專利名稱：：相位型小rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：圖6圖示了在單個回折結(jié)構(gòu)中含有雜合RNA的RNA轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.34)，所述回折結(jié)構(gòu)由具有SEQIDNO.33的序列的內(nèi)源相位型小RNA基因座(LOC—Osl2g42380.1lll982.m08017)預(yù)測，如在實施例4中所述。該基因座由水稻成熟顆粒和秧苗鑒定，并包含列于表4的相位型小RNA。該轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.34)包含5'側(cè)翼序列(SEQIDNO.66)和3'側(cè)翼序列(SEQIDNO.67),以及位于回折結(jié)構(gòu)的5，和3'臂之間的間隔區(qū)序列(SEQIDNO.68)。轉(zhuǎn)錄物的5，和3，末端示于圖的頂部；在圖的底部顯示轉(zhuǎn)錄物具有僅3個核苷酸的緊密轉(zhuǎn)角或環(huán)。除非另有定義，否則所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的通常理解具有相同含義。一般而言，所用的命名法和下述的生產(chǎn)或?qū)嶒炇页绦蛟诒绢I(lǐng)域眾所周知并廣泛使用。對這些程序使用常規(guī)方法，例如在本領(lǐng)域和多個一般性參考文獻(xiàn)中提供的那些。除非另有說明，否則在本說明書文本中的核酸序列在由左至右閱讀時以5，-3，方向給出。核酸序列可4耍照說明作為DNA或RNA提供；一個序列的公開內(nèi)容必然限定另一個序列，這是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。在術(shù)語以單數(shù)形式提供時，本發(fā)明還設(shè)想了以該術(shù)語的復(fù)數(shù)形式描述的本發(fā)明方面。所用的命名法和下述的實驗室程序是本領(lǐng)域眾所周知并常用的。在通過引用結(jié)合到本文中的參考文獻(xiàn)中使用的術(shù)語和定義中存在分歧的情況下，在本申請中使用的術(shù)普通含義，如多個技術(shù)辭典所示例的。本發(fā)明人無意限制作用機(jī)制或作用方式。提供其參考文獻(xiàn)僅為了闡述用途。編碼折疊為在體內(nèi)被相位性切割的雜合RNA的轉(zhuǎn)錄物的重組DNA構(gòu)建體本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其編碼的轉(zhuǎn)錄物折疊為雜合RNA,該雜合RNA在體內(nèi)^t相位性切割為多個用于基因抑制的小雙鏈RNA。所述"雜合RNA"是指已在基本互補(bǔ)的RNA鏈之間進(jìn)行了Watson-Crick堿基配對的RNA，由此形成了在鏈間基本上但優(yōu)選不完全;咸基配對或退火的RNA;這與由兩個形成完全雙鏈RNA的完全或接近完全堿基配對的鏈進(jìn)行的常規(guī)siRNA生產(chǎn)相反。在一個優(yōu)選的實施方案中，"雜合RNA"包括為一個分子的組成部分的兩條單鏈型RNA，其中兩條單鏈基本上互補(bǔ)，并彼此反向平行排列，由此允10許兩條單鏈彼此堿基配對；通過分子內(nèi)堿基配對形成雜合RNA。在備選的實施方案中，"雜合RNA"包括兩條單鏈RNA，每條鏈都是獨立分子的組成部分；通過分子間石咸基配對形成雜合RNA。在特別優(yōu)選的實施方案中，重組DNA編碼形成回折結(jié)構(gòu)的RNA轉(zhuǎn)錄物，該回折結(jié)構(gòu)含有兩個反向平行的單鏈臂，其中l(wèi)條臂與另一條臂基本上但不完全互補(bǔ)，回折結(jié)構(gòu)的兩條臂之間的堿基配對產(chǎn)生基本上但不完全雙鏈的包含錯配的RNA;優(yōu)選地，錯配沿著雜合RNA(例如在21個連續(xù)核苷酸的給定區(qū)段中有至少1個錯配)的長度分布，如在圖1、圖6和圖8B中所示。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，雜合RNA包含來源于天然相位型小RNA基因座的轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)，例如選自圖1、圖5、圖6和圖8B所示結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。體內(nèi)"相位性切割"是指雜合RNA在體內(nèi)被酶促加工或"切割"為較短的區(qū)段，其中切割位點沿著雜合RNA非隨機(jī)分布。雜合RNA在體內(nèi)被核糖核酸酶切割成多個較短的、基本上(但優(yōu)選不完全)雙鏈的區(qū)段，也就是說，多個小的基本上雙鏈的RNA，它們以連續(xù)方式排列，如在圖1、圖6和圖8B中所示；這與規(guī)范微RNA不同，在規(guī)范微RNA中，僅單個成熟微RNA由前體轉(zhuǎn)錄物顯著累積。核糖核苷酸非隨機(jī)地切割雜合RNA,產(chǎn)生多個相位型小雙鏈RNA的頻數(shù)分布；這與常規(guī)siRNA生產(chǎn)相反，在常規(guī)siRNA生產(chǎn)中，切割位點不產(chǎn)生siRNA的相位型頻數(shù)分布。優(yōu)選地，該頻H分布的分相為約21個核苷酸，如在圖7中所示。