專(zhuān)利名稱(chēng)：：在活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)中具有額外氨基酸殘基的i-s1和i-s2亞組枯草桿菌酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶(subtilase)，其在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基。這些蛋白酶當(dāng)用于洗滌劑、清潔和洗滌劑組合物時(shí)，顯示出色的或改良的洗滌性能。本發(fā)明還涉及編碼用于所述酶表達(dá)的基因，當(dāng)所述基因插入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或生物時(shí)表達(dá)所述酶。本發(fā)明還涉及用所述基因轉(zhuǎn)化的且能夠表達(dá)所述酶變體的宿主細(xì)胞，以及制備新型酶的方法發(fā)明背景在洗滌劑工業(yè)中，酶在洗滌配方中的應(yīng)用已經(jīng)超過(guò)30年。用于這些制劑的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纖維素酶以及其它酶，或者它們的混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。越來(lái)越多的商業(yè)上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程變體，如DURAZYM⑧(NovoNordiskA/S)、RELASE(NovoNordiskA/S)、MAXAPEM(Gist-BrocadesN.V.)、PURAFECT(Genencor國(guó)際有卩^/>司)。還有許多蛋白酶變體在本領(lǐng)域中已有描述，如EP130756(GENENTECH)(相應(yīng)于美國(guó)再頒專(zhuān)利34，606(GENENCOR));EP214435(HE服EL);WO87/04461(AMGEN);WO87/05050(GENEX);EP260105(GENENCOR);Thomas,Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318375-376;Thomas,Russell和Fersht(1987)分子生物學(xué)雜志(丄Mol.Bio1.)193803-813;Russell和Fersht(1987)自然328496-500(1987);WO88/08028(Genex);WO88/08033(AMGEN);WO95/27049(SOLVAYS.A.);WO95/30011(PROCTER&GAMBLE公司)；WO95/30010(PROCTER&GAMBLE公司)；WO95/29979(PROCTER&GAMBLE公司)；US5.543.302(SOLVAYS.A.);EP251446(GENENCOR);WO89/06279(NovoNordiskA/S);WO91/00345(NovoNordiskA/S);EP525610Al(SOLVAY)和WO9衡618(GIST-BROCADESN.V.)。然而，盡管已經(jīng)描述了許多有用的蛋白酶變體，許多工業(yè)用途仍然需要新的改良的蛋白酶或蛋白酶變體。因此，本發(fā)明的目的是提供改良的蛋白酶或蛋白質(zhì)工程化蛋白酶變體，尤其是用于洗滌劑工業(yè)。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了這樣的枯草桿菌酶，其中至少一個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)比那些已知的長(zhǎng)，所述酶在洗滌劑組合物中顯示改進(jìn)的洗滌性能。在構(gòu)建尤其是枯草蛋白酶309(BLSAVI或SAVINASE)的枯草蛋白酶(subtilisin)變體中對(duì)其進(jìn)行了鑒定，相對(duì)于親本野生型酶該酶顯示出改進(jìn)的洗滌特性。這一點(diǎn)在我們?cè)缦鹊纳暾?qǐng)DK1332/97中已描述。已知I-S1(真"枯草蛋白酶")或I-S2(高堿性枯草蛋白酶)亞組中的某些枯草桿菌酶或其變體在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位(或在96位與97位之間)具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，與目前已知的那些和在所述申請(qǐng)中描述的那些相比，所述酶顯示出人意料的改良的洗滌性能。本發(fā)明改進(jìn)的蛋白酶可通過(guò)從自然資源中分離獲得，或通過(guò)在野生枯草桿菌酶的96與97位之間的活性位點(diǎn)環(huán)(b)中導(dǎo)入至少一個(gè)額外的氨基酸殘基(一個(gè)插入)獲得(對(duì)于活性位點(diǎn)環(huán)和位置編碼見(jiàn)下述)。盡管本發(fā)現(xiàn)是在枯草蛋白酶309，預(yù)計(jì)可能產(chǎn)生或分離類(lèi)似有益的枯草桿菌酶或枯草桿菌酵變體。此外，可能通過(guò)特異地篩選天然分離抹，以鑒別新的野生型枯草桿菌酶，其含有至少一個(gè)比已知野生型枯草桿菌酶相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)更長(zhǎng)的活性位點(diǎn)環(huán)(b),如枯草蛋白酶309，該枯草桿菌酶被認(rèn)為在96與S)7位之間具有一個(gè)插入的氨基酸殘基，且與最相關(guān)的已知枯草蛋白酶(如枯草蛋白酶309)相比顯示在洗滌劑中出色的洗滌性能。相關(guān)的序列比較及編碼參照見(jiàn)如下圖1、la、2和2a,顯示枯草蛋白酶BPN，(BASBPN)(a)和枯草蛋白酶309(BLSAVI)(b)之間的序列比較，以及枯草蛋白酶BPN，(BASBPN)(a)和枯草蛋白酶Carlsberg(g)之間的序列比較。在圖1和2中，利用GCG軟件包常規(guī)GAP如下所示進(jìn)行序列比較，而圖la和2a的序列比較同WO91/00345所示。這些序列比較在本發(fā)明中用做殘基編碼的參照。在此定義了七個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)(a)至(g)(包括所示的兩個(gè)末端的氨基酸殘基)以涵蓋如下區(qū)段的氨基酸殘基(a)氨基酸殘基33-43之間的區(qū)域；(b)氨基酸殘基95-103之間的區(qū)域；(c)氨基酸殘基125-132之間的區(qū)域；(d)氨基酸殘基153-173之間的區(qū)域；(e)氨基酸殘基181-195之間的區(qū)域；(f)氨基酸殘基202-204之間的區(qū)域；和(g)氨基酸殘基218-219之間的區(qū)域。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種分離的(即純度〉10Vo)的I-Sl和I-S2亞組的枯草桿菌酶，其在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在96-97位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入片段。本發(fā)明第二方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。本發(fā)明第三方面涉及含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明第四方面涉及轉(zhuǎn)化了第四方面的表達(dá)載體的微生物宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶的生產(chǎn)。本發(fā)明的酶可一般地通過(guò)如下方法生產(chǎn)，培養(yǎng)微生物并從中分離且以基本上純的形式回收酶；或者通過(guò)將第四方面的表達(dá)栽體插入到合適的微生物宿主中，培養(yǎng)宿主以表達(dá)需要的枯草桿菌酶，并回收酶產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。最后本發(fā)明涉及本發(fā)明的酶在許多工業(yè)相關(guān)應(yīng)用中的用途，特別是在清潔組合物中的用途，以及在含有突變酶的清潔組合物，尤其是含有突變枯草桿菌蛋白酶的洗滌劑組合物中的用途。定義在進(jìn)一步詳細(xì)論述本發(fā)明之前，先定義下列術(shù)語(yǔ)。氨基酸的命名A=Ala=丙氨酸V=Va卜=纈氨酸L=Leu=亮氨酸1=lie-:異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met-甲硫氨酸G=Gly-甘氨酸S=Ser:=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬酰胺Q(chēng)=Gin=谷氨能胺D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸K=Lys-賴(lài)氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸X=Xaa=任何氨基酸核酸命名A=腺嘌呤G=鳥(niǎo)噤呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(只存在于DNA中)U=尿嘧咬(只存在于RNA中)變體的命名在描述本發(fā)明產(chǎn)生或包括的各種酶變體時(shí)，采用以下命名法以便于參考首先通過(guò)分離的或親本野生型酶與枯草蛋白酶BPN'(BASBPN)的排列比較定義參照框架。利用如下參數(shù)區(qū)間產(chǎn)生罰=8及區(qū)間延伸罰=8且所有其他參數(shù)保持為默認(rèn)值，通過(guò)GCG軟件包9.1版的GAP常規(guī)分析可獲得排列對(duì)比。另一種方法是利用已知的公認(rèn)的枯草桿菌酶之間的排列對(duì)比，如WO91/00345中所示的排列對(duì)比。在多數(shù)情況下，差異并不重要。在圖1、la、2和2a中分別顯示了枯草蛋白酶BPN，(BASBPN)和枯草蛋白酶309(BLSAVI)及枯草蛋白酶Carlsberg(BLSCAR))之間的序列比較。由此相對(duì)于BASBPN可定義許多缺失和插入。在圖1中，相比于BASBPN,枯草蛋白酶309在36、58、158、162、163和164位具有6個(gè)缺失，而在圖la中，相比于BASBPN,枯草蛋白酶309在36、56、159、164、165和166位具有同樣的缺失。在困2中，相比于BASBPN,枯草蛋白酶Carlsberg在58位具有1個(gè)缺失，而在圖2a中，相比于BASBPN,枯草蛋白酶Carlsberg在56位具有l(wèi)個(gè)缺失。這些缺失在圖l、la、2和2a中由星號(hào)(*)顯示。在野生型酶中進(jìn)行的多種修飾一般地使用如下三種要素顯示原始氨基酸位點(diǎn)替換的氨基酸注釋G195E因此是指195位的甘氨酸由谷氨酸替換。在原始氨基酸可以是任何氨基酸殘基的情況下，有時(shí)可以使用簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)，只表示位點(diǎn)和取代氨基酸位點(diǎn)替換的氨基酸這種符號(hào)在表示同源枯草桿菌酵內(nèi)的修飾時(shí)尤其合適(見(jiàn)下文)。類(lèi)似地，當(dāng)替換氨基酸殘基的身份不明確時(shí)，表示為原始氨基酸位點(diǎn)當(dāng)原始氨基酸和替換氨基酸都可能是任何氨基酸時(shí)，則僅表示位點(diǎn)，如170。當(dāng)原始氨基酸和/或替換氨基酸可包括一種以上氨基酸但非所有氨基酸時(shí)，則可選的氨基酸表示于括號(hào)U中原始氨基酸位點(diǎn)f替換的氨基酸v....替換的氨基酸J對(duì)于特定的變體，使用特異的三字母或單字母符號(hào)，包括用Xaa和X表示任何氨基酸殘基.替換在位點(diǎn)195由谷氨酸替換甘氨酸被記做Gly195Glu或G195E在位點(diǎn)195由任何氨基酸替換甘氨酸被記做Glyl95Xaa或G195X,或者Gly195或G195因此在位點(diǎn)170由絲氨酸替換任何氨基酸殘基記作Xaal70Ser或X170S，或者170Ser或170S這種符號(hào)在表示同源枯草桿菌酶內(nèi)的修飾時(shí)尤其合適(見(jiàn)下文)。