專利名稱：：?jiǎn)螚l植物線蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列套式pcr擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物寄生線蟲檢測(cè)領(lǐng)域，特別是用套式PCR技術(shù)擴(kuò)增單條植物寄生線蟲核糖體18SrDNA和28SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer,ITS)的核酸序列的方法。技術(shù)背景Poinar(1983)估計(jì)地球上有線蟲約50萬種，已知種類約15，000種，其中約有10%是植物線蟲。目前世界上己記載的植物線蟲約有200多屬5000多種(謝輝，2005，植物線蟲分類學(xué)，第二版，北京高等教育出版社)。2007年農(nóng)業(yè)部862號(hào)文件公布的中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中，植物寄生線蟲有20個(gè)屬/種，約160種。據(jù)2000年的統(tǒng)計(jì)，全世界因線蟲危害給糧食和纖維作物造成的損失約為12.7%，對(duì)蔬菜、花生、煙草和某些果樹造成的損失超過20%。因此，線蟲己成為植物的一類重要的病原生物，線蟲病害已成為農(nóng)林生產(chǎn)上的重要問題(劉維志，2004，植物線蟲志，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社)。植物線蟲危害如此嚴(yán)重，但是由于種類繁多，所以植保工作者要想對(duì)線蟲進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定非常困難，對(duì)于基層、口岸等經(jīng)驗(yàn)不足、水平不高的工作人員尤其如此，從時(shí)進(jìn)一步阻礙了農(nóng)業(yè)防治措施的運(yùn)用或檢疫處理措施的實(shí)施。ITS(ITS1和ITS2)區(qū)是一段高度重復(fù)且具有較高進(jìn)化速率的核酸序列，位于核糖體rDNA的18SrDNA和28SrDNA之間，其側(cè)翼片段均為保守序列，所以利用線蟲ITS區(qū)通用引物可以對(duì)多種線蟲的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序等分析，作為線蟲分類的分子標(biāo)記(PowersTO，ToddTC，BurnellAM,etal.1997.T小時(shí)erDNAinternaltranscribedspacerregionasataxonomicmakerfornematodes.Nematology，29:441450)。1998年以來，南京農(nóng)大植物線蟲實(shí)驗(yàn)室、天津出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室與德國(guó)聯(lián)邦農(nóng)林研究所(BBA)—直保持密切的聯(lián)系與合作，通過近10年的努力已經(jīng)基本解決了該技術(shù)需要的相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)1.已經(jīng)成功的建立了單條植物線蟲DNA微量提取技術(shù)(WANGJin-C小時(shí)eng,YUBen-Yuan,LINMao-Song，2005.Descriptionofanewspecies(Nematoda,ap小時(shí)elenc小時(shí)oididae)isolatedfromwoodpackagingmaterial.ActaZootaxonomica,30(2):314319)。2.通過多年研究，基本鎖定目標(biāo)片斷為核糖體rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS,并建立了傘滑刃屬、粒屬、莖屬、類短體屬、短體屬、矮化屬、根結(jié)屬等線蟲的rDNA-ITS序列的常規(guī)PCR或套式PCR擴(kuò)增體系。3.限制性內(nèi)切酶組合的選擇采用Webcutter2.0與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行，更加快速、便捷。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)植物線蟲檢測(cè)中現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)難度和我們的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本發(fā)明建立了單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR擴(kuò)增技術(shù)體系，該項(xiàng)技術(shù)是單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)的補(bǔ)充。目前，本發(fā)明技術(shù)已經(jīng)在植物寄生線蟲中的根結(jié)線蟲幼蟲和短體線蟲ITS區(qū)序列的擴(kuò)增上應(yīng)用并獲得了成功，效果顯著。本發(fā)明技術(shù)是構(gòu)建Nema-log植物線蟲分子標(biāo)記系統(tǒng)的關(guān)鍵共性技術(shù)(王金成，黃國(guó)明，劉鵬，2007，關(guān)于構(gòu)建Nema-log植物線蟲分子標(biāo)記系統(tǒng)的設(shè)想，未發(fā)表文章)，它解決了植物寄生線蟲單條幼蟲以及難于擴(kuò)增的線蟲種類ITS區(qū)序列的難題。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明目的是提供一種用于單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR擴(kuò)增技術(shù)，是構(gòu)建Nema-log植物線蟲分子標(biāo)記系統(tǒng)的關(guān)鍵共性技術(shù)，它包括以下步驟1.單條植物寄生線蟲總DNA的提取。2.篩選的引物序列如下Pl:5'-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'P2:5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'P3:5，-GATTACGTCCCTGCCCTTTGT-3'3.單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR第-'步的擴(kuò)增。4.單條植物寄生線蟲核糖體ITS核酸序列套式PCR第二步的擴(kuò)增。本發(fā)明可以在檢測(cè)植物寄生線蟲方面廣泛應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是所涉及的技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單，一般工作人員經(jīng)過l-2周的訓(xùn)練就可獨(dú)立操作。該技術(shù)所用引物少，目前只有3條就基本解決問題，免去了引物大量合成的成本和管理保存的麻煩。