專利名稱：賦予除草劑抗性的新型epsp合酶基因的制作方法
賦予除草劑抗性的新型EPSP合酶基因 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明提供了編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-砩酸 (5-enolpyruvylshikUate-3-phosphate ) ( EPSP )合酶的新型基因， 其提供了除草劑抗性。這些基因可用于植物生物學(xué)、農(nóng)作物育種和植 物細(xì)胞培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
N-膦酰甲基甘氨酸，通常稱為草甘膦，是重要的農(nóng)藝學(xué)化合物。 草甘膦抑制將磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸轉(zhuǎn)化成5-烯醇 丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。這種酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合 酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase); 在本文中 稱為"EPSP合酶，，)的抑制通過關(guān)閉莽草酸途徑從而抑制芳香族氨基 酸的生物合成而殺死植物細(xì)胞。
因?yàn)椴莞熟㈩惓輨┮种品枷阕灏被岬纳锖铣?，所以它們?僅殺死植物細(xì)胞，而且對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞也有毒性。草甘膦抑制許多細(xì)菌 的EPSP合酶，因此對(duì)這些細(xì)菌有毒。然而，某些細(xì)菌的EPSP合酶對(duì)
草甘膦具有高耐受性。
對(duì)草甘膦毒性有抵抗力的植物細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以表達(dá)
草甘膦抗性細(xì)菌EPSP合酶來產(chǎn)生。值得注意的是，來自根瘤土壤桿菌 (/^ro&"er/"邁"邁e/"ac/e/3S)菌抹CP4的細(xì)菌基因已用于在植物
中在表達(dá)后賦予植物細(xì)胞以除草劑抗性。來自鼠傷寒沙門氏菌 (i^/zzzMe/Za OT^/邁盯"邁)菌林CT7的突變的EPSP合酶在細(xì)菌細(xì)
胞中賦予草甘膦抗性，并且將草甘膦抗性賦予植物細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)
7061;和5， 094， 945 )。
美國(guó)專利6， 040， 497報(bào)告了突變型玉蜀黍EPSP合酶，其具有在位 置102處的蘇氨酸至異亮氨酸的置換和在位置106處的脯氨酸至絲氨 酸的置換("TIPS"突變)。此類改變將草甘膦抗性賦予該玉蜀黍酶。 來自鼠傷寒沙門氏菌(5^//z70/3e/" OT力7邁ur/咖)菌林CT7的突變的 EPSP合酶在細(xì)菌細(xì)胞中賦予草甘膦抗性，并且被報(bào)告將草甘膦抗性賦 予植物細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4， 535， 060; 4， 769， 061;和5， 094， 945 )。 He等人((2001 ) ^/oc力/邁et S/c^力/s/ca ^cta 1568: 1_6 )已通過 誘變以及在大腸桿菌co7/)和鼠傷寒沙門氏菌EPSP合酶基因之 間的重組開發(fā)出了具有增加的草甘膦耐受性的EPSP合酶，并且提出在 位置42 (T42M)和位置230 (Q230K)處的突變可能是造成所觀察到的 抗性的原因。
后續(xù)工作(He等人(2003 ) A/osc/. A/ofec力.A/oc力e瓜 67: 1405-1409 )顯示，T42M突變(蘇氨酸至甲硫氨酸)足以改善大腸桿 菌和鼠傷寒沙門氏菌的酶的耐受性。這些酶包含有在其活性位點(diǎn)中的 氨基酸置換，所述氨基酸置換阻止草甘膦的結(jié)合而不影響PEP或S3P 的結(jié)合。在EPSP合酶的2個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)中發(fā)生的突變已 顯示出改變了草甘膦而非PEP的結(jié)合親和力(He等人，2003,同上)。 因此，此類酶即使在草甘膦存在下也具有高的催化活性。
由于除草劑抗性植物提供許多優(yōu)點(diǎn)，所以用于鑒定具有草甘膦抗 性活性的除草劑抗性基因的方法是希望的。
發(fā)明概述
提供了用于將除草劑抗性或耐受性賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、 組織和種子的組合物和方法。所迷組合物包括編碼除草劑抗性或耐受 性多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的載體，和包含所述載體的宿 主細(xì)胞。所述組合物還包括針對(duì)除草劑抗性或耐受性多肽的抗體。如 所描述的，本發(fā)明的核苷酸序列可以在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中使用以
8用于轉(zhuǎn)化生物體并在其中表達(dá)，所述生物體包括微生物和植物。所述 組合物還包括轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。另外，提 供了用于產(chǎn)生由本發(fā)明的合成核苷酸編碼的多肽的方法。
具體地，提供了編碼除草劑抗性或耐受性多肽的分離的核酸分子 及其變體。此外，還包括由賦予除草劑抗性或耐受性的多核苷酸編碼 的氨基酸序列及其變體。具體地，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其
包含SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 28、 29、 30、 31、 32、 33 或34中所示的核苷酸序列，編碼SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10、 12 或14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，以登記號(hào)NRRL B-30911 、 證L B-30912、 NRRLB-30913、戲L B-30914 N、羅L B-30915、 NRRL B-30916 N或NRRL B-30917 N保藏在細(xì)菌宿主中的除草劑抗性核普酸 序列，以及其變體和片段。還包括與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷 酸序列，或者與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸序列。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A-1E顯示了 GRG25 ( SEQ ID NO: 2 ) 、 GRG26 ( SEQ ID NO: 4 )、 GRG27 ( SEQ ID NO: 6 ) 、 GRG28 ( SEQ ID NO: 8 ) 、 GRG29 ( SEQ ID NO: 10) 、 GRG30 (SEQ ID NO: 12)和GRG31 (SEQ ID NO: 14)的氨基酸 序列與其他草甘膦耐受性EPSP合酶基因的比對(duì)，所述其他草甘膦耐受 性EPSP合酶基因包括GRG1 ( SEQ ID NO: 15 ) 、 GRG5 ( SEQ ID NO: 16 )、 GRG6 ( SEQ ID NO: 17 ) 、 GRG7 ( SEQ ID NO: 18 ) 、 GRG8 ( SEQ ID NO: 19) 、 GRG9 (SEQ ID NO: 20) 、 GRG10 ( SEQ ID NO: 21) 、 GRG12 (SEQ ID NO: 22) 、 GRG15 (SEQ ID NO: 23) 、 GRG20 (SEQ ID NO: 24)、 GRG21 ( SEQ ID NO: 25 ) 、 GRG22 ( SEQ ID NO: 26 )和GRG23 ( SEQ ID NO: 27)。符號(hào)[*]表明，所述殘基在該比對(duì)中的所有序列之中是相同 的；[:]符號(hào)標(biāo)明保守置換；[.]符號(hào)標(biāo)明半保守置換。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)生物體特別是植物或植物細(xì)胞中的除草劑抗 性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發(fā)明的草甘膦抗性基因的