因此，170Ser意指包括例如BASBPN內(nèi)的Lysl70Ser修飾和BLSAVI內(nèi)的Argl70Ser修飾。有關(guān)這些實(shí)例參見(jiàn)圖1。對(duì)于原始氨基酸和/或替換氨基酸可包括一種以上氨基酸但非所有氨基酸的修飾，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸替換170位的精氨酸可記作Arg170(Gly，Ala，Ser，Thr}或R170(G，A，S，T}以表示變體R170G，R170A，R170S，R170T。刪除195位的甘氨酸被刪除記做Gly195*或G195*相應(yīng)地，一個(gè)以上氨基酸殘基的刪除，如195和196位的甘氨酸和亮氨酸的刪除記作Glyl95*+Leul96*或G195*+L196*插入一個(gè)額外的氨基酸殘基的插入如G195后插入賴(lài)氨酸記做Gly195GlyLys或G195GK;或者當(dāng)插入一個(gè)以上氨基酸殘基時(shí)，如G195后插入賴(lài)氨酸、丙氨酸和絲氨酸，可記作Gly195GlyLysAlaSer或G195GKAS在這樣的情況下，插入的氨基酸殘基的編號(hào)用該插入氨基酸前的氨基酸殘基位點(diǎn)號(hào)加上小寫(xiě)字母表示。在上述實(shí)例中，序列194-196可記作194195196BLSAVIA-G-L194195195a195b195c196變體AG-K-AS-L如果插入一個(gè)與已有氨基酸殘基相同的氨基酸殘基，顯然在命名上可以有幾種方式。例如，在上述實(shí)例中，在甘氨酸后插入一個(gè)甘氨酸可表示為G195GG。這一相同的改變也可以表示為A194AG，顯示由194195196BLSAVIA-G-L改變?yōu)?94195195a196變體A-G-G-L194194a195196這樣的情形是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，因此G195GG和表示同一類(lèi)型插入的相應(yīng)記法意指包括這樣的等同簡(jiǎn)并記法。缺口的填充當(dāng)一種酶與用于編號(hào)的枯草桿菌蛋白酶序列相比存在刪除時(shí)，在該位點(diǎn)的插入記法類(lèi)似于用*36Asp或"6D表示天冬氨酸在位點(diǎn)36的插入。多重修飾含有多重修飾的變體用加號(hào)分開(kāi)，如Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E表示在位點(diǎn)170和195分別用酪氨酸和谷氨酸替換精氨酸和甘氨酸的修飾?；蛘呃鏣yrl67{Gly，Ala，Ser，Thr}+Argl70{Gly，Ala，Ser，Thr}表示變體Tyrl67Gly+Argl70Ala,Tyrl67Gly+Argl70Thr,Tyrl67Ala+Arg170Ala,Tyr167Ala+Arg170Thr,Tyrl67Ser+Argl7OAla,Tyrl67Ser+Argl70Thr,Tyr167Thr+Argl7OAla,和Tyrl67Thr+Argl70Thr.Tyi:167Gly+Argl70Gl,Tyrl67Gly+Argl70Se:r,Tyrl67Ala+Argl70Gly,Tyrl67Ala+Argl70Ser,Ty;rl67Ser+Argl70Gly,Tyrl67Ser+Argl70Ser,Ty:rl67Thr+A;rgl70Gly,Tyrl67Th;r+Argl70Se;r,在表示有關(guān)具有特定共同特征的氨基酸殘基的替換、代替、插入或刪除，例如帶正電荷的殘基(K，R，H)、帶負(fù)電荷的殘基(D，E)或保守氨基酸修飾時(shí)，這種命名法特別有用，例如Tyrl67(Gly，Ala，Ser，Thr〉十Argl70{Gly，Ala，Ser，Thr}表示用小氨基酸替換另一小氨基酸。詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)"發(fā)明詳述"部分。蛋白酶將能切開(kāi)蛋白質(zhì)底物中酰氨鍵的酶歸類(lèi)為蛋白酶或肽酶(可互換使用)(參閱Walsh，1979，酶反應(yīng)機(jī)制(EnzymaticReactionMechanisms),W.H.FreemanandCompany,舊金山，第三章)。氨基酸位點(diǎn)/殘基的編號(hào)如果沒(méi)有特別指出，本文使用的氨基酸編號(hào)相應(yīng)于枯草桿菌酶BPN，(BASBPN)序列的編號(hào)。BPN，序列的進(jìn)一步描述參閱Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngng.)4(1991)719-737和圖1。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是指能催化肽鍵水解，并且在其活性位點(diǎn)存在必需絲氨酸殘基的酶(White，Handler和Smith,1973"生化原理"(PrinciplesofBiochemistry),第五版，McGraw-Hill書(shū)籍公司，紐約，第271-272頁(yè))。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍為20，000—45，000道爾頓。它們被二異丙基磷酸氟抑制。它們水解簡(jiǎn)單的末端酯，而且與真核生物的糜蛋白酶(也是絲氨酸蛋白酶)的活性相似。范圍更窄的術(shù)語(yǔ)-堿性蛋白酶(包括一個(gè)亞組)反映了一些絲氨酸蛋白酶最適pH高，從pH9.0到ll.O(有關(guān)綜述參閱Priest(1977)細(xì)菌學(xué)回顧(BacteriologicalRev.)41711-753)。絲氨酸蛋白酶的一個(gè)暫時(shí)命名為枯草桿菌酶的亞組，由Siezen等人[蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737提出。它們由對(duì)170多種絲氨酸蛋白酶(以前被稱(chēng)作枯草蛋白酶樣蛋白酶(subtilisin-likeprotease))的氨基酸序列同源分析確定?？莶輻U菌蛋白酶以前常被定義為由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人的定義，它是枯草桿菌酶的一個(gè)亞組。已經(jīng)鑒定了多種枯草桿菌酶，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已經(jīng)測(cè)定。關(guān)于這些枯草桿菌酶更詳細(xì)的描述和它們的氨基酸序列參閱Siezen等人(1997)的文獻(xiàn)。枯草桿菌酶的一個(gè)亞組，I-S1或"真枯草蛋白酶"，包括"經(jīng)典的"枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶BPN，、枯草蛋白酶Carlsberg(ALCALASE②，NovoNordiskA/S)和枯草蛋白酶DY。由Siezen等人(見(jiàn)上文)劃分了枯草桿菌酶的另一個(gè)亞組，I-S2。I-S2亞組蛋白酶被描述成高度堿性的枯草蛋白酶，包括如枯草蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL,Gist-BrocadesNV)、枯草蛋白酶309(SAVINASE,NovoNordiskA/S)、枯草蛋白酶147(ESPERASE,NovoNordiskA/S)和堿性彈性蛋白酶YaB?？莶輻U菌酵首字母縮略詞列表I-SI枯草蛋白酶168，BSS168(BSSAS(SuMilisinamylosacchariticus),BSAPRJ(枯草蛋白酶J)，BSAPRN(枯草蛋白酶NAT)，BMSAMP(Mes-entericopeptidase),枯草蛋白酶BPN，，BASBPN，枯草蛋白酶DY，BSSDY，枯草蛋白酶Carlsberg，BLSCAR(BLKERA(角蛋白酶)，BLSCAl，BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC,絲氨酸蛋白酶CBSSPRD,絲氨酸蛋白酶DI一S2枯草蛋白酶Sendai，BSAPRS枯草蛋白酶ALP1，BSAPRQ，枯草蛋白酶147,EsperaseBLS147(BSAPRM(枯草蛋白酶AprM)，BAH101)，枯草蛋白酶309，Savinase⑧，BLS309/BLSAVI(BSKSMK(M-蛋白酶)，BAALKP(枯草蛋白酶PB92,嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilic)堿性蛋白酶)，BLSUBL(枯草蛋白酶BL))，堿性彈性蛋白酶YaB，BYSYAB，"SAV脆SE⑧"SAVINASE⑧由NovoNordiskA/S出售。它是來(lái)源于遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶309，而且與BABP92只在一個(gè)位點(diǎn)不同(N87S，參閱本文圖1)。SAVINASE②具有命名為BLSAVI的氨基酸序列(參見(jiàn)本文圖1)。親本枯草桿菌酶術(shù)語(yǔ)"親本枯草桿菌酶"指根據(jù)Siezen等人(蛋白質(zhì)工程4:719-737(1991))定義的枯草桿菌酶。進(jìn)一步細(xì)節(jié)參閱上文"枯草桿菌酶"的描述。親本枯草桿菌酶也可以是由天然來(lái)源分離得到的枯草桿菌酶，隨后進(jìn)行了修飾而同時(shí)保留了枯草桿菌酶的特征。術(shù)語(yǔ)"親本枯草桿菌酶"或者可以稱(chēng)作"野生型枯草桿菌酶"?？莶輻U菌酶變體的修飾本文中使用的術(shù)語(yǔ)"修飾"被定義為包括枯草桿菌酶化學(xué)修飾以及編碼枯草桿菌酶的基因搡作。修飾可以是在感興趣的氨基酸位點(diǎn)處的替換、刪除和/或插入。枯草桿菌酶變體在本文中，術(shù)語(yǔ)枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達(dá)突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該突變基因來(lái)源于具有原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，其中親本基因已經(jīng)被突變以得到在合適的宿主中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生突變枯草桿菌酶的突變基因。同源枯草軒菌酶序列本文鑒定了枯草桿菌酶SAVINASE中的特異活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)以及所迷環(huán)中進(jìn)行修飾的氨基酸插入，以得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。然而，本發(fā)明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而可以擴(kuò)展到與8入￥^\入8￡*有同源的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。為了鑒定其它同源枯草桿菌酶之間的同一性程度，可使用相同的參數(shù)設(shè)置利用GCG軟件包9.1版的GAP常規(guī)進(jìn)行。由常規(guī)分析的輸出結(jié)果在氨基酸排列比較旁，計(jì)算了兩個(gè)序列間"同一性百分比"基于此處的描述，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言筌定適當(dāng)?shù)耐葱钥莶輻U菌酶和相應(yīng)的同源性活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)是常規(guī)技術(shù)，其可依本發(fā)明進(jìn)行修改。洗滌性能酶在例如清洗過(guò)程或硬表面清潔過(guò)程中催化待清洗物體上的各種天然存在底物的降解的能力，通常被稱(chēng)作它的洗滌能力(washingability)、可洗力(washability)、去紫力(detergency)或洗涂'炷能(washperformance).在本申請(qǐng)中，用術(shù)語(yǔ)洗滌性能表示這種特性。分離的DNA序列術(shù)語(yǔ)"分離的"，當(dāng)應(yīng)用于DNA序列分子時(shí)，表示該DNA序列已從其天然遺傳環(huán)境中取出，并且因而不含其它無(wú)關(guān)的或多余的編碼序列，而且以適合于在基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式存在。