專利名稱：重組人胱抑素c基因及其表達與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種重組人胱抑素c基 因及其表達與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成 員之一。它的分子量為13kD，是由122個氨基酸組成的低分子量非 糖基化蛋白質(zhì)(M Abrahamson， et al. Biochemical Journal, 1990.)， 含兩對二硫鍵，且能在所有有核細(xì)胞中恒定、持續(xù)地轉(zhuǎn)錄及表達，可 被看做House ke印ing基因(黃君富等，醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗 學(xué)分冊)。近來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胱抑素C參與機體許多生理與病理過 程，包括腫瘤的侵潤性生長及轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生與發(fā)展以及組織纖維 化(張耀全，袁發(fā)煥等，2003,23(6))等疾病。作為外分泌型蛋白， 它廣泛的存在于腦脊液、血液、唾液及精液等體液中且濃度較高。因 胱抑素C是一種低分子量蛋白質(zhì)，可經(jīng)腎小球自由濾過，在近曲小管 被重吸收并降解，腎臟是清除循環(huán)中胱抑素C的唯一器官，所以血清 胱抑素C濃度主要由GFR決定，由此可見胱抑素C是一種理想的反映 GFR變化的內(nèi)源性標(biāo)志物(GrubbA， et al， Acta Med Scand， 1985)。 同時有研究報道應(yīng)用兔抗胱抑素C抗體建立的ELISA技術(shù)檢測了急性 心肌梗塞病人急性期、恢復(fù)期及正常對照組的血清胱抑素C水平，發(fā) 現(xiàn)急性期與恢復(fù)期的自身對照并無顯著性差異，但有意義的是這兩者的胱抑素C水平均顯著低于正常對照組(馮建芳等，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨
床，1995)。提示胱抑素C的血清濃度改變，在一定程度上可以作為 急性心肌梗塞診斷的參考指標(biāo)。
血清胱抑素C濃度的測定具有重要的診斷意義，但目前我國還沒 有自主研發(fā)的胱抑素C診斷試劑。究其原因制備胱抑素C診斷試劑盒 需要特異性強和靈敏性高的抗胱抑素C單克隆抗體,而要得到該單克 隆抗體就必須得到高純度的胱抑素C蛋白，傳統(tǒng)的從胎盤、尿液等組 織中提取的胱抑素C蛋白濃度低，純度差，批間差大無法用做免疫 原制備單抗或制備診斷質(zhì)控品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組人胱抑素c基因、該
基因表達的重組蛋白及其制備方法，以及該蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 一種具有SEQ ID NO : 1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。
一種具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。 一種根據(jù)SEQ ID NO :1所示核酸序列制備重組可溶人胱抑素C 蛋白的方法，包括下述步驟(1)從新鮮人胎盤中獲得總RNA，用 RT-PCR方法得到截短人胱抑素C的DNA序列；(2)用步驟(1)獲得 的DNA序列與表達質(zhì)粒重組，重組子經(jīng)過DNA測序驗證，確定重組表 達質(zhì)粒的序列和閱讀框均正確；(3)用步驟(2)所獲得的重組表達 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主細(xì)胞；(4)培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從細(xì)胞胞質(zhì)中回收和純 化重組可溶性人胱抑素C蛋白。所述表達載體為能與人胱抑素蛋白的基因序列重組并形成表達 質(zhì)粒的表達載體，具體地，表達載體為原核表達載體，且該原核表達 載體的融合蛋白標(biāo)簽可對人胱抑素C蛋白的兩對二硫鍵正確配對起
到促進作用，該原核表達載體可選PET32a(+)。所述的表達宿主細(xì)胞 為能夠表達所述重組表達質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，且具有校正大腸桿菌密碼 子偏好性的特征，可選大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)。
