專利名稱：一種循環(huán)利用重組釀酒酵母生產(chǎn)低聚半乳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)低聚半乳糖的方法，尤其涉及一種表面展示e-半乳 糖苷酶的重組釀酒酵母及其制備方法以及循環(huán)利用該重組釀酒酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖的 方法。
背景技術(shù)：
低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides, G0S)是一種具有天然屬性的非消化類寡糖，是 人類母乳中的主要成分，具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖；降低齲齒發(fā)病率；保護(hù)肝臟，改善鈣鐵鋅等礦 物質(zhì)的吸收；改善脂類代謝，降低血脂和膽固醇等功能。該類寡糖可通過微生物產(chǎn)生的P-半乳 糖苷酶以乳糖為底物轉(zhuǎn)糖基合成，制備方式有兩種， 一種是采用游離酶，另一種是采用固定化酶。 游離酶在反應(yīng)過程中不穩(wěn)定，并且難以重復(fù)利用，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，而固定化酶能有效提高酶 的穩(wěn)定性，可重復(fù)利用，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。但固定化酶反應(yīng)過程中存在副產(chǎn)物(葡萄糖)的抑 制和酶的不斷流失等問題，降低了其使用效率。因而迫切需要尋找簡便高效的適合于固定化酶法 生產(chǎn)低聚半乳糖的方法，提高固定化酶的使用效率，大大降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表面展示e -半乳糖苷酶的重組釀酒酵母和循環(huán)利用 該重組釀酒酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖的方法。
一種表面展示e -半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞，該重組釀酒酵母細(xì)胞含有插入了 e -半乳 糖苷酶基因序列的質(zhì)粒載體。
優(yōu)選的，所述的P-半乳糖苷酶基因選自擴(kuò)張青霉(尸e/ /cj7L^歷e耶朋s咖)CGMCCNo. 2352 中的0-半乳糖苷酶基因。
一種表面展示e-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟如下
1) 將3-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示質(zhì)粒pYDl，得重組質(zhì)粒pYDl;
2) 將步驟l)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pYDl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后從陽性重組大腸桿菌中提取 含有e -半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pYDl,再用該重組質(zhì)粒pYDl轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY-100，獲得 含有重組質(zhì)粒pYDl的重組釀酒酵母；
3) 將步驟2)獲得的含有重組質(zhì)粒pYDl的重組釀酒酵母接種于YNB-CAA-葡萄糖培養(yǎng)液，30 'C培養(yǎng)，當(dāng)菌液0Ds。。為2.0 5. 0時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，收集重組釀酒酵母細(xì)胞；
4) 將步驟3)收集的重組釀酒酵母細(xì)胞用誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)液重懸菌細(xì)胞，并調(diào)0D^為0.5 L0， 2(TC 25。C誘導(dǎo)38 42小時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，收集已表面展示P -半乳糖苷酶 的重組釀酒酵母細(xì)胞。
所述YNB-CAA-葡萄糖培養(yǎng)液成分無氨基酸酵母氮源(YNB,購自Difco公司，產(chǎn)品號(hào)0919-15) 6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA，購自Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)A2427) 5 g/L，葡萄糖20 g/L， pH自然， 115。C滅菌30分鐘。
所述誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)液成分無氨基酸酵母氮源(YNB) 6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L， pH自然，115'C滅菌30分鐘；使用之前加入過濾除菌的半乳糖溶液至終濃度20 g/L。
3優(yōu)選的，所述步驟l)中的P-半乳糖苷酶基因來源于擴(kuò)張青霉(尸ey7/ci7/^/ff e;^a/7sw/77) CGMCC No.2352。
優(yōu)選的，所述步驟4)中的誘導(dǎo)產(chǎn)酶溫度為20'C。 優(yōu)選的，所述步驟4)中的誘導(dǎo)產(chǎn)酶時(shí)間為40小時(shí)。