這些分離的分子是與其天然環(huán)境分開(kāi)的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含它們最初與之相關(guān)的其它基因，但是可能包含天然存在的5，和3'非翻譯區(qū)如啟動(dòng)子和終止子。這些相關(guān)區(qū)域的鑒定顯然是本領(lǐng)域的基本技術(shù)之一(參閱如Dynan和Tijan,直然,ure)316:774-78，1985)。術(shù)語(yǔ)"分離DNA序列"也可稱(chēng)作"克隆DNA序列"。分離的蛋白質(zhì)當(dāng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語(yǔ)"分離的"說(shuō)明該蛋白質(zhì)存在于不同于它的天然環(huán)境的條件下。分離的蛋白質(zhì)優(yōu)選基本不含其它蛋白質(zhì)，尤其是其它同源蛋白質(zhì)(即"同源雜質(zhì)"(見(jiàn)下文))。分離蛋白質(zhì)由SDS-PAGE測(cè)定純度高于10%，優(yōu)選高于20%,更優(yōu)選高于30%。優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即由SDS-PAGE鑒定純度高于40%、純度高于60%、純度高于80%,更優(yōu)選純度高于95%,甚至更優(yōu)選純度高于99%。術(shù)語(yǔ)"分離的蛋白質(zhì)"也可稱(chēng)作"純化的蛋白質(zhì)"。同源雜質(zhì)術(shù)語(yǔ)"同源雜質(zhì)"指來(lái)自本發(fā)明多肽最初來(lái)源的同源細(xì)胞中的任何雜質(zhì)(如除本發(fā)明多肽外的另一種多肽)。來(lái)源于如本文與特殊微生物來(lái)源一起使用的術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于、指多核苷酸和/或多肽由特殊來(lái)源、或由插入了來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。底物術(shù)語(yǔ)"底物"與蛋白酶底物有關(guān)的使用，應(yīng)當(dāng)被理解為其范圍最寬的形式，如含有至少一個(gè)易被蛋白酶水解的肽鍵的化合物。產(chǎn)物術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)物"與來(lái)源于蛋白酶酵反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的使用在本文中應(yīng)當(dāng)被理解為包括涉及枯草桿菌酶蛋白酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可能是下一個(gè)水解反應(yīng)的底物。圖的簡(jiǎn)要描述圖1顯示了利用上述GAP常規(guī)方法的枯草蛋白酶BPN，(a)與Savinase(b)之間的排列比較。圖la顯示了取自WO91/00345D的枯草蛋白酶BPN，與Savinase之間的排列比較。圖2顯示了利用上迷GAP常規(guī)方法的枯草蛋白酶BPN，與枯草蛋白酶Carlsberg之間的排列比較。。圖2a顯示了取自WO91/00345D的枯草蛋白酶BPN，與枯草桿菌酶Carlsberg之間的排列比較。圖3顯示Savinase(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)錄入號(hào)1SVN)的三維結(jié)構(gòu)。此圖顯示了本文感興趣的活性位點(diǎn)環(huán)(b)。發(fā)明詳述本發(fā)明枯草桿菌酶的第一方面涉及一種分離的(即純度>10%)的I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶，其在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在96-97位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入片段。換言之，本發(fā)明的枯草蛋白酶特征在于，包含一個(gè)多于9個(gè)氨基酸殘基的活性位點(diǎn)環(huán)(b),與親本或已知野生型枯草蛋白酶相比，其中額外的氨基酸殘基是或可以被認(rèn)為在96與97位插入。本發(fā)明第一方面的枯草桿菌酶可以是從自然界鑒定并分離出的親本或野生型枯草桿菌酶。這樣的親本野生型枯草桿菌酶可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)特異地篩選出來(lái)。完成這項(xiàng)工作的一種優(yōu)選途徑是從各種不同的微生物，優(yōu)選不同的芽孢桿菌菌抹中，用PCR特異性擴(kuò)增已知編碼枯草桿菌酶的活性位點(diǎn)環(huán)的DNA區(qū)。枯草桿菌酶是一組保守的酶，因?yàn)樗鼈兊腄NA和氨基酸序列有同源性。因此，有可能構(gòu)建活性位點(diǎn)環(huán)側(cè)翼的相對(duì)特異引物。例如，通過(guò)分析不同枯草桿菌酶的對(duì)比(參見(jiàn)例如Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(ProteinScience),6:501-523，1997)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地構(gòu)建例如對(duì)應(yīng)于I-S1或I-S2組中任一個(gè)(如來(lái)自BLSAVI)的氨基酸殘基95-103之間的活性位點(diǎn)環(huán)(b)的活性位點(diǎn)環(huán)側(cè)翼的PCR引物。利用這些PCR引物，從不同的微生物，優(yōu)選不同的芽孢桿菌菌抹擴(kuò)增DNA,隨后對(duì)擴(kuò)增出的PCR片段進(jìn)行DNA測(cè)序，有可能筌定出能生產(chǎn)含有相比于BLSAVI內(nèi)95-103的相應(yīng)活性位點(diǎn)區(qū)、但更長(zhǎng)的活性位點(diǎn)區(qū)，并且其中插入片段可被認(rèn)為存在于位置96和97之間的枯草桿菌酶的那些菌抹。鑒定出菌抹及感興趣的枯草桿菌酶的部分DNA序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地完成目的枯草桿菌酶的克隆、表達(dá)和純化。然而，預(yù)計(jì)本發(fā)明枯草桿菌酶主要是親本枯草桿菌酶的變體。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明第一方面的分離的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是一種比其親本酶有更長(zhǎng)活性位點(diǎn)環(huán)(b)的構(gòu)建變體，該變體在氨基酸殘基96和97之間含有至少一個(gè)氨基酸的插入。本發(fā)明的枯草桿菌酶在洗滌劑中顯示出色的洗滌性能，如果該酶是構(gòu)建的變體，與其最相關(guān)的枯草桿菌酶(如枯草蛋白酶309)相比顯示在洗滌劑中改進(jìn)的洗滌性能。不同的枯草桿菌酶蛋白酶產(chǎn)品在不同類(lèi)型的洗滌劑組合物中將具有不同的洗滌性能。本發(fā)明的枯草桿菌酶在大多數(shù)不同類(lèi)型的洗滌劑組合物中具有改善的洗滌性能。如本文實(shí)施例3所示，優(yōu)選本發(fā)明的枯草桿菌酶在洗滌劑組合物(見(jiàn)下文)中具有改善的洗滌性能。為鑒定一種給定的枯草桿菌酶氨基酸序列(不論該枯草桿菌酶序列是親本野生型枯草桿菌酶序列還是由定點(diǎn)突變之外的方法產(chǎn)生的枯草桿菌酶變體序列)是否在本發(fā)明枯草桿菌酶序列的范圍之內(nèi)，可以進(jìn)行下述步驟i)對(duì)所述枯草桿菌酶與枯草蛋白酶BPN，(參見(jiàn)本文"定義"部分進(jìn)行對(duì)比(見(jiàn)上文)，；ii)根據(jù)步驟i)進(jìn)行的對(duì)比，鑒定出所述枯草桿菌酶序列中對(duì)應(yīng)于枯草蛋白酶BPN，(包括兩端氨基酸在內(nèi)的95-103位氨基酸殘基之間的區(qū)域)活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)(b)的活性位點(diǎn)環(huán)；iii)確定步驟ii)中鑒定出的所述枯草桿菌酶序列中的一個(gè)或多個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)是否比BLSAVI中的相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)更長(zhǎng)，以及所述延長(zhǎng)是否相應(yīng)于96-97位之間的至少一個(gè)氨基酸殘基。如果滿足這樣的標(biāo)準(zhǔn)，則該枯草桿菌酶是本發(fā)明范圍內(nèi)的枯草桿菌酶序列。利用GAP常規(guī)方法進(jìn)行上述步驟i)中的排列比較。根據(jù)上文描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地鑒定出枯草桿菌酶的活性位點(diǎn)環(huán)(b)以及所述枯草桿菌酶是否落入本發(fā)明的范圍。如果變體通過(guò)定點(diǎn)突變方法構(gòu)建，當(dāng)然可事先知道該枯草桿菌酶變體是否落入本發(fā)明的范圍?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)/隨機(jī)誘變或不同枯草桿菌酶序列的DNA重排構(gòu)建枯草桿菌酶變體。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參閱"生產(chǎn)枯草桿菌酶變體"部分以及本文的材料與方法(見(jiàn)下文)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及1.根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個(gè)選自T、G、A和S;2.根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所迷插入氨基酸殘基中的至少一個(gè)逸自帶電氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選選自D、E、K和R;3.根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個(gè)選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選選自N、Q、S和T;4.根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個(gè)選自小的疏水性氨基酸殘基A、G和V;或5.根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個(gè)選自大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y,更優(yōu)選選自F、I、L、M和Y。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中位點(diǎn)96與97之間的的所述插入與BLSAVI內(nèi)的相應(yīng)活性位點(diǎn)環(huán)相比包含有至少兩個(gè)氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的一種分離的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶包含選自下組的至少一個(gè)插入(BASBPN編號(hào)法)或更具體的枯草蛋白酶309和最相關(guān)枯草桿菌酶，如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK。L96LAL96LSIi96LiCIi96LNX96X(T,G,A,S}X96X(D,E,K,RX96X(H,V,C,N,Q)L96LFL9SLPIj9SLWL96LY此外，本發(fā)明涉及含有如下的在96位多重插入的枯草桿菌酶或下列任一的一種組合L96LA+A38TL96:LG+A98T+S103TIj96IjG+A98T+Y167AL96LjG+G100SL96LG+G100S+Y167ALi96L!G+Y167AIj96L!G+S99T+S101AL96LG+A98G+S99G+S101T+S103T本領(lǐng)域內(nèi)熟知一個(gè)氨基酸被所謂的保守氨基酸替換通常只引起酶特性的微小改變。下面的表III列出了幾組保守氨基酸。表ni保守氨基酸替換共同性質(zhì)氨基酸堿性的R-精氨酸K-賴(lài)氨酸H=組氨酸酸性的E-谷氨酸D-天冬氨酸極性的Q-谷氨跣胺N-天冬跣胺疏水性的L=亮氨酸1=異亮氨酸V-纈氨酸M=甲硫氨酸芳香族的F-苯丙氨酸W=色氨酸Y=酪氨酸小的G-甘氨酸A=丙氨酸S-絲氨酸T=蘇氨酸因此，包含保守性替換的枯草桿菌酶變體如G97A+A98AS+S99G,G97S+A98AT+S99A預(yù)期具有彼此間無(wú)甚差異的特征。根據(jù)本文公開(kāi)的和/或是舉例的枯草桿菌酶變體，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所有方面和實(shí)施方案可以常規(guī)地鑒定出這些變體的適當(dāng)?shù)谋Ｊ匦揎?，以獲得具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，感興趣的是那些屬于I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶，其用于從天然或從人工產(chǎn)生的不同種類(lèi)中分離本發(fā)明的新型酶，且用于從親本酶中設(shè)計(jì)和產(chǎn)生變體。關(guān)于從I-Sl亞組的變體，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自BSS168(BSSAS，BSAPRJ,BSAPRN，BMSAMP)、BASBPN、BSSDY和BLSCAR(BLKERA，BLSCA1,BLSCA2,BLSCA3)，BSSPRC，和BSSPRD,或它們的保留了I-Sl亞組特征的功能性變體。關(guān)于從I-S2亞組的變體，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自BSAPRQ，BLS147(BSAPRM，BAH101)、BLSAVI(BSKSMK,BAALKP，BLSUBL)、BYSYAB和BSAPRS,或它們的保留了I-S2亞組特征的功能性變體。更具體地說(shuō)，所述親本枯草桿菌酶是BLSAVI(SAVINASE，NOVONORDISKA/S)，且本發(fā)明的優(yōu)選枯草桿菌酶變體是8入￥^入8￡@的變體。本發(fā)明還包括上述本發(fā)明的枯草桿菌酶與任何其他對(duì)親本酶氨基酸序列的修飾的組合。尤其包括與本領(lǐng)域所知的用以改良酶特性的其它修飾的組合。本領(lǐng)域描述了許多具有不同改良特性的枯草桿菌酶變體，其中一部分在本文"發(fā)明背景"部分中提及(見(jiàn)上文)。那些參考文獻(xiàn)在本文公開(kāi)，作為鑒定可以有利地與本發(fā)明枯草桿菌酶變體相組合的枯草桿菌酶變體的參考。這些組合包括位點(diǎn)222(改善氧化穩(wěn)定性)和218(改善熱穩(wěn)定性)，Ca結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的替換使酶穩(wěn)定，如位點(diǎn)76，和現(xiàn)有技術(shù)已知的許多其它修飾。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以有利地與下列任何位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)修飾組合27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。特別地，下面的BLSAVI,BLSUBL，BSKSMK和BAALKP變體被認(rèn)為適合于組合K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。另外，包括V104N+S101G、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A變異或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合的任何變異與任何一個(gè)或多個(gè)上文提及的修飾組合的變體具有改良的特性。此外，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與129、131、133和194中任何位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)修飾(更優(yōu)選129K、131H、133P、133D和194P修飾，最優(yōu)選P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修飾)組合。那些修飾中的任何一種都使本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的表達(dá)水平更高。因此，本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的變體，其中所述修飾選自下組產(chǎn)生枯草桿菌酶變體用于克隆本發(fā)明的枯草桿菌酶和用于將插入引入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域中是眾所周知，參見(jiàn)"發(fā)明背景"部分引用的文獻(xiàn)。通常，可以使用克隆基因和在該基因中引入插入(隨機(jī)和/或定點(diǎn))的標(biāo)準(zhǔn)方法得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。關(guān)于合適技術(shù)的進(jìn)一步描述參閱本文實(shí)施例(見(jiàn)下文)和(Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；F.M.Ausubel等人(主編)"分子生物學(xué)的最新方法"，JohnWileyandSons,1995;C.R.Harwood和S.M.Cutting(主編)"芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法"，JohnWileyandSons,(1990);和WO96/34946)。此外，本發(fā)明枯草桿菌酶變體可以通過(guò)例如不同枯草桿菌酶基因的DNA重排的用于人工產(chǎn)生多樣性之標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建(W095/22625;StemmerWPC，自然370:389-91，1994)。例如將Savinase⑧與自然界中筌定出的包含比83￥111386@活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)更長(zhǎng)的相應(yīng)區(qū)的一或多個(gè)枯草桿菌酶部分序列的DNA重排，隨后篩選洗滌性能有所改善的變體，可以提供本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體。載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。由此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外實(shí)體形式存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣一種類(lèi)型，當(dāng)它被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中時(shí)，會(huì)部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中，并與整合的染色體一起復(fù)制。載體優(yōu)選是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地連接于DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體來(lái)源于質(zhì)粒或病毒DNA，或者可以含有二者的元件。術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"指的是諸區(qū)段的排列方式使得它們能夠行使與預(yù)期用途(如轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子起始并貫穿編碼酶的DNA序列)一致的功能。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以來(lái)源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子，或者入噬菌體Pk或Pt啟動(dòng)子，或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動(dòng)子。如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接合適的終止子。本發(fā)明的重組栽體還可以含有使栽體能夠在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。栽體還可以含有選擇標(biāo)記，如其產(chǎn)物互補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因，或者編碼對(duì)卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕?。為了將本發(fā)明的酶導(dǎo)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào)序列(也稱(chēng)作前導(dǎo)序列、前體序列或前序列)。分泌信號(hào)序列以正確的閱讀框架與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號(hào)序列通常位于編碼酶的DNA序列的5，端。分泌信號(hào)序列可以是通常與酶有關(guān)的序列或可以來(lái)自編碼其它分泌蛋白的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選地終止子和/或分泌信號(hào)序列，或用適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增方案將這些序列裝配起來(lái)，和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的合適載體的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參閱如Sambrook等人，出處同上)。宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以是與所選宿主同源或異源的序列。如果與宿主細(xì)胞同源，即由宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的，則通常將它可操作地連接另一個(gè)啟動(dòng)子序列，或者如果可行的話，可連接另一分泌信號(hào)序列和/或終止子序列從而不處于其天然環(huán)境下。術(shù)語(yǔ)"同源"意指包括編碼所選宿主生物天然的酶的DNA序列。術(shù)語(yǔ)"異源"意指包括宿主細(xì)胞天然不表達(dá)的DNA序列。因此，DNA序列可以來(lái)自另一種生物體，或者可以是合成序列。待導(dǎo)入本發(fā)明DNA構(gòu)建體或重組栽體的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬的菌林，諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌抹，或鏈霉菌屬的菌抹，諸如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細(xì)菌諸如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或通過(guò)感受態(tài)細(xì)胞以已知的方式進(jìn)行(參閱Sambrook等人，見(jiàn)上文)。