與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，該技術(shù)成木低、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，假陽性結(jié)果出現(xiàn)概率低，非常適合于口岸日常檢疫鑒定使用。圖1:單條根結(jié)線蟲幼蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增第一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2:單條根結(jié)線蟲幼蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3:單條斯氏短體線蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增第一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物閣4:單條斯氏短體線蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體實(shí)施方式為能進(jìn)一歩了解本發(fā)明的
發(fā)明內(nèi)容、特點(diǎn)及功效，茲舉以下實(shí)施例，并配合附圖詳細(xì)說明如下實(shí)施例1:單條根結(jié)線蟲幼蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增1.收集線蟲材料10個(gè)根結(jié)線蟲種群中，有4個(gè)來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的樣本，l個(gè)來自荷蘭的落新婦種苗，5個(gè)來自天津的蔬菜基地，見表l。_表l:供試線蟲樣品及來源_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.設(shè)計(jì)引物本實(shí)驗(yàn)釆用線蟲ITS區(qū)通用引物Pl:5，-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3，P2:5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'P3:5'-GATTACGTCCCTGCCCTTTGT-3'3.線蟲DNA的提取DNA提取方法如下用挑針逐一挑取線蟲10條左右，放入去離子水中洗滌3次，備用。在潔凈的載波片上加8nL去離子水，挑入一條洗過的線蟲，用解剖刀將線蟲切成數(shù)段，吸入到200(iLPCR反應(yīng)管中。在上述管中分別加入lfiL(10xPCRBuffer)和liiL蛋白酶K(l嗎4iL)，混勻，-20°。冷凍過夜，然后65t:保溫l小時(shí)，使蛋白酶K發(fā)揮作用，釋放DNA，最后94'C滅活10分鐘，5000轉(zhuǎn)/分離心30秒，上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。4.套式PCR擴(kuò)增第一步4.1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50iaL:ddH2033.6jaL，10xPCRBuffer(Mg2+)5pL，dNTP(2.5mmol/L)2^L，上游引物P3(l(Vmol/L)lnL,下游引物P2(10nmol/L)lpL，TaqDNA聚合酶(5U/nL)0.4^L，模板DNA8pL。4.2PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3分鐘，然后是25個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95t:變性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分鐘)，最后72'C保溫IO分鐘，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開始電泳檢査擴(kuò)增結(jié)果，也可置于-2(TC冰箱中保存。擴(kuò)增結(jié)果表明，南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲4種常見的根結(jié)線蟲的幼蟲通過一步PCR無法獲得每條線蟲的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物(圖l)。5.套式PCR擴(kuò)增第二步5.1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50ixL:ddH2041.4(iL，10xPCRBuffer(Mg2+)5pL，dNTP(2.5mmol/L)2pL,上游引物Pl(10pmol/L)lpL，下游引物P2(10pmol/L)lpL,TaqDNA聚合酶(5U/pL)0.4pL，模板DNA2(iL。5.2PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件95'C預(yù)變性3分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95'C變性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分鐘)，最后72'C保溫IO分鐘，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開始電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，也可置于-2(TC冰箱中保存。擴(kuò)增結(jié)果表明，南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲4種常見的根結(jié)線蟲的幼蟲通過套式PCR則能夠獲得理想的結(jié)果，即所有線蟲的ITS序列均能很好的擴(kuò)增(圖2)實(shí)施例2:單條斯氏短體線蟲核糖體ITS區(qū)核酸序列套式PCR擴(kuò)增1.收集線蟲材料12個(gè)斯氏短體線蟲種群全部來自荷蘭進(jìn)境的百合種球，由天津口岸植物檢疫人員截獲，見表2。表2:供試線蟲樣品及來源<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.設(shè)計(jì)引物本實(shí)驗(yàn)采用線蟲ITS區(qū)通用引物P1:5，-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3'P2:5,-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3，P3:5'-GATTACGTCCCTGCCCTTTGT-3'3.線蟲DNA的提取DNA提取方法如下用挑針逐一挑取線蟲10條左右，放入去離子水中洗滌3次，備用。在潔凈的載波片上加8nL去離子水，挑入一條洗過的線蟲，用解剖刀將線蟲切成數(shù)段，吸入到200pLPCR反應(yīng)管中。在上述管中分別加入1^L(10xBuffer)和1^L蛋白酶K(1嗎爾L)，混勻，-20。