核苷酸序列來轉(zhuǎn)化生物體。具體地，本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備 對(duì)除草劑草甘膦顯示出增加的耐受性的植物。因此，提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的
細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物包括涉及微生物和 植物中的除草劑耐受性的核酸和蛋白質(zhì)以及經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植
物組織和種子。更具體而言，公開了草甘膦抗性基因(grgZ5、 gw"、 grg"、 gr^ 《、grg"、 grgi grg仏，gr^ i"、 ，gr^d"、 ，^r^ 7、 S7/2^T^^、 S/Z7^r^ 夕、5777^T^ 。和s/7 ^r^^)的沖亥苷酸序列和由其 編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所述序列可用于構(gòu)建用于隨后轉(zhuǎn)化到目 的植物內(nèi)的表達(dá)載體，用作用于分離其他草甘膦抗性基因的探針，用 作選擇標(biāo)記等。因此，本發(fā)明的"草甘膦抗性"或"草甘膦耐受性" 基因意指SEDIDNO: 1、 3、 5、 7、 9、 11或13中所示的核苷酸序列， 及其片段和變體(例如SEQ ID NO: 28 - 34 )，它們編碼草甘膦抗性 或耐受性多肽。同樣地，本發(fā)明的"草甘膦抗性"或"草甘膦耐受性" 多肽是具有SEQ ID N0: 2、 4、 6、 8、 10、 l2或l4中所示氨基酸序列 的多肽，及其片段和變體，它們賦予宿主細(xì)胞以草甘膦抗性或耐受性。 包含本發(fā)明的除草劑抗性核苷酸序列的質(zhì)粒于2006年4月19日 保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory
(NRRL)， 1815 North University Street, Peoria， Illinois 61604， United States of America)的永久收藏中，登記號(hào)為證L B-30911
"r-)、羅LB-30912 、證LB-30913 "r《")、廳L
B-30914 N(^r^^《)、NRRL B-30915 ( ^rg") 、 NRRL B-30916 N ( 和NRRL B-30917 (^rgW)。這種保藏將根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序 的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行維持。這種保藏僅僅為了本領(lǐng) 域技術(shù)人員方便而進(jìn)行，并非承認(rèn)保藏是根據(jù)35 U. S. C. § 112所要求的。"草甘膦"意指N-膦酰曱基甘氨酸(包括其任何鹽)的任何除草 劑形式和導(dǎo)致在植物中產(chǎn)生草甘膦陰離子的其他形式。"除草劑抗性 蛋白質(zhì)"或由于"編碼除草劑抗性的核酸分子"的表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)包括將下述能力賦予細(xì)胞的蛋白質(zhì)比不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受 更高濃度的除草劑，或比不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間地耐受某一 除草劑濃度。"草甘膦抗性蛋白質(zhì)，，包括將下述能力賦予細(xì)胞的蛋白 質(zhì)比不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞耐受更高濃度的草甘膦，或比不表達(dá)該 蛋白質(zhì)的細(xì)胞更長(zhǎng)時(shí)間地耐受某一草甘膦濃度。"耐受"或"耐受性" 意指存活或者以不容易與未經(jīng)處理的細(xì)胞相區(qū)分的方式執(zhí)行基本的細(xì) 胞功能例如蛋白質(zhì)合成和呼吸。
分離的核酸分子，及其變體和片段
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的或重組的核酸分子，其包含編碼除 草劑抗性蛋白質(zhì)和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列；以及足以 用作雜交探針以鑒定編碼除草劑抗性的核酸的核酸分子。如本文所使 用的，術(shù)語"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，重組DNA、 cDNA 或基因組DM)和RNA分子(例如，mRNA)以及通過使用核苷酸類似 物而產(chǎn)生的DM或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但 優(yōu)選是雙鏈DNA。
編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括以登記號(hào)NRRL B-30911、 NRRLB-30912、 NRRLB-30913、 NRRL B-30914 N、 NRRLB-30915、 NRRL B-30916 N和NRRL B-30917 N保藏在細(xì)菌宿主中的除草劑抗性核苷酸 序列即SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 28、 29、 30、 31、 32、 33和34中所示的序列，及其變體、片段和互補(bǔ)物。"互補(bǔ)物"意指 這樣的核苷酸序列，即其與給定的核苷酸序列充分互補(bǔ)，如此使得它 可以與給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。關(guān)于由這些核 苷酸序列編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10、 12和14中。本發(fā)明還包括包含編碼部分長(zhǎng)度 的除草劑抗性蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸分子，及其互補(bǔ)物。
ii"分離的"或"純化的"核酸分子或者蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部 分，基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí))， 或者基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)制品(當(dāng)以化學(xué)方法合成時(shí))。
優(yōu)選地，"分離的"核酸不含在該核酸所源自的生物體的基因組DNA 中天然地位于該核酸側(cè)翼的序列(即，位于該核酸的5'和3'末端處的 序列)(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。對(duì)本發(fā)明而言，當(dāng)用于指核酸分子 時(shí)，"分離的"不包括分離的染色體。例如，在各種實(shí)施方案中，分 離的編碼草甘膦抗性的核酸分子可以包含少于約5 kb、 4 kb、 3 kb、 2 kb、 1 kb、 0. 5 kb或0. 1 kb的在該核酸所源自的細(xì)胞的基因組DNA 中天然地位于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列?；旧喜缓?xì)胞材料的 除草劑抗性蛋白質(zhì)包括具有少于約30% 、 20%、 10%或5% (干重) 的非除草劑抗性蛋白質(zhì)(在本文中也稱為"污染蛋白質(zhì)")的蛋白質(zhì) 制劑。
