混合20分鐘，允許沉淀并通過粗濾紙過濾)，接著配制AMS培養(yǎng)基。在2個月的富積后，將單元的內(nèi)含物離心(6000g，IO分鐘)，將生物量重新懸浮在磷酸緩沖液中并以小等分試樣(10ml)儲存在零下2(TC的冰箱中。在富積2周后，流出物中阿特拉津的殘留濃度通過高效液相色譜-HPLC監(jiān)測。還通過將適量培養(yǎng)物稀釋液涂布在含有阿特拉津(5GGml—1)和檸檬酸鈉(lgi—1)的固體AMS培養(yǎng)基上來監(jiān)測混合培養(yǎng)物的結(jié)構(gòu)。所使用的HPLC方法和色譜條件在StipicevicS，F(xiàn)inglerS,Zupancic-KraljL和DrevenkarV2003J.S印.Sci.26:1237-1246中描述；這里僅僅i兌明使用系統(tǒng)VarianProStar系統(tǒng)和色譜柱為ODSHypersil,250mmx4.6mm(粒子尺寸5nm)進行分析，所述系統(tǒng)裝備有具有一系列光學二極管(UV-腦)的VarianProStar330UV-檢測器(Varian，WalnutCreek,CA,USA),所述色譜柱具有安全柱HypersilODS色譜(10mmx4mm，5jum),ThermoHypersi1-Keystone,Bellefonte,PA，USA。阿特拉津和其他s—三嗪化合物以及降解中間產(chǎn)物的鑒別根據(jù)可靠標準的保釋時間和UV-波譜。來自確信阿特拉津完全消失的連續(xù)流動單元的培養(yǎng)物樣品的HPLC分析以及在固體阿特拉津培養(yǎng)基(在3(TC下培養(yǎng)10天后)上生長的克隆分析確保在培養(yǎng)物中一些宏觀形態(tài)上差異的克隆類型的存在；最通常存在4種克隆類型。在一些克隆的周圍觀察到透明帶，這表明阿特拉津降解細菌的存在。混合培養(yǎng)物AtzMix1的其他特征通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法篩選負責阿特拉津降解的基因來進行分析。用于擴增的PCR程序在RousseauxS,HartmannA和SoulasG2001FEMSMicrob.Ecol.36:211-222中描述；這里僅僅給出簡短描述使用蛋白酶K方案按照生產(chǎn)商的說明書(BoehringerMannheim,Germany)從在含有l(wèi)gT阿特拉津(光密度006。。=0.4)的培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)中生長的培養(yǎng)物AtzMix1中分離總基因組DNA。分離的DM被用作使用具有對阿特拉津降解基因擴增專一的引物的PCR反應(yīng)(反應(yīng)體積為25jal)中的模板(2.5nl)。PCR產(chǎn)物然后通過1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離，用溴化乙啶染色并在UV-光照射下使用數(shù)碼相機(加能，日本)成像。培養(yǎng)物AtzMix1的分子特性顯示編碼用于將阿特拉津轉(zhuǎn)化成氰尿酸的酶的分解代謝基因trzA、atzB和atzC以及編碼用于打開s-三嗪的環(huán)的酶的基因trzD的存在。這些基因的檢測還表明，阿特拉津分解代謝以去氯(羥基阿特拉津的形成)，接著是阿特拉津側(cè)鏈的水解除去(氰尿酸的形成)，隨后是s-三嗪環(huán)的裂解。該阿特拉津分解代謝途徑得到大量進一步的實驗支持，在這些實驗中羥基阿特拉津和氰尿酸作為在各種條件下(見例2和3)培養(yǎng)物AtzMix1的批量培養(yǎng)過程中形成的主要代謝產(chǎn)物被檢測。此外，使用環(huán)標記["C]阿特拉津(在RousseauxS，HartmannA和SoulasGFEMSMicrob.Ecol.200136:211-222中描述的方法)進行培養(yǎng)物AtzMix1的礦化實驗結(jié)果證實了阿特拉津高度(78%)轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物C。2和NH/(見圖1)。