專利名稱：草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中的基因克隆領(lǐng)域，尤其涉及草魚胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因的核苷酸及氨基酸序列。
背景技術(shù)：
蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內(nèi)，是一種活性非常強(qiáng)的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽 的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關(guān)。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三 羧酸循環(huán)、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進(jìn)胞質(zhì)和亞細(xì)胞器代謝 物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細(xì)胞內(nèi)定位的不同其表達(dá)種類不同，MDH具有多種同工酶 形式。胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，擔(dān)負(fù)著將NADH轉(zhuǎn)入線粒體的重任，并且還對(duì)調(diào) 控三羧酸循環(huán)有作用，同時(shí)cMDH還是核酸通路(NACh)復(fù)合體的一個(gè)組成部分。但目前對(duì)cMDH的研 究相對(duì)較少，且主要的研究集中在植物上。硬骨魚類通常會(huì)表達(dá)兩種平行基因形式的胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶 (cMDH-S和cMDH-L)，這與鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物類這些四足動(dòng)物只表達(dá)一種是不同的，而cMDH-L與線粒 體蘋果酸脫氫酶(mMDH)很相似。目前NCBI上只能査到較少種類魚類的cMDH的全長(zhǎng)cDNA，而在淡 水經(jīng)濟(jì)鯉科魚類中克隆到蘋果酸脫氫酶(MDH)尚屬首次。
目前胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶在草魚基因研究上還屬空白。本基因的獲得可以進(jìn)一步研究該基因在草魚細(xì)胞 中的組成及基因結(jié)構(gòu)，并為研究該基因在草魚生長(zhǎng)中的作用提供更高層次的科學(xué)服務(wù)，為研究草魚功能飼 料提供理論依據(jù)和新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以本實(shí)驗(yàn)室保存草魚腸道cDNA文庫(kù)中胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶EST序列為模版設(shè)計(jì)引物， 結(jié)合RACE技術(shù)，用PCR法擴(kuò)增克隆得到草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因的全表達(dá)序列。
上述目地是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
取出新鮮草魚腸道組織，采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取總RNA,甲醛變性凝膠 電泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)檢測(cè)總RNA質(zhì)量。
本實(shí)驗(yàn)室保存草魚腸道cDNA文庫(kù)中篩選到胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)EST序列，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該 EST序列具有胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶cDNA的完整3'端，欠缺cDNA序列的5'端。利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) (Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)對(duì)目的基因的5端進(jìn)行擴(kuò)增。
根據(jù)己知EST序列設(shè)計(jì)外側(cè)和內(nèi)側(cè)兩個(gè)特異引物
5端特異引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3 ，
5端特異引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3 ，
通用引物 Long:
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' Short: 5'—CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' 接頭引物5'—AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3' 5端核心引物5'"(T)25V N-3' (N = A， C， G or T; V = A, G or C)
以接頭引物和5端核心引物反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，上游引物使用通用引物， 下游引物使用5端特異引物1。PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳膠回收后用通用引物和5端特異引物2進(jìn)行PCR驗(yàn)證。 將驗(yàn)證后的序列片段連接到pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入f.Co/ZJM109菌株，經(jīng)質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后用M13通用引物測(cè) 序。擴(kuò)增得到片段大小為681bp。再根據(jù)5端擴(kuò)增片段和已知EST序列拼接所得結(jié)果設(shè)計(jì)引物對(duì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因的開(kāi)放閱讀框進(jìn) 行擴(kuò)增，引物分別為
上游引物5 ，-CACATCTCAACCTGCACAATCAGAC-3 ， 下游引物5 ，-CAGAGGAGTAGACGCCCATAGACAC-3 ，