本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其為這些編碼除草劑抗性的核苷 酸序列的片段。"片段"意指編碼除草劑抗性蛋白質(zhì)的核苷酸序列的
物的片段。作為除草劑抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約 15、 20、 50、 75、 100、 200、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1 300、 1 350、 1400個(gè)鄰接核苷酸，或高至在本文公開的 全長(zhǎng)的編碼除草劑抗性的核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目(例如， 對(duì)于SEQ ID NO: 1為1404個(gè)核苷酸；對(duì)于SEQ ID NO: 3為1 395個(gè) 核苷酸；和對(duì)于SEQ ID NO: 5為1368個(gè)核苷酸，等等)，這取決于 所期望的用途。"鄰接，，核苷酸意指彼此緊鄰的核苷酸殘基。
本發(fā)明的核苷酸序列的片段一般將編碼保留全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白 質(zhì)的生物活性即除草劑抗性活性的蛋白質(zhì)片段。"保留除草劑抗性活 性"意指該片段將具有本文公開為SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10、 12 或14的全長(zhǎng)草甘膦抗性蛋白質(zhì)的至少約30% 、至少約50%、至少約
1270%或至少約80%的除草劑抗性活性。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方 法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,535, 060和 5,188,642，所述專利各自通過提及而整體合并入本文。
編碼除草劑抗性的核苷酸序列的片段(其編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的生 物學(xué)活性部分)將編碼至少約15、 25、 30、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 250、 300、 350、 400、 450個(gè)鄰接核苷酸，或高至在本發(fā) 明的全長(zhǎng)除草劑抗性蛋白質(zhì)中存在的氨基酸的總數(shù)目(例如，對(duì)于SEQ ID NO: 2為467個(gè)氨基酸；對(duì)于SEQ ID NO: 4為464個(gè)氨基酸；和 對(duì)于SEQ ID NO: 6為455個(gè)氨基酸，等等)。
優(yōu)選的本發(fā)明的除草劑抗性蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 28、 29、 30、 31、 32、 33或34的核苷酸序列具有足夠同 一性的核苷酸序列編碼。術(shù)語"具有足夠同一性"意指這樣的氨基酸 或核苷酸序列，即通過使用本文描述的比對(duì)程序之一并采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)， 其與參照序列相比較具有至少約60%或65%序列同一性，約70%或 75%序列同一性，約80%或85%序列同一性，或者約90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98 %或99 %序列同 一性。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這些值可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)整以通過考慮密 碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等來確定由2個(gè)核苷酸序列 所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。
為了確定2個(gè)氨基酸序列或2個(gè)核酸的同一性百分比，就最佳比 較目的來對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。2個(gè)序列之間的同一性百分比是由所述序 列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，同一性百分比-相同位置的數(shù)目 /位置(例如，重疊位置)的總數(shù)目x 100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，2 個(gè)序列具有相同的長(zhǎng)度。2個(gè)序列之間的同一性百分比可以使用與下 文描述的那些類似的技術(shù)來進(jìn)行確定，其中允許或不允許缺口。在計(jì) 算同一性百分比中，通常計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的匹配。
2個(gè)序列之間的同一性百分比的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。 用于2個(gè)序列比較的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Karlin和Altschul (1990 )尸roc. #a〃. Sc/. /7W 87: 2264的算法，其在Karl in和Altschul ( 1993 )尸roc. JcaA 〃W 90: 5873-5877
中進(jìn)行了修改。將此類算法整合入Altschul等人(1990 )/. A/o人 215:403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN 程序(得分-lOO、字長(zhǎng)=12)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的草甘膦抗性核 酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX程序(得 分=50、字長(zhǎng)=3)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的除草劑抗性蛋白質(zhì)分子同 源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對(duì)，可以使用 如Altschul等人(1997 ) We義25: 3389中所描述的
Gapped BLAST。備選地，PSI-Blast可以用于執(zhí)行檢測(cè)分子間的遠(yuǎn)距 離關(guān)系的迭代搜索。參見Altschul等人(1997 )(同上)。當(dāng)利用 BLAST、 Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例 如，BLASTX和BLASTN )的缺省參數(shù)。參見www. ncbi. nlm. nih. gov。 用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是ClustalW算法
(Higgins等人(1994 )腸7e/cJc油細(xì).22: 4673-4680 )。 Clus talW 比較序列并比對(duì)氨基酸或DNA序列的整體，因此可以提供關(guān)于整個(gè)氨 基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法在幾個(gè)商購可得的DM/ 氨基酸分析軟件包中4吏用，例如Vector NTI Program Suite
