專利名稱：甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲醇酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，尤其是關(guān)于應(yīng)用含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒在甲醇酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)外源蛋白。
甲醇酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)是Invitrogen公司成功開發(fā)的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)。由于其表達(dá)量高、可分泌表達(dá)和雜蛋白少等特點(diǎn)，近年來已有大量外源蛋白在甲醇酵母系統(tǒng)中成功地得到表達(dá)(Ohtani W，Ohda T，Sumi Aet al.Anal Chem 70425～429，1998)。甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒中一般包含外源蛋白表達(dá)啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、3’末端轉(zhuǎn)錄終止序列(AOX1 3’末端序列)和表達(dá)抗性基因所需的啟動(dòng)子以及復(fù)制子等。對(duì)于分泌性質(zhì)粒，在啟動(dòng)子與多克隆位點(diǎn)間還存在分泌信號(hào)肽序列。外源基因插入啟動(dòng)子或信號(hào)肽后的多克隆位點(diǎn)中。表達(dá)質(zhì)粒中的啟動(dòng)子序列或3’末端序列通過與Pichia pastoris染色體DNA發(fā)生同源重組而使外源基因表達(dá)盒整合入酵母染色體中，通過與啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)方法誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，因此啟動(dòng)子的選擇對(duì)外源蛋白的表達(dá)有非常重要的影響。
可用于甲醇酵母表達(dá)的啟動(dòng)子大多來源于甲醇酵母本身，如pAOX(pAOX1和pAOX2)、pDAS、pP40、pGAP和pFLD等。不同的啟動(dòng)子根據(jù)其天然轉(zhuǎn)錄的蛋白在酵母中的作用不同而有不同的激活轉(zhuǎn)錄特性，其強(qiáng)也各不相同。根據(jù)Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)的現(xiàn)有報(bào)道，其中醇氧化酶啟動(dòng)子pAOX1是使用最多、表達(dá)效率很高的一個(gè)。pAOX1是一很強(qiáng)的啟動(dòng)子，用其構(gòu)建的外源蛋白表達(dá)工程菌經(jīng)甲醇的誘導(dǎo)，搖瓶中就可以得到很高的表達(dá)量。而pGAP和pFLD啟動(dòng)子則是最近才被報(bào)道的(Shen-S，et al.Gene216(1)93-102，1998；Doring-F，et al.Biochem Biophys Res Commun，250(2)531-535，1998)，據(jù)Doring等人報(bào)道，在Pichia pastoris表達(dá)體系中，pGAP啟動(dòng)子比pAOX1更適合于表達(dá)有功能的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。此外，來源于Candida，Hansenula和Torulopsis的真核啟動(dòng)子也可以用于甲醇酵母中的外源基因表達(dá)。
然而已有的專利和相關(guān)文獻(xiàn)表明(US 5643792；H.R.Waterham，et alGene 186(1)37-44，1997)，現(xiàn)在被大量使用的pAOX1表達(dá)系統(tǒng)由于甲醇對(duì)細(xì)胞的毒性和甘油對(duì)甲醇誘導(dǎo)的弱抑制等原因，在發(fā)酵罐中必須先經(jīng)1-2天的甘油生長(zhǎng)期，而后限量補(bǔ)加甘油使細(xì)胞生長(zhǎng)到合適的密度，最后才逐漸補(bǔ)加甲醇開始誘導(dǎo)表達(dá)，整個(gè)周期長(zhǎng)達(dá)7-12天，而且這種誘導(dǎo)表達(dá)的方法很難控制，因此pAOX1啟動(dòng)子的高效性往往無法充分地表現(xiàn)出來。而pGAP等啟動(dòng)子雖然可以組成型表達(dá)外源蛋白，但是對(duì)多數(shù)外源蛋白而言，采用pGAP啟動(dòng)子后其表達(dá)量并不令人滿意，這導(dǎo)致其應(yīng)用還遠(yuǎn)不如pAOX1廣泛。
