專利名稱：花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因及其編碼的蛋白質以及基因克隆方法
技術領域：
本發(fā)明屬于脂肪酸代謝工程領域，具體涉及花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶 基因及其編碼的蛋白質以及基因克隆方法。
背景技術：
植物硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶(SAD),催化硬脂酰-載體蛋白脫飽和反應， 在脂肪酸鏈的C9-C10間引入一個雙鍵形成油酰-載體蛋白。油?；\出質體可進 一步脫飽和形成多不飽和脂?；?，這些脂酰基可形成甘油脂等，成為生物膜的 組成成分，或貯存起來成為貯脂。因為多不飽和脂肪酸的形成主要以油?；?脫飽和為基礎，所以SAD催化的脫飽和作用是植物典型不飽和脂肪酸生物合成 的第一步，在很大程度上決定飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例(羅通,鄧騖 遠，張富麗.植物硬脂酰一酰基載體蛋白脫飽和酶[J].生命的化學，2006)。研究 表明，這一比例和生物膜系統(tǒng)的流動性、選擇透性以及植物的多種生理功能有 密切的關系，并決定著貯脂的成分和含量(Los D A， Murata N. Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochimiea et Biophysica Acta, 1998， 1394: 3-15)。
SAD的結構分析對紅花(C^W/^wmy """on^)中分離純化到的SAD進行分 析，推斷SAD是一個同源二聚體；Lindqvist等用X-射線晶體衍射分析描述了蓖 麻SAD的晶體結構。亞基的二級結構除了在其C末端有一個"發(fā)夾環(huán)"夕卜，主 要由ll個cx螺旋組成一個較大的螺旋結構區(qū)。該蛋白主要由4個螺旋東結構組 成，中間埋藏著一個由兩個鐵原子組成的二鐵中心，兩鐵原子之間通過一個氧 原子相聯(lián)，形成非常對稱的Fe-O-Fe二鐵氧簇，并主要由二鐵中心及四螺旋東的 氨基酸側鏈形成酶活性中心，金屬鐵離子在打斷脂肪酸鏈上的穩(wěn)定的C-H鍵時
起重要作用(Lindqvist Y, Huang W, Schneider G， " a/. Crystal structure of delta9 stearoyl隱acyl carrier protein desaturase from castor seed and its relationship to other di-iron proteins[J]. EMBO J, 1996, 15(16): 4081-4092 )。
SAD的功能分析目前已經(jīng)從蓖麻、大紅花、油菜等多種植物中分離獲得 SAD的cDNA片段(張羽航，鮑時翔，鄭學勤等.脂肪酸飽和酶的研究進展[J].生 物技術通報,1998,4: 1-8 ) 。 Kodama (Kodama H， a/. Fatty acid desaturation during chilling acclimation is one of the factors involved in conferring low temperature tolerance to young tobacco leaves[J]. Plant Physiology, 1995,107(4): 1 177-1 185.)將酵母的SAD基因編碼的硬脂酰基輔晦A去飽和酶導入煙草，Los 等(Hightower R, Expression of antifreeze protein in transgenic plants[J]. Plant MolBiol., 1991,17: 1 013-1 021.)將菠菜的SAD基因編碼的硬脂?；oA去飽和 酶導入煙草都可提高煙草的抗凍力。Los D等(Los D W Cloning of a temperature-dependent expression of desaturase desA gene in 5y"ec/ o，rt 尸CC6803[J], FEBS,1993,318(1): 57-60.)將SAD基因有義鏈或反義鏈插入到植物 轉化載體pBI121中，對基因工程的模式植物煙草進行了轉化，對轉基因煙草的 抗寒性分析表明正向表達SAD基因的轉基因煙草抗寒性明顯增強，反向表達 SAD基因的轉基因煙草抗寒性明顯減弱。由此也證明了脂肪酸去飽和酶高表達 時可增強植物抗寒性。另外，SAD催化的硬脂酰載體蛋白脫飽和作用在很大程 度上決定了飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例(羅通，鄧騖遠,張富麗.植物硬脂 酰一?；d體蛋白脫飽和酶[J].生命的化學，2006)。
但是，現(xiàn)有技術中沒有關于花生SAD基因的報道，因此在花生SAD研究領 域仍屬空白。而花生的SAD基因的獲得，能夠為下一步花生品質改良的研究和 抗寒性的研究奠定一個良好的基礎。
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種首次從花生中獲得的花生硬脂 酰-載體蛋白脫飽和酶(SAD)全長基因及其編碼蛋白的氨基酸序列。
花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶是脂肪酸脫飽和過程的關鍵酶，催化硬脂酰
-ACP脫飽和形成油酰-ACP的反應，在脂肪酸鏈的C9-C10間引入一個雙鍵， 油?；\出質體可進 一 步脫飽和形成多不飽和脂酰基。