當(dāng)在細(xì)菌諸如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常以不溶性顆粒存在(稱(chēng)為包涵體)，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間。在前一種情況中，裂解細(xì)胞，回收顆粒，變性，然后稀釋變性劑使酶重新折疊。在后一種情況中，酶可以從周質(zhì)空間回收，如用超聲波或滲透休克破碎細(xì)胞，以釋放周質(zhì)空間的成分，并回收酶。當(dāng)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌諸如芽孢桿菌或鏈霉菌菌抹中表達(dá)酶時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，酶可以如下文所述從培養(yǎng)基中回收。生產(chǎn)枯草桿菌酶的方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明之分離的酶的方法，其中將已轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細(xì)胞在允許酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的酶。當(dāng)含有編碼酶的DNA序列的表達(dá)栽體被轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時(shí)，有可能異源重組產(chǎn)生本發(fā)明的酶。由此有可能得到高度純化的枯草桿菌酶組合物，其特征為不含同源雜質(zhì)。在本文中，同源雜質(zhì)指由本發(fā)明的酶最初來(lái)源的同源細(xì)胞產(chǎn)生的任何雜質(zhì)(如不同于本發(fā)明的酶的其它多肽)。的任何常丄培養(yǎng)基。可以很方4地將i達(dá)的枯草桿菌酶分泌到培養(yǎng)基中，并通過(guò)眾所周知的方法從中回收，所述方法包括經(jīng)離心或過(guò)濾將細(xì)胞與培養(yǎng)基分開(kāi)、經(jīng)鹽(如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，隨后通過(guò)如離子交換層析、親和層析等層析方法純化。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的用途本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以用于許多工業(yè)用途，尤其是用于洗滌劑工業(yè)中。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的酶組合物。下文描述了關(guān)于優(yōu)選的工業(yè)應(yīng)用的概迷和相應(yīng)的優(yōu)選酶組合物。此概述并非旨在完全列出本發(fā)明枯草桿菌酶變體的所有適當(dāng)應(yīng)用。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可應(yīng)用于本領(lǐng)域內(nèi)已知使用蛋白酶、尤其是枯草桿菌酶的其它工業(yè)應(yīng)用中。含有突變酶的洗滌劑組合物本發(fā)明包括本發(fā)明的突變酶在清潔和去污組合物中的用途以及含有突變枯草桿菌蛋白酶的這種組合物。這些清潔和去污組合物在本領(lǐng)域中有很好的描述，關(guān)于合適的清潔和洗滌劑組合物的進(jìn)一步描述參閱WO96/34946、WO97/07202和WO95/30011。還可以參考本文如下的實(shí)施例，顯示本發(fā)明的許多枯草桿菌酶變體改良的洗滌性能。洗滌劑組合物本發(fā)明的酶可以被加入從而構(gòu)成洗滌劑組合物中的成分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如被配制成手洗或機(jī)洗洗滌劑組合物，其中包括適于污染了的織物預(yù)處理的洗衣添加組合物，以及增加織物柔軟性的漂洗組合物，或可被配制成用于一般家用硬表面清潔操作的組合物，或被配制用于手工或機(jī)械洗碟操作。在一個(gè)特殊方面，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明的酶的洗滌添加劑。洗滌添加劑及洗滌劑組合物可含有一種或多種其他酶，如蛋白酶、脂酵、角質(zhì)酶、淀粉酶、碳水化合物酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，如漆酶和/或過(guò)氧化物酶。一般地，所選酶的性質(zhì)應(yīng)與所選的洗滌劑相適應(yīng)(即pH最適，與其他酶和非酶組分相容，等)，且酶應(yīng)以有效量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的。微生物來(lái)源是優(yōu)選的。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草蛋白酶，尤其是從芽孢衍生的那些，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(描述于WO89/06270中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來(lái)源的)和描述于WO84/25583中的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的例子如W092/19729、WO98/20115、WO98/20116和W098/34946，尤其是在如下位置具有一個(gè)或多個(gè)替換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的市售蛋白酶包括NovoNordiskA/S(丹麥)以商品名AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DurazymTM、Esperase和Kannase銷(xiāo)售的那些，由GenencorInternational以商品名Maxatase、Maxacal、MaxapemM、ProperaseTM、Purafect、和PurafectOXPTM、FN2TM和FN3TM銷(xiāo)售的那些。脂酶:合適的脂酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)或蛋白質(zhì)工程修飾的突變體。有用的脂酶的例子包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬的(同義詞Thermomyces)脂酶，包括Humicolalanuginosa的例如描述于EP258068和EP305216中的，或來(lái)自H.insolens如WO96/13580中所述的，假單胞菌屬脂酶例如描述于EP218272中的產(chǎn)堿假單胞菌或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌脂酶、例如描述于EP331376中的洋蔥假單胞菌脂酶、例如公開(kāi)于GB1372034中的司徒茨氏假單胞菌脂酶，熒光假單胞菌脂酶，假單胞菌屬菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)，P.wisconsinensis(WO96/12012),芽孢桿菌脂酶例如枯草芽孢桿菌脂酶(Dartois等，(1993),BiochemicaetBiophsicaacta1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP64/744992)或短小芽孢桿菌脂酶(WO91/16422)。其他脂酶變體的例子如在下列文獻(xiàn)中所述W〇■92/05249,WO94/01541,EP407225,EP260105,W〇95/35381,WO96/00292,WO95/30744,WO94/25578,W〇95/14783,WO95/22S15,WO"/040"andWO97/07202.優(yōu)選的市售脂酶包括LipolaseTM和LipolaseUltraTM(NovoNordiskA/S)。淀粉酶-合適的淀粉酶(a和/或P)包括細(xì)菌和真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如，在GB1296839中詳細(xì)描述的從地衣芽孢桿菌的特定菌抹得到的a-淀粉酶。有用的淀粉酶的例子如WO94/02597，W094/18314,WO96/23837和WO97/43424中所述，尤其是在如下位置存在一個(gè)或多個(gè)替換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售的淀粉酶是Duramyl、TermamylTM、Fungamyl和BANTM(從NovoNordiskA/S得到)和RapidaseTM和MaxamylP頂(從Genencor得到)。纖維素酶:合適的纖維素酶包括細(xì)菌和真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼屬、小技頂孢屬(Acremoniiim)的種的纖維素酶，如公開(kāi)于US4435307，US5648263，US5691178,US5776757和WO89/09259中的從Humicolainsolens、Myceliophthorathermophila和尖鐮孢中生產(chǎn)的真菌纖維素酶。尤其適合的纖維素酶是具有護(hù)色功能的堿性或中性纖維素酶。這類(lèi)纖維素酶的例子EP0495257，EP0531372，W096/11262,W096/29397,WO98/08940中所述。其它纖維素酶變體的例子見(jiàn)如WO94/07998,EP0531315，US5457046，US5686593，US5763254，WO95/24471，WO98/42307和PCT/DK98/00299中所述。市售的纖維素酶包括Celluzyme和CarezymeTM(NovoNordiskA/S),Clazinase和PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.)以及KAC-500(B)TM(KaoCorporation).過(guò)氧化物酶/氧化酶:合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的例子包括來(lái)自鬼傘菌屬(Corphms),例如來(lái)自C.cinereus的過(guò)氧化物酶及其變體，如WO93/24618,WO95/10602和WO98/15257中所述。市售的過(guò)氧化物酶包括GuardzymeTM(NovoNordiskA/S)?？梢酝ㄟ^(guò)加入含有一種或多種酶的獨(dú)立添加劑，或通過(guò)加入含有所有這些酶的組合添加劑，將這些洗滌劑酶包含在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑即獨(dú)立添加劑或組合添加劑，可以配制成例如顆粒、液體或漿液等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制品是顆粒，尤其是非起塵(non-dusting)顆粒、液體，尤其是穩(wěn)定的液體，或漿液。非起塵顆粒可以按例如US4,106,991和4,661,452中所公開(kāi)的方法生產(chǎn)，并且可以任選地通過(guò)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行包被。蠟樣包被材料的例子是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12到20個(gè)碳原子，且具有15到80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單、二和三甘油酯。適于通過(guò)流化床技術(shù)應(yīng)用的薄膜形成包被材料見(jiàn)GB1483591中所迷。液體酶制品可以根據(jù)已有技術(shù)通過(guò)加入多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸來(lái)穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)EP238,216中公開(kāi)的方法制備受保護(hù)的酵。