以接頭引物和5端核心引物反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用上下游引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)。PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳膠回收后連接到pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入五.Coft'JM109菌株，經(jīng)質(zhì)粒酶 切驗(yàn)證后用M13通用引物測(cè)序。擴(kuò)增得到片段大小為861bp。
利用vector NT對(duì)擴(kuò)增所得開(kāi)放閱讀框序列和全cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)全序列進(jìn)行調(diào)整后獲得了完 整的草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列，既目的基因。
草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列的獲得可以進(jìn)一步研究該基因在草魚細(xì)胞中的組成及基因 結(jié)構(gòu)，并為研究該基因在草魚生長(zhǎng)中的作用提供更高層次的科學(xué)服務(wù)，為研究草魚功能詞料提供理論依據(jù) 和新思路。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)以下具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
1. 總RNA的提取
挑選實(shí)驗(yàn)材料——健康雌性草魚，體長(zhǎng)570mm，約1.5冬齡(18個(gè)月)，2.4kg。取出新鮮草魚腸道組 織，液氮迅速冷凍后保存于-80'C冰箱備用。采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取總RNA，甲 醛變性凝膠電泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)檢測(cè)總RNA質(zhì)量。
2. cDNA第一鏈的合成
取草魚腸道細(xì)胞總RNA5ug與反轉(zhuǎn)錄引物(5端核心引物和接頭引物)各lul(12uM)混合，70'C加 熱2分鐘，立即放置冰上，然后加入5 x buffer, 10mM dNTP混合液，20mM DTT， M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體 系為10UL。反應(yīng)過(guò)程為42。C l小時(shí)30分鐘，之后加入90ul TE buffer (PH 8. 0) ， 72°C加熱7分鐘。最 后得到100ul草魚腸道細(xì)胞cDNA模板，放入-20'C保存?zhèn)溆谩?br> 3. 引物設(shè)計(jì)依據(jù)和合成方法
在本實(shí)驗(yàn)室保存草魚腸道cDNA文庫(kù)中篩選到含有胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶EST序列的轉(zhuǎn)化子，送交測(cè)序， 并將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示該EST序列含有胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶cDNA的完整3' 端，欠缺cDNA序列的5'端。以該EST序列為模版設(shè)計(jì)2個(gè)5端特異引物，其中引物1用于初步擴(kuò)增胞質(zhì) 蘋果酸脫氫酶cDNA的5端序列，引物2用于對(duì)初步擴(kuò)增序列進(jìn)行驗(yàn)證。引物序列設(shè)計(jì)后送交Invitrogen Corporation進(jìn)行合成。
5端特異引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3'
5端特異引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3'
4. 草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因cDNA全序列的克隆
以草魚腸道胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶EST序列為模版設(shè)計(jì)的5端特異引物1和通用引物擴(kuò)增片段約為681bp。 4.1用第一鏈cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行初步PCR擴(kuò)增
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，根據(jù)已知EST序列設(shè)計(jì)特異性引物1，利用cDNA末端快速擴(kuò) 增技術(shù)(RapidAmplifkationof cDNAends， RACE)對(duì)目的基因的5'末端進(jìn)行擴(kuò)增。
在5'RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和接頭引物在cDNA的5'末端加上CCC后，以加尾后的cDNA作為 模板，利用5端特異性引物l和通ffl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段反應(yīng)體系如下第一鏈cDNA模板1.5 uL，10xPCR反應(yīng)緩沖液5uL， 25mmol/L MgCl2 3uL， 2.5 mmol/L dNTP 2uL， 10umoI/L5端特異引物1和通用 引物各luL， Taq酶1.25U，用PCR水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至50uL。反應(yīng)條件如下1個(gè)循環(huán)，94'C變性2min; 5個(gè)循環(huán)，94。C變性30s， 60。C退火30s， 72'C延伸2min; 5個(gè)循環(huán)，94。C變性30s， 57。C退火30s， 72°C 延伸2min; 25個(gè)循環(huán)，94。C變性30s， 54'C退火30s， 72。C延伸2min; 1個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min; 4'C保 溫。
所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，共得到3條清晰條帶，大小分別為1000bp、 550bp、 500bp，將其分別從凝膠中純化回收。
4.2用第一鏈cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行PCR驗(yàn)證擴(kuò)增
分別以4.1中擴(kuò)增得到的3個(gè)片段為模板，根據(jù)已知EST序列設(shè)計(jì)特異性引物2，利用cDNA末端快 速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNAends, RACE)對(duì)目的基因的5'末端進(jìn)行驗(yàn)證擴(kuò)增。