本發(fā)明的第二個目的是提供花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶編碼的氨基酸 序列及編碼蛋白性質的生物信息學預測。
同時，本發(fā)明還提供該花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因的克隆方法。
為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明所提供的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶，從花生G4rac/^ 中克隆，命名為^4/i&4"基因，核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
上述花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶編碼的蛋白質，命名為AhSAD蛋白質， 其氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
上述花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶(J^^4")基因的克隆方法，包括如下 步驟
(1)選用Ell花生種子作為實驗材料，釆用Pbiozol植物組織RNA提取 試劑盒提取花生種子中的總RNA, RNA含量及質量釆用瓊脂糖凝膠電泳檢測；
(2 )以獲得的總RNA為模板，采用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)反轉錄合成5，-RACE-Ready cDNA;
(3 )根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設計J/i5^i)全長基因引物RSAD-5A 5'-CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3'和RSAD-3B
5'-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG-3',以5，-RACE-Ready cDNA為模板， 用LATaq(Takara)進行PCR擴增，反應程序如下94。C預變性3min, 94。C變 性45s, 58。C復性60s， 72。C延伸90s, 30個循環(huán)后，72°C 10min;
(4 ) PCR產(chǎn)物回收后與pMDl8-T simple vector連接，連接產(chǎn)物轉化E co// ToplO感受態(tài)細胞，釆用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進一 步驗證后測序，獲得花生^/i^4Z)全長基因序列。
本發(fā)明的^MvlD基因全長1499bp,開放閱讀框為1218bp，位于20-1237aa。 DNAssist軟件分析表明屈&4D共編碼406個氨基酸。根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫分
析花生J/2&4Z)基因編碼的406個氨基酸，發(fā)現(xiàn)此段序列含有一個脂肪酸去飽
和酶家族 2 的活性標記，位于 326-345aa( USERSEQ1 ，
SAvaqR工gvytakDYad工LE)。另夕卜還包含6種其它功能位點，分另'j為蛋白激晦 C磷酸化位點 (Protein kinase C phosphorylation site, PS00005 )， N-端十四烷酰 化位點 (N-myristoylation site, PS00008 )，酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site, PS00006 ),酪氨酸激酶磷酸化位點(Tyrosine kinase phosphorylation site, PS00007 )， N-端糖基化位點(N-glycosylation site, PS00001 ), 酰胺化位點(Amidation site, PS00009 )。
用Protpamm預測編碼蛋白的物理化學性質，推測分子式為 C1797H282()N498 0 542 S2C)，分子量為46251.6，等電點為6.24，理論推導半衰期為30h， 不穩(wěn)定參數(shù)是45.07，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中含量相對較多的氨基酸是 Leu(9.9%)， Glu (8.1%), Ser(7.9%), Arg (7.4%), Ala (7.1%);該蛋白中不含Pyl和 Sec?？偟膸д姾傻臍埢鶠?Arg + Lys): 53;總的帶負電荷的殘基為(Asp + Glu):56。該蛋白親水性平均數(shù)為-0.508，預測該蛋白為水溶性蛋白。釆用SignalP 3.0 Server進行信號肽預測，表明該蛋白不含信號肽序列，為非分泌性蛋白。以 TMHMM2 program為基礎的跨膜結構預測表明該蛋白不含跨膜結構。亞細胞定 位預測表明該蛋白可能位于細胞質體中。
釆用PredictProtein預測花生AhSAD蛋白的二級結構，表明該蛋白含有 50.49%的cc-螺旋，5.91% (3-折疊以及43.60%的無規(guī)則巻曲。利用3D-JIGSAW 預測花生AhSAD蛋白三級結構，結果表明該蛋白呈緊密的球狀結構。