因此，由本發(fā)明的重組構(gòu)建體產(chǎn)生的多個小雙鏈RNA被稱為"相位型小RNA"。術(shù)語"相位型小RNA"也適用于形成由本發(fā)明的重組構(gòu)建體產(chǎn)生的給定小雙鏈RNA的成對鏈的單鏈；在優(yōu)選的實施方案中，所述成對鏈中的一條鏈累積至比另一條鏈更高的水平。0023在優(yōu)選的實施方案中，雜合RNA由非DCU核糖核酸酶的核糖核酸酶在體內(nèi)相位性切割。在最優(yōu)選的實施方案中，雜合RNA在體內(nèi)被DCL4或DCL4-樣核糖核酸酶(例如得自任何單子葉或雙子葉植物的DCL4直系同源物，例如但不限于商品化或農(nóng)業(yè)用途的植物，如作物(尤其是用于人類食物或動物飼養(yǎng)的作物)、產(chǎn)木、產(chǎn)纖維、產(chǎn)漿或產(chǎn)纖維素的樹和植物、蔬菜作物、果樹和觀賞植物，例如下文在標(biāo)題"制備和使用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物"下列出的那些)相位性切割為多個用于基因抑制的小雙鏈RNA("相位型小RNA，，)。每個相位型小RNA與下一個都是連續(xù)的；該排列的非限制性實例示于圖1、圖6和圖8B。每個相位型小RNA包含兩個反向平行的RNA區(qū)段，其每個均含有約20個至約27個核苷酸(例如20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸)。兩個反向平行的RNA區(qū)段之間的堿基配對足以使它們形成基本上雙鏈的RNA。在優(yōu)選的實施方案中，每個小雙鏈RNA或相位型小RNA都包含至少一個錯配。錯配一般包含一個或多個非堿基配對的核苷酸(在任一個區(qū)段上或在兩個區(qū)段上)，在另外堿基配對的雙鏈RNA中形成"曲折"或"凸出"或"環(huán)"。在優(yōu)選的實施方案中，每個相位型小RNA均包含在一個或兩個末端形成突出端的一個或多個未配對石威基；最優(yōu)選地，突出端為2-核苷酸突出端，如在圖1、圖6和圖8B中所示。12還提供含有本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的非天然植物以及由非天然轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的非天然轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物包括任何發(fā)育期的植物，并包括由本文公開的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備的非天然轉(zhuǎn)基因再生植物，或者再生植物的非天然轉(zhuǎn)基因子代植物(其可為近交或雜種子代植物)，或者此非天然轉(zhuǎn)基因植物的非天然轉(zhuǎn)基因種子。還提供并要求保護(hù)在其基因組中具有本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、非天然轉(zhuǎn)基因植物和非天然轉(zhuǎn)基因種子通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備，如在下文的標(biāo)題"制備和使用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物"之下所述。本發(fā)明還包含這樣的非天然植物其就重組DNA已導(dǎo)入其基因組中的意義而言不是轉(zhuǎn)基因的，但是其具有的基因組已通過非重組DNA技術(shù)的方法人工修飾。天然基因組序列的這類人工修飾包括插入、缺失、置換、移碼、轉(zhuǎn)座、復(fù)制和倒位。天然基因組序列的人工修飾通過任何方法實現(xiàn)，包括通過化學(xué)品(例如曱磺酸鹽、曱基曱磺酸鹽、硫酸二乙酯、亞硝基胍和其它烷基化劑、堿基類似物如5-溴-脫氧尿嘧啶、螯合劑如溴化乙錠、交聯(lián)劑如柏以及氧化劑如亞硝酸或活性氧物質(zhì))誘變或通過物理處理(例如暴露于紫外線、放射性同位素或致電離輻射)誘變。這類誘變可以為隨機(jī)的或非隨機(jī)的(例如定點誘變)。誘變可以用完整植物、植物組織或植物細(xì)胞進(jìn)行。誘變的一個非限制性實例是用烷基化劑處理玉米花粉。誘變一般對群體進(jìn)行，之后篩選該群體，以允許選擇具有所需特性的個體。這些非天然植物可以類似于以下對轉(zhuǎn)基因植物所述的方式使用；例如，它們可凈皮栽培用于生產(chǎn)種子或其它可收獲的部分，或用于栽培子代(包括雜種代)。耙基因耙基因可包括被靶向抑制的單個基因或部分單個基因，或者可以包括例如靶基因的多個連續(xù)區(qū)段、靶基因的多個非連續(xù)區(qū)段、靶基因的多個等位基因或一個或多個物種的多個靶基因。靶基因序列可包括來自任何物種(包括但不限于非真核生物，例如細(xì)菌和病毒；真菌；植物，包括單子葉和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非家種的或野生的植物；無脊推動物，例如節(jié)肢動物、環(huán)節(jié)動物、線蟲和軟體動物；以及脊推動物，例如兩棲動物、魚、鳥、馴養(yǎng)或野生哺乳動物乃至人)的任何序列。0048在一個實施方案中，耙基因?qū)ζ渲兄亟MDNA構(gòu)建體將轉(zhuǎn)錄的植物為外源的，但對植物的害蟲或病原體(例如病毒、細(xì)菌、真菌、卵菌，和無脊推動物，例如昆蟲、線蟲和軟體動物)為內(nèi)源的。