本發(fā)明不限于特定的表達載體，在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使 用原核表達載體，例如PET32a(+)。本發(fā)明不限于特定的宿主細(xì)胞， 在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)， Rosseta gami II (DE3)購于Merck公司，是MerK公司自己對有特殊 功能的大腸桿菌產(chǎn)品的命名。
所述培養(yǎng)宿主細(xì)胞所用的培養(yǎng)基采用含抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基擴增 培養(yǎng)宿主細(xì)胞，參數(shù)為培養(yǎng)溫度35。C 37T:，培養(yǎng)時間4 5h;誘 導(dǎo)溫度35-37°C ，誘導(dǎo)時間3 5h;誘導(dǎo)物IPTG終濃度為0. 2 0。 5mM。
篩選宿主細(xì)胞中高效表達的陽性表達菌株作為工程菌，重組可溶 性人胱抑素C蛋白通過工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心收集菌體，超聲破碎后 離心取上清經(jīng)過鎳柱一步純化得到。
一種制備抗人胱抑素C不同表位的系列單克隆抗體或多克隆抗 體的方法，運用按照上述方法制備的重組可溶性人胱抑素C蛋白免疫 實驗動物獲得單克隆抗體或多克隆抗體。通過位點疊加實驗確定抗不 同抗原表位的系列單克隆抗體；所述系列是指大于等于兩株。
一種制備測定人體內(nèi)人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法，運用上述方法制備的兩株單克隆抗體通過化學(xué)交聯(lián)劑分別與膠乳交聯(lián)后 混合于緩沖液中制備成診斷試劑，其中兩株單克隆抗體摩爾比為1:
所述化學(xué)交聯(lián)劑為Sulfo-NHS， EDC. HCL。
一種制備人胱抑素C診斷試劑質(zhì)控品的方法，按照上述方法制備 的重組可溶性人胱抑素C蛋白用保護性緩沖液分別調(diào)制到從低到高5 個固定濃度后凍干制備。
所述從低到高5個固定濃度是指按照上述制備的診斷試劑的檢 測線性范圍而定的濃度。
所述的5個固定濃度分別為0。 5ug/ml; lug/ml; 2ug/ml; 4ug/ml; 8ug/ml
綜上，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明運用基因工程技術(shù)表達純化 大量穩(wěn)定的重組可溶胱抑素C蛋白并利用該蛋白獲得了一對單抗，進 而制備了穩(wěn)定的胱抑素C診斷試劑及其質(zhì)控品。解決了我國人胱抑素 測定試劑盒自主研發(fā)的瓶頸問題。


圖1是本發(fā)明制備的人胱抑素c診斷試劑的測定結(jié)果示意圖，其
中橫軸表示進口試劑1測定進口試劑2校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)值(ug/ml)，縱
軸表示自制試劑測定進口試劑2校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)值(ug/ml);
圖2是重組人胱抑素C蛋白誘導(dǎo)純化電泳圖，其中，M:中分子量
蛋白Marker; 1: IPTG誘導(dǎo)前全菌裂解液；2: IPTG誘導(dǎo)3h后全菌裂解
液；3: Ni柱純化后重組蛋白；圖3是cystatin C重組蛋白Weastern Blot分析的示意圖，其 中，M:預(yù)染蛋白Marker;l: cystatin C重組蛋白， 一抗為抗人胱抑 素多抗；2: cystatin C重組蛋白，一抗為抗人血紅蛋白多抗。
具體實施例方式
實施例1:
制備重組可溶人胱抑素C蛋白
(1) 克隆截短胱抑素C基因、構(gòu)建表達質(zhì)粒
按照胱抑素C基因DNA序列設(shè)計引物，RT-PCR擴增該基因并與 pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ， PCR鑒定單克隆確定可能 的陽性質(zhì)粒，再提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。經(jīng)過DNA測序證明堿基及開放 閱讀框正確的陽性質(zhì)粒用適宜的酶切出與同樣雙酶切的PET32a (+)連 接，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達宿主菌Rosseta gami II 。 PCR鑒 定陽性宿主菌。上述實驗用質(zhì)粒載體均為本實驗室保存，表達菌 Rosseta gami II購于Merck公司，總RNA提取試劑盒購于Fermentas 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接試劑盒購于大連Takara 公司。