本發(fā)明公開了花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶(AhSAD)基因的核苷酸序列 及其編碼的蛋白質。該基因來自花生(Arachishypogaea),其超量表達可提高 花生中不飽和脂肪酸的含量，并且還可能增強花生的耐寒性，從而實現(xiàn)對花生 品質及抗逆性的改良。
花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶是調控花生脂肪酸脫飽和過程的關鍵酶，該 酶活性的增加也能夠使花生中不飽和脂肪酸含量增加，增強花生的耐寒性。


圖1為位于326-345aa位點的脂肪酸去飽和酶家族2的活性標記； 圖2為花生AhSAD蛋白三級結構。
具體實施例方式
下面結合具體實例對本發(fā)明作進一步詳細的描述。 花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶(AhSAD)基因的分子克隆 選用E11花生種子作為實驗材料，提取花生種子中的總RNA。以獲得的總 RNA為模板，反轉錄合成5'-RACE-ReadycDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST 信息設計花生J/^4Z)全長基因引物 RSAD-5A 5'匿CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3' 和 RSAD-3B
5'-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG-3'。以5'陽RACE-Ready cDNA為模板， 用LA Taq(Takara)進行PCR擴增，反應過程為94'C預變性3min， 94。C變性 45s, 58。C復性60s， 72。C延伸90s， 30個循環(huán)后，72°C 10min。 PCR產(chǎn)物回 收后與pMD18-T simple vector連接，連接產(chǎn)物轉化E co//Top IO感受態(tài)細胞， 釆用藍白斑法篩選陽性克隆。篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進一步驗證后測序，最終 獲得JA&4i)全長基因及其序列。
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。
發(fā)明涉及的序列及記號分列如下
(1) SEQ ID NO. 1的信息 (i)序列特征
(A) 長度1499bp，
(B) 類型核苷酸，
(C) 鏈性單鏈，
(D) 拓撲結構:線性；
(ii) 分子類型核苷酸；
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 1。
(2) SEQIDN0.2的信息
(i)序列特征
(A) 長度406a.a,
(B) 類型氨基酸，
(C) 鏈性單鏈，
(D) 拓撲結構:線性；
(ii) 分子類型蛋白質；
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 2。
序列表
<110>山東省花生研究所
<120>花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因及其編碼的蛋白質以及基因克隆方法
<160>2
<210>1
<211>1499
<212>DNA
<213>花生
<400>1
1cgaagacgcaacacgaaaaatggctctgaggctgaaccctaacccttcacagaagctctt
61tctctctccttcttcatcatcatcttcttcttcttcatcgttctcgcttcctcaaatggc
121tegcctc3gatctcc3aggttccgcatggcctcc3ccctccgcactggttcc3aag3ggt
181tgaaaatctcaagaagcctttcacgcctccccgagaggtacatgttcaagtaacccactc
241catgccaccccagaagattgagattttcaaatcgttagagggttgggctgaggagaacat
301tttgactctcctcaaacctgtagggaagtgctggcagccacaggactatttaccagaacc
361ttcagaggatggatttgaggagcaagtgagggaactgagagcaagggcaaaagagctccc
421tgatgattactttgttgttctggtcggagacatgatcactgaagaagcccttcctactta
481ccagacaatgcttaatactctcgacggggttcgagatgaaacaggtgccagccttacttc
541ctgggcagtttggacaagggcatggactgcggaggaaaatagacatggtgatcttcttaa
601caagtatctttacttgtctggccgcgttgacttgaggcaaattgagaagacaatacagta
661cttgattggctctggaatggatcctcggaccgagaacagcccctaccttggtttcattta
721tecttcatttcaag￡ig￡igggccacctttatatcccatggg3ac3C3gcteggctggcaa￡i
781ggaacatggggatatgaagttggcgcaaatatgtggtatgattgcctcagatgagaaacg