一種表面展示P -半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞在生產(chǎn)低聚半乳糖的應(yīng)用，其特征在于， 先將表面展示0 -半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞懸于YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液，調(diào)0"。。為8. 0 10.0, 25'C培養(yǎng)4 6天；然后3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，對離心后所得的上清液通過高效液相色 譜分析其低聚半乳糖含量；將離心后所得的重組酵母細(xì)胞，重懸于新的YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液，按 上述方法循環(huán)利用該重組釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖，并分析每個(gè)循環(huán)所得上清液的 低聚半乳糖含量。
所述YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液成分為無氨基酸酵母氮源(YNB) 6. 7 g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L，乳糖IOO g/L， pH自然，115。C滅菌30分鐘。
本發(fā)明中所涉及的實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)試劑，除有特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作和普通市售產(chǎn)品。
本發(fā)明提供了一種簡便高效的固定化酶生產(chǎn)低聚半乳糖的方法，即利用表面展示e-半乳糖 苷酶的重組釀酒酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖。該方法應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將e -半乳糖苷酶直 接錨定在釀酒酵母細(xì)胞表面，以乳糖為底物催化合成低聚半乳糖，節(jié)省了固定化酶所需要的載體 材料，解決了固定化酶反應(yīng)過程中酶的不斷流失、酶穩(wěn)定性差、使用效率低等問題，該方法還利 用釀酒酵母代謝葡萄糖的特點(diǎn)，解決了e-半乳糖苷酶反應(yīng)過程中葡萄糖副產(chǎn)物的抑制問題。重 組酵母細(xì)胞在發(fā)酵過程中利用葡萄糖進(jìn)行生長繁殖，有利于低聚半乳糖的生產(chǎn)；同時(shí)重組酵母細(xì) 胞能被反應(yīng)過程中新生成的半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶，即在其細(xì)胞表面展示e-半乳糖苷酶，可及時(shí)補(bǔ)充 反應(yīng)過程中酶的損耗。此外， 一個(gè)批次反應(yīng)結(jié)束后離心收集的重組酵母細(xì)胞仍然保持較高的e-半乳糖苷酶活性，可作為酶源直接用于下一個(gè)批次的低聚半乳糖合成，簡化了生產(chǎn)流程。本發(fā)明 所述的低聚半乳糖生產(chǎn)方法具有產(chǎn)量高、成本低、步驟簡單合理、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊 的工業(yè)化前景。


圖l是循環(huán)利用重組釀酒酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)的低聚半乳糖的含量分析其中縱坐標(biāo)表示低聚半乳糖含量；橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間；圖上方"1-7"數(shù)字表示循環(huán)數(shù)， 每個(gè)循環(huán)的曲線圖均表示低聚半乳糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，e-半乳糖苷酶基因來源于菌株擴(kuò)張青霉CGMCC
No. 2352，但不限于此。
實(shí)施例i: e -半乳糖苷酶的釀酒酵母表面展示載體構(gòu)建及其在酵母表面表達(dá) 根據(jù)擴(kuò)張青霉CGMCC No. 2352P-半乳糖苷酶基因序列(GenBank Accession No, EU543998) 設(shè)計(jì)引物F和R,分別引入能插入質(zhì)粒pYDl (購自Invitrogen公司，該質(zhì)粒載體具有a -凝集素受 體基因部分序列，可將重組蛋白錨定在酵母細(xì)胞表面)的fcoWI、 Abtl限制內(nèi)切酶位點(diǎn)(下劃 線所示)，序列如下
F: 5' -CATGAATTCGGAGTTGCTTCAAAAATATGTGACTTGGG-3' R: 5' -GCATGCGGCCGCGTACGCCCCCTTTCGAGAC-3，
4以提取的擴(kuò)張青霉總RNA為模板，采用上述R引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以cDNA 第一鏈為模板，用F禾B R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，加限制性內(nèi)切酶fbo^ I、 I 于37'C保溫5小時(shí)，凝膠回收目的片段，采用同樣酶切方法處理表達(dá)載體pYDl。將制備好的基 因片段與酶切處理后的酵母表面展示質(zhì)粒pYDl混合，于16。C連接24小時(shí)。采用CaCl2轉(zhuǎn)化法 轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌DH5 a ，轉(zhuǎn)化菌液涂布氨芐青霉素LB平板，37'C過夜培養(yǎng)，選取陽性質(zhì)粒， 采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY-100,轉(zhuǎn)化液涂布YNB-CAA-葡萄糖篩選平板，3(TC培養(yǎng)2 3 天，挑選生長良好的酵母菌落，采用菌落PCR法驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。