靶基因可以包括多個靶基因，或者一個或多個基因的多個區(qū)段。在一個優(yōu)選實施方案中，耙基因或基因為植物的無脊推害蟲或病原體的一個或多個基因。這些實施方案尤其可用于提供對一種或多種植物害蟲或病原體有抗性的轉(zhuǎn)基因植物，例如對線蟲(例如大豆孢嚢線蟲或根結(jié)線蟲)有抗性，或?qū)οx有抗性，或?qū)χ辽僖环N致病病毒、細(xì)菌或真菌有抗性。在某些實施方案中，可能需要設(shè)計用于沉默靶基因的相位型小RNA,以包含預(yù)期不產(chǎn)生不需要的多肽的區(qū)域，例如通過篩選編碼相位型小RNA或每個組成相位型小RNA的重組DNA構(gòu)建體，用于可編碼已知的不需要多肽或這些多肽的緊密同源物的序列。不需要的多肽包括但不限于與已知的變應(yīng)原性多肽同源的多肽和與已知的多肽毒素同源的多肽。編碼這些潛在不需要的變應(yīng)原性肽的公開可獲得的序列是可用的，例如食品變態(tài)反應(yīng)研究和資源計劃(FARRP)變應(yīng)原數(shù)據(jù)庫(可在allergenonline.com獲得)或食品安全數(shù)據(jù)庫的生物技術(shù)信息(可在www.iit.edu/~sgendel/fa.htm獲得)(另參見例如Gendel(1998)Jdv.尸ooc/A^r.42:63-92)。不需要的序列還可以包括例如那些注釋為已知毒素或潛在的或已知的變應(yīng)原的多肽序列，這些多肽序列包含在公開可獲得的數(shù)據(jù)庫中，例如GenBank、EMBL、SwissProt等，它們可通過Entrez系統(tǒng)(www.ncbi.nih.gov/Entrez)4全索。不需要的油質(zhì)蛋白和凝集素、小麥的麥谷蛋白、得自牛乳的酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白，以及得自多種貝類的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不需要的潛在毒性肽的非限制性實例包括破傷風(fēng)梭菌(C/o^nWwwtetam〕的破傷風(fēng)毒素tetA、金黃色葡萄球菌(5Va//y;/ococa^冊"1)的腹瀉毒素，以及毒液，例如巖螺屬(Com^spp.)的芋螺毒素以及節(jié)肢動物和爬4亍動物的一申經(jīng)毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。在一個非限制性實例中，篩選編碼相位型小RNA或每個組成相位型小RNA的重組DNA構(gòu)建體，以消除那些所編碼多肽與已知的變應(yīng)原或毒素在8個連續(xù)氨基酸內(nèi)具有完全的同源性或在至少80個氨基酸內(nèi)具有至少35。/。同一性的可轉(zhuǎn)錄序列；這樣的篩選可在兩個方向?qū)θ魏我约八锌勺x框、對以AUG(在對應(yīng)的DNA中為ATG)開始的潛在開放可讀框或?qū)λ锌赡艿淖x框進(jìn)行，與它們是否以AUG(或ATG)開始無關(guān)。當(dāng)獲得"命中結(jié)果"或匹配時，即在鑒定出所編碼的潛在多肽與已知的變應(yīng)原或毒素在8個連續(xù)氨基酸內(nèi)具有完全同源性(或在至少約80個氨基酸內(nèi)具有至少約35%同一性)的序列時，可在選擇序列用于沉默靶基因的RNA時避免、消除或改變對應(yīng)于命中結(jié)果的核酸序列。在一個實施方案中，設(shè)計編碼相位型小RNA或每個組成相位型小RNA的重組DNA構(gòu)建體，所以不包含以AUG(在對應(yīng)的DNA中為ATG)開始的潛在開放讀框。0066可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法中的任一種避免、消除或改變不需要的序列。在某些情況下，結(jié)果可為一般認(rèn)為天然不存在的新序列。例如，可將"干凈的"序列一起連接成在編碼相位型小RNA的重組DNA構(gòu)建體中使用的新嵌合序列，由此避免某些序列。用本發(fā)明的相位型小RNA控制害蟲和病原體的方法可以與控制植物害蟲和病原體的其它方法或組合物組合使用。因此，本發(fā)明還提供用于控制植物害蟲和病原體的方法組合和組合物組合。在優(yōu)選的實施方案，要組合的方法通過不同機(jī)制運行，為植物提供抗害蟲或病原體的保護(hù)。例如，可通過提供設(shè)計用于沉默無脊推害蟲的基因的替代基因抑制元件(例如通過在植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的常規(guī)雙鏈制無脊推害蟲；參見例如在美國專利申請^^布號2006/0200878中公開的多種用于基因抑制的重組DNA構(gòu)建體和方法，該專利申請在此引入作為參考。994)P/a,wJ.'5:299)、苜蓿(Masoud等(1996)7Va朋ge".i".，5:313);蕓苔(Radke等(/卵"戶/a^Ce〃i叩""W9-56(5)和番茄(Sim等(2006)P/flWCe〃PA，"/.,47:426-431)。另參見美國專利申請公布號2003/0167537Al關(guān)于轉(zhuǎn)化的擬南芥植物的載體、轉(zhuǎn)化方法和生產(chǎn)的描述，其中轉(zhuǎn)錄因子通過CaMV35S啟動子組成型表達(dá)，該專利申請在此引入作為參考。