(2) 篩選高效表達的陽性表達菌株
接種10株上述陽性菌株與5mlLB+amp中，37°C， 220rpm培養(yǎng) 過夜，第二日按l^接種量接種于新鮮的LB+amp培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm培養(yǎng)4一5小時，取lml菌液做未誘導(dǎo)條件下的菌體蛋白對照， 余下菌液加入終濃度0. 5mM的IPTG， 25°C ， 170rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，取 lml菌液做為誘導(dǎo)后的菌體蛋白對照。誘導(dǎo)前后的細(xì)菌菌液離心去上清，菌體分別用100ul的TE緩沖 液重懸，煮沸5min后，SDS—PAGE電泳?？捡R斯亮蘭染色，BandScan 分析電泳條帶。誘導(dǎo)后的菌在預(yù)測的分子量處有一條濃集的蛋白條 帶，誘導(dǎo)前的菌在相同的分子量處沒有蛋白條帶。經(jīng)BandScan軟件 分析該目的蛋白占總蛋白量的20%以上。選表達水平高的菌株為工
程菌株o
誘導(dǎo)后的細(xì)菌超聲破碎后離心取上清和沉淀分別進行SDS—PAGE 電泳分析，結(jié)果表明重組蛋白是以可溶形式存在于上清中。 (3)工程菌的擴大培養(yǎng)及目的蛋白的純化
按照小量培養(yǎng)的條件擴大培養(yǎng)量，1%的甘油菌接種于20mlLB +&!1^培養(yǎng)基中37。C，220rpm過夜培養(yǎng)，第二日2%接種量接種于1LLB 十a(chǎn)mp培養(yǎng)基中37°C ， 220rpm培養(yǎng)4-5h至OD,至0. 5-1, 0，加入IPTG 至終濃度為0.5mM， 37°C， 220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)3-5h，離心收集菌體按 1G菌體加入10ml Loading Buffer (20Mm PBS， 0. 5M NaCl， 30mM咪 唑，PH7.4) 的比例加入Loading Buffer,超聲破碎再次離心取上 清，用0.45uM的濾膜過濾以備純化。
HisTRAP H. P (GE company)柱，用10倍柱體積Loading Buffer 平衡柱子，上述過濾上清直接上柱，上樣后用Loading Buffer洗柱 至OD，吸收值至基線，用Elusion Buffer(20Mm PBS， 0. 5M NaCl， 300mM 咪唑，PH7,4)洗脫，收集洗脫峰，進行SDS-PAGE分析純度，結(jié)果顯 示純度達到90%以上，蛋白濃度2_3mg/ml。 6L培養(yǎng)液可得到140 一200mg蛋白。(4)Elisa及Western鑒定重組蛋白抗原性
純化的重組胱抑素C稀釋至10ug/ml后按照Elisa標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī) 程包板，分別使用抗胱抑素C多克隆抗體及抗人血紅蛋白多克隆抗體 為一抗，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗人IgG為二抗，結(jié)果顯示抗胱 抑素C多抗為一抗的孔板為陽性而抗人血紅蛋白多體為一抗的孔板 為陰性。證明重組胱抑素C免疫特異性高。Western實驗結(jié)果與Elisa 結(jié)果相同。
實施例2:
制備人胱抑素C診斷試劑
(1) 一對抗不同表位單克隆抗體的制備
純化重組胱抑素C蛋白按照單克隆抗體制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制備 多株抗克隆抗體。通過位點疊加實驗篩選一對抗不同位點的單抗。具 體步驟如下取純化的重組人胱抑素C蛋白稀釋至10ug/ml按照El isa 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程包數(shù)個板(l-N， N為待測單克隆株數(shù))，封閉洗板后加 入第一株單抗至此單抗所對應(yīng)的抗原位點飽和的濃度(至位點飽和所 需單抗?jié)舛仁峭ㄟ^預(yù)實驗完成的)，37"C孵育。第1板按普通程序加 入二抗并顯色，記錄下板孔0D值0DL同時第2板洗滌后加入第二株單 抗，第3板洗滌后加入第三株單抗…第N板洗滌后加入第N株單抗， 再次37X:孵育，按程序加入二抗后顯色，板孔0D"直與0D!進行比較， OD值差別超過臨界點的單抗確定為與第一株單抗抗不同抗原位點者。 按照上述方法篩選獲得了兩株抗不同位點的單抗，分別命名為d， Q 。
