專利名稱：PCR-mtDNA檢測鴿子源性成分的擴(kuò)增引物及其檢測試劑盒和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及禽類源性成分的檢測，尤其涉及鴿子源性成分的檢測。
背景技術(shù)：
瘋牛病、禽流感、羊搔癢病在世界各地的蔓延和傳染給人類的事例，引起了各國政 府和消費(fèi)者對肉食品、飼料安全性的高度關(guān)注。目前畜禽肉食品的動物源性成分的鑒別 檢測己涉及到肉食品的工業(yè)、進(jìn)出口貿(mào)易、市場及餐飲業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)，國內(nèi)外肉食品 及飼料貿(mào)易市場中的檢驗(yàn)檢疫工作對高新技術(shù)的需求也越來越迫切。因此，研究出一種 準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別畜禽類動物源性成分的方法，就非常有必要。目前，為了確定食物及飼料的真實(shí)成分，已經(jīng)開發(fā)了很多對動物源性成分鑒別的方 法，有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。在分子生物學(xué)方法中，分子標(biāo)記技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點(diǎn)顯示出巨 大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。目前在動植物源性成分鑒別檢測中應(yīng)用的分子標(biāo)記主 要包括核DNA 、 RNA、線粒體DNA (mtDNA)、和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記等。PCR分子標(biāo)記 鑒別檢測技術(shù)，具有特異性高、針對性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、對檢測樣品要求低(幾 乎所有的樣本都可以作為PCR的材料，它只要求樣本中有完整的靶序列核酸)，因此， 無論是經(jīng)過遠(yuǎn)途運(yùn)輸或低溫保存多年的陳舊樣本，都可以用于PCR擴(kuò)增。哺乳動物和禽類mtDNA在遺傳上相對獨(dú)立，是雙鏈的超螺旋環(huán)狀分子，具有基因 組小(約16kb)、沒有重復(fù)序列、生物個(gè)體內(nèi)無組織特異性、每個(gè)細(xì)胞中含有大量線粒 體基因組(哺乳動物約1000 2300個(gè)拷貝)等特點(diǎn)。因此，用mtDNA分子標(biāo)記鑒別畜 禽肉食品及飼料動物源性成分與核DNA分子標(biāo)記相比，具有靈敏度高、精確度好、快 速、降解小(加工過程中mtDNA保持較完整)、穩(wěn)定易操作等優(yōu)勢?；趧游飉tDNA 的PCR分子標(biāo)記技術(shù)的上述特點(diǎn)，因此在動物源性成分鑒別檢測中的應(yīng)用具有廣闊的 前景。國外已對牛、綿羊、豬、雞的源性成分進(jìn)行了研究報(bào)道，國內(nèi)對牛、綿羊、豬、雞、4驢、馬、鹿屬進(jìn)行了研究報(bào)道。在用分子生物學(xué)方法鑒定檢測動物源性成分的研究上， 國內(nèi)外尚未見到對鴿子源性成分鑒別檢測的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種PCR-mtDNA檢測鴿子源性成分的擴(kuò)增引物及其特異性引物的擴(kuò)增條件。本發(fā)明的另一 目的是提供一種PCR-mtDNA檢測鴿子源性成分的檢測試劑盒。 本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種PCR-mtDNA檢測鴿子源性成分的檢測試劑盒的使用方法。以解決準(zhǔn)確、快速、可靠的用PCR-mtDNA技術(shù)鑒別鴿子源性成分。本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn) 一種用于檢測鴿子源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其主要特點(diǎn)是上下游長度分別為22bp和20bp的核苷酸，序列如下上游弓I物GF(22bp): 5 ， -ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3 ，；下游引物GR(20bp): 5' -TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3，。所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，所述的特異性引物 的擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循環(huán)94'C變性30sec， 62. 5°C 退火30sec， 72。C延伸15sec， 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸3min。所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒，包括有① 10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20咖oL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ;③上游引物GF， 其中25pmoL/L;④下游引物GR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，2U/l^L;⑥滅菌超純水；⑦ DNA模板。所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法， 包括有如下步驟(1) 待檢物DNA的提??；(2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權(quán)利要求2的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有鴿子源性成分的檢領(lǐng),被引物GF+GR 擴(kuò)增出DNA特異性片段，即陽性。所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法， 所述的待檢物DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入50(^1細(xì)胞裂解液消^S; ,② 加入蛋白酶K10pl，濃度為20 mg/ml，慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次加入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化過夜，適時(shí)混勻多次；③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液； 4°C13000rpm/min離心10min，從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色， 中間有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)；用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成 大于3mm的口，使孔徑變大，以免核酸通過吸頭時(shí)發(fā)生機(jī)械剪切)小心吸出上 層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面；O加入RNase3 u 1 ，濃度1. 