作為甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)最為成功的例子是在甲醇酵母Pichia pastoris中高效表達(dá)人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)。HSA是一需求量極大的重要臨床藥物。由于艾滋病及肝炎等疾患的蔓延，使得血液來源的HSA藥物存在攜帶病毒的威脅，并且時(shí)有相關(guān)事故的報(bào)道。因此15年來國(guó)際上一直在探索基因工程HSA藥物的研究與開發(fā)，其中甲醇酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)是最為成功的一個(gè)。HSA在甲醇酵母中的表達(dá)為外分泌型，采用的啟動(dòng)子為pAOX1，其搖瓶表達(dá)量約為50mg/l。與此相關(guān)的專利有US5707828，EP 0570916A2，EP 0510693A2等。因此，建立甲醇酵母中新的含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒構(gòu)建系統(tǒng)，使得采用更簡(jiǎn)單方便的發(fā)酵條件即可獲得外源蛋白的高效表達(dá)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的目的在于對(duì)現(xiàn)有的甲醇酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，提供甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，使得能夠采用更簡(jiǎn)單方便的發(fā)酵條件即可獲得外源蛋白的高效表達(dá)，從整體上降低工業(yè)生產(chǎn)的成本。
本發(fā)明提供一種甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，它是由來自甲醇酵母的醇氧化酶啟動(dòng)子pAOX1和pAOX2、二羥丙酮合成酶啟動(dòng)子pDAS、P40基因啟動(dòng)子pP40、過氧化氫酶啟動(dòng)子、甲酸脫氫酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子pGAP和甲醛脫氫酶啟動(dòng)子pFLD，以及來自酵母Candida，Hansenula和Torulopsis的真核啟動(dòng)子中選出的激活表達(dá)不沖突的二種或二種以上的啟動(dòng)子，例如pAOX1和pGAP二種啟動(dòng)子，分別構(gòu)建成外源基因表達(dá)盒。而后整合入同一甲醇酵母宿主細(xì)胞中，通過多啟動(dòng)子的疊加效應(yīng)使外源蛋白高效表達(dá)，同時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間，并使得表達(dá)條件簡(jiǎn)單化。
外源基因包括人血清白蛋白(HSA)、辣根過氧化物酶、p53蛋白、降鈣素等等，下面以人血清白蛋白(HSA)為研究對(duì)象，提供含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的實(shí)例。人血清白蛋白(HSA)的基因可以通過反轉(zhuǎn)錄PCR的方法，從人胚肝細(xì)胞中反轉(zhuǎn)錄獲得。也可以采用全長(zhǎng)合成的方法，應(yīng)用DNA合成儀合成完整的HSA基因序列。本發(fā)明采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法獲得HSA全長(zhǎng)cDNA，其DNA序列前端含有天然HSA分泌信號(hào)肽及加工序列(

圖1，其中54～125bp為編碼24個(gè)氨基酸的人血清白蛋白分泌加工序列，即prepro序列；126～1883bp為成熟人HSA編碼序列)。按照常規(guī)分子生物學(xué)操作，將獲得的HSA基因裝入甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K和pGAPZαA中，分別獲得HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA(圖2)和pGAP-HSA(圖4)。圖2中，HSA基因位于pAOX1啟動(dòng)子下，裝入位點(diǎn)為BamHⅠ和EcoRⅠ，質(zhì)粒中含kanamycin多拷貝抗性篩選標(biāo)記。而圖4中，HSA基因位于pGAP啟動(dòng)子下，裝入位點(diǎn)為pGAPZαA中的NspV和EcoRI位點(diǎn)，質(zhì)粒中含Zeocin多拷貝抗性篩選標(biāo)記，此重組表達(dá)質(zhì)粒可組成型表達(dá)HSA。將上述兩種HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒整合入同一甲醇酵母宿主細(xì)胞，獲得HSA的含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒基因工程菌株。其中甲醇酵母Pichia pastoris宿主細(xì)胞可以是GS115、KM71、SMD1168、SMD1168H等，整合甲醇酵母細(xì)胞的方法可以是球質(zhì)體法和電穿孔轉(zhuǎn)化法等。
基于構(gòu)建的酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA和pGAP-HSA含有不同的抗性篩選標(biāo)記(Kanamycin和Zeocin)，因此構(gòu)建此含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒工程菌株時(shí)可以采用兩種重組表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化、兩種抗性同時(shí)篩選的方法來進(jìn)行，也可以先將一種重組表達(dá)質(zhì)粒整合入酵母宿主細(xì)胞中，通過相應(yīng)的抗性篩選陽性克隆，而后再以篩選獲得的陽性克隆為宿主細(xì)胞，導(dǎo)入另一種重組表達(dá)質(zhì)粒，通過與此重組表達(dá)質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的抗性篩選出整合有兩種重組表達(dá)質(zhì)粒的多表達(dá)盒工程菌株。本發(fā)明采用后一種方法進(jìn)行，使用的酵母宿主細(xì)胞為GS115。結(jié)果所構(gòu)建的含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒HSA基因工程菌株在不經(jīng)甲醇誘導(dǎo)時(shí)，可以通過含pGAP啟動(dòng)子的多個(gè)表達(dá)盒組成型表達(dá)HSA。而經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后含pGAP和pAOX1二種啟動(dòng)子的多個(gè)表達(dá)盒可同時(shí)作用，其表達(dá)量明顯高于僅含單一啟動(dòng)子表達(dá)盒的基因工程菌株。