841ccacgagactgcatacacaaagatagtggagaagctgtttgagatcgatcctgatggaac
901tgtaatggcttttgctgacatgatgaggaagaaaatagctatgccggcacacttgatgta
961tgatggccgtgatgacaacctgttcgaaaactattctgccgtcgctcagcgcatcggagt
1021ctacactgccaaggactatgctgatatccttgaatttcttgtggggcggtggaaggtggc
1081agacctaaccggactctctggtgagggaaggaaagctcaggattatgtttgtgggctgcc
1141gccaag3atccg肌ggctgg3gg堪3g3gctc犯gg犯g3gcca3gg3atcccc3agact
1201 taaattcagttggatttacgatagggaagtgcaactctaaacaaatcagatggaggagga
1261 tcatgatatgaatcattatgcatcattatgcaatatcctattctgagaaagtgttgaata
1321 gtgaagaaagctttcagtttgtcatttcctttttttttttttgggttttcttactctcta
1381 taatgtcatttgtaaggggaaacagttgttaaatggttaactggttaagggtttaagcag
1441 tttaggagctgtagtaattagaaacgctatgttttcggtgtggtgtccctttttttcct
<210>2
<211>406
<212>PRT
<213>花生
<400>2
Met Ala Leu Arg Leu Asn Pro Asn Pro Ser Gin Lys Leu Phe Leu Ser Pro Ser Ser Ser
15 10 15
20
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Leu Pro Gin Met Ala Ser Leu Arg Ser Pro Arg
25 30 35
40
Phe Arg Met Ala Ser Thr Leu Arg Thr Gly Ser Lys Glu Val Glu Asn Leu Lys Lys Pro
45 50 55
60
65 70 75
80
Glu lie Phe Lys Ser Leu Glu Gly Trp Ala Glu Glu Asn lie Leu Thr Leu Leu Lys Pro
85 卯 95
100
Val Gly Lys Cys Trp Gin Pro Gin Asp Tyr Leu Pro Glu Pro Ser Glu Asp Gly Phe Glu
105 110 115
120
Glu Gin Val Arg Glu Leu Arg Ala Arg Ala Lys Glu Leu Pro Asp Asp Tyr Phe Val Val
125 130 135
140
Leu Val Gly Asp Met lie Thr Glu Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gin Thr Met Leu Asn Thr
145 150 155
160
Leu Asp Gly Val Arg Asp Glu Thr Gly Ala Ser Leu Thr Ser Trp Ala Val Trp Thr Arg
165 170 175
180
Ala Trp Thr Ala Glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu Ser
185 190 195
200
Gly Arg Val Asp Leu Arg Gin lie Glu Lys Thr He Gin Tyr Leu lie Gly Ser Gly Met 205 210 215
220
Asp Pro Arg Thr Glu Asn Ser Pro Tyr Leu Gly Phe lie Tyr Thr Ser Phe Gin Glu Arg 225 230 235
240
Ala Thr Phe lie Ser His Gly Asn Thr Ala Arg Leu Ala Lys Glu His Gly Asp Met Lys 245 250 255
260
Leu Ala Gin lie Cys Gly Met lie Ala Ser Asp Glu Lys Arg His Glu Thr Ala Tyr Thr 265 270 275
280
Lys lie Val Glu Lys Leu Phe Glu lie Asp Pro Asp Gly Thr Val Met Ala Phe Ala Asp
285 290 295
300
Met Met Arg Lys Lys lie Ala Met Pro Ala His Leu Met Tyr Asp Gly Arg Asp Asp Asn
305 310 315
320
Leu Phe Glu Asn Tyr Ser Ala Val Ala Gin Arg lie Gly Val Tyr Thr Ala Lys Asp Tyr
325 330 335
340
Ala Asp lie Leu Glu Phe Leu Val Gly Arg Trp Lys Val Ala Asp Leu Thr Gly Leu Ser
345 350 355
360