5 yl /ml，輕輕混勻37。C水浴lh;(B)降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇，其比例為25:24:1溫和的混勻 兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液； 重復(fù)步驟 ;⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提；⑨ 重復(fù)步驟④； 在水相中加入1/10體積的3M NaAc混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無水乙 醇，棄上清液；@用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min; 加入3014 TE緩沖液，室溫放置24h，然后4。C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果是，近年來隨著數(shù)個(gè)國家高致病性禽流感的相繼發(fā)生，除雞以外 已波及到人、天鵝、貓等，因感染禽流感而致死的人數(shù)不斷增加，禽類食品和飼料的安 全性已關(guān)系到人類的安危。因此，研究出準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別禽類動物源性成分的 方法和技術(shù)，對有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究以滅菌超純水對鴿DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，能檢測到的最低濃度為120pg/ul，即該引物的靈敏度是120pg/ul。

圖1為鵒、含鴿源性成分的飼料、鵪鶴、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓鴣、牛、羊、馬、 驢、魚動物的基因組DNA的電泳檢測結(jié)果圖； 圖2鴣PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖3鴿特異性基因片段的PCR檢測電泳圖；圖中1、 2kbMarker; DNA: 2、鵒；3、含鵒源性成分的飼料；4、鵪享鳥；5、雞；6、鴨；7、鵝；8、鴕鳥；9、鷓鴣；10、牛；11、羊；12、馬；13、驢14、魚；15、空白對照。 圖4鴿特異性PCR靈敏度驗(yàn)證結(jié)果檢測電泳圖。
具體實(shí)施方式
-以下對所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例l:對鵒；含鵒源性成分的飼料；鵪鶴；雞；鴨；鵝；鴕鳥；鷓鴣；牛；羊; 馬；驢；魚動物的檢測驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。(1) 總DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鴿；含鴿源性成分的飼料；鵪鶉；雞；鴨；鵝；鴕鳥；鷓鴉；牛；羊；馬；驢；魚等動物的基因組DNA，電泳檢測結(jié)果如圖1。提取基因組DNA均經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度。測定OD260/OD280值均為1.8左右，說明DNA 純度較高符合PCR擴(kuò)增要求。(2) PCR-mtDNA特異性引物的設(shè)計(jì)比較GenBank中公布的各種動物線粒體基因序列，依據(jù)其物種保守序列設(shè)計(jì)出鑒別 檢測鴿源性成分的PCR特異性引物(只能擴(kuò)增出鴿DNA特異性片段，而擴(kuò)增不出其它 動物DNA限制性片段)，引物如下上游引物GF(22bp): 5， -ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3，；下游弓I物GR(20bp): 5 ， -TATGTCCTGCGAGCATTCAC -3 ，；擴(kuò)增序列長度為156bp。(3) 鵒PCR擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的特異性弓,GF和GR，以鴿DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 (3.1 ) PCR反應(yīng)體系10 X PCR緩沖液(含Mg2+20 mmoL/L) 2. 5|4;dNTP (2.5讓oL/L) 0.5|xl;上游引物GF (25pmoL/L) 1. 0l4;下游引物GR (25pmoL/L) 1.0|4;Taq酶0. 5|4;滅菌超純水 18.DNA模板 LOW;反應(yīng)總體積為25. OW。 (3.2) PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性30sec，62. 5。C退火30sec, 72'C延伸15sec,設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸3min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(圖2)，可以看出，擴(kuò)增出約156bp的DNA片段，與預(yù)期擴(kuò)增的片段長度相符。 原理1) 模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94。C5min后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò) 增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；2) 模板DNA與引物的復(fù)性模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至57°C，引物 模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；3 )引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為 反應(yīng)原料，靶序列DNA序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與 模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-復(fù)性-延伸三個(gè)過程，就可獲得更多的 "半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。