(2) 單克隆抗體致敏膠乳膠乳與EDC.HCL、 Sulfo-NHS按照一定比例混合于活化緩沖液 (0, 1M MES, 0. 15M NaCl，PH5. 0)中，15min后加入淬滅劑離心收集 膠乳，重懸于致敏緩沖液(O. 1M pBS，O. 5M NaCl,ra 7.2)中加入適量 混合單抗(單抗一與單抗二按摩爾比1: 1混合)反應(yīng)lh.反應(yīng)液加 入終濃度1腿SA封閉過夜。離心收集致敏好的膠乳重懸于反應(yīng)緩沖液 (0. 2M NH4C1， 0. 1M NaCl， 0. 2%。PEG20000， PH8. 4)中即為人胱抑素C 診斷試劑R2。
(3)試劑測定結(jié)果
通過自制試劑，進口試劑1分別測定進口試劑2配套校準(zhǔn)品得到 校準(zhǔn)值。結(jié)果顯示自制試劑與進口試劑1校準(zhǔn)值相關(guān)系數(shù)達到 0.9997 ，參見圖1所示。
實施例3:
制備人胱抑素C診斷質(zhì)控品
取濃縮重組人胱抑素蛋白用保護緩沖液(0. 02M碳酸鹽緩沖液， 20%丙三醇，0. 8%蔗糖，0. 5%BSA， 0. 2X。NaN3)稀釋成8ug/ml， 4 ug/ml， 2 ug/ml, 1 ug/ml，0.5 ug/ml等五個濃度，凍干后即制成人胱抑素C診 斷質(zhì)控品。序列表
〈110>四川省邁克科技有限責(zé)任公司 <120>重組人胱抑素C基因及其表達與應(yīng)用 <130〉重組人胱抑素C基因及其表達與應(yīng)用
<160〉 2
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 394
<212> DNA
〈213> 人
<400> 1
ggatcctccagtcccggcaagccgccgcgcCtggtggg3ggccccatggacgccagcgtg60
gtgtgcggcgtgC3Ctgg3Ctttgccgtcggcgagtacaacaaagccagc120
accacagccgcgcgctgcaggtggtgcgcgcccgcaagcaigatcgtagct180
ggggtgaactacttcttggacgtggagctgggccgaaccacgtgtaccaagacccagccc240
肌cttggacaactgccccttccatgaccag ccscatctga aa兆ga^agcattctgctct300
ttccagatctacgctgtgccttggcagggcacaatgaccttgtcgaaatccacctgtcag360
g3CgCCt3ggggtctgtaccgggctggcctgtgc394
〈210〉 2
〈211> 122
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Gly Ser Ser Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met
15 10 15
Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Gly Glu Tyx Asn Lys Ala Ser Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala 35 40 45Leu Gin Val Val Arg Ala Arg Lys Gin lie Val Ala Gly Val Asn Tyr
50 55 60
Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gin Pro 65 70 75 80
Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His Asp Gin Pro His Leu Lys Arg Lys
85 90 95
Ala Phe Cys Ser Phe Gin lie Tyr Ala Val Pro Trp Gin Gly Thr Met
100 105 110
Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gin Asp Ala 115 120
權(quán)利要求
1、一種具有SEQ ID NO1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。
2、 一種具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。