(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)的ALIGNX模塊。在用 ClustalW比對(duì)氨基酸序列后，可以評(píng)估氨基酸同一性百分比?？捎糜?Clus ta 1W比對(duì)分析的軟件程序的非限制性例子是GeneDoc 。 GeneDoc
(Karl Nicholas)允許評(píng)估多個(gè)蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DM )相似 性和同一性。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另 一個(gè)非限制性例子是 Myers和Miller ( 1988 ) (^5/^4: 11-17的算法。此類算法被整合 入ALIGN程序(版本2. 0 )中，所述ALIGN程序是GCG序列比對(duì)軟件 包(可從Accelrys， Inc. ， 9865 Scranton Rd. ， San Diego， Cal ifornia， USA獲得)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序來比較氨基酸序列時(shí)，可以 使用PAM120權(quán)重殘基表、12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分。
除非另有說明，采用Needleman和Wunsch ( 1970 )(同上)的算 法的GAP Vers ion 10將被用于測(cè)定序列同 一性或相似性，其中使用下述參數(shù)關(guān)于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP權(quán)重 和3的長(zhǎng)度權(quán)重，以及nwsgapdna. cmp評(píng)分矩陣；關(guān)于氨基酸序列的 同一性％或相似性％，使用8的GAP權(quán)重和2的長(zhǎng)度權(quán)重，以及 BLOSUM62評(píng)分矩陣。還可以使用等價(jià)的程序。"等價(jià)的程序"意指任 何這樣的序列比較程序，即對(duì)于所研究的任何2個(gè)序列，當(dāng)與由GAP Version 10產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)相比較時(shí)，產(chǎn)生具有相同的核苷酸殘基匹 配和相同的序列同 一性百分比的比對(duì)。
本發(fā)明還包括變體核酸分子。編碼除草劑抗性的核苷酸序列的"變 體"包括編碼本文公開的除草劑抗性蛋白質(zhì)但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性 而保守性地不同的那些序列，以及如上所述具有足夠同一性的那些序
鑒定，例如如下所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷 酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，其例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生 但仍編碼本發(fā)明中公開的除草劑抗性蛋白質(zhì)，如下所述。本發(fā)明所包
括的變體蛋白質(zhì)是在生物學(xué)上有活性的，即它們保留了所需的天然蛋 白質(zhì)的生物活性，即除草劑抗性活性。"保留除草劑抗性活性"意指 該變體將具有至少約30% 、至少約50%、至少約70%或至少約80% 的天然蛋白質(zhì)的除草劑抗性活性。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方法是 本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4， 535， 060和5, 188,642， 所述專利各通過提及而整體合并入本文。
技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)一步意識(shí)到，可以通過突變將改變引入本發(fā)明的 核苷酸序列內(nèi)，從而導(dǎo)致編碼的除草劑抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的 改變，而不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的生物活性。因此，分離的核酸分子變體可 以通過下述方式來制備將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或刪除引入 本文公開的相應(yīng)的核苷酸序列中，從而使得將一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、 添加或刪除引入所編碼的蛋白質(zhì)中。可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來引入突變， 例如通過定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。此類變體核苷酸序列也包括在 本發(fā)明內(nèi)。
例如，保守氨基酸置換可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的優(yōu)選地非必需氨
15基酸殘基處進(jìn)行。"非必需"氨基酸殘基是可以從除草劑抗性蛋白質(zhì) 的野生型序列中進(jìn)行改變而不改變生物活性的殘基，而"必需"氨基 酸殘基是生物活性所需的。"保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基被 具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的置換。在本領(lǐng)域中已定義了具有相 似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例 如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天 冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)， 具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有P-分枝的側(cè)鏈的 氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨 基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。氨基酸置換可 以在保留功能的非保守區(qū)域中進(jìn)行。 一般而言，此類置換不對(duì)保守的 氨基酸殘基，或者不對(duì)位于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行，其中此類 殘基是蛋白質(zhì)活性所需的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，功能變 體可以具有較少的在保守殘基中的保守或非保守改變。保守并且可能 對(duì)于蛋白質(zhì)活性而言必需的殘基的例子包括，例如在圖l的比對(duì)中所 包含的所有蛋白質(zhì)之間相同的殘基。保守但可能允許保守氨基酸置換 并仍保留活性的殘基的例子包括，例如僅在圖l的比對(duì)中所包含的所
有蛋白質(zhì)之間具有保守置換的殘基。
Lys-22、 Arg-124、 Asp-313、 Arg-344、 Arg-386和Lys-411是來 自大腸桿菌的EPSP合酶的保守殘基(Sch6nbrunn等人(2001 ) iVoc. vVa〃. 5c/. 〃W 98: 1376-1 380 )。對(duì)于EPSP合酶活性重要
的保守殘基還包括Arg-100、 Asp-242和Asp-384 ( Selvapandiyan等 人(1995 )尸^5S丄e"e" 374: 253—256 ) 。 Arg-27與S3P結(jié)合 (Shuttl,rth等人(1999 )倫c力e/n/"r/ 38: 296-302 )。