以上提供的構(gòu)建實(shí)例中，所構(gòu)建的含pGAP和pAOX1二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的HSA工程菌株，其HSA表達(dá)量明顯提高。如果多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒中的啟動(dòng)子包含有pAOX1，也可以針對(duì)pAOX1啟動(dòng)子的特性，通過以下改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)在提高表達(dá)量的同時(shí)，優(yōu)化表達(dá)菌株的發(fā)酵特性。
針對(duì)有pAOX1啟動(dòng)子構(gòu)建的基因工程菌株存在表達(dá)外源蛋白必須分階段進(jìn)行，周期長(zhǎng)、發(fā)酵條件不易控制等缺點(diǎn)，可以通過誘變的方法來改善此類包含有pAOX1的多啟動(dòng)子多表達(dá)盒基因工程菌株的特性。其中誘變可以采用紫外照射的方法、也可以通過使用誘變劑來進(jìn)行。常用的誘變劑可以是EMS、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，DES和丫啶等。外源基因仍以人血清白蛋白為例。首先構(gòu)建HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3-HSA(圖3)，整合入酵母宿主細(xì)胞GS115中，篩選出HSA表達(dá)克隆，而后采用EMS誘變劑，篩選獲得一甲醇誘導(dǎo)不受葡萄糖抑制的HSA工程菌株(圖5，其中顯示非誘變菌株在含葡萄糖培養(yǎng)基中不表達(dá)HSA，而誘變菌株可以表達(dá))。而后以此誘變獲得的HSA表達(dá)菌株作為宿主細(xì)胞，整合入HSA組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA(圖4)，經(jīng)表達(dá)篩選，結(jié)果獲得一HSA表達(dá)特性優(yōu)良的基因工程菌株P(guān)ichia pastoris SIB 121(于1999年7月15日保藏在北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0407)。此工程菌株由于pAOX1的甲醇誘導(dǎo)特性不再受葡萄糖等碳源的抑制，因此可以甲醇誘導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行，即不再需要進(jìn)行分階段發(fā)酵，達(dá)到了縮短發(fā)酵時(shí)間的目的。同時(shí)，由于pAOX1的甲醇誘導(dǎo)特性不再受葡萄糖和甘油等碳源的抑制，因此大規(guī)模發(fā)酵中也不存在甘油生長(zhǎng)期-甘油限量期-甲醇誘導(dǎo)期等復(fù)雜的控制過程，簡(jiǎn)化了發(fā)酵條件的控制。而通過構(gòu)建多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，其表達(dá)量更明顯高于單一啟動(dòng)子的構(gòu)建系統(tǒng)(圖6、圖7)。
由以上實(shí)例可以看出，通過對(duì)甲醇酵母Pichia pastoris宿主細(xì)胞GS115用EMS誘變劑進(jìn)行誘變，獲得一pAOX1的甲醇誘導(dǎo)不受葡萄糖等碳源抑制的宿主細(xì)胞，而后，用此宿主細(xì)胞結(jié)合本發(fā)明建立的含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，可以更簡(jiǎn)便地在甲醇酵母中表達(dá)外源蛋白。從而提高工作效率。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)與效果本發(fā)明建立的甲醇酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，可以聚合多種來源真核啟動(dòng)子的優(yōu)良特性，在所構(gòu)建的基因工程表達(dá)菌株中共同改善其特性并提高重組外源蛋白的表達(dá)量，避免了某些單一啟動(dòng)子表達(dá)盒菌株表達(dá)特性良好但表達(dá)量不高的缺點(diǎn)。
當(dāng)構(gòu)建的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒中包含有pAOX1啟動(dòng)子時(shí)，可以通過誘變的方法來改善此類包含有pAOX1的多啟動(dòng)子多表達(dá)盒工程菌株的特性，使得構(gòu)建的工程菌株可以在發(fā)酵過程中甲醇誘導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行，縮短了發(fā)酵時(shí)間，簡(jiǎn)化了發(fā)酵條件，同時(shí)通過多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒構(gòu)建系統(tǒng)提高外源蛋白的表達(dá)量。從整體上降低了工業(yè)生成的成本。
