專利名稱：產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測的方 法，具體是一種產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法。
背景技術(shù)：
棒曲霉素(Patulin)是青霉屬、曲霉屬、裸囊菌屬等多種真菌的次生代謝產(chǎn) 物，在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中都有發(fā)現(xiàn)。棒曲霉素在動物實驗中能 引起動物的致畸性、致突變性和致癌性，所以引起了世界各國衛(wèi)生、毒理醫(yī)學(xué)、 食品生產(chǎn)和安全等方面專家學(xué)者的極大關(guān)注，世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定了食品中 棒曲霉素的最高限量為50pg/L ，目前歐盟已有更嚴(yán)格要求的趨勢。果制品中的 棒曲霉素主要來源于青霉病，此病危害成熟或接近成熟的果實，病斑黃白色，近 圓形，果肉腐爛呈錐狀濕腐，當(dāng)條件適宜時，使全果腐爛，產(chǎn)生強(qiáng)烈的霉味， 能產(chǎn)生棒曲霉素的有毒真菌有展青霉、擴(kuò)張青霉、棒狀青霉、土曲霉等。果汁 中的棒曲霉素含量與原料品質(zhì)、貯藏時間有關(guān)，通過調(diào)査實驗表明，采后立即加 工生產(chǎn)的濃縮蘋果汁中棒曲霉素的含量最低，而隨著貯藏時間的延長，產(chǎn)品中棒 曲霉素含量呈增加趨勢。 一般而言，食品含有棒曲霉素并不會引起急性中毒反應(yīng)， 但動物測試發(fā)現(xiàn)，服食過量的棒曲霉素，會引致腸胃充血、擴(kuò)張、出血和潰瘍。 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食物添加劑專家委員會在1990年及 1995年先后就棒曲霉素進(jìn)行風(fēng)險評估，報告指出棒曲霉素有基因毒性，動物測試 亦顯示棒曲霉素會抑制免疫反應(yīng)、毒害神經(jīng)，以及影響胎兒發(fā)育。
現(xiàn)有棒曲霉素及相應(yīng)霉菌的檢測方法主要有微生物法、紙色譜法和高效液相色 譜法，但果汁行業(yè)都以高效液相色譜法作為檢測棒曲霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法，這種方法 準(zhǔn)確卻成本偏高。目前尚未見用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法，以 克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設(shè)計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個 內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)， 內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨 后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟 動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動
的DNA合成模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)DNA做模板，啟 動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán) DM; (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有耙 DNA重復(fù)序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應(yīng)可使耙DNA累積到109拷貝，可通過 熒光染料來觀察擴(kuò)增結(jié)果。
本發(fā)明涉及的產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法，其中包括的試 劑如下(1) - (4):
(1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液 其中包括10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1.0—1.4 mmol/L dNTP、 4一8mmol/L 硫酸鎂(MgS04)、 0. 8 — 1.6iJmol/L上游引內(nèi)物(FIP)、 0. 8 — 1. 6pmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.2—0. 3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和1 —1.5mol/L甜菜堿； 上游內(nèi)引物
5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG誦ATGGTGATTGCTTTCCCTGA -3 、
下游內(nèi)引物
5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3、 上游外引物5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3 、 下游外引物5國TGAAGGAGCTCTGCACGATA陽3 、
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反應(yīng)緩沖液中含有200 mmol pH8.8的三羥基甲基氨 基甲烷一鹽酸(Tris—HC1)、 100 mmol/L氯化鉀(KC1)、 100 mmol/L硫酸銨((NH4) 2S04)、 20 mmol/L硫酸鎂(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) 麗G酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /pL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)反應(yīng)液每管共有22IJL，其最佳組成為2. 5|jL
10XThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|JL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、 4.0|jl 1(Hmo1/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4.0|jL 1(Hjmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0. 5pL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0,5pL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 2pL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5M甜菜堿和2. 1|JL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
使用上述方法檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌，依次包括下列步驟(1) - (3):
(1) 待檢樣品或真菌DNA的提取-
提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26。/ OD28。在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度 在10-100 ng/iJL范圍內(nèi)。
(2) 進(jìn)行產(chǎn)棒曲霉素真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22ijL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2pL待檢模板DNA，和O. 5pL的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在反應(yīng)管中加入llJL Bst DNA聚合酶，并于水浴鍋中恒溫水浴上60—65'C 擴(kuò)增反應(yīng)45—90 min;
C. 將水浴調(diào)到80—85'C終止反應(yīng)，3—5min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入1IJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或為產(chǎn)棒曲霉素真菌。
本發(fā)明是根據(jù)產(chǎn)棒曲霉素真菌IDH基因的六個序列設(shè)計了兩個特異性內(nèi)引物和 兩個特異性外引物，該保守基因序列為產(chǎn)棒曲霉素真菌所共有，以保證檢測不同 來源的產(chǎn)棒曲霉素真菌的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)，該 技術(shù)特異性強(qiáng)，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需 普通的水浴鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即 可，簡單而快速，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。
具體實施例方式
下列實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。 實施例l
按下列配方制作產(chǎn)棒曲霉素真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液 (1) LAMP反應(yīng)液
含有2. 5pL lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10jJmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 4. 0|jL 10jjmol/L下游內(nèi)引 物(BIP)、 0.5|jL 1(Hmo1/L上游外引物(F3)、 0. 5|jL 1(Hmo1/L下游外引物(B3)、 2yL 100鵬ol/L MgS04、 5(jL 5M甜菜堿和2. lpL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物
5- atatgcattggtgacgctgcgg-atggtgattgctttccctga -3 、
下游內(nèi)引物