備選地，可以通過沿著全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，例如 通過飽和誘變，來制備變體核苷酸序列，并且可以就賦予除草劑抗性 活性的能力來篩選所得到的突變體，以鑒定保留活性的突變體。在誘變后，編碼的蛋白質(zhì)可以重組地表達(dá)，并且蛋白質(zhì)的活性可以通過使 用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法技術(shù)來測(cè)定。
使用諸如PCR、雜交等的方法可以鑒定出相應(yīng)的除草劑抗性序列， 此類序列與本發(fā)明的序列具有實(shí)質(zhì)的同一性。參見，例如，Sambrook J. 和Russell D. W. ( 2001 ) M /ecu/ar 67o/7/w」Za6or"c iy yl/a/ma/ (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)和Innis等人(1990 )戶C7 戶i7^oc0/s..」Ci/2'de 〃o"s ( Academic Press, NY)。
在雜交方法中，全部或部分除草劑抗性核苷酸序列可以用于篩選 cDNA或基因組文庫。用于構(gòu)建此類cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng) 域通常已知的，并且在Sambrook和Russell, 2001 (同上)中公開。 所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他 寡核苷酸，并且可以用可檢測(cè)基團(tuán)例如"P或任何其他可檢測(cè)標(biāo)記例如 其他放射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子進(jìn)行標(biāo)記。可以基于 本文公開的已知的編碼除草劑抗性的核普酸序列，通過對(duì)合成的寡核 苷酸進(jìn)行標(biāo)記來制備用于雜交的探針。可以另外使用基于在所述核苷 酸序列或編碼的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的簡(jiǎn) 并引物。探針通常包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，所述核苷酸序列區(qū)域
體的至少約12個(gè)，優(yōu)選約25個(gè)，至少約50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 250、 300、 350、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1000、 1200、 1300個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。用于制備用于雜交的探針的方法是本 領(lǐng)域通常已知的，并且公開于Sambrook和Russell, 2001 (同上)以 及Sambrook等人(1989 ) yl/o/ecw/ar 67o/7//2g.'爿Za60ra for/i/is/^i/a/ (第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中，所述2個(gè)參考文獻(xiàn)通過提及而合并入本文。
例如，本文公開的完整除草劑抗性序列，或者其一個(gè)或多個(gè)部分， 可以用作能夠與相應(yīng)的除草劑抗性序列和信使RMs特異性地雜交的 探針。為了達(dá)到在各種條件下的特異性雜交，此類探針包括獨(dú)特的并
17且長(zhǎng)度為至少約IO個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸的序列。此
性序列。這種技術(shù)可以用于從所需生物體中分離另外的編碼序列，或 用作診斷測(cè)定法以測(cè)定生物體中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括鋪板 的DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook等人(1989 ) //o/ecw7ar C7o/2/'/7g.'爿Za6orafor/ y^a/ wa/ (第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
此類序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格 雜交條件"意指這樣的條件，即在所述條件下探針將與其靶序列雜交， 達(dá)到相比與其他序列來說可檢測(cè)地更大的程度(例如，為背景的至少 2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同情況下是不同的。通過 控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶
序列(同源探測(cè))。備選地，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些 錯(cuò)配，從而使得檢測(cè)出較低程度的相似性(異源探測(cè))。 一般地，探 針長(zhǎng)度為小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。
通常，嚴(yán)格條件是這樣的條件，其中在PH 7.0-8.3下鹽濃度小 于約1， 5 M Na離子，通常約0. 01 - 1. 0 M Na離子濃度(或其他鹽)， 以及溫度對(duì)于短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)為至少約3(TC，和對(duì) 于長(zhǎng)探針(例如，超過50個(gè)核苷酸)為至少約6(TC。嚴(yán)格條件還可 以用添加去穩(wěn)定劑如曱酰胺來達(dá)到。示例性的低嚴(yán)格性條件包括于37 。C用30 - 35 %甲酰胺、1 M NaCl、 1% SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩 沖溶液進(jìn)行雜交，和于50 - 55 。C在1X-2X SSC ( 20X SSC = 3. 0 M NaC1/0. 3M檸檬酸三鈉)中進(jìn)行洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括 于37。C在40 - 45 %甲酰胺、l.OMNaCl、 1% SDS中進(jìn)行雜交，和于 55 - 60。C在0. 5X-1XSSC中進(jìn)行洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括于 37。C在50%甲酰胺、1 M NaCl、 1% SDS中進(jìn)行雜交，和于60-65 。C在0. IX SSC中進(jìn)行洗涂。任選地，洗涂緩沖液可以包含約0. 1% -約1% SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間一般少于約24小時(shí)，通常為約4-約12小時(shí)。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是離子強(qiáng)度和最終洗
滌溶液的溫度。對(duì)于DNA-DM雜交物，乙可以從Meinkoth和Wahl( 1984 ) ha/, 5/oc/ e瓜138: 267-284的等式中進(jìn)行估計(jì)！>81.5°C +16.6
