專利名稱：滅菌指示器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開的技術涉及一種滅菌指示器，和一種制造所述滅菌指示 器的方法。本發(fā)明公開的技術涉及一種使用所述滅菌指示器來測定滅菌 有效性的滅菌方法。
背景技術：
主要在醫(yī)療衛(wèi)生產業(yè)，也在許多其他商業(yè)和工業(yè)應用，監(jiān)測用于i殳 備如醫(yī)療和非醫(yī)療裝置、儀器和其他物品和材料的滅菌方法的有效性常 常是必要的。在需要滅菌的一批物品中包括一個滅菌指示器常常是這些 滅菌方法中的標準操作。這允許以 一種直接的方式來評估滅菌方法的致死率。
傳統(tǒng)的滅菌指示器通常包括一種生物指示劑。所述生物指示劑包括 與滅菌中需要被破壞的生物體相比， 一種或多種被設計成對滅菌方法具 有更高抵抗力的測試生物體。這些測試生物體通常是細菌芽孢。傳統(tǒng)的 滅菌指示器有兩種樣式可^L采用。
第一種樣式涉及一種基質的使用，其中細菌芽孢被直接涂于或接種 在該基質上。該基質被芽孢完全覆蓋。使用者的任何物理操作可能導致 芽孢從基質上喪失，轉移至使用者，或者潛在地污染周圍環(huán)境或被周圍 環(huán)境污染。已經提議提供特殊的夾子來讓使用者處理基質。然而，這些 夾子常常阻礙滅菌方法并可導致失敗的測試結果。另外，對這些基質的
最小尺寸限制常常導致要求相對大體積的培養(yǎng)基，如約5至約10毫升 (mL),和相對長的培養(yǎng)時間，如約2至約7天。
第二種樣式涉及一個自含式滅菌指示器。這類滅菌指示器通常在一 個單個容器的分開的隔室中包含細菌芽孢和培養(yǎng)基。細菌芽孢經受滅菌 方法。滅菌后，該容器被激活以使任何存活的芽孢可以接觸培養(yǎng)基，以氣體滅菌方法，但是通常不 適用于液體滅菌方法。
這些滅菌指示器的一個主要的劣勢涉及獲得滅菌測試結果的時間延
遲。這些滅菌指示器通常需要細菌芽孢被培育至少2天，常常達7天， 以確保對任何存活芽孢的適當檢測。在此期間，經過滅菌方法并處于評 估中的物品直至芽孢活性測試的結果被測定之后才能使用。然而，很多 醫(yī)療衛(wèi)生機構資源有限并且必須在24至48小時內甚至常常立即重新使 用他們"滅菌過"的儀器。這樣的情況下，無菌驗證的2到7天保留期是 不實用，浪費和沒有效率的。
因此，現(xiàn)有技術上存在的 一個問題是提供一種能最小化或者消除對 生物指示劑的處理并且在相對短的時間內準確地檢測滅菌方法的有效性 的滅菌指示器。所述滅菌指示器若能夠適用于液體滅菌方法和氣體滅菌 方法將是具有優(yōu)勢的。本發(fā)明公開的技術在至少一個實施方案中提供了 一種針對該問題的解決方案。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開的技術涉及一種滅菌指示器，其包括 一種載體，它有 一個第一表面和一個第二表面； 一種支撐體，它有一個第一部分和一個 第二部分，所述載體覆在所述支撐體的第一部分上，所述載體的第二表
面連接于所述支撐體的第一部分；和生物指示劑，它由所述載體支撐，
所述支撐體的第二部分有足夠的尺寸以允許在不接觸所述生物指示劑的
情況下處理所述滅菌指示器。
本發(fā)明公開的技術涉及一種滅菌指示器用品包，其包括 一個第一 隔室，它包含上述滅菌指示器，并且適于在滅菌過程中允許所述滅菌指 示器與滅菌介質接觸；和一個第二隔室，它含有培養(yǎng)基，并且適于在滅 菌過程中維持培養(yǎng)基與所述滅菌指示器分開，并允許培養(yǎng)基在所述滅菌 指示器已被暴露于滅菌介質之后與所述滅菌指示器接觸。
本發(fā)明公開的技術涉及一種制造上述滅菌指示器的方法，其包括 將所述生物指示劑涂于所述載體；和將載體黏附于支撐體。本發(fā)明公開的技術涉及一種滅菌方法，其包括將一件需要滅菌的 物品和上述滅菌指示器暴露于一種滅菌介質。
本發(fā)明公開的技術涉及一種用于測定滅菌有效性的方法,其包括將 一件需要滅菌的物品和上述滅菌指示器暴露于一種滅菌介質，所述生物 指示劑包含至少一種測試生物體；和在滅菌后將所述載體與培養(yǎng)基接觸 以測定滅菌是否有效。
本發(fā)明公開的技術涉及一種用于測定滅菌有效性的方法,其包括將 至少一件需要滅菌的物品和上述滅菌指示器暴露于一種滅菌介質，所述 生物指示劑包含至少一種酶；和將所述載體與至少一種酶底物接觸以測 定滅菌是否有效。


附圖中，相似的部分和特征有相似的參數。
圖l是本發(fā)明公開的滅菌指示器的一個實施方案的平面示意圖。
圖2是圖1中描述的滅菌指示器的側視示意圖。
圖3是一張用于測定滅菌有效性的裝置的分解示意圖，所述裝置包括 兩個隔室，前述的滅菌指示器被置于一個隔室內，并且培養(yǎng)基被置于另 一個隔室。
圖4是實施例1中公開的滅菌指示器的樣品的可恢復芽孢的制圖，該 制圖顯示超聲處理后有活力的芽孢的數目與超聲處理前相比沒有顯著的 不同。
圖5是實施例2公開的pH作為暴露于不同體積和緩沖能力的培養(yǎng)基 的嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geo^"7/^Weara,/^nwop/n7^)的芽孢生長的函 數的制圖。
具體實施例方式
術語"滅菌"指使一種物質無法繁殖、新陳代謝和/或生長。雖然這常 被用于表示活的生物體的完全不存在，該術語在本文用于表示一種物質 沒有活的生物體到以前認為可接受的程度。除非另有說明，術語"滅菌，，在本文也用于表示沒有滅菌那么嚴格的方法和程序，例如消毒、清潔， 等等。本文描述的滅菌指示器、方法以及裝置可用于醫(yī)療衛(wèi)生領域，科 學領域，等等。這些可被用于需要滅菌、消毒、清潔等等的商業(yè)和工業(yè) 應用，如食物加工，藥品制造，等等。
使用本發(fā)明公開的滅菌指示器的滅菌方法可以是任何滅菌方法。這 些方法包括其中滅菌介質或滅菌劑是氣流，干熱，輻射，以及一種或多 種氣體滅菌劑， 一種或多種液體滅菌劑等等的滅菌方法。輻射包括電子 束或任何電磁譜包括離子輻射，脈沖式白光或紫外光，微波，等等。輻
射包括Y或P輻射。氣體滅菌劑包括環(huán)氧乙烷，氣態(tài)過氧化氬，等等。 液體滅菌劑包括福爾馬林(甲醛氣體溶于水并任選添加甲醇以防止有毒 物質的生成)，戊二醛，過氧乙酸，液態(tài)過氧化氬，等等。
所述滅菌指示器可被用于檢驗滅菌劑針對任何，與用于滅菌指示器 的生物指示劑相比，對滅菌方法具有較低抵抗力的微生物體的致死率。 這些微生物體包括細菌如大腸桿菌(Esc/^n'c/n'a co// )，軍團菌(丄eg/owe〃a W.)，彎曲桿菌(Camp;;/0Z7acter 5p.)和其他腸道菌，以及葡萄球菌 (S鄉(xiāng)/^/ococ面)和鏈球菌(6V，tococ，)，和其他人類致病微生物，如 隱孑包子蟲(CV7/ tos/70廠Ww附)。
所述滅菌指示器可結合圖1和圖2被描述。結合這些附圖，滅菌指 示器10包括載體12,所述載體12有一個第一表面14和一個第二表面 16;支撐體20，所述支撐體20有一個第一部分22和一個第二部分24, 所述載體12覆在支撐體20的第一部分22上，所述載體12的第二表面 16被翁附到所述支撐體20的第一部分22;和生物指示劑30,所述生物 指示劑30由載體12支撐。所述生物指示劑30被支撐于或黏附到所述載 體12的第一表面14。所述支撐體20的第二部分24有足夠的尺寸，以允 許在不接觸所述生物指示劑30的情況下處理滅菌指示器10。也就是說， 所述第二部分24有足夠的尺寸以用作手柄(handle)從而允許便捷地處 理所述滅菌指示器10。
所述載體12可以是一種在附圖中描述的圓形的相對平坦的基質。然 而，可被理解的是所述載體12可以有任何希望的形狀或樣式，例如正方形，矩形，橢圓形，等等。所述載體12可以有一個棱形截面。所述載體
12有相對較小的厚度，例如，從約0.001到約3毫米，在一個實施方案 中從約0.01到約2毫米，在一個實施方案中從約0.05到約1.5亳米，并 且在一個實施方案中從約0.1到約1亳米。為所述生物指示劑30提供支 撐的所述載體12的第一表面14的面積相對較小，例如，面積在約1到 約80平方亳米的范圍內，在一個實施方案中從約2到約70平方毫米， 在一個實施方案中從約3到約60平方毫米，并且在一個實施方案中從約 5到約50平方亳米。這樣小面積的一個優(yōu)勢是生物指示劑30的尺寸相對 較小，因而培養(yǎng)生物指示劑所需的培養(yǎng)基的量相對較小，而且培養(yǎng)所需 時間也相對較短。
載體12包括一種多孔材料或者一種非多孔材料。所述載體包括一種 固體載體。所述載體包括任何在滅菌或者培養(yǎng)的過程中不會溶解或者損 壞的材料。載體12包括紙，金屬，玻璃，陶瓷，塑料，膜，或者上述的 兩種或多種的組合。金屬包括鋁或者鋼。塑料包括聚烯烴，聚苯乙烯， 聚碳酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，聚酰亞胺，聚酯，等等。載 體12包括膜。所述載體可以是紡毛布或者無紡毛布。載體可以包括一塊 壓縮纖維墊。所述載體可以包括由燒結玻璃，玻璃纖維，陶瓷，合成聚 合物，或上述的兩種或多種的組合制成的多孔材料。所述載體可以包括 濾紙或者吸收性紙。所述載體可以包括纖維素墊。
支撐體20包括任何在滅菌或培養(yǎng)過程中不會溶解或者分解的材料。 所述支撐體包括金屬，玻璃，陶瓷，塑料，或上述的組合。所述支撐體 包括鋁或者不銹鋼。所述支撐體包括聚苯乙烯，聚烯烴(如聚丙烯，聚 乙烯)，等等。支撐體20可以是柔性的或者剛性的。支撐體20可以是可 折疊的。附圖描述的支撐體20是矩形的，然而，可被理解的是所述支撐 體可以是任何需要的形狀或樣式，例如，正方形，圓形，橢圓形，等等。 支撐體20的長度在約0.2到約12厘米的范圍內，在一個實施方案中約 0.2到約10厘米，在一個實施方案中約0.5到約7厘米，在一個實施方案 中約1到約5厘米，并且在一個實施方案中約1.5到約3.5厘米。支撐體 20的寬度在約0.2到約2厘米的范圍內，在一個實施方案中約0.2到約1.5厘米，并且在一個實施方案中約0.25到約l厘米。支撐體20的厚度 在約0.02到約3毫米的范圍內，并且在一個實施方案中約0.1到約2毫 米。第二部分24的長度在約0.2到約12厘米的范圍內，在一個實施方案 中約0.3到約11厘米，在一個實施方案中約0.5到約IO厘米，在一個實 施方案中約l到約7厘米，并且在一個實施方案中約1.5到約4.5厘米。