非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物還可以通過用其它載體轉(zhuǎn)化獲得，例如但不限于病毒載體(例如煙草蝕紋馬鈴薯Y病毒(TEV)、大麥條斑花葉病毒(BSMV)和在Edwardson和Christie"ThePotyvirusGroup:MonographNo.16,1991,Agric.Exp.Station,Univ.ofFlorida"中提及的病毒)、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)或在使用適宜的轉(zhuǎn)化方案時的任何其它適宜的克隆載體，所述適宜的轉(zhuǎn)化方案例如為細(xì)菌感染(例如釆用如上所述的土壤桿菌)、二元細(xì)菌人工染色體構(gòu)建體、直接遞送DNA(例如經(jīng)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔、與碳化硅纖維一起攪拌和微粒轟擊)。對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，可使用和改變多種轉(zhuǎn)化方法，用于由眾多目標(biāo)植物物種生產(chǎn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。00781提供含穩(wěn)定整合的重組DNA的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞控的環(huán)境中實施。"介質(zhì)"是指用于體外(即在完整的活體生物外部)培養(yǎng)細(xì)胞的眾多營養(yǎng)混合物。受體細(xì)胞耙包括但不限于分生組織細(xì)胞、愈傷組織、不成熟胚或部分胚，以及配子細(xì)胞，例如小孢子、花粉、精細(xì)胞和卵細(xì)胞。任何可由其再生能育植林的細(xì)胞都可用作實施本發(fā)明的受體細(xì)胞。愈傷組織可由多種組織源發(fā)端，包括但不限于不成熟胚或部分胚、實生頂端分生組織、小孢子等。能夠作為愈傷組織增殖的那些細(xì)胞可用作遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的實際轉(zhuǎn)化方法和材料(例如多種介質(zhì)和受體靶細(xì)胞、不成熟胚的轉(zhuǎn)化以及隨后的能育轉(zhuǎn)基因植物的再生)公開于例如美國專利6,194,636和6,232,526以及美國專利申請公布號2004/0216189,所述專利在此引入作為參考?？墒斋@轉(zhuǎn)基因育性植物的種子并用于培育在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物的子代，包括雜種代。因此，除了用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化4直物之外，本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物可通過使具有重組DNA的第一種植物與沒有該構(gòu)建體的第二種植物雜交制備。例如，可將重組DNA導(dǎo)入經(jīng)歷轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物系中，該植物系可與第二種植物系雜交，以將重組DNA漸滲入獲得的子代中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可與具有其它重組DNA的植物系雜交，所述其它重組DNA賦予一種或多種另外的性狀(例如但不限于除草劑抗性、害蟲或疾病抗性、環(huán)境逆境抗性、改良的營養(yǎng)物含量和產(chǎn)量改善)，以產(chǎn)生具有賦予期望的把序列表達(dá)行為和另外性狀這二者的重組DNA的子代植物。因此，如本文所述，本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或非天然轉(zhuǎn)基因植物可通過使用本領(lǐng)域已知的或目前公開的任何適宜的瞬時或穩(wěn)定的、整合或非整合的轉(zhuǎn)化方法獲得。重組DNA構(gòu)建體可在任何植物細(xì)胞或組織中或在任何發(fā)育階段的全林中轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植物可來源于任何單子葉或雙子葉植物，例如^f旦不限于商業(yè)或農(nóng)業(yè)用途的植物，例如作物(尤其是用于人類食物或動物飼料的作物)、產(chǎn)木、產(chǎn)纖維、產(chǎn)漿或產(chǎn)纖維素的樹和植物、蔬菜植物、果樹和觀賞植物。