Gly Glu Gly Arg Lys Ala Gin Asp Tyr Val Cys Gly Leu Pro Pro Arg lie Arg Arg Leu
365 370 375
380
Glu Glu Arg Ala Gin Gly Arg Ala Lys Glu Ser Pro Arg Leu Lys Phe Ser Trp lie Tyr
385 390 395
400
Asp Arg Glu Val Gin Leu
405 410 415
420
權利要求
1. 花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因，其特征在 于，基因全長1499bp,開放閱讀框為1218bp，位于20-1237aa。
3. 根據(jù)權利要求1所述的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因，其特征在 于，該基因編碼的406個氨基酸，發(fā)現(xiàn)此段序列含有一個脂肪酸去飽和酶家族 2的活性標記，位于326-345aa。
4. 根據(jù)權利要求1或3所述的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因，其特征 在于，還包含6種其它功能位點，分別為蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site, PS00005 ), N-端十四烷?；稽c (N國myristoylation site, PS00008 ),酪蛋白激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site, PS00006 )， 酪氨酸激酶磷酸化位點(Tyrosine kinase phosphorylation site, PS00007 ), N-端糖基化位點(N-glycosylation site, PS00001 ),酰胺化位點(Amidation site, PS00009 )。
5. 花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
6. 根據(jù)權利要求5所述的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因編碼的蛋白 質，其特征在于，氨基酸的含量是Leu9.9%， Glu 8.1%， Ser7.9%， Arg 7.4%， Ala 7.1%。
7. 根據(jù)權利要求5或6所述的花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因編碼的蛋 白質，其特征在于，該蛋白為非分泌性蛋白。
8. —種花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶基因的克隆方法，包括如下步驟(1 )選用Ell花生種子作為實驗材料，釆用Pbiozol植物組織RNA提取 試劑盒提取花生種子中的總RNA， RNA含量及質量釆用瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)以獲得的總RNA為模板，釆用SMARTTM RACE Amplification Kit 反轉錄合成5，-RACE-Ready cDNA;(3 )根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設計花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶 全長基因引物RSAD-5A 5'-CGAAGACGCAACACGAAAAATGGC-3'和 RSAD-3B 5'-AGGAAAAAAAGGGACACCACACCG國3', 以5，-RACE-ReadycDNA為模板，用LA Taq (Takara)進行PCR擴增，反應程序如下94。C預變 性3min,94。C變性45s， 58。C復性60s， 72。C延伸90s, 30個循環(huán)后，72°C 10min;(4)PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T simple vector連接，連接產(chǎn)物轉化五.cW ToplO感受態(tài)細胞，釆用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進一 步驗證后測序，獲得花生SAD全長基因序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了花生籽粒中脂肪酸脫飽和反應過程中花生硬脂酰-載體蛋白脫飽和酶如SEQ ID NO1所示的基因及其編碼蛋白質，該基因采用以下方法克隆用瓊脂糖凝膠電泳檢測花生種子中的總RNA、以總RNA為模板反轉錄合成5’-RACE-Ready cDNA、PCR擴增、PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple vector連接，轉化，篩選陽性克隆。本發(fā)明基因表達可提高花生中不飽和脂肪酸的含量，并且還可能增強花生的耐寒性，從而實現(xiàn)對花生品質及抗逆性的改良。
文檔編號C12N15/53GK101386863SQ20081014743
公開日2009年3月18日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權日2008年8月15日
發(fā)明者任增凱, 曹玉良, 楊慶利, 潘雨娟, 禹山林, 陳明娜 申請人:山東省花生研究所