支撐體20是矩形片或者條的形狀，支撐體20的第一部分22占載體 20的長度的小部分，支撐體20的第二部分24占支撐體20長度的大部分。 第二部分24和第一部分22的長度比在約2: 1到約12: l的范圍內，在 一個實施方案中從約4: l到約8: 1，并且在一個實施方案中從約5.5: 1 到約6.5: 1。
載體12通過聲波焊接，熱封，粘合劑，或層壓被翁附于支撐體20。 在將生物指示劑30涂在載體12之前或者之后將載體12黏附于支撐體 20。在將生物指示劑30涂在載體12之后使用聲波焊接或者粘合劑將載 體12黏附于支撐體20。聲波焊接涉及支撐體與載體的摩擦性粘合。粘合 劑可為任何適用于載體12和支撐體20并且在滅菌或者培養(yǎng)的過程中不 會溶解或者損壞的粘合劑。粘合劑不應對目標生物體有殺傷或者抑制作 用。粘合劑可以是壓力敏感型粘合劑。
滅菌指示器IO可以被用于任何方法，其中生物指示劑30在滅菌方 法中被暴露于滅菌介質及隨后的培養(yǎng)基以測定滅菌方法是否有效。滅菌 指示器IO可被用于任何滅菌方法，例如，使用氣體或液體滅菌劑的滅菌 方法。滅菌指示器IO和需要滅菌的物品一起在滅菌方法中被暴露于一種 滅菌介質。滅菌完成后，滅菌指示劑IO被置于含有培養(yǎng)基的瓶子。生物 指示劑30隨后被培養(yǎng)一段需要的時間，然后被檢測以測定滅菌方法是否 有效。
滅菌指示器IO可以被用于一種自含式滅菌指示器用品包，它包括一 個帶有兩個分開的隔室的容器。其中一個隔室包括一個滅菌指示器10。 另一個隔室包括一種培養(yǎng)基。使用時，所述用品包和需要滅菌的物品被 暴露于滅菌介質。滅菌后所述用品包被激活以使生物指示劑30與培養(yǎng)基 充分接觸以測定滅菌方法是否有效。這些用品包可以被用于任何滅菌方法，其中生物指示劑被暴露于滅菌介質，例如使用氣體滅菌劑的滅菌方 法。
自含式滅菌指示器用品包可以是圖3中描述的樣式。參照圖3，用品 包40包括錐形管42,內隔室44和封蓋46。封蓋46包括突出部分48。 在錐形管42的內表面和內隔室44的外表面之間形成一個環(huán)形空間43。 環(huán)形空間43形成另一個內部隔室。滅菌指示器IO被置于環(huán)形空間43內。 培養(yǎng)基包含于內隔室44中。錐形管42和封蓋46可用任何適用于滅菌方 法中使用的條件和化學品的材料制成。這些材料包括聚碳酸酯，聚烯烴 類，聚酰胺，聚曱基丙烯酸酯類，聚甲基戊烯類，聚酯類，等等。內隔 室44可以是玻璃安瓿或者脆性玻璃安瓿。更多關于錐形管42、內隔室 44和封蓋46的構造細節(jié)可見于美國專利4,304,869,該專利通過引用方 式并入本發(fā)明申請。在滅菌過程中，用品包40以及需要滅菌的物品被暴 露于滅菌介質。當滅菌結束時，封蓋46被向下壓入錐形管42。突出部分 48壓迫內隔室44并導致其破裂。這使培養(yǎng)基與生物指示劑30接觸。在 培養(yǎng)一段設定的時間后，滅菌指示器10被取出，滅菌程度通過檢測生物 指示劑30中的變化來測定。
生物指示劑30可以包括一種或多種測試生物體。或者，生物指示劑 30可以包括一種或多種酶。所述一種或多種酶書f生于和/或分離于一種或 多種測試生物體。生物指示劑30可以包括一種或多種測試生物體以及一 種或多種酶。
所述測試生物體包括任何對預期的滅菌方法的抵抗性超過被該滅菌 方法破壞的其它生物體的抵抗性的生物體。用作生物指示劑30的測試生 物體的類型取決于多種因素，例如但不限于，使用的滅菌方法的類型。 所述測試生物體可以是微生物。被使用的菌林是那些對滅菌方法抵抗性 最大的菌抹。所述測試微生物體可以包括細菌。細菌微生物體是那些形 成內生芽孢即細菌芽孢的細菌微生物。所述測試生物體包括桿菌或梭菌 屬細菌。這些包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌，萎縮芽孢桿菌(&d〃w Wrap/^RS),枯草芽孑包桿菌(5ad〃ws 5t/磁/s )，短小芽孑包桿菌(Sac/〃us1 ^pwmz7us1),;疑纟吉芽孑包斗干菌(5acz7/ws coagw/a^y )， 產孑包才麥菌(C7os^nW/w附),枯草芽孢桿菌球形變異(5ad〃"sw^7&g/o6/g"),蠟樣芽孑包4干菌(5ad〃Ms ), 環(huán)3夫芽孑包才干菌(5acz7/us cz7rw/aws), 等等。纟田
菌包括真菌，分枝桿菌，原生動物，營養(yǎng)細菌，等等。被使用的真菌的例子包括黑曲霉菌(爿5/7^^'〃Ry m'gw),白色念珠菌(OmAV/a a/6/ca朋)，須褲毛褲菌(7Wc/jo/ /y;to"膨",agrcip/y^ ), 皮炎萬吉拉菌(,"gz'e〃a^rma"^),等等。被使用的分枝桿菌的例子包括龜分枝桿菌(Afyco/ acte"'調c/ e/owae )， 戈登分枝軒菌(^Zkfyco6"cfe"'畫)，恥裙分牙支4干菌(AfycoZ actehwm 5Tweg附aw"51), 土分4支斥干菌(A^coZ acten'wm,等等。被使用的原生動物包括藍氏賈第蟲(G/fln^a/amMa)，小隱孢子蟲(Co^o^onWwm ; arvwm ),等等。被使用的營養(yǎng)細菌包括親水產氣單胞菌(/z>Y/rap/ 7a ), 糞腸球菌 (^Vzferacoccwsy^ecafo)， 糞鏈球菌(5V邵tococcusy^eca/k ), 尿腸球菌(五她racoccws力ec/twz),酉良腺鏈J求菌(5V廠e/ tococcws/^ragew^s1),大腸4干菌(五5^/zen.c/nVzco//),克雷白氏肺炎牙干菌(iT/efe/e〃a/ wewmom'"e), p者月市軍團菌(丄egz'o"e〃ajwewmop/^7a ), 甲基才干菌(Me^y/oZ acter/wm )，纟錄膿斗干菌(i^ei^/omowos1aen^7zos"a )， 豬霍亂沙門氏菌(iSa/mowe〃a c/ o/era^s^ )， 幽門蟲累旋軒菌(ii/ie//coi acteu^/on-), 金黃色葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococci^ awm^ ),表皮葡萄球菌 (S鄉(xiāng)/^/ococcus1 —^fermW51 )， 嗜麥芽窄食單胞菌(5^朋,ra/^omo"^ wa/top/n7/a ),等等。生物體例如嗜熱脂肪地芽孢桿菌，萎縮芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，產孢梭菌，等等，可以被用于測定濕熱滅菌法(高壓滅菌)的功效，其中嗜熱脂肪地芽孢桿菌特別地有效。
被用作測試生物體的微生物體如營養(yǎng)細菌，營養(yǎng)細胞和/或它們的構成組分，在一種或多種賦形劑存在下沉積時，沉積在載體12上并且可在干燥和貯藏過程中存活。賦形劑可以定義為 一大類被用于穩(wěn)定不穩(wěn)定物的通常是惰性的化合物。被使用的一類賦形劑亞類包括碳水化合物，例如，寡糖和多糖。此類化合物的一個例子是屬于一種雙糖的海藻糖。在特定生物體的組織內的高濃度的海藻糖允許該生物體在缺水狀態(tài)下存活。海藻糖被用于復蘇脫水后的功能性細胞組分。海藻糖為對細胞在極端環(huán)境條件(如冷凍干燥)下存活十分重要的細胞膜和其它大分子結構提供穩(wěn)定性。其它穩(wěn)定賦形劑化合物包括單糖(如蔗糖，葡萄糖，麥芽糖，等等)和長鏈高分子(如右旋糖酐，淀粉，瓊脂糖，纖維素，等等)。其它基于非碳水化合物的賦形劑包括基于蛋白質，膦酸酯，緩沖劑，蠟，脂類，油和其它碳氫化合物的材料。
除了基于被接受為抵抗性最大的生物體(如嗜熱脂肪地芽孢桿菌)
選出的類似的生物體，生物指示劑30還可包括非自復制因子和/或細胞的亞細胞組分或產物。這些被使用是因為它們的臨床重要性或它們作為生化恐怖因子的用途。這些生物體包括因其自然或者人為的修飾而對正常的抗生素治療或者化學消毒有抵抗性的菌抹。前者的例子包括VREs (萬古霉素抗性腸球菌)，MSRAs (曱氧西林抗性金黃色葡萄球菌)，龜分枝桿菌，等等。使用它們是因為萬古霉素抗性腸球菌和曱氧西林抗性金黃色葡萄球菌已經發(fā)展出對治療對策的抵抗性(如抗生素抗性)并且龜分枝桿菌已經發(fā)展出對一些消毒模式的抵抗性(如戊二趁抗性)。
生物指示劑30包括一種或多種還沒有類似的可替代物的新出現(xiàn)的生物體。這些對治療過程或消毒產生特別的風險或挑戰(zhàn)。此類生物體的例子包括朊病毒。朊病毒本身不是活的生物體，但它們作為致病因子的功能和它們的結構有關并且這種結構/功能關系可^L用于決定它們的相對感染性。其它非自主因子(如病毒)和亞細胞元件和蛋白質性朊病毒可以-陂用作生物指示劑30。
可通過制備包含測試生物體的水懸浮液或分散液而使用測試生物體接種載體12。水懸浮液或分散液包括例如在如約105到約101()菌落形成單位(cfii)/亳升，和在一個實施方案中約107到約109菌落形成單位/毫升的濃度范圍內的細菌芽孢。一等份的該懸浮液或分散液被置于載體12上。例如，枯草芽孢桿菌芽孢的懸浮液或分散液被制備以產生用于接種載體12的每等份期望數量的芽孢。允許芽孢在載體上干燥。氣流可以被用于千燥支撐體上的芽孢，例如將載體置于層流凈化罩以加速干燥過程。干燥載體上的芽孢的方法包括通過令它們豎立使芽孢空氣干燥，將芽孢置于一個含有干燥劑如氯化鈣的干燥器，將芽孢置于一個層流凈化罩，等等。由載體12支撐的菌落形成單位的數目在約104到約107菌落形成單 位/平方毫米支撐(cfU/mm2)的范圍內，并且在一個實施方案中約105到 約106菌落形成單位/平方毫米的范圍內。
滅菌指示器10通過將其用與需要無菌條件的物品相同的滅菌介質和 處理方式處置而使用。加熱可以被使用并且/或者氣體，液體，蒸汽，或 化學品和/或物理因子可穿過生物指示劑30所在區(qū)域，從而將生物指示劑 30暴露于與需要滅菌的物品一樣的滅菌方法或介質。滅菌后，培養(yǎng)基被 引入以接觸生物指示劑30。所述培養(yǎng)基指生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以是固 體或者液體。培養(yǎng)基可以包括一種緩沖水溶液，但本發(fā)明公開的技術的 一個優(yōu)勢是培養(yǎng)基的緩沖能力被減弱以致生物指示劑對pH變化、還原電 位、酶活性等等較敏感。任何其中生物指示劑在允許測試生物體(如果 生物指示劑還存在的話)生長的條件下被引入與培養(yǎng)基接觸的程序可被 使用。培養(yǎng)基以粉末或者片劑的形式存在于滅菌隔室內，在滅菌后，無 菌水被添加以使生物指示劑與水性培養(yǎng)基接觸。
