專利名稱：異檸檬酸測(cè)定試劑盒及異檸檬酸的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定異檸檬酸濃 度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異檸檬酸isocitric acid是檸檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。 在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能 夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)成分。檸檬酸在鳥(niǎo)頭酸酶的作用下可 逆地生成異檸檬酸和順鳥(niǎo)頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC1丄1.41; EC1丄1.42) 的作用下變成a-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶(isocitmtelyase, EC4. 1. 3. 1) 的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GBT16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料 中D-異檸檬酸的測(cè)定方法一紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃 縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸 的測(cè)定。其測(cè)定原理異檸檬酸脫氫酶isocitmte dehydrogenase有兩種類型 以NAD為輔酶的酶(ECl. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶的酶(EC1. 1. 1.42)， 兩者催化同一反應(yīng)。
異檸檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+ 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異擰檬酸鹽與NAD或NADP作用，生 成NADH或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在波長(zhǎng)340nrn處測(cè) 定吸光度，確定樣品中總D-異擰檬酸的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑，使試劑能在28'C保存下，穩(wěn)定 一年以上，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變 化，得以測(cè)定異檸檬酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的 異檸檬酸測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng) 生化分析儀上進(jìn)行異檸檬酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性高， 使用方便，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明異檸檬酸濃度測(cè)定方法原理如下
異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+酮戊二酸酯+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用異檸檬酸脫氫酶isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1丄1.42)酶促反應(yīng)終點(diǎn)法。異檸檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸，最終將輔酶(在 340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得 以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上 升的程度，可以測(cè)算異檸檬酸的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異檸檬酸測(cè)定試劑盒較為理想: 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
本發(fā)明的異檸檬酸測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。 輔酶、異檸檬酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是
干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑還是雙劑，本發(fā)明測(cè)定異擰檬酸濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的異檸檬酸測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)異檸檬酸樣品與試劑的體積 比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè) 時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的異檸檬酸測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
輔酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《
0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)異檸檬酸樣品與試劑1、試
劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分
鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器
得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.002;吸光度時(shí) 間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(RX).99)線形范圍可達(dá) 20mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±4%;試劑測(cè)試的精密 度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2°/。；試劑的靈敏度可達(dá)0.1 ± 0.05AA/mmol /L;試劑在2—8"C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度 好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。這是一個(gè)效率非常高，成 本非常低廉的方法。
權(quán)利要求
1.一種異檸檬酸測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500mmol/L穩(wěn)定劑1——4000mmol/L輔酶 1——6mmol/L異檸檬酸脫氫酶1000——80000U/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶組成單劑試劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。 輔酶、異檸檬酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術(shù)的異檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定異檸檬酸濃度的試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、異檸檬酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。這是一個(gè)效率非常高，成本非常低廉的方法。關(guān)鍵在使用本法的穩(wěn)定劑可以使試劑盒在2～8℃下保存穩(wěn)定一年或以上，使用非常方便。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101609019SQ20081012283
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司