一種快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病原物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種快速檢測(cè)桑尼短體線 蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 短體線蟲，也稱為根腐線蟲，是一種重要的迀移性內(nèi)寄生線蟲。這類線蟲能在植物 跟內(nèi)移動(dòng)、穿刺和取食會(huì)，同時(shí)會(huì)引起根組織形成壞死斑、空腔進(jìn)而使根組織壞死。由于根 部壞死，所以被根腐線蟲危害的植物會(huì)表現(xiàn)出缺水和營(yíng)養(yǎng)不足的癥狀。短體線蟲是造成農(nóng) 作物損失最多的三種植物線蟲之一，其中桑尼短體線蟲（Pratylenchusthoreni)是最重要 的短體線蟲之一。它們不單分布廣泛，而且可以侵染多種重要的農(nóng)作物。但是，不同種類作 物或不同的品種對(duì)桑尼短體線蟲的抗病性和耐病性有差異，因此，輪作和種植抗病品種是 防治這種短體線蟲的有效方法。如此一來(lái)，只有正確的鑒定這種線蟲，才能在實(shí)際工作中選 擇合適的作物或品種種植來(lái)防治它們。
[0003] 但是，目前主要還是通過(guò)形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，而形態(tài)學(xué)鑒定桑尼短體線蟲和 桑尼短體線蟲是一個(gè)復(fù)雜和耗費(fèi)大量時(shí)間的工作，而且對(duì)于大部分人來(lái)說(shuō)這是一個(gè)非常困 難的工作，往往也會(huì)造成準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。此外，形態(tài)學(xué)的鑒定方法只能準(zhǔn)確的鑒定短體線 蟲的成熟雌蟲，但是在田間調(diào)查的時(shí)候，常常會(huì)分離到大量不同齡期的幼蟲。因此，要通過(guò) 形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確的鑒定桑尼短體線蟲幼蟲，目前在技術(shù)上還是不可能的。
[0004] 目前，國(guó)外有報(bào)道通過(guò)PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR方法檢測(cè)和定量桑尼短體線蟲的方法， 但是，該方法需要使用昂貴的PCR儀，而且，還需要進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求 較高，不利于在基層檢測(cè)單位中推廣和使用。因此，在實(shí)際的應(yīng)用中，使用環(huán)等溫?cái)U(kuò)增的方 法檢測(cè)桑尼短體線蟲會(huì)大大減輕的基層人員的工作量和檢測(cè)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有桑尼短體線蟲檢測(cè)技術(shù)的不足，為解決快速 檢測(cè)桑尼短體線蟲提供一組引物組和檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供上述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 一種快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物，包括外側(cè)引物ptF31/ptB31和內(nèi) 側(cè)引物ptFIPl/ptBIPl;引物ptF31的序列（如SEQIDNO. 1所示），引物ptB31的序列（如 SEQIDN0. 2所示），引物ptFIPl的序列如（SEQIDN0. 3)所示，引物ptBIPl的序列（如 SEQIDN0. 4 所示）。
[0010] 上述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物在檢測(cè)桑尼短體線蟲方面的應(yīng)用或者在制備檢測(cè)桑尼短體 線蟲的試劑或試劑盒方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] -種快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法，該方法是以樣品DNA為模板，利 用上述引物對(duì)ptF31/ptB31和引物對(duì)ptFIPl/ptBIPl進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。
[0012] 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的判定方法為：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，如果出 現(xiàn)特異性階梯狀條帶，則判定樣品中含有桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽(yáng)性；或者 向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR green I或鈣黃綠素，如果擴(kuò)增產(chǎn)物由橘紅色變?yōu)闇\綠色，則判定 樣品中含有桑尼短體線蟲DNA，即為桑尼短體線蟲陽(yáng)性。
[0013] 優(yōu)選地，所述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法的反應(yīng)體系為：1μLDNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1. 6μM，引物ptF31 和ptB31 各 0· 2μM，dNTP0· 35μM，2. 5μL10XBST2. 0DNA聚合酶緩沖 液，0· 8Μ甜菜堿，L5μLMgS04 (100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶，余量ddH20補(bǔ)足，共 25μL。