為了檢查培養(yǎng)物AtzMix1在其他s-三嗪化合物降解中的活性，使用在例2中描述的搖瓶培養(yǎng)方法(單個化合物的初始濃度大約為2mgl-1),并在3(TC的溫度下進行實驗。HPLC方法被用于定量測定單個s-三嗪化合物的初始和殘留濃度。在圖2中顯示的色譜表明，在7天后，除氰尿酸以外所有被檢s-三嗪化合物幾乎都完全小室，測定氰尿酸的濃度大約為lmg廠1。應(yīng)當注意對于所有s-三嗪化合物來說氰尿酸是核心降解中間產(chǎn)物。因此，所得到的結(jié)果表明培養(yǎng)物AtzMix1表現(xiàn)了完全降解所有被測s-三嗪化合物的能力。例2不同溫度下培養(yǎng)物AtzMix1的分解代謝活性溫度對培養(yǎng)物AtzMix1生長以及其分解代謝活性的影響在含有與例1中描述的相同礦物鹽并添加了阿特拉津(lOOmgI—1)和檸檬酸鈉(lg")作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過程中被監(jiān)測。在溫度分別為10°C、2(TC和30。C下在旋轉(zhuǎn)搖床(200revmirT1)上在Erlemneyer燒瓶(500ml,200ml培養(yǎng)基)中進行實驗。在實驗過程中，培養(yǎng)物生長通過測定光密度(0D6。。)進行監(jiān)測，通過使用由已知密度培養(yǎng)物的干重產(chǎn)生的標準曲線將得到的數(shù)據(jù)換算成生物量干重。在離心后(6000g,5分鐘)通過HPLC方法測定培養(yǎng)物樣品中的阿特拉津和形成的中間產(chǎn)物?；趧恿W闡述，培養(yǎng)物AtzMixl的特定生長率(ju)和阿特拉津降解的特定生長率(Q)通過下列等式來計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Xt和X,是以小時(h)表示的開始時間(ti)和指定時間(t2)之后的生物量濃度(由干重(gr1)表示)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Si和S2是分別為時刻ti和時刻t2的初始和殘余阿特拉津濃度(由mM表示)。當與圖3中顯示的培養(yǎng)物AtzMix1的生長曲線進行比較時，可以發(fā)現(xiàn)在3(TC和2(TC時得到了類似的培養(yǎng)曲線，而隨著溫度下降到l(TC培養(yǎng)物的生長顯著減緩。但是，雖然與更高溫度相比更慢，在1(TC時產(chǎn)生了相同的最終生物量濃度，表明培養(yǎng)物AtzMix1具有適應(yīng)更低溫度的機制。此外，雖然圖3中顯示的阿特拉津小室曲線表明培養(yǎng)物AtzMixl在更高溫度時更為有效，但培養(yǎng)物在l(TC時仍然顯示了其專一性分解代謝活性(即通過相同的分解代謝途徑進行阿特拉津降解)。動力學參數(shù)分析、最大阿特拉津降解專一性速率(表1)進一步證明培養(yǎng)物AtzMix1即便是在低溫(例如l(TC)下也保持了顯著的阿特拉津降解活性。所有前述結(jié)果表明，培養(yǎng)物AtzMixl可能擁有在不同和變化的溫度條件下誘導阿特拉津分解代謝的機制，這最可能歸功于培養(yǎng)物成分之間的相互作用，同時指示了這種培養(yǎng)物作為用于在阿特拉津污染的環(huán)境中加速生物轉(zhuǎn)化過程的生物試劑的高潛能。表l.不同溫度下培養(yǎng)物AtzMix1生長和阿特拉津降解動力學<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ia目是在實驗條件下培養(yǎng)物AtzMix1的最大專一性生長率Q,是在實驗條件下的最大阿特拉津?qū)Ｒ恍越到饴?niM阿特拉津每小時每克生物干重)例3不同阿特拉津濃度下培養(yǎng)物AtzMix1的生長和分解代謝活性在3(TC的溫度下在搖瓶中使用添加了連續(xù)量的檸檬酸鈉(lg—。和不同量的阿特拉津(初始阿特拉津濃度范圍為30mgr到iogr)的AMS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)物AtzMixl培養(yǎng)過程中進行了這些研究。