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以呈任何方便的形式，例如條形、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是水性的，一般含有至多70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑，或者是非水性的。洗滌劑組合物含有一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子型的包括半極性和/或陰離子型和/或陽(yáng)離子型和/或兩性型離子表面活性劑。這些表面活性劑一般以0.1%到60%(重量)的水平存在。當(dāng)包括在其中時(shí)，洗滌劑通常含有大約1%到大約40%的陰離子型表面活性劑，例如直鏈烷基笨磺酸鹽、ot-烯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、a-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。當(dāng)包括在其中時(shí)，洗滌劑通常含有大約0.2%到大約40%的非離子表面活性劑，諸如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、聚羥基烷基脂肪酸跣胺，或氨基葡糖("葡糖酰胺")的N-酰基N-烷基衍生物。該洗滌劑可以含有0-65%的洗滌助劑或配位劑例如沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸酯，碳酸鹽，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或分層的硅酸鹽(例如來(lái)自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。例子有羧甲基纖維素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)，聚(乙晞基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和十二烷基甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包括H202源物質(zhì)，例如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，這些物質(zhì)又可以與形成過(guò)酸的漂白活性劑例如四乙酰乙二胺或壬酰基羥基笨磺酸鹽結(jié)合?；蛘?，漂白體系可以含有例如酰胺、酰亞胺或砜類(lèi)的過(guò)氧酸。本發(fā)明洗滌劑組合物中的酶可以通過(guò)使用常規(guī)穩(wěn)定劑來(lái)穩(wěn)定，例如多元醇(如丙二醇或丙三醇)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如芳香硼酸醋)、或苯基硼酸衍生物(如4-甲?；交鹚?，并且該組合物可以按例如WO92/19709和WO92/19708所述配制。洗滌劑還可以含有其它常規(guī)去污成分，例如織物調(diào)理劑，其包括粘土、發(fā)泡增效劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、光漂白劑、增溶劑、晦暗抑制劑或香料。目前已構(gòu)思可在洗滌劑組合物中加入任何酶，尤其是本發(fā)明的酶，加入量為每升洗滌液中加入相當(dāng)于0.01-100mg的酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液中加入0.05-5mg的酶蛋白，尤其是每升洗滌液中加入O.l-lmg的酶蛋白。另外，可以將本發(fā)明的酶摻入WO97/07202中所公開(kāi)的洗滌劑制品中，在此引入作為參考。在皮革工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于皮革工業(yè)，尤其是用于皮膚的脫毛。在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。關(guān)于合適的其它蛋白酶的更詳細(xì)的描述參閱關(guān)于適用于洗滌劑組合物中的酶的部分(見(jiàn)上文)。在毛紡工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于毛紡工業(yè)，尤其是用于含毛衣物的洗滌。在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。關(guān)于適當(dāng)?shù)钠渌鞍酌傅母敿?xì)描述參閱關(guān)于適用于洗滌劑組合物中的酶的部分(見(jiàn)上文)。本發(fā)明在下列實(shí)施例中有更詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例并不以任何方式意圖限制本發(fā)明要求的范圍。材料和方法菌抹枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。遲緩芽孢桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的特殊菌抹，保藏于NCIB，編號(hào)NCIB10309和10147，而且描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，723，250中，該專(zhuān)利文獻(xiàn)本文引用作為參考。大腸桿菌MClOOO(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980);分子生物學(xué)雜志138179-207),用常規(guī)方法制成r-，m+，其還描述于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?39,298中。質(zhì)粒pJS3:大腸桿菌一枯草芽孢桿菌穿梭栽體，含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因(由JacobSchiodt等人描述于"蛋白質(zhì)和肽通訊"(ProteinandPeptideletters)3:39-44(1996)》pSX222:枯草芽孢桿菌表達(dá)栽體(描述于WO96/34946)。常用分子生物學(xué)方法除非特別指出，DNA操作和轉(zhuǎn)化用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；F.M.Ausubel等人(主編)"分子生物學(xué)通用方法"(CurrentProtocolsinMolecularBiology),JohnWileyandSons,1995;C.R.Harwood和S.M.Cutting(主編)"芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法"(MolecularBiologicalMethodsforBacillus),JohnWileyandSons,1990)。用于DNA操作的酶根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)使用。用于DNA操作的酶除非特別指出，所有用于DNA操作的酶，如限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶等等，均購(gòu)自NewEnglandBiolabs,Inc.。蛋白水解活性在本發(fā)明中蛋白水解活性以"千諾氏蛋白酶單位"(KiloNOVOProteaseUnits,KNPU)表示。活性是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)酶(8入￥^入8￡@)測(cè)定的，而且測(cè)定是建立在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即50tl，pH8.3，反應(yīng)時(shí)間9分鐘，測(cè)量時(shí)間3分鐘)蛋白水解酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液的基礎(chǔ)之上的?？梢韵虻淣ovoNordiskA/S索取文件AF220/1，該文件此處引用作為參考。GU即甘氨酸單位，定義為以N-乙酰酪蛋白作為底物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，于40X:保溫15分鐘時(shí)，產(chǎn)生相當(dāng)于1毫摩爾甘氨酸的氨基量的蛋白水解酶活性。酶活性也可以用PNA實(shí)驗(yàn)，根據(jù)與可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-對(duì)硝基笨酚的反應(yīng)測(cè)量(描述于美國(guó)石油化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(JournalofAmericanOHChemistsSociety),T.M.Rothgeb,B.D.Goodlander，P.H.Garrison和L.A.Smith，(1988)).發(fā)酵枯草桿菌酶的發(fā)酵于30t:在旋轉(zhuǎn)搖床上(300r.p.m.)含100mlBPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板Erlenmeyer錐形瓶中進(jìn)行5天。因此，為了得到例如2升培養(yǎng)液，需要20個(gè)Erlenmeyer錐形瓶同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)基BPX:組成(每升)土豆淀粉100g碾碎的大麥50g大豆粉20gNa2HP0412H209gPluronicO.lg酪蛋白酸鈉10g培養(yǎng)基中的淀粉用a-淀粉酶液化，培養(yǎng)基通過(guò)加熱至120"C并保持45分鐘滅菌。滅菌后加入NaHC03至O.IM將培養(yǎng)基的pH調(diào)至9。實(shí)施例1酶變體的構(gòu)建和表達(dá)定點(diǎn)誘變枯草桿菌酶309定點(diǎn)誘變突變體包括活性位點(diǎn)環(huán)(b)96與97位之間的特定的插入，其是通過(guò)DNA片段的傳統(tǒng)克隆獲得的(Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港)，所述DNA片段由含有期望的插入片段之寡核苷酸(見(jiàn)下)的PCR產(chǎn)生。模板質(zhì)粒DNA是pJS3，或該質(zhì)粒含有枯草桿菌酵309的類(lèi)似物。用一段寡核苷酸指導(dǎo)突變的插入片段的導(dǎo)入以構(gòu)建L96LX插入變體(X-在96與97位之間插入的任意氨基酸殘基)，產(chǎn)生L96LX枯草桿菌酶309變體。將枯草桿菌酶309變體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用從這些轉(zhuǎn)化子的過(guò)夜培養(yǎng)物中純化的DNA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，方法是用限制酶消化、DNA片段的純化、連接、和枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化?？莶菅挎邨U菌的轉(zhuǎn)化如39Dubnau等人，1971,分子生物學(xué)雜志，56:209-211中所述。定域隨機(jī)誘變以將隨機(jī)插入導(dǎo)入確定區(qū)域中進(jìn)行定域隨機(jī)誘變的完整策略是合成對(duì)應(yīng)于插入位點(diǎn)側(cè)翼的DNA序列中的誘變引物(寡核苷酸)，該引物由定義插入片段的DNA堿基對(duì)分隔。然后，將得到的誘變引物與適當(dāng)?shù)膶?duì)向引物一起用于PCR反應(yīng)。將得到的PCR片段純化和消化并克隆到大腸桿菌一枯草芽孢桿菌穿梭載體中(見(jiàn)下)?；蛘撸绻斜匾?，將得到的PCR片段作為引物與第二個(gè)適當(dāng)?shù)膶?duì)向引物一起用于第二個(gè)PCR反應(yīng)，使得能夠消化誘變區(qū)并將其克隆到穿梭載體中。