目標(biāo)植物的非限制性實例包括谷類作物(例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、黑小麥、水稻、黍、高粱、昆諾阿藜、莧和蕎麥)；草料作物(例如銅草和草料雙子葉植物，包括苜蓿、野豌豆、三葉草等)；油籽作物(例如棉花、紅花、向曰葵、大豆、油菜、油菜籽、亞麻、花生和油椰子)；樹類堅果(例如胡桃、腰果、榛果、美洲山核桃、扁桃、澳大利亞堅果等)；甘蔗、椰子、海棗、橄欖、甜菜、茶和咖啡；產(chǎn)木、產(chǎn)纖維、產(chǎn)漿或產(chǎn)纖維素的樹和植物(例如棉花、亞麻、黃麻、苧麻、劍麻、洋麻、柳枝稷和竹)；蔬菜作物，例如豆類(例如菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、花生)、萵苣、蘆筍、朝鮮薊、旱芹、胡蘿卜、蘿卜、木薯、甘薯、山藥、可可、咖啡、茶、蕓苔屬植物(例如甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、芥菜和其它葉狀蕓苔、椰菜、花椰菜、芽甘藍(lán)、蕪箐、球莖甘藍(lán))、食用葫蘆科植物(例如黃瓜、甜瓜、西葫蘆、筍瓜)、食用蔥屬植物(例如洋蔥、大蒜、韭菜、蔥、細(xì)香蔥)、食用茄科成員(例如番茄、茄子、馬鈐薯、胡椒、燈籠果)和食用藜科成員(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、昆諾阿藜、莧)；結(jié)果作物，例如蘋果、梨、柑橘類水果(例如橙子、酸橙、檸檬、柚子等)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、獼猴桃、番木瓜、鱘梨、無花果、芒果和漿果；以及觀賞植物，包括開花觀賞植物、觀賞樹木和灌木、觀賞地被植物和觀賞草類。優(yōu)選的雙子葉植物包括但不限于油菜、椰菜、甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、大白菜、黃瓜、干豆、茄子、茴香、四季豆、葫蘆、萵苣、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、西葫蘆、蘿卜、菠菜、南瓜、西瓜、棉花、馬鈴薯、昆諾阿藜、莧、蕎麥、紅花、大豆、糖甜菜和向日葵。優(yōu)選的單子葉植物包括但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米(包括甜玉米和其它變種)、黑麥、黑小麥、水稻、觀賞草類和飼草、高粱、黍、洋蔥、韭蔥和甘蔗，更優(yōu)選玉米、小麥和水稻。0092植物轉(zhuǎn)化的最終目標(biāo)是生產(chǎn)可用于人的植物。在這方者有價值的任何用途。例如，人們可能希望收獲轉(zhuǎn)基因植物自身，或者收獲用于種植目的的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子，或者可由轉(zhuǎn)基因植物或其種子獲得產(chǎn)品，例如油、淀粉、乙醇或其它發(fā)酵產(chǎn)物、動物飼料或人類食品、藥物以及各種工業(yè)產(chǎn)品。例如，玉米被廣泛用于食品和祠料工業(yè)以及工業(yè)用途。玉米用途的其它論述可見于例如通過引用結(jié)合到本文中的美國專利號6,194,636、6,207,879、6,232,526、6，426，446、6，429，357、6，433，252、6,437,217和6，583，338以及PCT公布號WO95/06128和WO02/057471。因此，本發(fā)明還提供由本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子生產(chǎn)的商品產(chǎn)品，包括但不限于收獲的葉、根、枝、塊莖、莖、果實、種子或其它植物部分、粗粉、油、提取物、發(fā)酵或消化產(chǎn)物、碾碎的或完整的植物?；蚍N子，或者任何食品或非食品產(chǎn)品，包括由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子生產(chǎn)的這些商品產(chǎn)品。在本文涉及的一種或多種商品或商品產(chǎn)品中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的一種或多種核酸序列的檢測實際上證明了商品或商品產(chǎn)品包含或來源于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子。水稻(O/7z"加Z/v")回折結(jié)構(gòu)的基因組序列和推定前體在SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和SEQIDNO.11中給出。預(yù)測1個基因組DNA序列(SEQIDNO.9)包含如在圖2中所示的cDNA序列、內(nèi)含子序列和回折臂，該轉(zhuǎn)錄物的幾個可變剪接形式見于cDNA數(shù)據(jù)庫。1個豐富的可變剪接轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.IO)表明除去了一半回折結(jié)構(gòu)，可能阻止小RNA生產(chǎn)。表達(dá)的序列標(biāo)簽(SEQIDNO.ll)被鑒定為代表SEQIDNO.10的互補(bǔ)序列。規(guī)范TATA盒(由圖2中加框的核苷酸指示)位于SEQIDNO.8中預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點上游的34個堿基處，證實這是轉(zhuǎn)錄物的真正5，末端。單個回折結(jié)構(gòu)因此由l個啟動子轉(zhuǎn)錄，并獨立于RNA依賴性RNA聚合酶形成在體內(nèi)被相位性切割為多個用于基因抑制的小雙鏈RNA的雜合RNA。或者，由相同啟動子轉(zhuǎn)錄的兩個(或以上)剪接變體各自均含有每個回折結(jié)構(gòu)臂的其中一個，并獨立于RNA依賴性RNA聚合酶一起以反式形成在體內(nèi),皮相位性切割為多個小雙鏈RNA的雜合RNA。收集的證據(jù)證明該基因座為新型的RNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)(抑制)元件。