其他實驗條件與例中描述的相同。在實驗過程中培養(yǎng)物樣品的HPLC分析顯示在阿特拉津的寬濃度范圍(圖4A到圖4D)內(nèi)培養(yǎng)物AtzMix1的完全阿特拉津降解活性。這尤其涉及阿特拉津降解的第一步(降解成氰尿酸)。此外，以最大專一性生長率和最大專一性阿特拉津降解率(表2)表示的動力學參數(shù)分析顯示，在初始阿特拉津濃度為30mgr和100mgr(摩爾碳氮比C/N-31.1和C/N=10.4)時達到培養(yǎng)物AtzMixl的最快生長速率，而阿特拉津濃度進一步增加但不增加碳源(檸檬酸鈉)培養(yǎng)物生長率逐漸降低。相反，專一性阿特拉津降解率隨著阿特拉津濃度增加到1000mgr(C/N=2.5)而增加，完全培養(yǎng)物降解能力也表示為5000mgr1(C/N=1.8)。表2中列出的動力學參數(shù)還表明，培養(yǎng)物AtzMix1顯示了極大的阿特拉津降解活性，即幾乎是專一性阿特拉津降解率的三分之一，即便在10g"的濃度下也是如此表2.培養(yǎng)物AtzMix1生長和不同廚師阿特拉津濃度下阿特拉津降解動力學阿特拉津C/NK平均M"maxmgrmg1墨V1h-13031.11.2±0.20.26±0.050.6±0.510010.416.6±1.50.25±0.041.5±0.0510002.539.8±2.50.14±0.031.8±0.0450001.871.4±3.80.10±0.031.4±0.05100001.759.5±5.50.03±0.020.5±0.02K，是在實驗條件下平均阿特拉津降解率H,是實驗條件下培養(yǎng)物AtzMix1的最大專一性生長率Q,是實驗條件下最大阿特拉津?qū)Ｒ恍越到饴?mM阿特拉津每小時每克生物干重)例4在其他氮源存在下培養(yǎng)物AtzMix1的生長和分解代謝活性為了評估其他氮源對培養(yǎng)物AtzMix1的分解代謝活性的影響，使用添加了阿特拉津作為唯一氮源(lOOmgI—1)的AMS培養(yǎng)基和添加了以與阿特拉津等摩爾量的氮(2.3mM)其他氮化合物(尿素，(NH4)2，KN03)的AMS培養(yǎng)基進行了比較搖瓶實驗。其他實驗條件與例3中描述的相同。圖5中顯示的培養(yǎng)物生長曲線和阿特拉津小時曲線表明，在加入尿素作為輔助氮源(圖5B)時培養(yǎng)物AtzMix1顯示了最大生長，在所有被測氮源存在時(圖5B到5D)阿特拉津的降解率都比當將阿特拉津作為唯一氮源時的情況下高(圖5A)。這進一步表明培養(yǎng)物AtzMix1可能具有克服添加的有機或無機氮化合物對阿特拉津分解作用的抑制影響的機制，而這種抑制影響在迄今為止研究的大多數(shù)阿特拉津降解細菌中都存在。因此，可以預期培養(yǎng)物AtzMix1將證明在當一些容易得到的氮源存在時的條件下的分解代謝活性，而這通常是殺蟲劑污染的土壤和生產(chǎn)廢水中的情形。權(quán)利要求1、一種來自天然環(huán)境的混合細菌培養(yǎng)物，具有降解阿特拉津和其他s-三嗪化合物的遺傳潛能和活性，并具有培養(yǎng)物AtzMix1的其他鑒別特性，被存放在NationalCollectionofAgriculturalandIndustrialMicroorganisms，Budapest，Hungary，保藏號NCAIM(P)B0013292005-12-09。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的混合細菌培養(yǎng)物，其中阿特拉津降解遺傳潛能由起阿特拉津降解作用的基因trzA、atzB、atzC以及trzD組成。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的混合細菌培養(yǎng)物，其中阿特拉津降解活性產(chǎn)生二氧化碳和銨離子作為阿特拉津降解的最終產(chǎn)物。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的混合細菌培養(yǎng)物，其中阿特拉津礦化是培養(yǎng)副成分的互補分解代謝活性的結(jié)果；至少一個成員將阿特拉津降解成氰尿酸，至少一個成員繼續(xù)將氰尿酸降解成二氧化碳和銨離子。