培養(yǎng)基可包括一種或多種營養(yǎng)源。營養(yǎng)源被用于為任何幸存于滅菌 方法的測試生物體的生長提供能量。營養(yǎng)源的例子包括酪蛋白胰酶消化 物，大豆粉酶消化物，蔗糖，葡萄糖，酵母提取物，L-胱氨酸，和上述 的兩種或多種的混合物。改變顏色或者原本狀態(tài)的微生物生長指示劑， 在有活力的測試生物體存在下，與培養(yǎng)基一同使用。該生長指示劑分散 或者溶于培養(yǎng)基，并且賦予培養(yǎng)基一種初始顏色。當微生物生長時，該
生長指示劑導致培養(yǎng)基的顏色變化。可使用的生長指示劑包括pH敏感染 料指示劑(如溴百里酚藍，溴曱酚紫，酚紅等，或其組合)，氧化還原染 料指示劑(如亞甲基藍等)，酶底物，或上述的兩種或多種的混合物。酶 底物包括任何活性與存在于測試生物體中的一種或多種酶相關聯(lián)的酶底 物。被使用的酶底物包括下述的那些。這些微生物生長指示劑的使用導 致顏色的變化以響應微生物體的生長現(xiàn)象，例如pH、氧化還原電位、酶 活性的變化，以及其它生長跡象。培養(yǎng)基還可包括一種或多種pH緩沖劑， 一種或多種中和劑， 一種或多種維持滲透平衡的制劑，或上述的兩種或 多種的混合物。pH緩沖劑包括K2HP04， KH2P04, (NH4) 2HP04， 2，2-雙(羥基曱基)-2,2',r-次氮基三乙醇(BisTris)， 1，3國二[三(羥基甲基) 甲氨基]-丙烷(Bis-Tris丙烷)，4—(2-羥乙基)哌溱-乙磺酸(HEPES )， 2-氨基-2-羥甲基-l,3-丙二醇(Trizma, Tris堿)，N-[三(羥甲基)甲基]甘氨 酸(Tricine),雙甘肽(Gly-Gly), N,N-二 ( 2-羥乙基)甘氨酸(Bicine )， N- ( 2-乙酰氨基)-亞氨基二乙酸(ADA )， N- ( 2-乙酰氨基)-2-氨基乙 磺酸(aces )， 1,4-哌溱二乙磺酸(PIPES )，卩-羥基-4-嗎啉丙磺酸(MOPSO ), N，N-二 ( 2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES ), 3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS ), 2-[ (2-羥基-1，1 二[羥曱基]乙基)氨基]乙磺酸(TES), 3-[N,N-二 ( 2-羥 乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO), 4- (N-嗎啉)丁磺酸(MOBS), 2-羥基-3-[三(鞋曱基)曱氨基]-l-丙磺酸(TAPSO)， 4- (2-羥乙基)哌 溱-1_2-羥基丙磺酸水合物(HEPPSO), p底溱-l，4-二 (2-羥基丙磺酸)二 水合物(POPSO)， 4- (2-羥乙基)-l-哌溱丙磺酸(EPPS), N- (2-羥乙 基)派口秦畫N'- (4-丁磺酸)(HEPBS)， [2-羥基-l，l-二 (羥曱基)乙基)氨 基]-l-丙磺酸(TAPS)， 2-氨基-2-曱基-l,3-丙二醇(AMPD)， N-三(羥曱 基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)， N-(l，l-二曱基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥 基丙磺酸(AMPSO), 2國(環(huán)己氨基)乙磺酸(CHES)， 3-(環(huán)己氨基)國2-羥基-l-丙磺酸(CAPSO), 2-氨基-2-甲基-l-丙醇(AMP), 3-(環(huán)己氨基) -l-丙磺酸(CAPS ), 4-(環(huán)已氨基)-l-丁磺酸(CABS )， 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸水合物(MES), N- (2-乙酰氨基)國2-氨基乙磺酸(ACES),及上 述的兩種或多種的混合物。中和劑包括但不限于巰基乙酸鈉，硫代硫酸 鈉,過氧化氫酶，硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉卵磷脂，聚山梨醇酯20，聚山梨醇 酯80,碳酸氫鈣，及上述的兩種或多種的混合物。維持滲透平衡的制劑 包括鈉鹽類，鉀鹽類，鎂鹽類，錳鹽類，釣鹽類，金屬性鹽類，氯化鈉， 氯化鉀，硫酸鎂，氯化鐵，及上述的兩種或多種的混合物。培養(yǎng)基包括 一種水性組合物，該組合物包括水； 一種或多種營養(yǎng)源，從約0.01到 約100克/升水(g/1)，在一個實施方案中從約0.1到約50 g/l; —種或多 種微生物生長指示劑，從約1.0xl0-s到約10g/l,在一個實施方案中從約 1.0xl0-4到約1.0g/l; —種或多種pH緩沖劑，達約5000g/1,在一個實施 方案中從約0.001到約5000 g/l，在一個實施方案中從約0.1到約1000 g/l;一種或多種中和劑，達約100 g/l，在一個實施方案中從約0.01到約100 g/1, 在一個實施方案中從約0.1到約50 g/1; —種或多種維持滲透平衡的制劑， 達約50 g/1,在一個實施方案中從約0.1到約50 g/1,在一個實施方案中從 約0.1到約25g/1。
培養(yǎng)基具有相對較弱的緩沖能力，在約-0.001到約-0.070摩爾質子范 圍內，在一個實施方案中在約-0.01到約-0.070摩爾質子范圍內，并且在 一個實施方案中在約-0.01到約-0.014摩爾質子的范圍內。這一緩沖能力 通過配制具有所述的弱緩沖能力的培養(yǎng)基或者通過用水或其它液體稀釋 預制的具有較強緩沖能力的培養(yǎng)基而提供。在現(xiàn)有技術中，培養(yǎng)基通常 被配制成用以促進生物體的生長。這引起生物體耗費較多能量在生長和 分裂上，同時耗費較少的能量在排出新陳代謝產生的不斷積累的酸性廢 物和其它副產物上。培養(yǎng)基中的緩沖劑被用于保持該介質足夠中性或者 堿性，以使酸性副產物(質子)穿過細胞膜的運輸變得容易。本發(fā)明所 公開的滅菌指示器所使用的培養(yǎng)基關注于生長如何快速地被檢測到。通 過運用減弱的在約-0.001到約-0.010摩爾質子的范圍內的緩沖能力，在一 個實施方案中在約-0.005到約-0.007摩爾質子的范圍內，培養(yǎng)基對pH、 還原電位和/或酶活性的小幅變化4交為^:感。
培養(yǎng)基包括一種營養(yǎng)肉湯，D/E中和肉湯，戴維斯基本培養(yǎng)基，無 菌試驗肉湯，和任何基于大豆酪蛋白消化物或牛肉浸膏的培養(yǎng)基。這些 包括一種大豆酪蛋白消化物肉湯、液體巰基乙酸鹽和葡萄糖胰蛋白胨 (Difco Laboratories, Inc.)的水溶液。 一種不含葡萄糖的修飾過的胰酶大 豆肉湯基底可以被使用。如果酶活性被檢測，培養(yǎng)基包括水， 一種酶底 物，和任選pH緩沖劑。
可以被使用的培養(yǎng)基的一個例子是BactoTM胰酶大豆肉湯，其含有 酪蛋白胰酶消化物(17.0 g/1),大豆粕酶消化物(3.0 g/1),氯化鈉(5.0g/1), 磷酸氬二鉀(2.5 g/1),和葡萄糖(2.5 g/l)。這些配料被分散或者溶解于 水中。以g/l表述的濃度是指每升水配料的克數。酪蛋白胰酶消化物，大 豆粕酶消化物和葡萄糖為微生物體的生長提供能量來源。這些被稱為營 養(yǎng)源。氯化鈉被用于保持液體培養(yǎng)基的滲透平衡。磷酸氫二鉀用作pH緩沖劑。舉例而言， 一種pH敏感染料苯酚紅，被添加(18mg/l)到BactoTM 胰酶大豆肉湯的配制物。該染料被用作培養(yǎng)基中由微生物體生長導致的 pH變化的指示劑。
被使用的培養(yǎng)基的另一個例子是BBl7M液體巰基乙酸鹽培養(yǎng)基。該 培養(yǎng)基含有酪蛋白胰酶消化物(15.0 g/1),酵母提取物(5.0 g/1),葡萄糖 (5.5 g/1 )，氯化鈉(2.5 g/1), L-胱氨酸(0.5 g/1),巰基乙酸鈉(0.5 g/1), 和刃天青(1.0mg/1)。這些配料被分散或者溶解于水中。酪蛋白胰酶消化 物，酵母提取物，葡萄糖和L-胱氨酸是為微生物體生長提供能量的營養(yǎng) 源。氯化鈉被用于保持液體培養(yǎng)基的滲透平衡。巰基乙酸鈉用作中和劑。 刃天青被用作氧化還原染料指示劑。為本領域技術人員所知的其它營養(yǎng) 源、滲透介質和普通配料可替代所列配料。
本發(fā)明公開的技術的一個優(yōu)勢是生物指示劑30的尺寸相對較小，因 而用于培養(yǎng)在載體12上的任何存活的測試生物體所需要的培養(yǎng)基的體積 相對較小。這導致培養(yǎng)期相對較短。因此，在一個實施方案中，生物指 示劑30由一個相對較小的載體12支撐，載體12的表面積在約1到約 80平方毫米的范圍內，在一個實施方案中在約5到約50平方毫米的范圍 內。在滅菌前，載體12支撐的芽孢的數目在約104到約107菌落形成單 位/平方毫米(cfU/mm"的范圍內，在一個實施方案中在約105到約106菌 落形成單位/平方亳米的范圍內。在滅菌后培養(yǎng)生物指示劑30所需要的培 養(yǎng)基的體積在約0.1到約5毫升的范圍內，在一個實施方案中在約0.1到 約4毫升的范圍內，在一個實施方案中在約0.1到約3毫升的范圍內，在 一個實施方案中在約0.1到約2毫升的范圍內，在一個實施方案中在約 0.1到約1.5毫升的范圍內，和在一個實施方案中在約0.3到約1亳升的范 圍內。滅菌后培養(yǎng)生物指示劑30所需的時間在約0.1到約48小時內，在 一個實施方案中在約0.1到約36小時內，在一個實施方案中在約0.1到 約24小時內，在一個實施方案中在約0.1到約18小時內，在一個實施方 案中在約0.1到約15小時內，在一個實施方案中在約0.1到約12小時內， 在一個實施方案中在約0.1到約10小時內，在一個實施方案中在約0.1 到約8小時內，在一個實施方案中在約0.1到約6小時內，在一個實施方案中在約0.1到約5小時內，和在一個實施方案中在約0.1到約4小時內。