[0014] 優(yōu)選地，所述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法的反應(yīng)條件為：65°C反應(yīng)60min。
[0015] -種快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物對(duì)ptF31/ptB31 和引物對(duì)PtFIPl/ptBIPl。
[0016] 所述試劑盒所使用的檢測(cè)方法即為上述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法。
[0017] 上述環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法或上述試劑盒在檢測(cè)桑尼短體線蟲方面的應(yīng)用也都在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)大量的研究和探索，最終得到的引物對(duì)ptF31/ptB31和引物對(duì) ptFIPl/ptBIPl配合使用，建立的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法，不僅能夠非常特異的檢測(cè)桑尼短體線 蟲，而且檢測(cè)靈敏性達(dá)到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度，檢測(cè)效果非常好。而且環(huán)等溫?cái)U(kuò) 增方法不需要依賴于任何昂貴的儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人員的要求也很低，是一種安全、簡(jiǎn)單、 快速、成本低的檢測(cè)方法。
[0019] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明提供了一組快速檢測(cè)桑尼短體線蟲的環(huán)等溫?cái)U(kuò)增引物。所述引物特異性 強(qiáng)、靈敏度好、且具有很好的重復(fù)性。本發(fā)明利用所述引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)桑 尼短體線蟲，檢測(cè)靈敏性達(dá)到了單條，甚至是0. 1條的靈敏度。
[0021] 本發(fā)明僅需使用簡(jiǎn)單的恒溫儀器就能完成全部的檢測(cè)，不需要依賴于任何昂貴的 儀器，并且檢測(cè)時(shí)間僅為60min，比普通的熒光定量PCR方法節(jié)省了 2~3h，簡(jiǎn)單快速、對(duì)環(huán) 境要求低、無(wú)需大型儀器，非常適合在基層檢測(cè)單位中使用。
[0022] 另外，本方法檢測(cè)結(jié)果的判定方法多樣，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。本方法還可以 實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的可視化，準(zhǔn)確可靠，無(wú)需電泳檢測(cè)，不使用溴化乙錠，保障了工作人員 的安全，為桑尼短體線蟲的檢測(cè)，尤其是檢驗(yàn)檢疫工作提供了技術(shù)支持，具有非常好的推廣 應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為不同引物的LAMP電泳圖對(duì)擴(kuò)增效率的影響。
[0024] 圖2為引物組1的LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果。圖中3~8為不同種群的桑尼短體線 蟲，1，2,9~24為非靶標(biāo)線蟲（具體種類見表1)。
[0025] 圖3為引物組2的LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果。圖中3~8為不同種群的桑尼短體線 蟲，1，2,9~24為非靶標(biāo)線蟲（具體種類見表1)。
[0026] 圖4為不同濃度的線蟲DNA的可視化檢測(cè)結(jié)果，0. 1、1、10和100表示使用的DNA 來(lái)自于〇. 1、1、1〇和100條桑尼短體線蟲，CK表示使用滅菌水作為模板。
[0027] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
[0028] 1、根據(jù)NCBI中多種短體線蟲的28s核糖體DNA序列（基因登錄號(hào)為：EU130854、 JX046968、KM200579、JQ303333、JX261951、JX261960、JX261954、EU130875、EU130866、 EU130873、EU130845、JN244270、EU130889、HQ662581、JN091970、AM231916、JX261948、 肝765435、〇0498832、幾047005、幾003994、《]214114、幾144360)，設(shè)計(jì)引物如下 ：
[0029] (1)引物組 1:
[0030] 外側(cè)引物ptF31 (如SEQIDNO. 1 所示）
[0031] 5' -TGAAACACGGACCAAGGAGT-3'
[0032]外側(cè)引物ptB31 (如SEQIDNO. 2 所示）
[0033] 5, -CACCATCTTTCGGGTCTCAC-3，
[0034] 內(nèi)側(cè)引物ptFIPl(如SEQIDNO.3 所示）：
[0035] 5' -GCGAGGGATGCCTTCACTTTCAtttaaaTTATCGTGTGCGCAAGTCAT-3'
[0036] 內(nèi)側(cè)引物ptBIPl(如SEQIDNO. 4 所示）：
[0037] 5, -GGTGTCCGAGTGCAGCATGGttttttGCGTACGCTCTTCCTCCA-3'
[0038] (2)引物組 2
[0039] 外側(cè)引物ptF32 (