(log M) + 0. 41 ( %GC) - 0. 61 ( %form) - 500/L;其中M是一價(jià) 陽離子的摩爾濃度，。/。GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是雜交溶液中曱酰胺的百分比，和L是以堿基對(duì)計(jì)的雜交物的長(zhǎng) 度。L是這樣的溫度，在該溫度下50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探 針雜交(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。對(duì)于每1%的錯(cuò)配，TJ咸少約 rc;因此，可以調(diào)整L、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序 列雜交。例如，如果尋求具有>90%同一性的序列，那么L可以減少 l(TC。 一般地，嚴(yán)格條件被選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH下比關(guān)于特 定序列和其互補(bǔ)物的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，極端嚴(yán)格條件可 以利用在比熱解鏈點(diǎn)(L)低1、 2、 3或4。C下的雜交和/或洗滌；中 等嚴(yán)格條件可以利用在比熱解鏈點(diǎn)(Tra)低6、 7、 8、 9或10。C下的雜 交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用在比熱解鏈點(diǎn)(L)低11、 12、 13、 14、 15或20。C下的雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組成以 及所需L，普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液 的嚴(yán)格性中的改變。如果所希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致低于4 5 °C (水性溶液) 或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，那么優(yōu)選增加SSC濃度，從而使得可以 使用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的詳細(xì)指導(dǎo)可見下述參考文獻(xiàn) Tijssen ( 1993 ) 丄a6orator/ rec力刀/gues //j 5/oc力e/h/stry #o/ecw/ar "/o/o^j - ^/6rWza 〃0/7 w〃力jVi/c/e2'c力c/c/尸ro6e51， 第I部分，第2章(Elsevier, New York);和Ausubel等人，編輯，
(1995 ) CwrreW尸rc^oco/s // #。/ecw/<2_r A/o/og/, 第2章(Greene Publishing and Wi ley-Interscience， New York)。 參見Sambrook 等人(1989 ) #o/ecu/ar C/o/n'w Z/a6or"oiy (第二版，
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
19分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段
除草劑抗性蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明中。"除草劑抗性蛋白質(zhì)"意
指具有SEQIDNO: 2、 4、 6、 8、 10、 12或14中所示的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)。還提供了其片段、生物學(xué)活性部分和變體，并且它們可以用
于實(shí)踐本發(fā)明的方法。
"片段，，或"生物學(xué)活性部分"包括這樣的多肽片段，所述多肽 片段包含SEQIDNO: 2、 4、 6、 8、 10、 12或14中所示的編碼除草劑 抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分，并保留除草劑抗性活性。除草劑抗 性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分可以是例如長(zhǎng)度為10、 25、 50、 100或更 多個(gè)氨基酸的多肽。此類生物學(xué)活性部分可以通過重組技術(shù)來制備， 并且就除草劑抗性活性來進(jìn)行評(píng)估。用于測(cè)量除草劑抗性活性的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4，535，060和 5,188,642,所述專利各自通過提及而整體合并入本文。如本文所使用 的，片段包含SEQIDNO: 2、 4、 6、 8、 10、 12或14的至少8個(gè)鄰接 氨基酸。然而，本發(fā)明包括其他片段，例如該蛋白質(zhì)中超過約10、 20、 30、 50、 100、 150、 200、 250、 300、 350或400個(gè)氨基酸的任何片段。
"變體，，意指這樣的蛋白質(zhì)或多肽，其具有與SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10、 12或14的氨基酸序列至少約60% 、 65%,約70%、 75%、 80%、 85°/。，或者90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97 %、 98%或99%同一的氨基酸序列。變體還包括由這樣的核酸分子編 碼的多肽，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 28、 29、 30、 31、 32、 33或34的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交。 變體包括由于誘變而在氨基酸序列方面不同的多肽。本發(fā)明所包括的 變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)上有活性的，即它們繼續(xù)擁有所希望的該天然蛋 白質(zhì)的生物活性，即保留了除草劑抗性活性。用于測(cè)量除草劑抗性活 性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如美國(guó)專利號(hào)4， 535， 060和 5， 188， 642，所述專利各自通過提及而整體合并入本文。
細(xì)菌基因，例如本發(fā)明的grg"、 grg2么grg27、 g/^M、 grg"、 gi^J〃、 gr^J7、 sy/7^rg夕i"、 s//2gr^2d\ sy/2gr^ 7、》7"^rg2《、s//7^/^2^、W/7^^^和^7 ^X7/基因，在開放讀碼框的起始附近十分經(jīng)常具有 多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常，在這些起始密碼子中的一個(gè)或多個(gè) 處的翻譯起始將導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括
atg密碼子。然而，諸如芽孢桿菌屬物種(Asc277m m.)的細(xì)菌還 將密碼子gtg識(shí)別為起始密碼子，并且在gtg密碼子處起始翻譯的蛋 白質(zhì)在第一個(gè)氨基酸處包含曱硫氨酸。此外，常常事先不確定這些密 碼子中的哪一些天然地在細(xì)菌中使用。因此，應(yīng)當(dāng)理解，備選的曱疏 氨酸密碼子之一的使用可能導(dǎo)致產(chǎn)生賦予除草劑抗性的grg"、 grW、 gi^"、 ^rW《、,"、^r-、 gr^J7、 ，^r^ /、 s河rgi^、 ，grg"、 S7力gr"《、S7刀grg"、 5y/z^7^〃和5y/7^r^ 7的變體。這 些除草劑抗性蛋白質(zhì)包括在本發(fā)明中，并且可以在本發(fā)明的方法中使 用。
還包括了針對(duì)本發(fā)明的多肽或者其變體或片段的抗體。用于產(chǎn)生 抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如Harlow和Lane ( 1988 ) j/7〃60d/w ^ Za60r"ar7yJ/a/7i/a/, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.;美國(guó)專利號(hào)4， 196， 265 )。
改變或改善的變體