被用作生物指示劑30的酶包括任何酶，包括胞外酶或胞內酶，其活 性與至少 一種測試生物體的活力相關聯(lián)。"相關聯(lián)"的意思是相對于背景 的酶活性;陂用來預測一種測試生物體未來的生長。在經歷了一個對于測 試生物體是亞致死的滅菌循環(huán)之后，該酶保留有足夠的活性與酶底物在 需要的時間內反應，例如約4到約164小時內，和在一個實施方案中約4 到約84小時內，但經歷了 一種對測試生物體是致死的滅菌方法后卻是無 活性的或者活性明顯降低。
隨后的測試用于鑒定那些具有必需特征^:用作生物指示劑30的酶。 該酶在被置于剛好足以使約口106的測試生物體的數目減少約6個級數 (即，到數目約為0,在沒有測試生物體生長時測得)的滅菌條件時，有 與通過與酶底物反應測得的"背景"相當的殘余酶活性；然而，該酶在 被置于僅足以使約lxl(f的測試生物體的數目減少至少約1個級數但少于 約6個級數的滅菌情況時，有比通過與酶底物反應測得的"背景，，更大 的酶活性。酶底物是一種物質或者多種物質的混合物，當其與酶作用時 產生可檢測的酶修飾產物，如發(fā)熒光或者有顏色的酶修飾產物。酶活性 可通過產生的可檢測的酶纟f飾產物的數量纟皮測量。所述酶是這樣一種酶 即，在其經歷不足以降低測試生物體數目約6個級數的滅菌條件后，在 約0.1到約48小時的時間內，在一個實施方案中在約0.1到約12小時的 范圍內，和在一個實施方案中在約0.1到約4小時的范圍內具有足夠活性 與酶底物反應而產生可檢測的數量的酶修飾產物。
在不足以降低微生物體數目約6個級數的滅菌條件后，生物指示劑 30的活性至少比背景高約2個百分點，在一個實施方案中至少比背景高 約5個百分點，并且在一個實施方案中至少比背景高約IO個百分點。被 定義為"背景"的殘余酶活性水平高于在酶被滅活后通過酶底物到產物的 自發(fā)轉化實現(xiàn)的酶活性水平。
被用于生物指示劑30的酶包括但不限于來自形成芽孢的微生物體的 水解酶。這些酶包括從形成芽孢的微生物體如念珠菌、桿菌或梭菌微生 物衍生而來的(3-D-葡萄糖苷酶，a-D-葡萄糖苦酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，丁酸酯酶，辛酸酯酶脂肪酶，肉豆蔻酸脂肪酶，亮氨酸氨基肽酶，
纈氨酸氨基肽酶，糜蛋白酶，焦磷酸酶，a-D-半乳糖苷酶，(3-D-半乳糖苷 酶，a-L-吹喃阿拉伯糖苷酶，N-乙?；?(3-氨基葡萄糖苷酶，P-D-纖維二 糖苷酶，丙氨酸氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶，苯丙氨 酸氨基肽酶，P-D-葡萄糖苷酸酶，和脂肪酸酯酶。
來自祐:使用的嗜熱脂肪地芽孢桿菌的酶包括a-D-葡萄糖苷酶，(3-D-葡萄糖苷酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，丁酸酯酶，辛酸酯酶脂肪酶， 亮氨酸氨肽基酶，糜蛋白酶，焦磷酸酶，a-D-半乳糖苷酶，P-D-半乳糖苷 酶，丙氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶，苯丙氨酸氨基肽酶，和脂肪酸 酯酶。來自被使用的枯草芽孢桿菌的酶包括a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶，(3-D-葡萄糖苷酶，N-乙酰基-(3-氨基葡萄糖苷酶，(3-D-纖維二糖苷酶，丙氨酸 氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶，亮氨酸氨肽基酶和苯丙 氨酸氨基肽酶。
來自枯草芽孢桿菌的p-D-葡萄糖苷酶和a-L-吹喃阿拉伯糖苷酶被用 于環(huán)氧乙烷滅菌的監(jiān)測。來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的a-D-葡萄糖香酶被 用于監(jiān)測蒸汽滅菌情況。
酶底物是在被酶作用時被轉化為一種酶修飾產物的一種物質或者多 種物質的混合物。通常，酶修飾產物是一種發(fā)光的、發(fā)熒光的、有顏色 的或者輻射性材料。然而，酶底物包括一種或多種化合物，它在與酶作 用時生成一種與另外的一種化合物或者組合物反應生成一種發(fā)光的、熒 光的、有顏色的或者輻射性材料的產物。當酶底物在滅菌過程中被包括 在生物指示劑30中時，酶底物不應該在滅菌或者培養(yǎng)過程中自發(fā)地分解 或者轉化為一種可檢測的產物。例如，在用于監(jiān)測蒸汽滅菌和干熱滅菌 的滅菌指示器內，酶底物應該在約20。C到約180。C間是穩(wěn)定的。酶底物 被包括在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中時，它應該在培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的，如不會在培 養(yǎng)基內自發(fā)熒光。
被用于檢測特定酶的酶底物有兩種基本類型。第一種酶底物是發(fā)熒 光的或者生色的，并且給予了化學式例如AB。當與酶作用時，AB分解 為A+B。例如，B是發(fā)熒光或者有顏色的。此類熒光底物的一個具體例子是4-曱基傘花基磷酸酯。在磷酸酶存在下，該底物被分裂成4-甲基傘 形酮和磷酸。其它此類熒光底物包括4-曱基傘花基、試卣靈(resorufm) 和熒光素衍的生物。此類生色底物的一個例子是5-溴-4-氯-3-P引咮磷酸。 在磷酸酶的存在下，該底物被分解成龍藍和磷酸。其它此類生色底物包 括吲哚酚、硝基苯酚和酚酞的衍生物，其中生色p引哚酚底物被分解，并 且AB后續(xù)的化學反應產生一種比色響應。當AB隨后與適合的酶作用時， AB分解成A+B。然后當BB發(fā)生時生成顏色。
第二類酶底物以例如化學式CD給出，其被一種特定的酶轉化為 C+D。然而，C和D均不是發(fā)熒光的或者有顏色的。但是D可以進一步 與化合物Z反應產生發(fā)熒光或者有顏色的化合物，因而指示酶活性。此 類的一個具體的熒光的例子是賴氨酸。在賴氨酸脫羧酶的存在下，賴氨 酸失去一個二氧化碳分子。賴氨酸剩余的部分然后被稱為尸胺，為一種 強堿性。 一種堿性指示劑例如4-曱基傘形酮被摻入并且在強堿的存在下 發(fā)熒光。 一種此類的生色底物是2-萘磷酸酯。磷酸酶與該酶底物反應生 成p-萘酚。釋放的(3-萘酚與一種含有l(wèi)-重氮-4-苯曱酰氨-2，5-二乙氧基苯 的生色劑反應生成一種紫羅蘭色。
酶底物可以是發(fā)熒光的化合物，此處定義為一種能夠被酶促修飾如 水解以提供 一 種適當修飾過的或者有增強的熒光的衍生熒光團的化合 物。
熒光化合物自身是非熒光的或者meta-熒光(meta-fluorescent )的(即， 與相應的酶修飾過的產物明顯不同形式(如色彩或強度上)的熒光)，并 且適當的激發(fā)和檢測波長被用于分離酶修飾產生的熒光信號與任何存在 的其它熒光。
許多針對自然存在的或者合成的不同來源的酶的酶底物可以被使 用。這些包括發(fā)熒光的4-曱基傘花基衍生物(可水解為4-甲基傘形酮)； 7-酰氨基-4-曱基香豆素的衍生物；二乙酰熒光素衍生物；和熒光胺。
被用作酶底物的4-曱基傘花基的衍生物包括4-甲基傘花基-2-乙酰 氨基-4，6-0-亞千基-2-脫氧-!3-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基傘花基乙酸酯；4-甲 基傘花基-N-乙?；?(3-D-氨基半乳糖苷；4-曱基傘花基-N-乙?；?a-D-氨基葡萄糖苷；4-曱基傘花基-N-乙?；?(3-D-氨基葡萄糖苷；2，-(4-曱基傘 花基)-a-D-N-乙酰神經氨酸；4-曱基傘花基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-曱 基傘花基-a-L-阿拉伯糖苷；4-甲基傘花基丁酸酯；4-甲基傘花基-(3-D-纖 維二糖苷；甲基傘花基-P-D-N，N，-雙乙酰殼二糖苷；4-甲基傘花基反油酸 酯；4-曱基傘花基-(3-D-巖藻糖苷；4-曱基傘花基-a-L-巖藻糖苷；4-曱基傘 花基-(3-L-巖藻糖苷；4-甲基傘花基-a-D-半乳糖苷；4-甲基傘花基-(3-D-半 乳糖苷；4-曱基傘花基-a-D-葡萄糖苷；4-曱基傘花基-p-D-葡萄糖苷；4-甲基傘花基-P-D-葡萄糖苷酸；4-曱基傘花基對胍基苯曱酸酯；4-甲基傘 花基庚酸酯；4-曱基傘花基-a-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基傘花基-(3-D-吡喃 甘露糖苷；4-甲基傘花基油酸酯；4-甲基傘花基棕櫚酸酯；4-甲基傘花基 磷酸酯；4-曱基傘花基丙酸酯；4-甲基傘花基硬脂酸酯；4-甲基傘花基硫 酸酯；4-曱基傘花基-(3-D-N,N，，N"-三乙?；鶜と擒?；4，-曱基傘花基 -2,3，5-三+苯甲?；?a-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-曱基傘花基-(3-三甲基肉桂 酉吏酉旨氣4妄 (4國methylumbelliferyl-beta-trimethylammonium cinnamate chloride);和4-曱基傘花基-(3-D-木糖香。
被用作酶底物的7-酰氨基-4-曱基香豆素的衍生物包括L-丙氨酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素；L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-酰氛基_4-曱基香豆素；L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-苯丙氨酸-7-酰氛基_4-曱基香豆素；和7-戊二酰-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