3、 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述核酸序列制備重組可溶人胱抑素C 蛋白的方法，其特征在于，包括下述步驟(1) 從新鮮人胎盤中獲得總RNA，用RT-PCR方法得到SEQ ID NO : 1所示的截短人胱抑素C基因序列；(2) 用步驟(1)獲得的截短人胱抑素C基因序列與表達質(zhì)粒重 組，重組子經(jīng)過DNA測序驗證，確定重組表達質(zhì)粒的序列和閱讀框均 正確；(3) 用步驟(2)所獲得的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主細(xì)胞；(4) 培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從細(xì)胞胞質(zhì)中回收和純化重組可溶性人胱 抑素C蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特征在于所述表達載體為原核表達載體，且該原核表達載體的融 合蛋白標(biāo)簽可對人胱抑素C蛋白的兩對二硫鍵正確配對起到促進作 用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特征在于所述原核表達載體為PET32a(+)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特征在于所述的表達宿主細(xì)胞為能夠表達所述重組表達質(zhì)粒的宿 主細(xì)胞，且具有校正大腸桿菌密碼子偏好性的特征。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特征在于所述的表達宿主細(xì)胞為大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特征在于所述培養(yǎng)宿主細(xì)胞所用的培養(yǎng)基采用含抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng) 基擴增培養(yǎng)宿主細(xì)胞，參數(shù)為培養(yǎng)溫度35'C 37'C，培養(yǎng)時間4 5h;誘導(dǎo)溫度35-37°C，誘導(dǎo)時間3 5h;誘導(dǎo)物IPTG終濃度為0. 2 0. 5mM。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特征在于篩選宿主細(xì)胞中高效表達的陽性表達菌株作為工程菌， 重組可溶性人胱抑素C蛋白通過工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心收集菌體，超 聲破碎后離心取上清經(jīng)過鎳柱一步純化得到。
10、 一種制備抗人胱抑素C不同表位的系列單克隆抗體或多克隆 抗體的方法，其特征在于運用按照權(quán)利要求3所述制備的重組可溶 性人胱抑素C蛋白免疫實驗動物獲得單克隆抗體或多克隆抗體，通過 位點疊加實驗確定抗不同抗原表位的系列單克隆抗體；所述系列是指 大于等于兩株。
11、 一種制備測定人體內(nèi)人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法， 其特征在于運用權(quán)利要求10所制備的兩株單克隆抗體通過化學(xué)交 聯(lián)劑分別與膠乳交聯(lián)后混合于緩沖液中制備成診斷試劑，其中兩株單克隆抗體摩爾比為l: 1。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述制備測定人體內(nèi)人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法，其特征在于所述化學(xué)交聯(lián)劑為Sulfo-NHS， EDC, HCL。
13、 一種制備人胱抑素C診斷試劑質(zhì)控品的方法，其特征在于 按照權(quán)利要求3所述制備的重組可溶性人胱抑素C蛋白用保護性緩沖 液分別調(diào)制到從低到高5個固定濃度后凍干制備。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述制備人胱抑素C診斷試劑質(zhì)控品的方 法，其特征在于所述從低到高5個固定濃度是指按照權(quán)利要求11 制備的診斷試劑的檢測線性范圍而定的濃度，所述5個固定濃度分別 為O. 5ug/ml; lug/ml; 2ug/ml; 4ug/ml; 8ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人胱抑素C基因及其表達與應(yīng)用。該截短人胱抑素C基因具有SEQ ID NO1所示核酸序列；截短人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列。本發(fā)明運用基因工程技術(shù)表達純化大量穩(wěn)定的重組可溶胱抑素C蛋白并利用該蛋白獲得了一對單抗，進而制備了穩(wěn)定的胱抑素C診斷試劑及其質(zhì)控品。解決了我國人胱抑素測定試劑盒自主研發(fā)的瓶頸問題。
文檔編號C12N15/12GK101413001SQ20081014771
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者丹 吳, 周文娟, 堃 喻, 王保寧, 丹 陳 申請人:四川省邁克科技有限責(zé)任公司