利用5端特異性引物1和通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段反應(yīng)體系如下模板1.5 uL (分別以4.1中擴(kuò) 增得到的3個(gè)片段為模板)，10xPCR反應(yīng)緩沖液5uL， 25mmol/L MgCl2 3uL， 2.5 mmol/L dNTP 2uL， lOumol/L 5端特異引物2和通用引物各luL, Taq酶1.25U,用PCR水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至50uL。反應(yīng)條件如下1 個(gè)循環(huán)，94'C變性2min; 5個(gè)循環(huán)，94'C變性30s， 59'C退火30s, 72'C延伸2min; 5個(gè)循環(huán)，94'C變性 30s， 56。C退火30s， 72。C延伸2min; 25個(gè)循環(huán)，94。C變性30s， 53。C退火30s， 72。C延伸2rain; 1個(gè)循環(huán)， 72'C延伸10min; 4'C保溫。
所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，僅在以lOOObp片段為模板的反應(yīng)體系中得到 大小為700bp左右的清晰條帶，從凝膠中純化回收該片段。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)EcoR I和Hind HI雙酶切驗(yàn)證 后，將具有插入片段質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。
4.3用第一鏈cDNA進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的PCR擴(kuò)增
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，根據(jù)5端擴(kuò)增片段和已知EST序列拼接所得結(jié)果設(shè)計(jì)上下游引 物對(duì)上述操作所的草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證所得序列的正 確性。
利用上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段反應(yīng)體系如下模板luL， 10xPCR反應(yīng)緩沖液5uL， 25mmol/L MgCl23uL, 2.5 mmol/L dNTP 2uL， 10umol/L上游引物和下游引物各luL, Taq酶1.25U,用PCR水將反 應(yīng)體系補(bǔ)充至50uL。反應(yīng)條件如下1個(gè)循環(huán)，94'C變性2min; 30個(gè)循環(huán)，94'C變性30s, 57'C退火30s， 72。C延伸2min; 1個(gè)循環(huán)，72'C延伸10min; 4'C保溫。
所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用l免的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢湖ij，得到大小為900bp左右的清晰條帶，從凝膠中 純化回收該片段。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞， 挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和Hindm雙酶切驗(yàn)證后，將具有插入片段質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子 送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。
將開(kāi)放閱讀框序列的測(cè)序結(jié)果與5端擴(kuò)增片段和已知EST序列拼接所得序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)全序列進(jìn)行 調(diào)整后獲得了完整的草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列，既目的基因。
5. 草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列的確定
將PCR反應(yīng)所得5端擴(kuò)增片段和開(kāi)放閱讀框片段分別克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切驗(yàn)證后，將具有插入片段質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)化子送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。所得結(jié)果用vector NT 進(jìn)行拼接，比對(duì)分析，獲得 一 完整的cDNA序列。將該序列用BLAST軟件 (http:〃ww.ncbi.nim.nih. gcw/blast)進(jìn)行同源性測(cè)定，來(lái)確定為草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基 因同源序列。比對(duì)結(jié)果為<formula>formula see original document page 8</formula>
根據(jù)Ironl995年的報(bào)道，只要兩個(gè)序列間用BLAST軟件比對(duì)后E-Value值小于0.005，則兩個(gè)序列之 間具有絕對(duì)的同源性，即證明序列為同一種基因序列。從比對(duì)結(jié)果看草魚腸道目的基因序列BLAST比對(duì) 后，與其他物種的蘋果酸脫氫酶基因的E值絕對(duì)小于0.005，所以證明所克隆的目的基因是蘋果酸脫氫酶 基因的同源序列。
草魚是我國(guó)特有鯉科大型經(jīng)濟(jì)魚類，在本研究之前沒(méi)有對(duì)其蘋果酸脫氫酶的研究報(bào)道，也沒(méi)有類似的 鯉科魚類的蘋果酸脫氫酶的研究報(bào)道。從草魚胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶與其它代表性物種的同源序列比對(duì)結(jié)果來(lái) 看，草魚蘋果酸脫氫酶的蛋白序列個(gè)與其他代表性動(dòng)物的該酶相似度都極高，只在個(gè)別位點(diǎn)有特異性蛋白。 利用NCBI (/^p:/Avmv.wCW./iZ/ ."yi.gov)提供的蛋白序列保守區(qū)分析軟件進(jìn)行保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)草魚胞 質(zhì)蘋果酸脫氫酶具有典型的蘋果酸脫氫酶功能區(qū)保守序列，包括一個(gè)NAD結(jié)合位點(diǎn)(NAD binding site), —個(gè)蘋果酸結(jié)合位點(diǎn)(malate binding site)以及一個(gè)二聚化接觸功能區(qū)(dimerization interface )。序列表