圖2、HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA的構(gòu)建圖。
圖3、HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3-HSA的構(gòu)建圖。
圖4、HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA構(gòu)建圖。
圖5、葡萄糖非抑制HSA工程菌表達(dá)HSA的SDS-PAGE電泳圖。(1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2.誘變出發(fā)菌株，作為對(duì)照；3-7.分別為篩選的葡萄糖非抑制型產(chǎn)HSA工程菌株)。
圖6、多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒菌株SIB 121與單一啟動(dòng)子菌株GS115/pPIC3-HSA+表達(dá)HSA的SDS-PAGE電泳比較(1．低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2．SIB121在BMMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl；3．GS115/pPIC3-HSA+在BMMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl；4．SIB 121在BMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl)。
圖7、多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒菌株SIB 121與單一啟動(dòng)子菌株GS115/pPIC3-HSA+表達(dá)HSA的SDS-PAGE掃描分析(1.SIB 121在BMMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl；2.GS115/pPIC3-HSA+在BMMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl；3.SIB 121在BMGY中誘導(dǎo)兩天上清液，上樣10μl)。
本發(fā)明可以通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)材料說明(1)試劑DNA擴(kuò)增試劑盒、klenow片段多聚酶和所有使用的酶均為GIBCO BRL公司產(chǎn)品。DNA序列測(cè)定試劑盒、Trizol RNA抽提試劑盒購自Promega公司。YNB(w/o amino acid)購自DIFCO公司，G418和Zeocin購自GIBCO BRL公司。Wizard plus minipreps DNA質(zhì)粒抽提試劑盒、Wizard PCR preps DNA回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。HSA抗血清本實(shí)驗(yàn)室提供。電轉(zhuǎn)化儀CELL-PORATOR為GIBCOBRL公司產(chǎn)品。(2)質(zhì)粒和菌種質(zhì)粒pPIC3、pPIC3.5K和pGAPZαA，甲醇酵母菌株P(guān)ichia pastorisGS115(his4Mut+)均為Invitrogen公司產(chǎn)品，質(zhì)粒PUC19和E.Coli DH5αF’菌株為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保藏。
實(shí)施例1 preproHSA cDNA的克隆取2克人胚肝細(xì)胞，按照Trizol RNA抽提試劑盒推薦方法，從人胚肝細(xì)胞中抽提總RNA。根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列，設(shè)計(jì)引物如下引物1 引物2 以抽提的人胚肝細(xì)胞總RNA為模板，PCR反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白preproHSA cDNA。反應(yīng)條件為94℃變性45秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，按照GIBCO BRL公司Klenow多聚酶的推薦使用方法，將PCR產(chǎn)物用Klenow片段聚合酶補(bǔ)平，并采用Promega DNA回收試劑盒回收補(bǔ)平的PCR擴(kuò)增片段。
將補(bǔ)平的PCR產(chǎn)物與SmaI酶切的PUC19載體平端連接，連接反應(yīng)體系為PUC19(SmaI切)1μl，5×連接緩沖液3μl，T4 DNA連接酶(1U／μl)1.5μl，SmaI(1U／μl)0.5μl，PCR補(bǔ)平產(chǎn)物5μl，無菌水4μl。以上混合物21℃連接5小時(shí)。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5αF’感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用Promega質(zhì)粒抽提試劑盒制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHI和EcoRI雙酶切初步鑒定出重組質(zhì)粒PUC19-HSA。DNA序列分析表明(圖1)PCR擴(kuò)增所得的中國(guó)人HSA基因與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，僅在preproHSA多肽序列的122位Arg(AGA)變?yōu)镾er(AGT)、466位Glu(GAA)變?yōu)镚ly(GGA)，162位改變(TTA變?yōu)镃TA)不引起氨基酸的變化。