將上述重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子及pYDl空質(zhì)粒對照轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于YNB-CAA-葡萄糖培 養(yǎng)液中，3(TC培養(yǎng)至OD,達(dá)到2. 0 5. 0， 3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞，棄去上清，用YNB-CAA-半乳糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)0D6。。為0.5 L0， 2(TC半乳糖誘導(dǎo)40小時(shí)。測定細(xì)胞表面的P-半乳糖苷酶活性，將完全符合要求的重組酵母作為菌種保存。
上述LB平板成分蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC17g/L，瓊脂粉15 g/L, pH 7. 0~ 7.5， 121。C滅菌20分鐘；
上述YNB-CAA-葡萄糖平板成分無氨基酸酵母氮源(YNB) 6. 7 g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L， pH自然，115。C滅菌30分鐘。
上述細(xì)胞表面e-半乳糖苷酶活性的測定方法取lmL培養(yǎng)液，離心收集菌體，加2mmol/L 的鄰硝基苯-e -D-半乳糖苷溶液45CmL， 50'C反應(yīng)10分鐘，加lmLO. 5mol/L的％20)3溶液終止 反應(yīng)，12, 000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，上清液測0D4。。。酶的活力單位規(guī)定以1分鐘水解鄰硝基苯-P -D-半乳糖苷釋放l陶ol鄰硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。
實(shí)施例2:循環(huán)利用細(xì)胞表面重組酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖
將實(shí)施例1保存的重組酵母接種于YNB-CAA-葡萄糖培養(yǎng)液，3(TC培養(yǎng)至0D,達(dá)到2. 0 5. 0， 3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞，棄去上清，用YNB-CAA-半乳糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)00600為 0.5 1.0， 2CTC半乳糖誘導(dǎo)40小時(shí)，然后3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集表面展示P-半乳糖苷 酶的重組釀酒酵母EBY-100，重懸于YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液，調(diào)OD,為8. 0 10. 0， 25。C培養(yǎng)4 6天，3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，所得上清液進(jìn)行高效液相色譜分析低聚半乳糖含量，所得酵母細(xì) 胞重懸于新的YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液，按照上述方法重復(fù)進(jìn)行下一循環(huán)培養(yǎng)。
其中所述第一個(gè)循環(huán)的上清液的高效液相色譜分析結(jié)果表明糖組分含量為低聚半乳糖 43.6%，半乳糖1.41%，葡萄糖0、乳糖54.99%。
按上述方法連續(xù)進(jìn)行7個(gè)循環(huán)，高效液相色譜分析結(jié)果表明，每個(gè)循環(huán)所得的低聚半乳糖含 量均高于40% (圖1)。
上述高效液相色譜分析所用設(shè)備及條件如下
島津(SHIMADZU)高效液相色譜儀；島津RID-10A示差檢測器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱 (300咖X7.8mm);流動(dòng)相為超純水，流速為0.4mL/min ，柱溫70°C ;結(jié)果分析軟件為 Class-VP6.0。含低聚半乳糖的上清液用超純水稀釋成重量體積百分比為1%的溶液，煮沸離心后， 上清液用0. 22 u m的濾膜過濾，進(jìn)樣分析。SEQUENCE LISTING
<110> 山東大學(xué)
<120> —種循環(huán)利用重組釀酒酵母生產(chǎn)低聚半乳糖的方法 〈腿2
<170〉 Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211> 38
<212〉 DNA 〈213>人工合成
〈400〉 1
catgaattcg gagttgcttc犯aaatatgt gacttggg 38
<210> 2
〈211〉 31 <212>腿 〈213>人工合成
〈400〉 2
gcatgcggcc gcgtacgccc cctttcg卿c 31
權(quán)利要求
1、一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞，其特征在于，含有插入了β-半乳糖苷酶基因序列的質(zhì)粒載體。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母細(xì)胞，其特征在于，所述的半乳糖苷酶基因選自擴(kuò)張 青霉CGMCC No. 2352中的0 -半乳糖苷酶基因。