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的混合細菌培養(yǎng)物，其中完全阿特拉津降解活性在從1(TC到30。C的溫度范圍內(nèi)在很寬的阿特拉津濃度范圍內(nèi)(幾個ppb到數(shù)千ppm)顯示。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合細菌培養(yǎng)物，其中顯示了高達10g"的高阿特拉津濃度的耐受性。7、一種利用培養(yǎng)物AtzMix1NCAIM(P)B0013292005-12-09進行阿特拉津和其他s-三嗪化合物降解的微生物方法。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物方法，包括在保證培養(yǎng)物AtzMixl的阿特拉津降解能力和其他鑒別特性的條件下混合培養(yǎng)物的批量培養(yǎng)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物方法，其中培養(yǎng)物的培養(yǎng)直接在被污染位置進行。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物方法，其中培養(yǎng)物作為最初在使保證其具有完全降解阿特拉津效率的條件下生長的液體培養(yǎng)物被施加。11、根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物方法，其中培養(yǎng)物作為固定培養(yǎng)物即與足夠載體連接的小室被施加。12、根據(jù)權(quán)利要求l-ll中任何一個所述的混合培養(yǎng)物AtzMixl作為生物試劑的用途，其中提供了用于阿特拉津污染環(huán)境(土壤、地下水和地表水)補救的方法以及用于含有阿特拉津和其他三嗪化合物的固體廢物和廢水處理的方法。全文摘要本發(fā)明提供了被標記為AtzMix1的混合細菌培養(yǎng)物，其來自被暴露于阿特拉津和s-三嗪化合物長期污染的土壤。培養(yǎng)物AtzMix1在各種溫度下(10℃到30℃)在廣泛的阿特拉津濃度單位內(nèi)(幾個ppb到數(shù)千ppm)降解阿特拉津，而不形成有毒代謝產(chǎn)物并導致阿特拉津完全降解(礦化)。AtzMix1是穩(wěn)定的混合培養(yǎng)物，包括至少四種不同形態(tài)學、生理學和分解代謝特性的成分。培養(yǎng)物AtzMix1的分子特性顯示編碼用于將阿特拉津轉(zhuǎn)化成氰尿酸的酶的分解代謝基因trzA、atzB和atzC以及編碼用于隨后打開s-三嗪的環(huán)的酶基因trzD的存在，而環(huán)標記[¹⁴C]阿特拉津的高度礦化(80％)證實，繼續(xù)進行降解產(chǎn)生CO₂和NH₄⁺。作為本發(fā)明的一部分的降解阿特拉津和其他s-三嗪環(huán)化合物的微生物學方法優(yōu)于迄今為止所描述的使用單個細菌培養(yǎng)物的方法。這基本上是由于被用作生物試劑的混合培養(yǎng)物AtzMix1的專一性生長和分解代謝特性，即由于在與在阿特拉津污染環(huán)境(例如變化的溫度、低C/N比、優(yōu)選氮源的存在、高阿特拉津濃度)中類似的那些條件下其表現(xiàn)持續(xù)生長和阿特拉津降解效力的能力。此外，應(yīng)當強調(diào)的是，迄今為止觀察到的大多數(shù)所描述的單個菌株在容易獲得的氮源存在下阿特拉津降解的抑制對于培養(yǎng)物AtzMix1而言沒有記錄。因此，可以預期本發(fā)明的微生物學方法可適用于阿特拉津污染土壤的補救，即便是在氮豐富的區(qū)域也是如此，而且可用于加速含有高濃度s-三嗪化合物的廢水中阿特拉津的礦化過程。文檔編號C12N1/00GK101395262SQ200780008048公開日2009年3月25日申請日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2006年2月20日發(fā)明者梅加·哈瑞魯克,達布瑞卡·赫薩克申請人:魯杰爾博斯科維茨學院