實(shí)施例2 HSA酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA和pPIC3-HSA構(gòu)建將PUC19-HSA克隆載體中preproHSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切下，1％瓊脂糖電泳，Promega PCR Prep Kit回收約1.8Kb的preproHSA基因片段。回收片段與用相同酶切的pPIC3.5K表達(dá)質(zhì)粒連接，連接反應(yīng)體系為pPIC3.5K(BamHI，EcoRI雙切)1μl，5×連接緩沖液3μl，T4 DNA連接酶(1U/μl)1.5μl，preproHSA 3μl，無菌水6.5μl。以上混合物21℃連接5小時(shí)。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5αF’感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。Promega質(zhì)粒DNA抽提試劑盒制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA(圖2)。
同樣方法，將上述構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA經(jīng)SacI和SalI酶切并回收HSA基因片段，與用相同酶切的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3連接，酶切驗(yàn)證可篩選獲得酵母HSA重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3-HSA(圖3)。
實(shí)施例3 HSA酵母組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA的構(gòu)建將構(gòu)建的pPIC3.5K-HSA重組表達(dá)質(zhì)粒DNA用BamHI酶切，而后用核酸酶S1于23℃處理15分鐘去除BamHI酶切產(chǎn)生的粘性末端，PromegaDNA回收試劑盒回收線性DNA。所得鈍端線性DNA再用EcoRI酶切、1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，膠回收約1.8Kb的preproHSA基因片段。pGAPZαA表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)NspV酶切后，按以上相同方法用核酸酶S1去除粘性末端、EcoRI酶切、1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳并回收2.9Kb片段。所得線性化DNA片段與前述pPIC3.5-HSA來源的preproHSA基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)，其體系為pGAPZαA(NspV+S1+EcoRI)2μl，preproHSA(BamHⅠ+S1+EcoRⅠ)8μl，5×連接緩沖液3μl，T4 DNA連接酶(1U/μl)2μl。以上混合物16℃連接過夜。所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5αF’感受態(tài)細(xì)胞，涂布SLB/Zeocin平板(0.5％酵母膏、1％蛋白胨、0.5％NaCl、25mg/l Zeocin)篩選陽性克隆。Promega質(zhì)粒DNA抽提試劑盒制備質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒DNA用BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切鑒定得組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA(圖4)。
實(shí)施例4 pPIC3.5k-HSA電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞及其表達(dá)將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K-HSA約10μg用SalⅠ酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于10μl無菌水中，同時(shí)將空載pPIC3.5K質(zhì)粒相同酶切線性化并回收作為對(duì)照。接種GS115于500ml YPD培養(yǎng)基(1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，28-30℃培養(yǎng)至OD600為1.3-1.5，5000r/min離心5min，菌體沉淀分別用100ml冰冷無菌水、20ml冰冷無菌水和20ml1mol/l冰冷山梨醇各洗一次，每次洗后均5000r/min離心5min并收集菌體，最后將離心的菌體細(xì)胞用200μl 1M冰冷山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細(xì)胞。將上述線性化DNA分別與80μl GS115電轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合，采用GIBCOBRL電轉(zhuǎn)化儀CELL-PORATOR電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V，電容50μF，電阻4KΩ。電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到一無菌微量離心管中，立即加入0.50mL1mol/l冰浴預(yù)冷的山梨醇，30靜置一小時(shí)，加入0.5ml YPD后30℃200rpm培養(yǎng)1-1.5小時(shí)，快速離心去除上清，加入300μl無菌水懸浮菌體，各取100μl涂布含不同濃度G418的YPD平板(含G418各0.5mg/ml、1.0mg/ml和1.5mg/ml)，30℃2～4天后將陽性克隆點(diǎn)接MD平板(13.4g/l YNB，4×10-4g/l生物素，20g/l葡萄糖，20g/l瓊脂)驗(yàn)證his+表型，30℃2天后的陽性克隆即為Pichia pastoris GS115/HSA(his+Mut+)重組克隆，其中含G418濃度高的YPD平板上的陽性克隆為多拷貝重組克隆。