C冷凍過夜，然后65t:保溫l小時(shí)，使蛋白酶K發(fā)揮作用，釋放DNA，最后94'C滅活I(lǐng)O分鐘，5000轉(zhuǎn)/分離心30秒，上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。4.套式PCR擴(kuò)增第一步4.1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50iiL:ddH2033.6^iL，10xPCRBuffer(Mg2+)5|iL，dNTP(2.5mmol/L)2pL,上游引物P3(l(Vmol/L)0.5|iL，下游引物P2(10pmol/L)0.5nL，TaqDNA聚合酶(5U/|iL)0.4pL，模板DNA8nL。4.2PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95。C變性30秒，55。C退火30秒，72'C延伸1分鐘)，最后72'C保溫10分鐘，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開始電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，也可置于-2(TC冰箱中保存。擴(kuò)增結(jié)果表明，斯克里布納短體線蟲的12個(gè)來自荷蘭的種群通過一步PCR無法獲得，條線蟲的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)5.套式PCR擴(kuò)增第二步5.1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積50ixL:ddH2041.4(xL，10><PCRBuffer(Mg2+)5pL，dNTP(2.5mmol/L)2pL，上游引物Pl(l(Vmol/L)0.6^L，卜'游引物P2(10nmol/L)0.6pL，TaqDNA聚合酶(5U/n丄)0.4pL，模板DNA2nL。5.2PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件95'C預(yù)變性3分鐘，然后是40個(gè)循環(huán)反應(yīng)(95'C變性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分鐘)，最后72'C保溫IO分鐘，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開始電泳檢査擴(kuò)增結(jié)果，也可置于-2(TC冰箱中保存。擴(kuò)增結(jié)果表明，斯克里布納短體線蟲的12個(gè)來自荷蘭的種群通過套式PCR則能夠獲得理想的結(jié)果，即所有線蟲的ITS序列均能很好的擴(kuò)增，但擴(kuò)增結(jié)果與根結(jié)線蟲略有不同。根結(jié)線蟲套式PCR的第一部擴(kuò)增有可見條帶出現(xiàn)，而在斯克里布納短體線蟲的套式PCR第一步擴(kuò)增未有可見條帶出現(xiàn)。而且在斯克里布納短體線蟲擴(kuò)增的第二步中部分泳道有非特性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(圖4)。序列列表SEQUENCELISTING〈110〉天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心〈120〉單條植物線蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列套式PCR擴(kuò)增方法<130〉20080102〈160〉3〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工合成〈220〉〈221〉primer—bind〈222>(1)..(19)〈400〉1cgtaacaaggtagctgtag<210〉2〈211〉21<212〉DNA〈213>人工合成〈220〉<221〉primer_bind〈222〉(1)..(21)〈400〉2tttcactcgccgttactaagg〈210〉3〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉primer_bind〈222〉(1)..(21)〈400〉3gattacgtccctgccctttgt2權(quán)利要求1.單條植物線蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列套式PCR擴(kuò)增方法，其特征是，它包括以下步驟(1)單條植物寄生線蟲DNA的提取技術(shù)；(2)所用引物的篩選，序列如下P15’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’P25’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’P35’-GATTACGTCCCTGCCCTTTGT-3’(3)套式PCR擴(kuò)增第一步的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序；(4)套式PCR擴(kuò)增第二步的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序。2.權(quán)利要求1所述單條植物線蟲核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列套式PCR擴(kuò)增方法在檢測(cè)植物寄生線蟲方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及套式PCR技術(shù)擴(kuò)增單條植物寄生線蟲核糖體rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer，ITS)的核酸序列，屬于植物寄生線蟲檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選了3條引物，建立了套式PCR擴(kuò)增技術(shù)，包括2套不同的PCR擴(kuò)增體系和2套不同的PCR擴(kuò)增程序，免去了引物大量合成的成本和管理保存的麻煩。本發(fā)明的有益效果是所涉及的技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單，所用引物少，目前只有3條就基本解決問題，與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，該技術(shù)成本低，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，假陽性結(jié)果出現(xiàn)概率低，可用于單條植物寄生線蟲幼蟲或通過常規(guī)PCR無法擴(kuò)增的單條植物寄生線蟲ITS核酸序列的擴(kuò)增。非常適合于口岸日常檢疫鑒定使用。文檔編號(hào)C12N15/10GK101230343SQ20081005204公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年1月10日優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日發(fā)明者鵬劉,楊秀麗,王金成,郭京澤,黃國(guó)明申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心