被用作酶底物的7-酰氨基-4-甲基香豆素的肽衍生物包括N-t-BOC-異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；N-t-BOC-亮氨 酸-絲氨酸-蘇氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-苯丙氨酸-精 氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-甲基 香豆素；N-t-BOC-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；和N-戊二酰-甘氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素。
被用作酶底物的二乙酰熒光素衍生物包括二乙酸熒光素，雙((3-D-吡喃半乳糖苷)熒光素，和雙月桂酸熒光素。
在活性可被檢測的酶是a-D-葡萄糖苷酶、糜蛋白酶或者脂肪酸酯酶 的情況，如來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌，被使用的熒光酶底物分別是4-甲基傘花基-a-D-葡萄糖苷，7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素，或
4- 曱基傘花基庚酸酯。在活性可被檢測的酶是a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶的 情況，如衍生自枯草芽孢桿菌，被使用的熒光酶底物是4-曱基傘花基-01丄-呋喃阿拉伯糖苷。在活性可被檢測的酶是P-D-葡萄fe苷酶的情況，如衍 生自枯草芽孢桿菌，被使用的熒光酶底物是4-曱基傘花基-p-D-葡萄糖苷。
被使用的酶底物可以是一種能夠被酶促修飾產生衍生生色團的生色 化合物，或一種與另一種類似或者不同的化合物反應產生衍生生色團的 產品，所述生色團具有一種不同的或者更強的顏色。該生色化合物是無 色的或者有與相應的酶修飾產物相比明顯不同形式(如在色彩或者強度 上)的顏色。這些變化是肉眼可辨認的或者需要使用顏色檢測儀器。適 當的激發(fā)和檢測波長，以比色計使用者熟知的方式，被用于分離酶修飾 產生的顏色信號與存在的任何其他顏色。
被用作酶底物的生色化合物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基衍生物；硝基苯 基衍生物；巧l哚酚衍生物；酚狀衍生物。
被使用的5-溴-4-氯-3-吲咮基衍生物包括5-溴-6-氯-3-吲哚基乙酸 酯，5-溴-4-氯-3-P引哚乙酸酯，5-溴-4-氯-3-P引哚酚-(3-D-吡喃半乳糖苷，
5- 溴-4-氯-3-。引哚基-l,3-二乙酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-D-p比喃巖藻糖 苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-p-D-吡喃葡萄糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-!3-D-葡糖 醛酸，5-溴-4-氯-3-。引哚基磷酸酯，和5-溴-4-氯-3-吲哚基硫酸酯。
被使用的硝基苯基衍生物包括對硝基苯酚和鄰硝基苯酚衍生物。這 些包括二乙基對硝基苯基磷酸酯；雙(對硝基苯基)磷酸酯；對硝基苯基 -2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0-P-吡喃半乳糖基-(3-p比喃葡萄糖苷；對硝基苯基 -2-乙酰氨基-2-脫氧-(3-吡喃葡萄糖苷；對硝基苯基乙酸酯；對硝基苯基-N-乙?；?P-D-氨基葡糖苷；對硝基苯基-P-D-N，N'-二乙?；鶜ざ擒?；對硝 基苯基-a-吡喃葡萄糖苷；對硝基苯基-a-麥芽糖苷；對硝基苯基-(3-麥芽糖 苷；對硝基苯基-a-吡喃甘露糖苷；對硝基苯基-p-吡喃甘露糖苷；對硝基 苯基肉豆蔻酸酯；對硝基苯基棕櫚酸酯；對硝基苯基磷酸酯；雙(對硝基 苯基)磷酸酯；三(對硝基苯基)磷酸酯；對硝基苯基-(3-吡喃葡萄糖苷；對 硝基苯基-P-葡萄糖苷酸；a-對硝基苯基甘油；對硝基苯基-a-鼠李糖苷；對硝基苯基硬脂酸酯；對硝基苯基硫酸酯；對硝基苯基-2,3，4,6-四-0-乙酰 基-P-氨基葡萄糖苷；對硝基苯基胸苷單磷酸酯；對硝基苯基-2,3,4-三-0-乙酰基-(3-葡萄糖醛酸甲酯；和對硝基苯基戊酸酯。
有用的鄰硝基苯酚包括鄰硝基苯基乙酸酯，鄰硝基苯基-(3-葡萄糖 苦，和鄰硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷。其它有用的硝基苯基衍生物包括 硝基苯基-(3-吡喃巖藻糖苷；硝基苯基-a-吡喃半乳糖苷；硝基苯基-(3-吡喃 半乳糖苦；硝基苯基丁酸酯；硝基苯基癸酸酯；硝基苯基己酸酯；硝基 苯基辛酸酯；硝基苯基月桂酸酯；和硝基苯基丙酸酯。
被使用的。引哚酚衍生物包括p引哚酚乙酸酯；吲哚酚-P-D-葡萄糖苷； 3-卩引咮酚硫酸酯；和3-p引咮酚磷酸酯。
尋皮使用的酚酞書f生物包括酚酞二丁酸酯；酚酞二磷酸酯；酚酞二 硫酸酯；酚酞葡萄糖醛酸；酚酞單-(3-葡萄糖苷酸；酚酞單-(3-葡萄糖醛酸； 和酚酞單磷酸酯。
上述生色酶底物直接與 一種適合的酶反應產生一個生色團。
如果衍生的酶修飾產物進一步與生色劑反應產生生色團，可使用另 外的含有l(wèi)-萘基、2-萘基和萘基-AS-BI衍生物的酶底物，所述生色劑例 如重氮染料，如l-重氮-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯，l-重氮-4-苯甲酰 氨基-2,5-二乙氧基苯，對-重氮-2,5-二乙氧基-N-苯甲酰丙氨酸 (p-diazo-2,5-diethoxy-N-benzoyalanine), 4-氯-2-甲苯重氮氯，和鄰氨基偶 氮曱苯重氮鹽。
被使用的1-萘基的衍生物包括l-萘基-N-乙?；?P-D-氨基葡萄糖苷。 被使用的2-萘基的衍生物包括2-萘磷酸酯；2-萘丁酸酯；2-萘辛酸酯； 2-萘肉豆蔻酸酯；L-亮氨酰-2-萘酰胺；L-纈氨酰-2-萘酰胺；L-胱氨酰-2-萘酰胺；N-苯甲酰-DL-精氨酸-2-萘酰胺；N-戊二酰-苯丙氨酸2-萘胺； 2-萘磷酸酯；6-溴-2-萘基-a-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-P-D-吡喃半乳糖苷； 2-萘基-2-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘酚-(3-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘基 -2-D-吡喃甘露糖苷；和2-萘基-a-L-吡喃巖藻糖苷。
被使用的萘基-AS-BI衍生物包括萘基-AS-BI-磷酸酯；和萘基 -AS-BI-(3-D-葡萄糖苷酸。在活性可以被;險測的酶是a-D-葡萄糖苷酶的情況，如來自嗜熱脂肪 地芽孢桿菌，酶底物是對硝基苯基-a-吡喃葡萄糖苷。在活性可以被;險測 的酶是a-L-呔喃阿拉伯糖苷酶的情況，如衍生自枯草芽孢桿菌，被使用 的酶底物是對硝基苯基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷。在活性可以被^r測的酶是 J3-D-葡萄糖苷酶的情況，如衍生自枯草芽孢桿菌，被使用的酶底物是對 硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷。在活性可以被檢測的酶是p-半乳糖苷酶的 情況，酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-j3-D-吡喃半乳糖苷。在活性可以被檢測 的酶是(3-半乳糖苷酶的情況，酶底物是4-甲基傘形酮-P-D-吡喃半乳糖苷。
被使用的酶底物取決于活性在研究中的酶的特性。下面是許多酶底 物和與該底物反應生成具有可觀察到的修飾或者增強的熒光或顏色的產
物的相應的酶的列表。
酶底物酶
4-甲基傘花基乙酸酯酯酶
4-甲基傘花基丁酸酯酯酶
4-甲基傘花基反油酸酯脂肪酶
4-甲基傘花基-(3-D-吡喃半乳糖苷p-D-半乳糖苷酶
4-甲基傘花基-a-D-吡喃半乳糖苷a-D-半乳糖苷酶
4-曱基傘花基-a-D-吡喃葡萄糖苷a-D-葡萄糖苷酶
4-曱基傘花基+D-吡喃葡萄糖苷P-D-葡萄糖苷酶
4-甲基傘花基庚酸酯酯酶
4-曱基傘花基油酸酯脂肪酶
4-曱基傘花基磷酸酯酸性或;威性磷酸酶
4-曱基傘花基丙酸酯酯酶
4-曱基傘花基-P-D-半乳糖苷(3-D-半乳糖香酶
4-甲基傘花基-(3-D-葡萄糖苷(3-D-葡萄糖苷酶
4-曱基傘花基-a-D-葡萄糖苷a-D-葡萄糖苷酶
4-甲基傘花基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷a-L-呋喃阿拉伯糖普酶
L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素亮氨酸氨基肽酶7-戊二酰-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素糜蛋白酶
D-蜜二糖a-D-半乳糖苷酶
對硝基苯基磷酸酯堿性或酸性磷酸酶
對硝基苯基乙酸酯脂肪酶
鄰硝基苯基-(3-D-吡喃半乳糖苷(3-D-半乳糖苷酶
對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷a-D-半乳糖苷酶
鄰硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷P-D-葡萄糖苷酶
對硝基苯基-a-D-p比喃葡萄糖苷a-D-葡萄糖苷酶
對硝基苯基-P-D-葡萄糖苷酸P-D-葡萄糖苷酸酶
對硝基苯基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶
對硝基苯基月桂酸酯酯酶
對硝基苯基肉豆蔻酸酯酯酶
對硝基苯基棕櫚酸酯酯酶
對硝基苯基磷酸二鈉鹽堿性磷酸酶
酚酞二丁酸酯酯酶
酚酞二磷酸酯酸性或》咸性磷酸酶
酚酞二磷酸戊鈉鹽酸性或堿性磷酸酶
酚酞-(3-D-葡萄糖苷酸鈉鹽P-D-葡萄糖香酸酶
酚酞-(3-D-葡萄糖苷酸P-D-葡萄糖苷酸酶
鹽酸L-苯丙氨酸乙酯糜蛋白酶
苯基-卩-D-吡喃半乳糖苦p-D-半乳糖苷酶
苯基-P-D-葡萄糖苷酸P-D-葡萄糖苷酸酶