將上述構(gòu)建篩選獲得的一株產(chǎn)HSA工程菌株(GS115/pPIC3.5k-HSA)接種3ml YPD試管，30℃300r/min搖床中培養(yǎng)過夜，以0.1-0.2％接種含8mlBMGY(10g/l酵母膏，20g/l蛋白胨，0.1mol/l磷酸鉀緩沖液pH6.0，13.4g/lYNB，4×10-4g/l生物素，10g/l甘油)的50ml培養(yǎng)管中。30℃300r/min培養(yǎng)至OD600為2～10。常溫5000r/min離心5-10min。所收集的菌體用40mlBMMY(將BMGY中10g/l甘油改變?yōu)?ml/l甲醇)懸浮后轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶，28℃300r/min開始誘導(dǎo)。每24小時(shí)補(bǔ)加甲醇到5ml/l。誘導(dǎo)48小時(shí)后用自制HSA抗血清ELISA檢測(cè)發(fā)酵液上清，HSA表達(dá)量約為60-80mg/l。
實(shí)施例5葡萄糖非抑制型HSA工程菌GS115/pPIC3-HSA+的獲得將實(shí)施例2獲得的HSA重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC3-HSA按實(shí)施例4所述步驟電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GS115，而后涂布MD平板，30℃培養(yǎng)2-4天后，陽性克隆經(jīng)MM平板(13.4g/l YNB，4×10-4g/l生物素，5ml/l甲醇，20g/l瓊脂)驗(yàn)證，挑選得甲醇利用正常型的HSA表達(dá)克隆(GS115/pPIC3-HSA)。
將得到的HSA表達(dá)克隆GS115/pPIC3-HAS接種至3ml YPD試管，28℃、300r/min培養(yǎng)過夜。取0.6ml菌液常溫15000r/min離心1min。收集菌體，以無菌水反復(fù)洗滌后，重懸于2ml磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。加入60μlEMS原液，混合均勻后，于28℃旋轉(zhuǎn)搖床上溫育1hr。用400倍體積無菌5％Na2S2O3處理滅活EMS。常溫15000r/min離心1min，收集菌體，懸浮于2ml無菌水中。以不同濃度涂布含0.02％2-脫氧葡萄糖的bm-YNB平板(0.1mol/l磷酸緩沖液pH6.0，5ml/l甲醇，13.4g/lYNB，15g/l瓊脂)，置30℃培養(yǎng)2-5天。所得陽性克隆接種至3ml YPD試管，28-30℃、300r/min培養(yǎng)過夜。1％轉(zhuǎn)接至10ml YPDM(10g/l酵母膏、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖、5ml/l甲醇)，28-30℃、300r/min誘導(dǎo)2-3天，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為5ml/l。發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE電泳表明，EMS誘變菌株(GS115/pPIC3-HSA+)比未誘變菌株(GS115/pPIC3-HSA)有明顯的67kD蛋白條帶(圖5)。
實(shí)施例6含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒HSA工程菌GS115/pPIC3.5k+p GAP將實(shí)施例3構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA約10μg用PshAⅠ酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于10μl無菌水中。同實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)步驟制備GS115/pPIC3.5k-HSA電擊感受態(tài)細(xì)胞。將上述線性化DNA分別與80μl電轉(zhuǎn)化細(xì)胞混合，采用GIBCO BRL電轉(zhuǎn)化儀CELL-PORATOR，以實(shí)施例4電擊轉(zhuǎn)化步驟電擊轉(zhuǎn)化。最后取100μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布含不同濃度Zeocin的YPDS平板(10g/l酵母膏、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖、1mol/l山梨醇、20g/l瓊脂，Zeocin濃度為100mg/l或500mg/l)，30℃培養(yǎng)2～4天，所得陽性克隆即為含pAOX1和pGAP兩種啟動(dòng)子表達(dá)HSA的工程菌。其中含Zeocin濃度高的YPDS平板上的陽性克隆為pGAP-HSA多拷貝重組克隆。通過以上步驟最后篩選得到一株含兩種啟動(dòng)子多表達(dá)盒HSA工程菌GS115/pPIC3.5k+p GAP，此菌株在不含甲醇的培養(yǎng)基YPD或BMGY中即可表達(dá)HSA，表明組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA可以在酵母中表達(dá)HSA。經(jīng)ELBA分析測(cè)定，此菌株在甲醇誘導(dǎo)2天后HSA表達(dá)量可達(dá)約120mg/l。