與反式作用的siRNA不同，多個小雙鏈RNA全部來自原始RNA轉(zhuǎn)錄物或前體的正鏈，與RNA依賴性RNA聚合酶無關(guān)，且沒50有啟動雙鏈RNA生產(chǎn)的miRNA革巴位點。與微RNA不同，所述基因座在體內(nèi)被切割為大量相位型小RNA,(如在以下的實施例5中所述)，該過程需要DCL4(或DCL4直系同源物)，不需要DCL1。本發(fā)明人因此稱該新基因座為"相位型小RNA"基因座。具有驅(qū)動GUS和Hspl7終止子表達(dá)的35S啟動子的對照構(gòu)建體(pMON94320)包括SEQIDNO.12的部分序列，插入位點(在圖3B中以粗體指示)位于GUS編碼序列和Hspl7終止子之間。設(shè)計3個基于該對照構(gòu)建體的另外的構(gòu)建體，每個構(gòu)建體均含有至少1個對應(yīng)于本發(fā)明的相位型小RNA的識別位點。第一個構(gòu)建體(pMONl00574)包含SEQIDNO.13的部分序列，其含有1個在實施例1中描述的21聚體相位型小RNA(SEQIDNO.6),以插入位點的有義方向摻入(圖3C)。第二個構(gòu)建體(pMON100575)包含SEQIDNO.14的部分序列，其含有1個在實施例1中描述的21聚體相位型小RNA(SEQIDNO.6),以插入位點的反義方向(即作為對應(yīng)于有義方向的SEQIDNO.6的識別位點)摻入(圖3D)。第三個構(gòu)建體(pMON100576)包含SEQIDNO.15的部分序列，其包含2個在實施例1中描述的21聚體相位型小RNA(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)，這二者均以插入位點的反義方向(即作為對應(yīng)于有義方向的SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的識別位點)摻入(圖3E)。按照在實施例1中詳述的方法，由水稻(O7MM^'va)成熟籽粒和籽苗RNA文庫鑒定出第二個"相位型小RNA"基因座。該基因座LOC—Osl2g42380.1|11982.m08017具有DNA序列CTCCCGCTCCCGCTCTCGCCTGCAGTATTTGTTCCATTGCCGCGCACCACTTTCCGGTGGGCGGCGGGCAATGCTAGGGGTTAAGAGACCTTCTCTCCCCGAGATGGAGGCGCCGGGCGGCGCGGCGGGGGACGCGGAGGAGGAAGTTGATGCCCGGATCCGCTGGGTTCCATGGTGGCTGCTATGGAATGGTGGAATTGCTTGGATGGCCACGAAGGGGATCGACGCCAATTGTTTGGCGACCTCTACGATAGAATCGCGTCGAGTCGGGGTGTTCTTTCCTGTTATTACTAGAAGTAGTTGAATTTCGTGATTGAACACACAAGGAAGCTTGATATCGCGTCGGGGGTGTTCTTTCCTGTTATTACTAGATGTAGTTGGGTTTCGTGATTGGAGAAAATGCACTCTCTCAAGAGATTCTAAAGGGCGCTTTCTTCCAAGAGAGAGTAAGGGGGGAGACATCGGAGGAAATGCTACAGAGAGTGAAGTTGATTATGACCGCTTCATGAACTTTCAGGCACCTGACTTCGCTACCATCTTAAGTATTTTGAAAGGCTGGAAAGGCATGAAGCAATGTAACAAGATCAGGCGCCTCAAGGATCCTGACTTCGTCCCTCTCATGAACGTCATGAGCAACACTGGATATGTGACCGAGGATGATGGTCACTATGATGTGCTGAAAGTCTTGATGCATGCAGATGGCTGGTCTGCATAGTGATTCAAGCTCTCAAATCAAAACATTCAGGCCTATGGCCTTGTTGCTAGAACAGTGGTTTCTTCTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO.33)，相唯一性記》0.959，高度支持具有以下序列的預(yù)測的RNA轉(zhuǎn)錄物GCUGAAA(SEQIDNO.34),并含有如在圖6中所示的序列和單個回折結(jié)構(gòu)。圖7A圖示了沿著完整序列(約2千堿基)的siRNA豐度，以每25萬個序列的轉(zhuǎn)錄物("tpq，，)表示，圖7B圖示了siRNA區(qū)和得自該基因座的小RNA豐度的21-核苷酸分相的展開圖。關(guān)于該基因座(SEQIDN0.33)的相位型小RNA的數(shù)據(jù)在表4中提供。這些相位型小RNA大部分由水稻小RNA文庫克隆，還在由籽粒(授粉后32天和授粉后39天)和根(V9期)制備的玉米(Zeama，)RNA文庫中鑒定出幾個，表明在玉米中存在類似的相位型小RNA基因座。由該基因座(SEQIDNO.33)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.34)還包括5，側(cè)翼序列CGUAGUAACUGUCGUCCACGA(SEQIDNO.66)和3'側(cè)翼序列以及位于回折結(jié)構(gòu)的5，和3，臂之間的間隔序列UUUAUUUUCGCUUGGUUUCCGGCAAAAAGGG(SEQIDNOGS),該間隔序列包含3-核苷酸的轉(zhuǎn)角。