<110>通威股份有限公司
<120>草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因序列
<160>2
<210>1
<211>1391
<.212>RNA
<213>草魚(CtewcpA。;ywgcwtora !'</e//us ) <220>
<221>5，UTP
<222> (1)…(62)
<220>
<221>CDS
<222> (63)... (1061)
<220>
<221>PolyAsite <222> (1350)... (1391) <220>
<221>PolyA signal <222>(1343)... (1349) <220>
<221>3，UTP
<222> (1062)... (1391)
<400>1
gctg3gtggc 3g3gc3gc3c 3tctttggcg C3C3tctc犯cctgcjicaat C3gacttgaa 60 ac atggccgaaccgatccgtgtcctggtgact 92 Met AlaGluProlieArgVal Leu Val Thr 1 5 10
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ttaacgtatg cgtgtgtgcg tgtgtaactt ctcaagaaac gtttgcaatg taacttactc 1241
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Met Ala Glu Pro lie Arg Val Leu Val Thr 1 5 10
AlaAlaGlyGin lie AlaTyr Ser Leu
15 20 lieAla LysGlyAsp Val Phe 25
He He
Gly
II Leu 21 Gly 31 Leu 41 Asp 51 Ala 61 Thr 71 Leu 81 Pro 91 Leu 101 Thr
III Gin 121 Asn 131 Ser 141 Asn 151 Asn 161 Val 171 Val 181 Gin 191
Tyr Ser
Lys Asp
Asp lie Gly Val
Gin Pro
35
Thr Pro
45
Val Met 55
Leu Pro Leu Leu 65
AkLys Val
Asp Ala Ala Arg Lys Glu
Met Leu Glu Leu Arg 'Asp Val Gly Leu Val
Leu Lys
Gin Gly
Lys Thr
Pro Ala
Lys Ser
Phe Ser
Arg Ala
Gly Val
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Ala Glu Val Asn
Glu 75 lie 85
Gly Met Glu 95
Asn Val Ala 105
30
LeuVal Leu 40
ProVal Leu 50
Gin Asp Cys 60
Val lie Pro 70
Phe Lys Asp 80
Gly Ser Met 90
ArgLys Asp 100
lie Phe Lys 110
AlaLeuGlu LysTyr Ala
115
120 Gly 130 Ala 140 Glu 150 His 160
LysValLeu Val Val 125
Thr AsnCys Leu lie 135
Ala Pro Ser liePro Lys 145
Cys LeuThrArg Leu Asp 155
ArgSerGinVal AlaMet Arg 165 170 SerSer Asp Asn ValLys Asn 175 180 TrpGlyAsn HisSerSer Thr 185 190 AspValHisHis Alalie Val 195 200
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A t- 3 、 3 L 權(quán)利要求
1、一種草魚草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列g(shù)ctgagtggc agagcagcac atctttggcg cacatctcaa cctgcacaat cagacttgaa 60ac atg gcc gaa ccg atc cgt gtc ctg gtg act 92Met Ala Glu Pro Ile Arg Val Leu Val Thr 101 5 10ggc gca gcc gga cag atc gcc tat tct ctg 122Gly Ala Ala Gly Gln Ile Ala Tyr Ser Leu2011 1520ctc tac agc att gct aaa gga gat gtg ttc 152Leu Tyr Ser Ile Ala Lys Gly Asp Val Phe 3021 25 30ggc aag gac cag cca atc atc ttg gtg ctt 182Gly Lys Asp Gln Pro Ile Ile Leu Val Leu 4031 35 40ctg gac atc act ccc atg ctg cct gtg ctg 212Leu Asp Ile Thr Pro Met Leu Pro Val Leu 5041 45 50gat ggg gtc gtc atg gaa ctg cag gat tgt 242Asp Gly Val Val Met Glu Leu Gln Asp Cys 6051 55 60gct ctt cct ctt ctg agg gat gtg att cct 272Ala Leu Pro Leu Leu Arg Asp Val Ile Pro 7061 65 70act gat aag gtt gag gtg ggc ttc aag gac 302Thr Ala Lys Val Glu Val Gly Phe Lys Asp8071 75 80ctt gat gct gcc atc ttg gtg ggc tct atg 332Leu Asp Ala Ala Ile Leu Val Gly Ser Met 9081 85 90cca agg aaa gag ggc atg gag aga aag gac 362Pro Arg Lys Glu Gly Met Glu Arg Lys Asp 10091 95 100ctt ctg aag gcc aac gtg gcc att ttt aaa 392Leu Leu Lys Ala Asn Val Ala Ile Phe Lys110101105110acc caa ggt gaa gca ctg gag aag tac gcc 422Thr Gln Gly Glu Ala Leu Glu Lys Tyr Ala120111115120cag aag act gtc aag gtg cta gtt gtc ggg 452Gln Lys Thr Val Lys Val Leu