苯基-P-D-吡喃葡萄糖苷p-D-葡萄糖苷酶
苯基-(3-D-葡萄糖苷酸卩-D-葡萄糖苷酸酶
苯基-a-D-葡萄糖苷a-D-葡萄糖苷酶
(3-甘油磷酸鈉酸性或堿性磷酸酶
1_萘磷酸鈉酸性或》咸性磷g吏酶
2-萘磷酸鈉酸性或堿性磷酸酶
2—萘丁酸酯酯酶(3-萘乙酸酯脂肪酶
6-溴-2-萘-卩-D-葡萄糖苷(3-D-葡萄糖苷酶
L-亮氨酰-2-萘酰胺氨基肽酶亮氨酸
L-纈氨酰-2-萘酰胺氨基肽酶纈氨酸
N-戊二酰-苯丙氨酸-2-萘胺糜蛋白酶
萘基-AS-BI-磷酸酯焦磷酸酶
巧卜呆酚乙酸酯脂肪酶
N-曱基吲哚酚乙酸酯脂肪酶
N-甲基吲咮酚肉豆蔻酸酯脂肪酶
5-溴。引咮酚乙酸酯脂肪酶
3-巧l哚酚磷酸酯酸性或》威性磷酸酶
巧l咮酚-(3-D-葡萄糖苦卩-D-葡萄糖苷酶
5-溴-4-氯-3-。引哚乙酸酯脂肪酶
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯酸性或堿性磷酸酶
5-溴-4-氯-3-吲哚-(3-D-葡萄糖醛酸(3-D-葡萄糖苷酸酶
二乙酰基熒光素脂肪酶/酯酶
滅菌方法完成后，上面帶有任何經歷滅菌方法而存活的酶的載體12 接觸或被置于水性介質或者水性溶液中或者帶有適當的酶底物的半固體 或固體上。水性介質或水性溶液已被緩沖。本發(fā)明公開的技術的一個優(yōu) 勢是置于載體12上的酶的數量相對較小，因而用于檢測任何經歷滅菌而 存活的酶所需的酶底物的量相對較小。這導致檢測期相對較短。載體12 的表面積在約1到約80平方亳米( mm )的范圍內,并且在^個實施方 案中在約5到約50平方毫米(mm2)的范圍內。滅菌前，載體12支撐的 酶的單位在約10々到約1(f單位/平方毫米(units/mn。的范圍內,并且在一 個實施方案中在約104到約103單位/平方毫米的范圍內。酶與其適當的 酶底物在水性介質或水性溶液中相接觸。 一種等滲緩沖液，如磷酸緩沖 鹽溶液，三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸溶液，或乙酸鹽緩沖液可以被使用。 這些等滲緩沖液與大多數發(fā)熒光或者生色的酶底物相兼容。選擇緩沖劑的另一個考慮是其對酶活性的影響。例如，磷酸緩沖鹽水含有高濃度的 無機磷酸鹽，其是堿性磷酸酶的強竟爭性抑制劑。對于該酶，三(羥曱基) 氨基曱烷-鹽酸緩沖劑被使用。
緩沖的水性溶液中酶底物的濃度取決于酶底物和酶的特性，所產生 的必須可被肉眼或者儀器檢測的酶修飾產物的數量，和決定是否有活性 酶存在于反應混合物中所需的時間。充足的酶底物的數量是與在滅菌完
成后存在的任何活性酶反應在達約4小時或者更少的時間內產生以摩爾 濃度計的至少約lxl(y8摩爾(molar)的酶修飾產物所需的數量。在酶底 物是4-曱基傘花基衍生物時，其在緩沖水溶液中的濃度在約1 x 1 (T5到約 1 x l (T3摩爾(molar)的范圍內。
含有酶底物的緩沖的水溶液的pH可以^皮調整到pH在約5到約9.5 的范圍內，并且在一個實施方案中約7.5,以避免一些堿性熒光底物的自 發(fā)熒光。
水性緩沖溶液中的酶底物被與活性在被置于滅菌循環(huán)后檢測的酶一 起培養(yǎng)。假設任何酶仍有活性，培養(yǎng)在足以釋放可檢測量的酶修飾產物 的條件下持續(xù)一段時間。通常，可檢出的產物的量低至約lxl0-s摩爾 (molar)。培養(yǎng)條件應該足以產生至少約lxl(^摩爾(molar)的酶修飾產 物，并且在一個實施方案中是約1><10-6到約lxl0-s摩爾(molar)的酶修 飾產物。產生可檢測量的酶修飾產物所需的培養(yǎng)時間和溫度耳又決于酶和 酶底物的特性，以及其各自在緩沖水溶液中的濃度。通常，要求的培養(yǎng) 時間達約48小時，并且在一個實施方案中達約36小時，并且培養(yǎng)溫度 在約2(TC到約7(TC的范圍內。培養(yǎng)時間在約0.1到約48小時的范圍內， 在一個實施方案中在約0.1到約36小時的范圍內，在一個實施方案中在 約0.1到約24小時的范圍內，在一個實施方案中在約0.1到約12小時的 范圍內，在一個實施方案中在約0.1到約6小時的范圍內，在一個實施方 案中在約0.1到約4小時的范圍內，并且在一個實施方案中在約0.1到約 3小時的范圍內。在枯草芽孢桿菌或嗜熱脂肪地芽孢桿菌是酶的來源的情 況，培養(yǎng)時間在約0.1到約3小時的范圍內，并且培養(yǎng)溫度分別地在約 30°C到約40°C的范圍內，和約50°C到約65°C的范圍內。被使用的通常適用于檢測酶修飾產物的方法包括光度測定，電位測 定，重量測定，熱量測定，電導測定或電流測定才支術。在一個實施方案
中，熒光光度或分光光度法被使用。例如，特定的酶底物包括4-曱基傘 花基衍生物，其與酶相互作用產生可被焚光光度監(jiān)測的傘形酮，或者所 述底物包括硝基苯酚，或者類似類型的衍生物，其與酶相互作用產生可 被比色法監(jiān)測的產物。
生物指示劑30，雖然其最初被以一種酶和/或測試生物體描述，包括 許多種酶和/或測試生物體或其組合。例如，生物指示劑30包括4種類型 的酶(其衍生自三種類型的微生物體)， 一種酶耐熱，第二種酶耐氣態(tài)滅 菌介質，第三種耐輻射，如Y或P射線，以及第四種耐液態(tài)介質，如過 氧乙酸，穩(wěn)定的過氧化氫，氯胺，季胺，苯酚，臭氧水，或戊二醛等。 類似地，生物指示劑30包括三種測試生物體，第一種耐熱，第二種耐氣 態(tài)滅菌介質，第三種耐輻射，第四種耐液態(tài)介質。
實施例
實施例1
一張Ahlstrom238紙( 一種由AWstrom提供的紙)被切成六個圓形 的支撐盤，每個直徑6毫米(表面積28.3平方毫米)。其中三個圓盤的一 面被接種7微升有多于108菌落形成單位/毫升的嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽 孢懸浮液。三個圓盤沒有被接種。每個圓盤被聲波焊接到一個尺寸為25 毫米x6毫米x0.25毫米的聚苯乙烯支撐帶上。對于每個圓盤， 一個焊接 角與載體帶的一面接觸，而圓盤與載體帶的另一面接觸。對于已接種的
圓盤，不含芽孢的圓盤面與支撐帶接觸。超聲后，三個未接種圓盤被以 上述同樣的方式接種。圖4顯示這些測試的結果。這些測試-驗證了不存 在由聲波焊接導致的明顯的微生物體丟失。
實施例2
實施例1中描述的滅菌指示器樣品被接種106菌落形成單位/毫升的嗜熱脂肪地芽孢桿菌并暴露于具有不同體積和緩沖能力的培養(yǎng)基樣品。
將pH變化作為微生物體生長的函數來監(jiān)測這些樣品。培養(yǎng)基樣品如下 樣品A:有完全緩沖能力的1.0毫升含有苯酚紅的胰酶大豆肉湯 (TSB )。
樣品B:有50%完全緩沖能力的0.5毫升含有苯酚紅的TSB和0.5 毫升無菌去離子(DI)水。
樣品C:有80%完全緩沖能力的0.4毫升含有苯酚紅的TSB和0.1 毫升的無菌去離子(DI)水。
樣品D:有60%完全緩沖能力的0.3亳升含有苯酚紅的TSB和0.2 毫升的無菌去離子(DI)水。
樣品E:有40%完全緩沖能力的0.2毫升含有苯酚紅的TSB和0.3 毫升的無菌去離子(DI)水。
試驗結果顯示在圖5中。這些結果表明較小的培養(yǎng)基體積和減弱的 緩沖能力比較大的培養(yǎng)基體積顯示出較快的微生物生長。
雖然本發(fā)明公開的技術已經根據具體的實施例加以解釋，可被理解
的。因此，應理解本文公開的發(fā)明意于涵蓋落在附加的權利要求的范圍 內的所述》f改。
權利要求
1.一種滅菌指示器，其包括一種載體，它有一個第一表面和一個第二表面；一種支撐體，它有一個第一部分和一個第二部分，所述載體覆在它的第一部分上，所述載體的第二表面被黏附到它的第一部分；和一種生物指示劑，它由所述載體支撐，所述支撐體的第二部分有足夠的尺寸以允許在不接觸所述生物指示劑的情況下處理所述滅菌指示器。
2. 按照權利要求1所述的滅菌指示器，其中，所述載體的第一表面 有在約1到約80平方毫米范圍內的表面積。
3. 按照權利要求1或2所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括多 孔材料或非多孔材料。
4. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括 紙，金屬，玻璃，陶瓷，塑料，膜，或上述的兩種或多種的組合。
5. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括 壓縮纖維。
6. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括 由燒結玻璃，玻璃纖維，陶瓷，合成高聚物，或上述的兩種或多種組合 制成的多孔材料。
7. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括紙。
8. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括 纖維素墊。
9. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體是形 狀為圓形，正方形，矩形，橢圓形或者棱形截面的基質。
10. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述支撐體由 包括金屬，玻璃，陶資，塑料，或上述的兩種或多種的組合的材料制成。
11. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述支撐體由塑料制成。
12. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述支撐體由 聚苯乙烯制成。
13. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述支撐體是 有長度的矩形條，所述支撐體的第一部分占其長度的小部分，所述支撐 體的第二部分占其長度的大部分。
14. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體使用聲波焊接，粘合劑，熱封或層壓被私附在所述支撐體。
15. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示劑包括一種或多種測試生物體， 一種或多種酶，或其混合物。
16. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括細菌。
17. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括細菌芽孢。
18. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括桿菌或梭菌屬細菌。
19. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中所述生物指示劑 包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌，萎縮芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿 菌，凝結芽孢桿菌，產孢梭菌，枯草芽孢桿菌球形變異，蠟樣芽孢桿菌， 環(huán)狀芽孢桿菌，或上述的兩種或多種的混合物。
20. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括真菌，分枝桿菌，原生動物，營養(yǎng)細菌，或上述的兩種或多種的 混合物。
21. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括黑曲霉菌，白色念珠菌，須癬毛癬菌，皮炎萬吉拉菌(『a"gzW/G ^rm加'&),龜分枝桿菌，戈登分枝桿菌，恥垢分枝桿菌，土分枝桿菌， 藍氏賈第蟲，小隱孢子蟲，親水產氣單胞菌，糞腸球菌，糞鏈球菌，屎 腸球菌，釀膿鏈球菌，大腸桿菌，克雷白氏肺炎桿菌，嗜肺軍團菌，甲 基桿菌，綠膿桿菌，豬霍亂沙門氏菌，幽門螺旋桿菌，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，嗜麥芽窄食單胞菌，或上述的兩種或多種的混合物。
22. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌。
23. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括營養(yǎng)細菌，營養(yǎng)細胞，和/或它們的構成組分。
24. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括一種或多種微生物體并進一步包括一種或多種賦形劑。
25. 按照權利要求24所述的滅菌指示器，其中，所述賦形劑包括一 種或多種碳水化合物。
26. 按照權利要求24或25所述的滅菌指示器，其中，所述賦形劑包 括海藻糖。
27. 按照權利要求24-26中任一權利要求所述的滅菌指示器，其中， 所述賦形劑包括蔗糖，葡萄糖，麥芽糖，右旋糖酐，淀粉，瓊脂糖，纖 維素，蛋白質，膦酸酯，緩沖劑，蠟，脂類，油，或上述的兩種或多種 的混合物。
28. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括萬古霉素抗性腸球菌，甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌，龜分枝桿 菌，或上述的兩種或多種的混合物。
29. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括一種或多種朊病毒。
30. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體支撐 的芽孢的濃度在約104到約107菌落形成單位/平方毫米載體的范圍內。
31. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括一種或多種酶。
32. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括(3-D-葡萄糖苷酶，a-D-葡萄糖香酶，堿性磷酸酶，酸性磷酸酶， 丁酸酯酶，辛酸酯酶脂肪酶，肉豆蔻酸脂肪酶，亮氨酸氨基肽酶，纈氨 酸氨基肽酶，糜蛋白酶，焦磷酸酶，a-D-半乳糖苷酶，(3-D-半乳糖苷酶， a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶，N-乙酰基-p-氨基葡萄糖苷酶，P-D-纖維二糖香酶，丙氨酸氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶，苯丙氨酸氨基肽酶，(3-D-葡萄糖苷酸酶，脂肪酸酯酶，或上述的兩種或多種的混合物。
33. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述生物指示 劑包括a-D-葡萄糖苷酶，P-D-半乳糖苷酶，a-D-葡萄糖苷酶，卩-D-葡萄糖 苷酶，；咸性磷酸酶，酸性磷酸酶，丁酸酯酶，辛酸酯酶脂肪酶，亮氨酸 氨基肽酶，糜蛋白酶，焦磷酸酶，a-D-半乳糖苷酶，(3-D-半乳糖香酶，丙 氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶，苯丙氨酸氨基肽酶，脂肪酸酯酶，a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶，P-D-葡萄糖苷酶，N-乙?；?(3-氨基葡萄糖苷酶，P-D-纖維二糖苷酶，丙氨酸氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶，酪氨酸氨基肽酶， 亮氨酸氨基肽酶，苯丙氨酸氨基肽酶，或上述的兩種或多種的混合物。
34. 按照以上任一權利要求所述的滅菌指示器，其中，所述載體包括 紙，所述生物指示劑包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌的芽孢，并且所述支撐體 包括聚苯乙烯，所述載體通過聲波焊接被黏附在支撐體。
35. —種滅菌指示器，其包括一種載體，它有一個第一表面和一個第二表面，所述第一表面的面 積在約1到約80平方毫米的范圍內；一種支撐體，它有一個第一部分和一個第二部分，所述載體覆在它 的第一部分上，所述載體的第二表面被凝附到它的第一部分；和一種生物指示劑，它由所述載體的第一表面支撐，并且含有細菌芽 孢，所述支撐體的第二部分有足夠的尺寸以允許在不接觸所述生物指示 劑的情況下處理所述滅菌指示器。
36. —種滅菌指示器用品包，其包括一個第一隔室,它包括上述權利要求中任一項所述的滅菌指示器， 并且允許所述滅菌指示器在滅菌過程中與滅菌介質接觸；和一個第二隔室，它包括培養(yǎng)基，并且適于保持所述培養(yǎng)基在滅菌過 程中與所述滅菌指示器分開，并允許所述培養(yǎng)基在所述滅菌指示器已被 暴露于滅菌介質之后與所述滅菌指示器接觸。
37. —種制造按照權利要求1-35任一項所述的滅菌指示器的方法，其包括將所述生物指示劑涂到所述載體；和 將所述載體黏附到所述支撐體。
38. 按照權利要求37所述的方法，其中，所述載體用聲波焊接或粘 合劑纟皮黏附到所述支撐體。
39. —種滅菌方法，其包括將需要滅菌的物品和按照權利要求1-35任一項所述的滅菌指示器暴 露于一種滅菌介質。
40. 按照權利要求39所述的方法，其中，所述滅菌介質包括至少一 種液體滅菌劑。
41. 按照權利要求39所述的方法，其中，所述滅菌介質包括至少一 種氣體滅菌劑。
42. —種測定滅菌有效性的方法，其包括將至少一件需要滅菌的物品和按照權利要求1-35任一項所述的滅菌 指示器暴露于滅菌介質，所述生物指示劑包括至少一種測試生物體；和 滅菌后將所述載體與培養(yǎng)基接觸以測定滅菌是否有效。
43. 按照權利要求42所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基包括一種或多 種營養(yǎng)源和一種或多種^f鼓生物生長指示劑。
44. 按照權利要求43所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基還包括一種或 多種pH緩沖劑， 一種或多種維持滲透平衡的制劑， 一種或多種中和劑， 或上述的兩種或多種的混合物。
45. 按照權利要求42-44所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基包括一種具 有在約-0.001到約-0.070摩爾質子范圍內的緩沖能力的緩沖溶液。
46. —種測定滅菌有效性的方法，其包括將至少一件需要滅菌的物品和按照權利要求1-35任一項所述的滅菌 指示器暴露于滅菌介質，所述生物指示劑包括至少一種酶；和 將所述載體與至少一種酶底物接觸以測定滅菌是否有效。
47. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括 一種或 多種發(fā)熒光的4-曱基傘花基衍生物； 一種或多種7-酰氨基-4-曱基香豆素的衍生物； 一種或多種二乙?；鶡晒馑匮苌铮粺晒獍?；或上述的兩種 或多種的混合物。
48. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括4-曱基 傘花基-2-乙酰氨基-4，6-0-亞千基-2-脫氧-P-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基傘花 基乙酸；4-曱基傘花基-N-乙酰基-P-D-氨基半乳糖苷；4-曱基傘花基-N-乙酰基-a-D-氨基葡萄糖苷；4-甲基傘花基-N-乙?；?(3-D-氨基葡萄糖苷； 2，-(4-曱基傘花基)-a-D-N-乙酰基神經氨酸；4-曱基傘花基-a-L-呋喃阿拉 伯糖苷；4-曱基傘花基-a-L-阿拉伯糖苷；4-甲基傘花基丁酸酯；4-曱基傘 花基-P-D-纖維二糖苷；曱基傘花基-P-D-N,N'-二乙?；鶜ざ擒?；4-甲基 傘花基反油酸酯；4-曱基傘花基-(3-D-巖藻糖苷；4-甲基傘花基-a-L-巖藻 糖苷；4-曱基傘花基-P-L-巖藻糖苷；4-甲基傘花基-a-D-半乳糖苷；4-曱基 傘花基-(3-D-半乳糖苷；4-曱基傘花基-a-D-葡萄糖苷；4-甲基傘花基-J3-D-葡萄糖苦；4-曱基傘花基-P-D-葡萄糖苷酸；4-甲基傘花基對胍基苯曱酸 酯；4-曱基傘花基庚酸酯；4-甲基傘花基-a-D-吡喃甘露糖苷；4-曱基傘花 基-P-D-吡喃甘露糖苷；4-曱基傘花基油酸酯；4-曱基傘花基棕櫚酸酯； 4-曱基傘花基磷酸酯；4-甲基傘花基丙酸酯；4-曱基傘花基硬脂酸酯；4-甲基傘花基硫酸酯；4-曱基傘花基-(3-D-N,N，，N，，-三乙?；鶜と擒眨?，-甲基傘花基-2，3,5-三-P-苯甲?；?a-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基傘花基-(3-三曱基肉桂酸酯氯化銨；4-甲基傘花基-(3-D-木糖苷；或上述的兩種或多 種的混合物。
49. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括L-丙氨 酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素；L-脯氨酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素；L-酪氨酸 -7-酰氨基-4-曱基香豆素；L-亮氨酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素；L-苯丙氨酸 -7-酰氨基-4-曱基香豆素；7-戊二酰-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-曱基香豆素；或 上述的兩種或多種的混合物。
50. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括N-t-BOC-異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；N-t-BOC-亮氨 酸-絲氨酸-蘇氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-苯丙氨酸-精 氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；N-t-BOC-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；N-戊二酰-甘氨酸-精氨酸7-酰氨基-4-曱基香豆素；或上述的兩種或多種的 混合物。
51. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括二乙酸熒 光素，雙((3-D-吡喃半乳糖苷)熒光素，和雙月桂酸熒光素，或上述的 兩種或多種的混合物。
52. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括a-D-葡萄糖香 酶，糜蛋白酶，或脂肪酸酯酶；并且所述酶底物包括4-曱基傘花基-a-D-葡萄糖苷，7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素，或4-甲基傘花基 庚酸酯。
53. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括a-L-呋喃阿拉 伯糖苷酶；并且所述酶底物包括4-曱基傘花基-a-L-呋喃阿拉伯糖苷。
54. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括P-D-葡萄糖苷 酶；并且所述酶底物包括4-曱基傘花基-(3-D-葡萄糖苷。
55. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括 一種或 多種5-溴-4-氯-3-p引哚基衍生物； 一種或多種硝基苯基衍生物； 一種或多 種巧l哚酚衍生物； 一種或多種酚酞衍生物；或上述的兩種或多種的混合 物。
56. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括5-溴-6-氯-3-吲哚基乙酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基乙酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚酚+-0-吡喃半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲咮基-l,3-二乙酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基 -卩-D-吡喃巖藻糖苷，5-溴-4-氯-3-吲咮基-(3-D-吡喃葡萄糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基P-D-葡糖醛酸，5-溴-4-氯-3-P引哚基磷酸酯，5-溴-4-氯-3-。引哚基硫 酸酯，或上述的兩種或多種的混合物。
57. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括 一種或 多種對硝基苯酚衍生物； 一種或多種鄰硝基苯酚衍生物；或上述的混合 物。
58. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括二乙基 對硝基苯基磷酸酯；雙對硝基苯基磷酸酯；對硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0-P-吡喃半乳糖基-(3-吡喃葡萄糖苷；對硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脫氧 -卩-吡喃葡萄糖苷；對硝基苯基乙酸酯；對硝基苯基-N-乙酰基-l3-D-氨基葡 萄糖苷；對硝基苯基-P-D-N,N，-二乙酰基殼二糖苷；對硝基苯基-a-p比喃葡 萄糖苷；對硝基苯基-a-麥芽糖苷；對硝基苯基-|3-麥芽糖苷；對硝基苯基-a-吡喃甘露糖苷；對硝基苯基-(3-吡喃甘露糖香；對硝基苯基肉豆蔻酸酯； 對硝基苯基棕櫚酸酯；對硝基苯基磷酸酯；雙(對硝基苯基)磷酸酯；三(對 硝基苯基)磷酸S旨；對硝基苯基-(3-吡喃葡萄糖苷；對硝基苯基-(3-葡萄糖苷 酸；a-對硝基苯基甘油；對硝基苯基-a-鼠李糖苷；對硝基苯基硬脂酸酯； 對硝基苯基硫酸酯；對硝基苯基-2，3,4，6-四-0-乙?；?P-氨基葡萄糖苷； 對硝基苯基胸苷單磷酸酯；對硝基苯基-2,3，4-三-0-乙酰基-(3-葡萄糖醛酸 甲酯；對硝基苯基戊酸酯；或上述的兩種或多種的混合物。
59. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶底物包括鄰硝基 苯基乙酸酯；鄰硝基苯基-(3-葡萄糖苷；鄰硝基苯基-l3-D-吡喃葡萄糖苷； 硝基苯基-a-吡喃半乳糖香；硝基苯基-P-吡喃半乳糖苦；硝基苯基丁酸酯； 硝基苯基癸酸酯；硝基苯基己酸酯；硝基苯基辛酸酯；硝基苯基月桂酸 酯；硝基苯基丙酸酯；吲哚酚乙酸酯；吲味酚-(3-D-葡萄糖苷；3-吲哚酚 硫酸S旨；3-P引哚酚磷酸酯；酚酞二丁酸酯；酚酞二磷酸酯；酚酞二碌u酸酯； 酚酞葡萄糖醛酸；酚酞單-P-葡萄糖苷酸；酚酞單-P-葡萄糖醛酸；和酚酞 單磷酸酯；l-重氮-4-苯曱酰氨基-2，5-二乙氧基苯；l-重氮-4-苯曱酰氨基 -2,5-二乙氧基苯；對-重氮-2,5-二乙氧基-N-苯曱酰丙氨酸；4-氯-2-甲苯重 氮氯；鄰氨基偶氮甲苯重氮鹽；l-萘基-N-乙?；?p-D-氨基葡萄糖苷；2-萘磷酸酯；2-萘丁酸酯；2-萘辛酸酯；2-萘肉豆蔻酸酯；L-亮氨酰-2-萘酰 胺；L-纈氨酰-2-萘酰胺；L-胱氨酰-2-萘酰胺；N-苯甲酰-DL-精氨酸-2-萘 酰胺；N-戊二酰-苯丙氨酸-2-萘胺；2-萘磷酸酯；6-溴-2-萘基-a-D-吡喃半 乳糖苷；2-萘基-P-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘酚-(3-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘基-2-D-p比喃甘露糖普；2-萘基-a-L-吡 喃巖藻糖苷；萘基-AS-BI-磷酸酯；萘基-AS-BI-p-D-葡萄糖苷酸；或上述 的兩種或多種的混合物。
60. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括a-D-葡萄糖苷酶，并且所述酶底物包括對硝基苯基-a-吡喃葡萄糖苷。
61. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括a-L-吹喃阿拉 伯糖苷酶，并且所述酶底物包括對硝基苯基-a-L-呋喃阿拉伯糖香。
62. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括(3-D-葡萄糖香 酶，并且所述酶底物包括對硝基苯基-(3-D-吡喃葡萄糖苷。
63. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括P-半乳糖苷酶， 并且所述酶底物包括5-溴-4-氯-3-P引哚-(3-D-吡喃半乳糖苷。
64. 按照權利要求46所述的方法，其中，所述酶包括P-半乳糖苷酶， 并且所述酶底物包括4-甲基傘形酮-(3-D-p比喃半乳糖苷。
全文摘要
本發(fā)明公開的技術涉及一種滅菌指示器和一種用于濃縮信號的方法，所述信號在最小的體積和最小的pH和生長緩沖或介導作用下，通過將它限制至最小的表面而產生。所述滅菌指示器包括一種載體(12)，所述載體有一個第一表面(14)和一個第二表面(16)；一種支撐體(20)，所述支撐體有一個第一部分(22)和一個第二部分(24)，所述載體(12)覆在所述支撐體(20)的第一部分(22)上，所述載體的第二表面(16)被黏附到與所述支撐體(20)的第一部分(22)；和一種生物指示劑(30)，所述生物指示劑(30)由一個所述載體(12)支撐指示劑。所述支撐體(20)的第二部分(24)有足夠的尺寸以允許在不接觸所述生物指示劑(30)的情況下處理滅菌指示器(10)。本發(fā)明公開了一種用于所述滅菌指示器制造的方法。本發(fā)明公開了所述滅菌指示器的使用方法。
文檔編號C12M1/34GK101541944SQ200780042827
公開日2009年9月23日 申請日期2007年9月19日 優(yōu)先權日2006年9月20日
發(fā)明者特里克拉·A.·克雷格, 菲利普·P.·弗朗西斯克維赫, 馬克·J.·杜達 申請人:美國殺菌器公司