圖6圖示了每個小RNA沿著由水稻基因座(SEQIDNO.33)預(yù)測的雜合西A(回折)結(jié)構(gòu)(SEQIDNO.34)的5，和3'臂的相對位置。這些小RNA大部分但不是全部是21聚體。預(yù)測由SEQIDNO.59編碼的小RNA含有27個核苷酸，包括8個未配對核苷酸的大凸出；預(yù)測修飾該序列，使該小RNA更接近兩個螺旋轉(zhuǎn)角(約21個核苷酸)，從而加工該小RNA。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*"tpq",每25萬個序列讀取結(jié)果(以3個測序循環(huán)的平均值給出)的轉(zhuǎn)錄物"小RNA也由玉米克隆承"由相位型sRNA^因座序列(SEQIDNO.33)預(yù)測，但未克隆實施例5相位型小RNA形成新型的調(diào)節(jié)性小RNA,其與規(guī)范微RNA(miRNA)和反式作用的siRNA均不同。本文公開的相位型小RNA在某種程度上使人聯(lián)想到擬南芥中的miR163,在擬南芥中，測序siRNA的兩個相位，單個小RNA(miR163自身)顯著累積；參見Allen等人(2004)A^/.36:1282-1290;以及Kurihara和Watanabe(2004)iVoc.淑/Jcac/m,101:12753-12758。然而，相位型小RNA明顯與miR163不同，因為大量相位型小RNA^t加工，并可以由單個轉(zhuǎn)錄物分離。相位型小RNA基因座是單個擴(kuò)展的不完全的回折結(jié)構(gòu)(例如在圖1、圖6或圖8B中所示的基因座)，因此也與在擬南芥中鑒定的反式作用的siRNA基因座明顯不同，siRNA基因座需要RNA依賴性RNA聚合酶(RDR6)來產(chǎn)生雙鏈RNA,由該雙鏈RNA加工相位型siRNA。使用miRSite算法，由植物cDNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測由具有SEQIDNO.33的基因座產(chǎn)生的相位型小RNA(參見表4)調(diào)節(jié)的推定耙基因。miRSite通過比較輸入miRNA和靶cDNA數(shù)據(jù)集之間的序列相似性預(yù)測miRNA靶?；诮?jīng)實驗驗證的miRNA靶建立的規(guī)則(Allen等人(2005)Ce//，121:207-221)記分miRNA:靶對(或類似地，相位型小RNA:靶對)。簡而言之，4普配對和單個核苷酸空位記分為1,G:U對記分為0.5,堿基2-13的錯配對記分加倍，沿著靶的長度求和。預(yù)測的耙按照其罰分排列，記分低于4.5被視為推定的靶。就保守miRNA或相位型小RNA而言，優(yōu)先給出存在于直系同源基因和位置中的靶。表5提供了預(yù)計由具有SEQIDNO.33的基因座的相位型小RNA調(diào)節(jié)的靶基因(和在靶基因RNA轉(zhuǎn)錄物中鑒定的識別位點)的非限制性實例；還顯示了相位型小RNA和識別位點的比對。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>使用稱為RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA5'末端快速擴(kuò)增("5，RLM-RACE")的技術(shù)經(jīng)實驗驗證植物(例如水稻和玉米)中的預(yù)測靶；參見例如Kasschau等人(2003)Z)ev.CW/,4:205-217，和Llave等人(2002)5Wewce,297:2053-2056。該方法依賴RNA適體分子連接至切割位點的5'末端，并取決于由包括Agol的RNAaseIII酶所留下的5'磷酸。測序產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，對準(zhǔn)核苷酸10和11之間的預(yù)測miRNA(或相位型小RNA)切割位點的克隆相對于miRNA(或相位型小RNA)5'末端的相對數(shù)目提供了miRNA(或相位型小RNA)活性評價。5，RLM-RACE測定的結(jié)果用于證實任何相位型小RNA對預(yù)測耙的切割。[00131鑒定和-瞼it由天然表達(dá)的相位型小RNA基因座的相位型小RNA調(diào)節(jié)的內(nèi)源基因，可用于例如消除或改變內(nèi)源基因中的相位型小RNA識別位點，以便分離該基因的表達(dá)，所述基因由天然調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的相位型小RNA的調(diào)節(jié)。例如，可增加涉及2-13位堿基的錯配數(shù)目(在具有連續(xù)的21個核苷酸的相位型小RNA識別位點中)，以防止^皮相位型小RNA識別和切割。[00132本文公開并要求保護(hù)的所有材料和方法都可以按照以上公開內(nèi)容的說明獲得和使用，無需過度試驗。盡管已依據(jù)優(yōu)選實施方案和說明性實施例描述了本發(fā)明的材料和方法，4旦對本領(lǐng)域4支術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可對本文描述的材料和方法實施改變。所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類似置換和修改都被認(rèn)為屬于由隨附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念。權(quán)利要求1.