Val Val Gly 130121125 130aat cca gcc aat acc aac tgt ttg atc gcc 482Asn Pro Ala Asn Thr Asn Cys Leu Ile Ala 140131 135140tcc aaa tct gct ccg tcc att cct aag gag 512Ser Lys Ser Ala Pro Ser Ile Pro Lys Glu 150141 145 150aac ttc tcc tgc ctg acc cgt ctg gac cat 542Asn Phe Ser Cys Leu Thr Arg Leu Asp His 160151 155 160aac agg gcc cgc tct cag gtg gcg atg cgt 572Asn Arg Ala Arg Ser Gln Val Ala Met Arg 170161 165 170gtt ggt gtg tcc tct gac aat gtg aag aat 602Val Gly Val Ser Ser Asp Asn Val Lys Asn 180171 175 180gtg att atc tgg gga aat cac tcc tca act 632Val Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Ser Thr 190181 185 190cag tac cca gat gtg cac cac gct atc gtg 662Gln Tyr Pro Asp Val His His Ala Ile Val 200191 195 200aac cac cat ggg aag gag ttg gca gcc ttt 692Asn His His Gly Lys Glu Leu Ala Ala Phe 210201 205 210gac gcc gtg aat gat gaa agc tgg ctg aag 722Asp Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Leu Lys 220211 215 220ggc gac ttc atc tcc acg gtg cag cag aga 752Gly Asp Phe Ile Ser Thr Val Gln Gln Arg 230221 225 230ggt gca gct gtc atc aag gcc agg aag ctc 782Gly Ala Ala Val Ile Lys Ala Arg Lys Leu 240231 235 240tcc agc gca atg tct gct gcc aaa gcc atc 812Ser Ser Ala Met Ser Ala Ala Lys Ala Ile 250241 245 250tgt gac cac atg agg gac atc tgg ttc ggc 842Cys Asp His Met Arg Asp Ile Trp Phe Gly 260251 255 260act cct gat ggt gag tgg gtg tct atg ggc 872Thr Pro Asp Gly Glu Trp Val Ser Met Gly 270261 265 270gtc tac tcc tct ggt aat tcc tat gga gtt 902Val Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Tyr Gly Val 280271 275 280cct gat gat ctc atg tac tcc ttc cct gtt 932Pro Asp Asp Leu Met Tyr Ser Phe Pro Val 290281 285 290aag att aag aac aag acc tgg aag gtg gtt 962Lys Ile Lys Asn Lys Thr Trp Lys Val Val 300291 295 300gac gga ctc tcc atc aac gat ttc tcc cgc 992Asp Gly Leu Ser Ile Asn Asp Phe Ser Arg 310301 305 310gct aag atg gac gcc acc tcc gct gag ctg 1022Ala Lys Met Asp Ala Thr Ser Ala Glu Leu 320311 315 320gta gag gag aga gac acg gca gtc acc ttc 1052Val Glu Glu Arg Asp Thr Ala Val Thr Phe 330321 325 330ctt gga gcg 1061Leu Gly Ala 333331 333tgactcgact ccacgacaac accgcagcag ttagaccctt caaagggccc aaatccccga 1121ctgtagaatt cacagctgac cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggata ttcatgtatc 1181ttaacgtatg cgtgtgtgcg tgtgtaactt ctcaagaaac gtttgcaatg taacttactc 1241tgcttggagt gtccggggca acacctgaag gagaaccttt ccaattataa ccgttacgca 1301catggttgtc ctgaccaaaa tgatgatcat ctgtcataca acaataaaag tacatgggaa 1361aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcga139全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶的基因，以本實(shí)驗(yàn)室保存草魚腸道cDNA文庫(kù)中胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶EST序列為模版設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RACE技術(shù)，用PCR法擴(kuò)增克隆得到草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因的全表達(dá)序列。對(duì)于研究草魚腸道細(xì)胞胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因結(jié)構(gòu)組成，探討其在草魚腸道代謝調(diào)控中的作用和功能區(qū)域位置，以及與其他物種的區(qū)別都提供了重要的理論依據(jù)。本發(fā)明對(duì)探索建立草魚基因組計(jì)劃與功能飼料產(chǎn)業(yè)化之間紐帶的方法具有開(kāi)創(chuàng)性作用。
文檔編號(hào)C12N9/04GK101434961SQ200810147928
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者江 吳, 恒 徐, 朱文漓, 娟 王, 辜文博, 顧繼銳 申請(qǐng)人:通威股份有限公司;四川大學(xué)