5- gactgggagaacagtttcgcga-acttttccaagtacggggtg -3、 上游外引物5- tcggacgaattgacgtgatt -3 、 下游外引物5-tgaaggagctctgcacgata-3
其中混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP-2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序進(jìn)行檢測
(1) 樣品DNA的提取
檢測菌種擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)，菌種來源中國普通微生物菌種 保藏管理中心，編號CGMCC3. 5761。
使用北京天根生物工程公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D26。/ 0D28。能夠達(dá)到1.8,濃度達(dá)到20 ng/pLo
(2) 進(jìn)行擴(kuò)展青霉的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)
A. 在裝有22nL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2IJL待檢模板DNA，和O. 5yL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入l |JL Bst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65 T擴(kuò)增反應(yīng)l 小時；
C. 將水浴調(diào)到80 t:終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入lyL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為擴(kuò)展青霉。 實施例2
按下列配方制作產(chǎn)棒曲霉素真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液-(1) LAMP反應(yīng)液
含有2. 5pL lOXThermopol反應(yīng)緩沖液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP、4. 0 pL 10[Jmol/L 上游內(nèi)引物(FIP)、 4.0 |JL 10 nmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.5 10nmol/L上游 外引物(F3)、 0.5 pL 10 ymol/L下游外引物(B3)、 2yL 100 mmol/L MgS04、 5 |JL 5mol/L甜菜堿和2. 1jjL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP-2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /pL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序進(jìn)行檢測
(1) 樣品DNA的提取
檢測菌種灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)，菌種來源中國普通微生物 菌種保藏管理中心，編號CGMCC3. 0833。
使用北京天根生物工程公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D260/ OD280能夠達(dá)到1. 8，濃度達(dá)到20 ng/fjL。
(2) 進(jìn)行灰黃青霉的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)-
A. 在裝有22pL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2iJL待檢模板DNA，和O. 5ijL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應(yīng)管中加入ljjLBst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65-C擴(kuò)增反應(yīng)l h;
C. 將水浴調(diào)到8(TC終止反應(yīng)，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應(yīng)管中加入llJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏 色變?yōu)榫G色，則待檢樣品也為灰黃青霉。
核苷酸序列表
〈110〉山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
〈120>產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法
<160> 4
〈210〉 1
<211〉 42
〈212>腿
〈213〉人工序列
<221〉 prim—bind
<222> (1)…(42)
〈400〉 1
ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA 42
〈210> 2 〈211〉 42 <212〉 DNA 〈213>人工序列 〈221〉 prim一bind <222> (1)…(42) 〈400〉 2
GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCMGTACGGGGTG 42
〈210> 3 〈211〉 20 〈212〉醒 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(20) 〈400〉 3
TCGGACGAATTGACGTGATT 20
<210> 4 〈211〉 20 <212> DNA 〈213〉人工序列 <221> prim—bind 〈222〉 (l)... (20) 〈400> 4
TGAAGGAGCTCTGCACGATA 20
權(quán)利要求
1. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌的試劑，其特征是該試劑包括(1)-(4)(1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸鎂、0.8—1.6μmol/L上游引內(nèi)物、0.8—1.6μmol/L下游內(nèi)引物、0.2—0.3μmol/L上游外引物、0.2—0.3μmol/L下游外引物和1—1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X—100；其中上游內(nèi)引物:5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA-3；下游內(nèi)引物:5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3；上游外引物:5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3；下游外引物:5-TGAAGGAGCTCTGCACGATA-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌的試劑，其特征是上述的dNTP 內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為鍵dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 利用權(quán)利要求1中所述的試劑進(jìn)行等溫快速檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌的 方法，其特征是依次包括(1) - (3)下列步驟(1)待檢樣品或真菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26Q/ 0D哪在1. 6-2. 0范圍 內(nèi)，濃度在10-100 ng/uL范圍內(nèi)；(2) 進(jìn)行產(chǎn)棒曲霉素真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有22 u L LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2 u L待檢樣品模板DNA， 和0. 5 u L的麗G酶，于恒溫95 。C放置3 — 5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 再在反應(yīng)管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒溫65 "C擴(kuò)增反 應(yīng)45 — 90 min;C. 將溫度調(diào)到80 "C終止反應(yīng)，3 — 5 min后取出待檢；(3) 顯色檢測在每個反應(yīng)管中加入1PL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液 顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有或為產(chǎn)棒曲霉素真菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)棒曲霉素真菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測方法。其中的試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；其中的反應(yīng)液含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA-3、下游內(nèi)引物5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3、上游外引物5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3、下游外引物5-TGAAGGAGCTCTGCACGATA-3和甜菜堿；檢測產(chǎn)棒曲霉素真菌的方法包括真菌DNA的提取、產(chǎn)棒曲霉素真菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增、顯色檢測。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/04GK101381773SQ20081015790
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日
發(fā)明者劉云國, 靜 唐, 姜英輝, 健 張, 房保海, 李正義, 祝素珍, 楠 賀, 賈俊濤, 趙麗青, 雷質(zhì)文, 馬維興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心