3、 一種如權(quán)利要求l所述的表面展示e-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在 于，步驟如下1) 將e-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示質(zhì)粒pYDl，得重組質(zhì)粒pYDl;2) 將步驟l)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pYDl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，然后從陽性重組大腸桿菌中提取 含有0 -半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pYDl，再用該重組質(zhì)粒pYDl轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY-100，獲得 含有重組質(zhì)粒pYDl的重組釀酒酵母；3) 將步驟2)獲得的含有重組質(zhì)粒pYDl的重組釀酒酵母接種于YNB-CAA-葡萄糖培養(yǎng)液，30 'C培養(yǎng)，當(dāng)菌液0D,為2.0 5.0時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，收集重組釀酒酵母細(xì)胞；4) 將步驟3)收集的重組釀酒酵母細(xì)胞用誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)液重懸菌細(xì)胞，并調(diào)0Ds。。為0.5 1. 0， 2(TC 25'C誘導(dǎo)38 42小時(shí)，3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，收集已表面展示0 -半乳糖苷酶 的重組酵母細(xì)胞；所述YNB-CAA-葡萄糖培養(yǎng)液成分無氨基酸酵母氮源6. 7 g/L，酪蛋白水解物5g/L,葡萄糖 20 g/L， pH自然，115。C滅菌30分鐘j所述誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)液成分無氨基酸酵母氮源6.7 g/L，酪蛋白水解物5 g/L， pH自然， 115'C滅菌30分鐘；使用之前加入過濾除菌的半乳糖溶液至終濃度20 g/L。
4、 如權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟i)中的e-半乳糖苷酶基因來源于擴(kuò)張青霉CGMCC No. 2352。
5、 如權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的誘導(dǎo)產(chǎn)酶 溫度為20。C。
6、 如權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中的誘導(dǎo)產(chǎn)酶 時(shí)間為40小時(shí)。
7、 一種利用如權(quán)利要求i所述的表面展示e -半乳糖苷酶的重組釀酒酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚半乳糖的應(yīng)用，其特征在于，先將表面展示P-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母懸于YNB-CM-乳糖培養(yǎng)液，調(diào) 0D恥。為8.0 10.0， 25。C培養(yǎng)4 6天；然后3000轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘，對離心后所得的上清液通過 高效液相色譜分析其低聚半乳糖含量；將離心后所得的重組酵母細(xì)胞，重懸于新的YNB-CAA-乳糖 培養(yǎng)液，按上述方法循環(huán)發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖，并分析每個(gè)循環(huán)所得上清液的低聚半乳糖含 量；所述YNB-CAA-乳糖培養(yǎng)液成分為無氨基酸酵母氮源6. 7 g/L，酪蛋白水解物5g/L，乳糖IOO g/L， pH自然，115 。C滅菌30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用重組釀酒酵母生產(chǎn)低聚半乳糖的方法，尤其涉及一種表面展示β-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母及其制備方法以及循環(huán)利用該重組釀酒酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖的方法。首先構(gòu)建β-半乳糖苷酶酵母表面展示載體，將β-半乳糖苷酶展示在釀酒酵母細(xì)胞表面，然后循環(huán)利用該重組酵母發(fā)酵乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖。本發(fā)明所述的表面展示β-半乳糖苷酶的重組釀酒酵母可被循環(huán)利用生產(chǎn)低聚半乳糖，且產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，工藝簡單，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101475914SQ200810157830
公開日2009年7月8日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者盧麗麗, 李玉梅, 敏 肖 申請人:山東大學(xué)