應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以通過各種方法來改變g/^2么^rW6、 gr^7、 grW《、 ^rg」夕、《r^J〃、《rgJ厶^//7^t^2J、 ^//7^t^^(5"、 i"7/^r《27、 i7v7《rgi^、 s/z^r^ 久s/z^r^^和S7"^^"的DM序列，并且這些改變可以導(dǎo) 致編碼這樣的蛋白質(zhì)的DNA序列，所述蛋白質(zhì)具有與分別由grgZ5、 ^r^ d"、 gr^ 7、 ^r^ 《、^r^ 久^r^M或所編碼的氨基酸序列 不同的氨基酸序列。這種蛋白質(zhì)可以以各種方式進(jìn)行改變，包括SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 28、 29、 30、 31、 32、 33或34的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸的氨基酸置換、刪除、截短和插入，包括高至約2、約3、 約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約 30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、 約80、約85、約90、約100個(gè)或更多氨基酸置換、刪除或插入。
21用于此類操作的方法是本領(lǐng)域通常已知的。例如，可以通過DNA 中的突變來制備本文公開的GRG蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通 過幾種誘變形式之一和/或在定向進(jìn)化中來完成。在某些方面，氨基酸 序列中所編碼的改變將基本上不影響蛋白質(zhì)的功能。此類變體將具有 所希望的除草劑抗性活性。然而，應(yīng)當(dāng)理解，GRG25、 GRG26、 GRGH、 GRG28、 GRG29、 GRG30或GRG31賦予除草劑抗性的能力可以通過此類 技術(shù)對(duì)本發(fā)明的組合物的一種用途來進(jìn)行改善。例如，可以在這樣的 宿主細(xì)胞中表達(dá)GRG25、 GRG26、 GRG27、 GRG28、 GRG29、 GRG30或GRG31, 所述宿主細(xì)胞顯示出高比率的在DNA復(fù)制期間的堿基錯(cuò)摻入，例如 XL-1 Red ( Stratagene， LaJolla， CA )。在此類菌林中進(jìn)行繁殖后， 可以分離出本發(fā)明的DNA (例如通過制備質(zhì)粒DNA，或者通過經(jīng)由PCR 進(jìn)行擴(kuò)增并將所得到的PCR片段克隆到載體中)，在非誘變菌林中培 養(yǎng)fg突變，并鑒定對(duì)于除草劑例如草甘膦具有改善的抗性的經(jīng)突變 的基因，例如通過在濃度漸增的草甘膦中培養(yǎng)細(xì)胞，并對(duì)于賦予針對(duì) 濃度增加的草甘膦的耐受性的克隆進(jìn)行測(cè)試。
備選地，可以在氨基或羧基末端處對(duì)許多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列進(jìn) 行改變而基本上不影響活性。這可以包括通過現(xiàn)代分子方法例如PCR 而引入的插入、刪除或改變，所述方法包括借助于在PCR擴(kuò)增中使用 的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼序列的 PCR擴(kuò)增。備選地，所添加的蛋白質(zhì)序列可以包括完整的蛋白質(zhì)編碼 序列，例如本領(lǐng)域通常用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些序列。此類融合 蛋白常常用于(1)增加目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、 酶活性或表位以有助于蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測(cè)或本領(lǐng)域已知的其他 實(shí)驗(yàn)用途；或(3)將蛋白質(zhì)的分泌或翻譯靶向至亞細(xì)胞器，例如革蘭 氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的 糖基化。
本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還包括衍生自誘變和重組操作 程序例如DNA改組的序列。使用此類操作程序，可以將一個(gè)或多個(gè)不
編媽性蛋白質(zhì)。以這種方式，從包含這樣的序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸 群體中產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫，所述序列區(qū)域具有充分的序列同一 性并可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。例如，使用這種方法，可以在 本發(fā)明的除草劑抗性基因和其他已知的除草劑抗性基因之間改組編碼 目的結(jié)構(gòu)域的序列基序，以獲得編碼具有改善的目的性質(zhì)例如增加的
草甘膦抗性活性的蛋白質(zhì)的新基因。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng) 域已知的。參見，例^口， Stemmer ( 1994 )尸roc. yVs〃. JcaA ScA ^S^ 91: 10747-10751; Stemmer ( 1994 )艇u,e 370: 389-391; Crameri 等人(1997 ) yv"we丑/Wec力.15: 436-438; Moore等人(1997 ) /. #。厶5/。/. 272: 336—347; Zhang等人(1997 )戶roc. #a〃. Sc/. 脂94: 4504-4509; Crameri等人(1998 ) #"固391: 288-291; 以及美國(guó)專利號(hào)5， 605， 793和5， 837， 458。
溫度謙(temperature spectrum)
已在植物中進(jìn)行了草甘膦代謝的幾項(xiàng)研究，并且揭示，草甘膦不 被植物代謝或者非常緩慢地代謝。草甘膦快速滲透角質(zhì)層，并且經(jīng)過 相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間段轉(zhuǎn)移遍及植物各處(在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了綜迷 Kearney 和 Kaufman, 編輯 (1988 ) 〃er6/c/^w C力e/ff/"r/， "egracfa《#ode of Jc〃o/ Marcel Dekker ， Inc., New York, 3:1-70;以及Grossbard和Atkinson,編輯(1985 ) 7T e #er6/"Ve 67/; 力osafe Butterworths， London,第25-34頁)。因jt匕，在農(nóng)藝 學(xué)上重要的植物中進(jìn)行草甘膦暴露之后的持續(xù)的時(shí)間段內(nèi)草甘膦耐受 性可能是必需的。如果在生長(zhǎng)季節(jié)期間溫度經(jīng)常超過30°C,那么采用 在升高的溫度下保持活性的草甘膦耐受性EPSP合酶將是有利的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EPSP合酶在高于或低于外界環(huán)境溫 度(ambient environmental temperature)的溫度下展示出熱穩(wěn)定 性。"熱穩(wěn)定性"意指所述酶在高于或低于外界環(huán)境溫度的溫度下， 比在那個(gè)溫度下不是熱穩(wěn)定的EPSP合酶在更長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)是有活性 的。例如，在高于或低于外界環(huán)境溫度的溫度下，熱穩(wěn)定的EPSP合酶
23在超過約l小時(shí)，超過約2小時(shí)，約3小時(shí)，約4小時(shí)，約5小時(shí)，
約6小時(shí)，約7小時(shí)，約8小時(shí)，約9小時(shí)，約10小時(shí)，約11小時(shí)，