PCR反應(yīng)在常規(guī)條件下進(jìn)行。遵循這種策略，構(gòu)建SAVINASE的定域隨機(jī)文庫(kù)，其中在96-97位置之間的活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)內(nèi)導(dǎo)入插入。通過(guò)誘變引物(見(jiàn)下文)導(dǎo)入突變，代表了所有20種氨基酸(=25%的A,T,C和G;而S-50。/oC和G。通過(guò)又一輪PCR將所產(chǎn)生的PCR片段向Savinase的N端延伸，方法是利用如下引物，與帶有由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR片段與重疊序列的組合5，CTAAATATTCGTGGTGGCGC3'(有義)，和5GACTTTAACAGCGTATAGCTCAGC3，(反義)。將延伸的DNA片段克隆入經(jīng)修飾的質(zhì)粒pJS3的HindIII和Mlul位點(diǎn)(見(jiàn)上)，對(duì)隨機(jī)選出的10個(gè)大腸桿菌菌落進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)含有所設(shè)計(jì)的突變。將誘變引物(5，6CTGAGCTATACGCTGTTAAAGTCCTANNSGGGGCGAGCGGTTCAGGTTC3，(有義))與位于pJS3中Mlul位點(diǎn)下游的適當(dāng)?shù)膶?duì)向引物(如5，-CCCTTTAACCGCACAGCGTTT-3，(反義))一起用于PCR反應(yīng)，而質(zhì)粒pJS3作為模板。用限制酶Hindlll和Mlul將所得PCR產(chǎn)物克隆到pJS3穿梭載體中。然后用周知的方法將隨機(jī)文庫(kù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。如此制備的文庫(kù)含有大約100，000個(gè)單克隆/文庫(kù)。對(duì)隨機(jī)選取的IO個(gè)菌落測(cè)序以確認(rèn)設(shè)計(jì)的突變。為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，將含有本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pJS3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌抹中，并如上文所述在含10ng/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中發(fā)酵。實(shí)施例2酶變體的純化這一步驟涉及2升水平發(fā)酵的純化，用于在枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生枯草桿菌酶。將大約1.6升發(fā)酵液在1升離心杯中于5000rpm離心35分鐘。用10%醋酸將上清液調(diào)至pH6.5，并在SeitzSupraS100過(guò)濾板上過(guò)濾。使用配備了AmiconS1Y10UF柱體的AmiconCH2AUF裝置將濾出液濃縮至大約400ml。在上Bacitracin親和柱(室溫，pH7)吸附前，先將UF濃縮液離心并過(guò)濾。用含25。/。2-丙醇和lM氯化鈉的0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣緩沖液(pH7)于室溫將蛋白酶從Bacitracin柱上洗脫下來(lái)。將來(lái)自Bacitracin純化步驟具有蛋白酶活性的級(jí)分合并，并加到750mlS印hadexG25柱(直徑5cm，用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鉤，pH6.5的緩沖液平衡過(guò))上。將來(lái)自SephadexG25柱具有蛋白水解活性的級(jí)分合并，并加到150mlCMSepharoseCL6B陽(yáng)離子交換柱(直徑5cm,用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化釣，pH6.5的緩沖液平衡過(guò))上。用2升相同緩沖液中的線形梯度0-0.1M氯化鈉(枯草蛋白酶147的情況下用0-0.2M氯化鈉)將蛋白酶洗脫下來(lái)。在最后的純化步驟中，將來(lái)自CMSepharose柱含有蛋白酶的級(jí)分合并，并在配備了GR81PP膜(購(gòu)自DanishSugarFactoriesInc.)的Amicon超濾室中濃縮。通過(guò)使用實(shí)施例1用于構(gòu)建的技術(shù)和上述分離方法，生產(chǎn)并分離得到下列枯草桿菌蛋白酶309變體:L96LTIj96LHL96LIL96LGL9化A+A98TLi96LT+Yl67A丄96LG+G100SL96IjG+G100SL96IjG+A98T+Y167A;L96LG.+A98T+S103TL96LA+A98T+A194PIj96LG+S99T+S101A.Ij96IX3+G100S+Y167AN々6D+L96LA+A98T'丄96IjG+A98G+S99G+S101T+S103T在初步分析中這些變體顯示優(yōu)于Savinase的洗滌性能。實(shí)施例3含有酶變體的洗滌劑組合物的洗滌性能下列實(shí)施例提供了在指明的條件下進(jìn)行的一些洗滌測(cè)試的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件表III:評(píng)價(jià)枯草蛋白酶309變體的實(shí)驗(yàn)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>洗滌劑使用的洗滌劑或是模式洗滌劑，稱(chēng)作洗滌劑95，或者分別獲自丹麥的超級(jí)市場(chǎng)(OMO，目錄ED-9745105)和美國(guó)(Wisk，目錄ED-9711893)。使用前所有洗滌劑中的酶活性均用微波處理滅活。洗滌劑95是筒單的模式制劑。pH調(diào)至10.5，這在粉劑型洗滌劑的正常范圍內(nèi)。95型洗滌劑的組成如下STP(Na5P3O10)25%Na2S0425%Na2C0310%LAS(Nansa80S)20%非離子型表面活性劑(Dobanol25-7)5.0%Na2Si2055.0%羧甲基纖維素(CMC)0.5%水9.5%樣本使用的樣本為EMPA116和EMPA117，獲自EMPATestmareialen，Movenstrasse12，CH-卯15，St.Gall,瑞士。參照使用MacbethColorEye7000型光度計(jì)測(cè)量測(cè)試材料在460nm的反射率(R)。測(cè)量根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。評(píng)估枯草桿菌酶的洗滌性能所研究的枯草桿菌酶之改善因子或性能因子評(píng)價(jià)改善因子IF劑量/反應(yīng)定義為含有待研究的枯草桿菌酶之洗滌劑，與所述參照枯草桿菌酶含量趨近于零之相同洗滌劑的洗滌性能曲線的斜率之比。IF劑量/反應(yīng)=a/a參照根據(jù)式I計(jì)算洗滌性能<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>c其中R是以反射率單位表示的洗滌性能；Ro是擬合曲線對(duì)Y軸的截距(空白)；a是當(dāng)c趨近于O時(shí)擬合曲線的斜率，c是酶濃度；且ARmax是當(dāng)c趨向于無(wú)窮大時(shí)的理論最大洗滌效率。性能因子P根據(jù)式II計(jì)算P=(R變體-R空白)(Rsavinase一R空白)(H)其中R變體用10nM變體洗滌后測(cè)試材料的反射率；RSavinase:用10nMSavinase⑧洗滌后測(cè)試材料的反射率；R空白不用酶洗滌后測(cè)試材料的反射率。模式洗滌劑95變體pIj96;LG+A98G+S99G+S101T+S103T1.3L96LG+S99T+S101A1.2L9"G+A98T+S103T1.3us(洗滌劑usWisk'Swatch:EMPA117)變體PL9"G1.7L96IjA1.41.41-5Ij9化A+A98T2.2L96IjG+G100S1.8L96LG+Y167A2Ij96LA+A98T13L96LG+A98T+S103T1.3Li96LA+A98T+A194P1.2L96LG+S99T+S101A1.2N76D+L96LA+A98TL96LG+A98G+S99G+S101T+S103T1.7^P在[E-5nM計(jì)算由此可見(jiàn)，本發(fā)明的枯草桿菌酶與8入￥11>^^￡@相比在洗滌性能方面有所改善。序列表<110>NovoNordiskA/S<i2°>在活性位點(diǎn)環(huán)區(qū)中具有額外氨基酸殘基的I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶<130>5793.204<140><170>Paten仁InVer.2.1<210>1<211>275<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌<400>1AlaGinThrValProiyrGly工leGinAlaGinGlyPheLysGlyAla20ThrGly工leGinAlaSerHisPro3540SerPheValAlaGlyGluAlaTyr5055ThrHisValAlaGlyThrValAlaS570LeuGlyValAlaProSerValSer85AsnSerSerGlySerGlyThrTyr100TrpAlaThrThrAsnGlyMetAsp115120ProSerGlySerThrAlaMetLysProLeulieLysAlaAspLysVal1015AsnValLysValAlaValLeuAsp2530AspLeuAsnValValGlyGlyAla45AsnThrAspGlyAsnGlyHisGly60AlaLeuAspAsnThrThrGlyVal7580LeuTyrAlaValLysValLeuXaaSerGly工leValSerGly工leGlu105110VallieAsnMetSerLeuGlyGly125GinAlaValAspAsnAlaTyrAla130135140ArgGlyValValValValAlaAlaAlaGlyAsnSerGlySerSerGly145150155160AsnThrAsnThrlieGlyTyrProAlaLysTyrAspSerVallieAla165170175ValGlyAlaValAspSerAsnSerAsnArgAlaSerPheSerSerVal180185130GlyAlaGluLeuGluValMetAlaProGlyAlaGlyValTyrSerThr195200205丁yrProThrSerThrTyrAlaThrLeuAsnGlyThrSerMetAlaSer210215220ProHisValAlaGlyAlaAlaAlaLeulieLeuSerLysHisProAsn225230235240LeuSerAlaSerGinValArgAsnArgLeuSerSerThrAlaThrTyr250255LeuGlySerSerPheTyrTyrGlyLysGlyLeu工leAsnValGluAla260265270AlaAlaGin275:210>2:21b270:212>PRT:213>遲緩芽孢桿菌<400>2AlaGinSerValProTrpGlylieSerArgValGinAlaProAlaAlaS1015HisAsnArgGlyLeuThrGlySerGlyValLysValAlaValLeuAsp202530ThrGly工leSerThrHisProAspLeuAsnlieArgGlyGlyAlaSer354045PheValProGlyGluProSerThrGinAspGlyAsnGlyHisGlyThr505560HisValAlaGlyThrlieAlaAlaLeuAsnAsnSer工leGlyValLeu65707580GlyValAlaProSerAlaGluLeuTyrAlaValLysValLeuXaaGly859095AlaSerGlySerGlySerValSerSer工leAlaGinGlyLeuGlu丁rp100105110AlaGlyAsnAsnGlyMetHisValAlaAsnLeuSerLeuGlySerPro115120125SerProSerAlaThrLeuGluGinAlaValAsnSerAlaThrSerArg130135140GlyValLeuValValAlaAlaSerGlyAsnSerGlyAlaGlySer工le145150155160SerTyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaMetAlaValGlyAlaThrAsp165170175GinAsnAsnAsnArgAlaSerPhe180工leValAlaProGlyValAsnVal195200SerGinTyrGlyAlaGlyLeuAspGinSerThrTyrProGlySerThr205TyrAlaSerLeuAsnGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGly210215220AlaAlaAlaLeuValLysGinLysAsnProSerTrpSerAsnValGin225230235240工leArgAsnHisLeuLysAsnThrAlaThrSerLeuGlySerThrAsn245250255LeuTyrGlySerGlyLeuValAsnAlaGluAlaAlaThrArg260265270權(quán)利要求1.