(4) 引物的特異性驗(yàn)證-利用所設(shè)計(jì)鑒別檢測鴿源性成分的特異性引物，分別以鴿子、含鵒成分的飼料樣品、鵪鶴、雞、鴨、鵝、鴕鳥、鷓聘、牛、羊、馬、驢、魚等動物和含鴿源性成分飼料的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(圖3)，該 引物能夠從鴿及含鴿成分的詞料樣品的DNA中擴(kuò)增出特異性的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大 小為156bp，而從其它動物組織的DNA中均沒有能夠擴(kuò)增出目的條帶。(5) 擴(kuò)增鵒DNA產(chǎn)物測序序列 將鴿PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后送測序公司測序。測序結(jié)果經(jīng)與GENEBANK比對分析表^^: PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果如下。與鴿mt-DNA的D-loop環(huán)區(qū)段同源性 達(dá)到94 %。鴿PCR產(chǎn)物測序序列結(jié)果acactgatgc actttgtctt ccataactcg gctggatgta atggattaag gacatacaga 60 gcttcgcccg cgagatgcac cctttcgagc atctggttatggtgtgtccg caagtaccta 120 caaatgctgc atattagtga atgctcgcag 'gacata 156(6)特異性PCR的靈敏度驗(yàn)證以滅菌朝純水對鴿DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖(圖4)可知，能檢測到的最低線為120pg/ul,即該引物的靈敏度 是120pg/ul。實(shí)施例2:對含有鴿子源性成分的飼料的PCR檢測方法。 (一)提取DNA:采用酚氯仿抽提法(參照"分子克隆試驗(yàn)指南(第二版).北京科學(xué)出版社，1995:34 60")① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入50(^1 細(xì)胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/ml)10nl，慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于5(TC水浴中消化過夜，適時(shí)混勻多次；③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液； 4°C13000rpm/min離心10min，小心從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動，可見 有清晰的分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相，一 般為黃色，中間可見有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)。用大口的tip頭(用剪刀將lml Tip頭口剪成大于3mm的口，使孔徑變大，以免核酸通過吸頭時(shí)發(fā)生機(jī)械剪切) 小心吸出上層水相，移至另一千凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase (1%) 3 y 1 (1. 5 iU /ml)，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1)溫和的混勻兩相，振 蕩2min，形成均勻乳濁液；⑦ 重復(fù)步驟④；⑧ 加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提；⑨ 重復(fù)步驟④；⑩ 在水相中加入1/10體積的3M NaAc混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無水乙 醇，棄上清液； 用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min; 加入30)4 TE緩沖液，室溫放置24h，然后4。C保存?zhèn)溆谩?二) 引物合成將上游引物GF(22bp): 5，-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3 ，;下游引物GR(20bp): 5' -TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3''送往生物公司合成，每條引物各20D ，用時(shí)稀 釋到25pmol/L。(三) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)試劑盒10XPCR緩沖液(含Mg2+20 mmoL/L) 2. 5|4;dNTP (2. 5 ,L/L) 0. 5W;上游引物GF (25pmoL/L) 1. 0W;下游引物GR (25pmoL/L)Taq酶(2U/叱) 0. 5rt;DNA模板加滅菌超純水至25ri。 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合。 PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min, 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循環(huán)94。C變性30sec， 62. 5。C退火 30sec， 72。C延伸15sec，設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸3min。(四) 電泳檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(圖3)。(五) 檢測結(jié)果含有鴿子源性成分的檢測物會被弓卿GF+GR擴(kuò)增出DNA特異性片段，即陽性。 實(shí)施例3: , 基因組DNA的提取試劑的制備(1)細(xì)胞裂解液的制備① 1M Tris-HC1 250mL:稱30.285gTris，加水定容至250mL，加HC1調(diào)解pH至8. 0，高壓滅菌，4。C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL雙蒸水中加入37. 22g E加A-Na2. 2H20,劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0 (約需4gNaOH)，定容至200 mL，分裝后高壓滅菌，4。C保存。 ③10% (m/v) SDS:將10g SDS溶于90mL雙蒸水中，加熱至68°C (助溶幾滴濃HC1， pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分裝備用，室溫保存，無須滅菌。取lmol/L的Tris-HC1 (pH8. 0) 2mL、 0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、 10% (m/v)的SDS 10mL，加滅菌雙蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制備100mg蛋白酶K溶于5ml滅菌雙蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿異戊醇(24:1):將氯仿、異戊醇按24: l的體積混合，置棕色瓶中4'C 保存。