約12小時(shí)，約13小時(shí)，約14小時(shí)，約15小時(shí)，約20小時(shí)，約25
小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)具有酶促活性。對(duì)于本發(fā)明而言，"外界"環(huán)境溫
度為約30°C。在某些實(shí)施方案中，高于外界溫度(ambient
temperature)是等于或高于約32。C,約34。C，約37。C，約40。C，約
45匸，約50。C，約55。C，約60。C，約65。C或更高的溫度。低于外界
溫度是等于或低于約28°C，低于約27。C，約26°C，約25°C，約23°C，
約20°C，約18°C,約15°C，約l(TC，等于或低于約5°C，或約(TC的
溫度。用于測(cè)定EPSP合酶活性的方法在本文其他地方更詳細(xì)地進(jìn)行討
論。對(duì)于本發(fā)明而言，當(dāng)它以約90% - 100%、約80% -約90% 、約
70% -約80%、約60% -約70%或約50% -約60。/。的在那種酶的最
適溫度下觀察到的最大活性水平發(fā)揮作用時(shí)，該熱穩(wěn)定的EPSP合酶被
視為是有活性的。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的EPSP合酶的最適溫度高于或低于
野生型草甘膦耐受性EPSP合酶的最適溫度。對(duì)于本發(fā)明而言，野生型
草甘膦耐受性EPSP合酶是在外界環(huán)境溫度下具有最大活性的酶(例
如，在2006年11月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/605,824中以
GRG23進(jìn)行描述的草甘膦耐受性EPSP合酶，所述專利通過提及而整體
合并入本文)。"最適"意指例如當(dāng)經(jīng)過多個(gè)溫度范圍進(jìn)行測(cè)量時(shí)，
對(duì)于EPSP合酶觀察到最大活性。在非限制性實(shí)例中，在本發(fā)明的方法
中使用的EPSP合酶可以在約(TC -約l(TC、約l(TC _約20°C、約20
。C -約30°C、約30°C -約40°C、約40°C -約50°C、約50°C -約60
°C、約60°C -約70。C或約70'C -約80。C下具有最佳活性。
因此，本發(fā)明提供了用于在高于或低于外界環(huán)境溫度的溫度下增加草甘膦耐受性的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括
將編碼草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦
耐受性EPSP合酶在高于或低于外界溫度的溫度下是熱穩(wěn)定的；并且分
別在高于或低于外界環(huán)境溫度的溫度下使所述植物進(jìn)行生長(zhǎng)。在具體實(shí)施方案中，生長(zhǎng)溫度在所述植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間以平均至少約2小時(shí)/天，至少約3小時(shí)/天，至少約4小時(shí)/天，至少約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約14、約16、約18、約20、至少約22小時(shí)/天，或直至約24小時(shí)/天的時(shí)間高于或低于外界溫度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將編碼除了 SEQ ID NO: 35、36或37之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶具有高于外界環(huán)境溫度的最適溫度；使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸；和在這樣的溫度下使所述植物生長(zhǎng)，所述溫度超過外界環(huán)境溫度至少1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約3小時(shí)、至少約4小時(shí)或更多小時(shí)/天，共至少2、 3、 4、 5、 6、7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更多天(在將草甘膦施用至植物后)，其中溫度超過外界環(huán)境溫度的那些天出現(xiàn)在植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將編碼除了 SEQ ID N0: 38之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶具有低于外界環(huán)境溫度的最適溫度；使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸；和在這樣的溫度下使所述植物生長(zhǎng)，所述溫度低于外界環(huán)境溫度至少約1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約3小時(shí)、至少約4小時(shí)或更多小時(shí)/天，共至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、19、 20或更多天(在將草甘膦施用至植物后)，其中溫度超過外界環(huán)境溫度的那些天出現(xiàn)在植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將編碼草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在高于外界環(huán)境溫度的溫度下是熱穩(wěn)定的；使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸；和在高于外界環(huán)境溫度的溫度下使所述植物生長(zhǎng)，其中所述溫度高于外界環(huán)境溫度至少約1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約3小時(shí)、至少約4小時(shí)或更多小時(shí)/天，共至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更多天(在將草甘膦施用至植物后)，其中溫度超過外界環(huán)境溫度的那些天出現(xiàn)在植物的生
25長(zhǎng)季節(jié)期間。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，所述熱穩(wěn)定的EPSP合酶為SEQID NO: 14中所示。備選地，所述方法包括將編碼草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在低于外界環(huán)境溫度的溫度下是熱穩(wěn)定的；使所述植物與除草有效濃度的草甘膦接觸；和在這樣的溫度下使所述植物生長(zhǎng)，所述溫度低于外界環(huán)境溫度至少約l小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約3小時(shí)、至少約4小時(shí)或更多小時(shí)/天，共至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更多天(在將草甘膦施用至植物后)，其中溫度超過外界環(huán)境溫度的那些天出現(xiàn)在植物的生長(zhǎng)季節(jié)期間。
在各種實(shí)施方案中，在高于或低于外界環(huán)境溫度的溫度下熱穩(wěn)定的，或者在低于或高于外界環(huán)境溫度的溫度下具有熱最佳值的草甘膦耐受性EPSP合酶不是植物來源的EPSP合酶。"植物來源的"意指天然植物EPSP合酶序列，或與天然植物序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或至少約99%同一的序列。參見，例如在美國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者B·卡爾, B·范德伯格, C·皮特斯, D·J·湯姆索 申請(qǐng)人:阿則耐克斯公司