實(shí)施例7含二種啟動(dòng)子多表達(dá)盒HSA工程菌株P(guān)ichia pastoris SIB 121的構(gòu)建同實(shí)施例6步驟，以實(shí)施例5中獲得的HSA菌株GS115/pPIC3-HSA+為宿主細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化入組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAP-HSA，經(jīng)誘導(dǎo)篩選，得到一工程菌GS115／pAOX1+pGAP(Pichia pastoris SIB 121)。此工程菌可以在YPDM或BMMGY(10g/l酵母膏，20g/L蛋白胨，0.1mol/l磷酸鉀緩沖液pH6.0，13.4g/lYNB，4×10-4g/l生物素，10g/l甘油，5ml/l甲醇)培養(yǎng)基中同時(shí)啟動(dòng)兩個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)HSA，搖瓶發(fā)酵液經(jīng)SDS-PAGE分析表明，其表達(dá)量明顯高于單啟動(dòng)子的工程菌(圖6、圖7)。用自制HSA抗血清進(jìn)行ELISA分析，表明SIB 121經(jīng)BMMGY發(fā)酵兩天其HSA表達(dá)量就可達(dá)近120mg/l(搖瓶)。
權(quán)利要求
1．一種甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，其特征在于所述的多種啟動(dòng)子是由來自甲醇酵母的醇氧化酶啟動(dòng)子pAOX1和pAOX2、二羥丙酮合成酶啟動(dòng)子pDAS、P40基因啟動(dòng)子pP40、過氧化氫酶啟動(dòng)子、甲酸脫氫酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子pGAP和甲醛脫氫酶啟動(dòng)子pFLD，以及來自酵母Candida，Hansenula和Torulopsis的真核啟動(dòng)子中選出的激活表達(dá)不沖突的二種或二種以上的啟動(dòng)子，分別構(gòu)建成外源基因表達(dá)盒，而后整合入同一宿主細(xì)胞中。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒，其特征在于所述含多種啟動(dòng)子的多表達(dá)盒是含有pAOX1與pGAP二種啟動(dòng)子的多表達(dá)盒。
3．一類含有權(quán)利要求1所述的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的基因工程菌株，其特征在于將由多種啟動(dòng)子分別構(gòu)建成的外源基因表達(dá)盒整合入同一甲醇酵母宿主細(xì)胞中，經(jīng)表達(dá)篩選得到的含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的外源基因工程菌株。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于將pAOX1與pGAP二種啟動(dòng)子分別構(gòu)建人血清白蛋白基因表達(dá)盒，整合入同一酵母宿主細(xì)胞中經(jīng)表達(dá)篩選得到保藏編號(hào)為CGMCC NO.0407含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的人血清白蛋白基因工程菌株P(guān)ichia pastoris SIB 121。
全文摘要
本發(fā)明對(duì)已有的甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn),提供甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中含有的多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒。通過尋找激活表達(dá)不沖突的啟動(dòng)子,分別構(gòu)建外源基因的表達(dá)盒,整合入同一酵母細(xì)胞后,得到整合有含多種啟動(dòng)子多表達(dá)盒的基因工程菌株,其外源蛋白的表達(dá)量明顯高于單啟動(dòng)子表達(dá)盒工程菌株。通過誘變或選擇組成型等合適的啟動(dòng)子,可以實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)和表達(dá)同時(shí)進(jìn)行,縮短發(fā)酵時(shí)間,簡(jiǎn)化發(fā)酵條件。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1283699SQ9911396
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1999年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月6日
發(fā)明者袁中一, 邱榮德, 吳星佳, 李士蕓 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所