(4) 苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1):按25:24:1的體積將苯酚、氯仿、異戊醇 混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3MNaAc的制備稱取40. 8gNaAc. 3H20,溶解，加水至100mL。高壓滅菌15min ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制備稱取RNase A lOmg溶于10,1/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IO(TC加熱煮沸15min滅活DNase，緩慢冷卻至室溫，分 裝成小份保存于一2(TC。如為Sigma公司產(chǎn)品， 一般則不需加熱煮沸。序歹IJ表〈110〉深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心〈120〉 PCR-mtDNA檢測鴿子源性成分的擴(kuò)增引物及其檢測試劑盒和使用方法〈211〉 156〈212〉腿〈400〉acactgatgc actttgtctt ccataacteg gctggatgta atggatteag gacatacaga 60 gcttcgcccg cgagatgcac cctttcgagc atctggttatggtgtgtccg caagtaccta 120 caaatgctgc atattagtga atgctcgcag gacata 1561權(quán)利要求
1.一種用于檢測鴿子源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其特征是上下游長度分別為22bp和20bp的核苷酸，序列如下上游引物GF(22bp)5’-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3’；下游引物GR(20bp)5’-TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3’。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其特 征是所述的特異性引物的擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性5min， 1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入PCR循 環(huán)94。C變性30sec， 62. 5'C退火30sec， 72。C延伸15sec， 35個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸3min。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒，其特征是包括有①10XPCR緩沖液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ;③上游引物GF，其中25pmoL/L;④下游引物GR，其中25pmoL/L;⑤T叫酶， 2U/A; (D滅菌超純水；⑦DNA模板。
4. 如權(quán)利要求3所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法，其特征是包括有如下步驟:(1) 待檢物DNA的提取；(2) 將試劑盒中各組分與待檢物DNA混合，按權(quán)利要求2的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5y。瓊脂糖凝膠電泳檢測;含有鴿子源性成分的檢測物被引物GF+GR 擴(kuò)增出DNA特異性片段，即陽性。
5. 如權(quán)利要求4所述的所述的用于檢測鴿子源性成分的特異性的PCR-mtDNA檢測的試劑盒的使用方法，其特征是所述的待檢物DNA的提取有如下步驟① 稱取0.03g研碎的待檢測物樣品于高壓滅菌后的1.5ml離心管中，加入500|il 細(xì)胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10|il，濃度為20 mg/ml，慢速攪拌使之溶解并混勻，如需要可再 次加入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化過夜，適時(shí)混勻多次-,③ 將細(xì)胞裂解液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，溫和地轉(zhuǎn)動離心管混勻 兩相，使水相與酚形成乳狀液； 4°C13000rpm/min離心10min，從離心機(jī)中取出離心管，禁止晃動，有清晰的 分層，上層為水相，提取的DNA便在這上層水相中，下層為酚相， 一般為黃色，中間有白色的絮狀物為蛋白質(zhì)；用大口的tip頭吸出上層水相，移至另一干凈離心管中，盡量不要吸出兩相的交界面； 加入RNase3 u 1 ，濃度1. 5 u 1 /ml，輕輕混勻37。C水浴lh; 降至室溫后，再加入等體積酚氯仿異戊醇，其比例為25:24:1溫和的混勻兩相，振蕩2min，形成均勻乳濁液； 重復(fù)步驟 ;⑧加入等體積的氯仿異戊醇，其比例為24:1，使兩相充分混勻繼續(xù)抽提； 0)重復(fù)步驟(3);⑩在水相中加入1/10體積的3M NaAc混勻后，再加入兩倍體積的預(yù)冷的無水乙 醇，棄上清液； 用70%乙醇漂洗1次，13000rpm離心5min，棄上清液，將離心管倒置于滅菌 的濾紙上10 15min使乙醇揮發(fā)，干燥10 15min; 加入30!4 TE緩沖液，室溫放置24h，然后4。C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明主要涉及禽類源性成分的檢測，尤其涉及鴿子源性成分的檢測。一種用于檢測鴿子源性成分的特異性PCR-mtDNA擴(kuò)增引物，其主要特點(diǎn)是上下游長度分別為22bp和20bp的核苷酸，序列為上游引物GF(22bp)5’-ACACTGATGCACTTTGTCTTCC-3’；下游引物GR(20bp)5’-TATGTCCTGCGAGCATTCAC-3’。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，準(zhǔn)確、快速、可靠的鑒別鴿子源性成分的方法和技術(shù)，對有效抵御禽流感及其它禽類疫病的傳播和蔓延，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以滅菌超純水對鴿DNA模板進(jìn)行稀釋，使其濃度分別降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果可知，能檢測到的最低濃度為120pg/ul，即該引物的靈敏度是120pg/ul。
文檔編號C12Q1/68GK101260439SQ20081008241
公開日2008年9月10日 申請日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者吳建平, 卉 宗, 張利平, 張慧霞, 曹琛福, 李麗娟 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心