一種I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶，其在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在96-97位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是在前體枯草桿菌酶96-97位之間具有至少一個(gè)插入的氨基酸殘基的構(gòu)建的變體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的枯草桿菌酶，其選自4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基選自T、G、A和S。5.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基選自帶電氨基酸殘基D、E、H、K和R,更優(yōu)選選自D、E、K和R。6.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選選自N、Q、S和T。7.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基選自小的疏水性氨基酸殘基A、G和V。8.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基選自大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選選自F、I、L、M和Y。9.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一種額外或插入的氨基酸殘基包含在活性位點(diǎn)環(huán)(b)中的一個(gè)以上的額外或插入的氨基酸殘基。10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的枯草桿菌酶變體，其中所述的96與97位之間的插入與進(jìn)一步在任一其他位置的一種或多種修飾相結(jié)合。11.權(quán)利要求15的枯草桿菌酶變體，其中進(jìn)一步的修飾是在一個(gè)或多個(gè)如下位置27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的枯草桿菌酶變體，其中所述的一種或多種i務(wù)飾與位置129、131、133和194的一個(gè)或多個(gè)4務(wù)飾結(jié)合。13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的枯草桿菌酶變體，其中所述的枯草桿菌酶，或如果枯草桿菌酶是變體，親本枯草桿菌酶屬于I-Sl亞組。14.根據(jù)權(quán)利要求13的變體，其中所述親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR,或其保留了I-S1亞組特征的功能性變體。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的變體，其中枯草桿菌酶，或如果述枯草桿菌酶是變體，親本枯草桿菌酶屬于I-S2亞組。16.根據(jù)權(quán)利要求15的變體，其中親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB，或其保留了I-S2亞組特征的功能性變體。17.權(quán)利要求3、15或16的分離的枯草桿菌酶，其選自L96LA,L96LT,L961^L96LS,Ij96IjK,Ii96LR,L96LV,L96LC,L96LQ,:L96LF,L961^,L96LP,L96IiW,和L96LY.18.根據(jù)權(quán)利要求15-17的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾選自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。19.根據(jù)權(quán)利要求15-17的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步修飾選自V104N+S101G、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A,或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合，與權(quán)利要求1一14中任一項(xiàng)提及的任何一個(gè)或多個(gè)替換、刪除和/或插入的組合。20.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述進(jìn)一步的一個(gè)或多個(gè)修飾選自還包含了P129K、P131H、A133P、A133D和A194P的組。21.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的變體，其包含的修飾選自如下的組L96LA+A98T,L96LG+G100S,L9SLG+Y167A,L96LA+A98T,L96LG+A98T+S103T,L96LG+A98T+Y167A,L96LG+S99T+S101A,L96LG+G100S+Y167A,L96LA+A98T+A194P,N76D+L96LA+A98T,Ij96LG+A98G+S99G+S101T+S103T.22.—種屬于I-S1亞組的枯草桿菌酶，具有如下氨基酸序列1102030A-Q-T-V-P-Y-G-工-P-L-I-K-A-D-K-V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V405060L-D-T-G-1-Q-A-S-H-P-D-L-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-T-D708090G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-V-A-A-L-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P二S-V-S-L96a110120Y-A-V-K-V-L-X-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-A-T-T-N-G-M-D130140150V-工-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A-R-G-V-V-V-V160170180A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-1-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D-S-V-I-A-V-G-A-V190200210D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A-P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P220230240T-S-T-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H-V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N250260270L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-G-K-G-L-I-N-V275E-A-A-A-Q或具有包含帶有99a位氨基酸殘基且顯示與其有高于70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列之同源枯草桿菌酶。23.—種屬于I-S2亞組的枯草桿菌酶，具有如下氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或具有包含帶有％a位氨基酸殘基且顯示與其有高于70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列之同源枯草桿菌酶。24.權(quán)利要求22或23的枯草桿菌酶變體，其中96a位的X選自T、A、G、S和P。25.編碼權(quán)利要求1—24中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。26.—種含有權(quán)利要求25的分離的DNA序列的表達(dá)載體。27.—種轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求26的表達(dá)載體的微生物宿主細(xì)胞。28.根據(jù)權(quán)利要求27的微生物宿主，它是細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬的，尤其是遲緩芽孢桿菌。29.根據(jù)權(quán)利要求27的微生物宿主，它是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，尤其是曲霉屬。30.生產(chǎn)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的方法，其中將權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的宿主在有利于表達(dá)和分泌所述變體的條件下培養(yǎng)，并回收變體。31.—種含有權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。32.根據(jù)權(quán)利要求31的組合物，其中還含有纖維素酶、脂酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶或淀粉酶。33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的組合物，其中所述組合物是洗滌劑組合物。34.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體或者權(quán)利要求31或32中任一項(xiàng)的酶組合物在洗衣和/或洗碟洗滌劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶，其在從95-103位的活性位點(diǎn)環(huán)(b)區(qū)中的96位具有至少一個(gè)額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應(yīng)于在96-97位之間至少一個(gè)氨基酸殘基的插入片段。所述枯草桿菌酶在洗滌劑中的洗滌性能相比于其親本酶有所改良。文檔編號(hào)C12N9/00GK101275127SQ20081008744公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期1999年12月20日優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日發(fā)明者C·安德森,F·米凱爾森,K·安德森威爾布爾,M·諾萊加德-麥德森,P·漢森坎姆普申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司