一種編碼折疊成雜合RNA的轉(zhuǎn)錄物的重組DNA構(gòu)建體，所述雜合RNA在體內(nèi)被相位性切割成多個具有抑制基因作用的小雙鏈RNA。2.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述雜合RNA的產(chǎn)生與RNA依賴性RNA聚合酶無關(guān)。3.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述雜合RNA在體內(nèi)被DCL4或DCL4直系同源物相位性切割成多個具有基因抑制作用的小雙鏈RNA。4.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述多個小雙嗜連RNA含有至少3個小雙鏈RNA。5.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述雜合RNA含有得自天然相位型小RNA基因座的轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)。6.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體含有得自相位型小RNA模板序列的核苷酸序列，其中在所述相位型小RNA模板序列中的至少1個21個連續(xù)核苷酸的區(qū)段被修飾以抑制靶基因。7.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述小雙鏈RNA各自均含有至少1個錯配。8.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述基因抑制為1個靶基因的基因抑制。9.權(quán)利要求1的重組DNA構(gòu)建體，其中所述基因抑制為多個靶基因的基因抑制。10.—種重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有的DNA轉(zhuǎn)錄為(a)第一個系列的連續(xù)RNA區(qū)段，和(b)第二個系列的連續(xù)RNA區(qū)段，其中所述第一個系列的連續(xù)RNA區(qū)^R在體內(nèi)與所述第二個系列的RNA區(qū)段雜交，形成雜合RNA，所述雜合RNA在體內(nèi)被DCL4或DCL4直系同源物相位性切割成多個具有抑制基因作用的小雙鏈RNA。11.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述RNA區(qū)段各自由20至27個核苷酸組成。12.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述第一個系列和第二個系列包含21個核苷酸的RNA區(qū)段。13.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述雜合RNA的鏈位于一個分子上，所述構(gòu)建體還含有被轉(zhuǎn)錄為間隔區(qū)的DNA,所述間隔區(qū)連接所述第一個和第二個系列的連續(xù)RNA區(qū)段。14.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述雜合RNA的鏈位于不同分子上。15.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其含有至少1個得自天然相位型小RNA基因座轉(zhuǎn)錄物的核苦酸序列，所述轉(zhuǎn)錄物選自5'側(cè)翼序列、3，側(cè)翼序列和間隔序列。16.—種含有啟動子和與其有效連接的、轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA的重組DNA構(gòu)建體，所述RNA含有(a)至少一個可纟皮相位型小RNA識別的外源識別位點，所述相位型d、RNA在多細(xì)胞真核生物的特定細(xì)胞中表達(dá)，和(b)在所述特定細(xì)胞中被抑制的靶RNA,其中所述靶RNA在所述特定細(xì)胞之外的所述多細(xì)胞真核生物的細(xì)胞中表達(dá)。17.權(quán)利要求16的重組DNA構(gòu)建體，其中所述至少1個外源識別位點位于至少以下其中之一中'.(a)所述靶RNA的5'非翻譯區(qū)；(c)所述靶RNA。18.—種在其基因組中具有權(quán)利要求1、權(quán)利要求IO或權(quán)利要求16的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。19.一種非天然轉(zhuǎn)基因植物，所迷植物含有權(quán)利要求18的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了編碼可用于調(diào)節(jié)一種或多種目標(biāo)基因表達(dá)的相位型小RNA的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還公開了含有本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子。文檔編號C12N15/11GK101600798SQ200780039293公開日2009年12月9日申請日期2007年8月31日優(yōu)先權(quán)日2006年8月31日發(fā)明者E·艾倫,S·E·黑賽爾,S·I·伊瓦舒塔,張遠(yuǎn)記,亮郭申請人:孟山都技術(shù)有限公司