專利名稱：小麥多屬雜交后代種質(zhì)系的細(xì)胞學(xué)研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明小麥多屬雜交后代種質(zhì)系的細(xì)胞學(xué)研究屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥族內(nèi)的近緣物種大約有300種，類型繁多、變異多樣，具有許多優(yōu)良的特性， 如對多種病害的良好抗性，廣泛的適應(yīng)性和獨(dú)特的品質(zhì)等(Oliver, Crop Science, 2005， 45(4) :1353-1360)。這些近緣物種是小麥遺傳改良中非常寶貴的基因資源，通過遠(yuǎn)緣雜交 和染色體工程等途徑，將它們的優(yōu)良基因通過不同途徑轉(zhuǎn)移進(jìn)普通小麥，已經(jīng)成為拓寬小 麥遺傳基礎(chǔ)，豐富小麥育種基因庫的安全、有效的重要途徑(Zaharieva， Crop Sci，2006， 46 :512-527)。 為了綜合利用不同屬的優(yōu)良性狀和基因，從而豐富小麥的種質(zhì)資源，拓寬現(xiàn)有 栽培小麥的遺傳基礎(chǔ)，人們在利用小麥近緣植物進(jìn)行小麥遺傳改良的過程中，逐漸由過 去利用單一的近緣種屬，向綜合利用多種近緣種屬方向發(fā)展(Li， Euphytica， 2006， 150 : 117-122)。通過多屬雜交，不僅可以創(chuàng)造綜合多屬優(yōu)良特性的新種質(zhì)，而且也可在同一遺傳 背景中評價(jià)不同屬染色(組)間的親緣關(guān)系。 1926年，Tschermak報(bào)道了通過天然雜交產(chǎn)生的小麥_山羊草_黑麥三屬雜種。 1968年，Knobloch進(jìn)行了小麥族幾組三屬雜交研究，較早地得到了一些人工創(chuàng)制的三屬雜 種(張紅軍，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31(3) :337-344)， 1970年H.B.齊津利用他創(chuàng)制的多 年生小麥和多年生黑麥草雜交創(chuàng)制了小麥_偃麥草_黑麥三屬雜種，并對其進(jìn)行了染色體 加倍，還對雜種F1及其后代進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。八十年代以來，隨 著雜交技術(shù)的改進(jìn)和組織培養(yǎng)、幼胚拯救等技術(shù)的成功應(yīng)用，不僅使得遠(yuǎn)緣雜交的范圍不 斷擴(kuò)大，也大大促進(jìn)了多屬雜種的研究。目前國內(nèi)外已經(jīng)創(chuàng)制了幾十種三屬雜種和兩種四 屬雜種(Lima Brito，Genome， 1998,41 (6) :763-768)，并在多屬雜交的后代篩選出具有不同 屬優(yōu)良特性的種質(zhì)系。

發(fā)明內(nèi)容
本研究的目的是小麥野生近緣物種具有小麥遺傳改良可以利用的眾多優(yōu)良性 狀，采用遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程的方法一直是外源基因?qū)胄←湹闹饕緩剑←溩宥鄬?雜種是指把三個或三個以上屬的染色體組染色體或染色體片段結(jié)合在一起產(chǎn)生具有多屬 特點(diǎn)的雜種，創(chuàng)建多屬雜種，不僅可以創(chuàng)造綜合多屬優(yōu)良特性的新種質(zhì)，而且也可在同一遺 傳背景中評價(jià)不同屬染色體(組)間的親緣關(guān)系。
小麥多屬雜交后代種質(zhì)系的細(xì)胞學(xué)研究 實(shí)驗(yàn)材料所用實(shí)驗(yàn)材料山農(nóng)05094、山農(nóng)05081、山農(nóng)05083、山農(nóng)05086、山農(nóng) 05099，以上材料均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室種植保存。
多屬雜交后代種質(zhì)系的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn) 利用改良卡寶品紅壓片法，對五個種質(zhì)系的根尖細(xì)胞(RTC)染色體數(shù)目、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I (PMC MI)染色體構(gòu)型以及其與煙農(nóng)15雜種的PMC MI的染色體構(gòu)
型進(jìn)行了觀察分析。 (1)根尖細(xì)胞染色體數(shù)目觀察根尖細(xì)胞(RTC)染色體數(shù)目觀察結(jié)果表明，山農(nóng)05094的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為 2n = 56(表1，圖4a)，山農(nóng)05081、05083、05086和05099等4個多屬雜交后代種質(zhì)系的根 尖細(xì)胞染色體數(shù)目均為2n = 42，與普通小麥親本相同，其染色體構(gòu)成需進(jìn)一步確定(表5， 圖la-圖3a、圖5a)。
(2)染色體構(gòu)型分析 對山農(nóng)05081、05083、05086和05099的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I (PMC MI)染 色體構(gòu)型以及它們分別與普通小麥煙農(nóng)15(ynl5)的雜種巳PMC MI的染色體構(gòu)型觀察結(jié)果 (表1，圖1-圖3，圖5)顯示，它們具有不同的染色體構(gòu)型特點(diǎn)。 山農(nóng)05081和山農(nóng)05083的細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體均聯(lián)會形成21個二價(jià) 體(圖3b，圖4b)，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體形成20個二價(jià)體和2個單價(jià)體，平均染色體構(gòu)型為 2n = 42 = 0. 07271+20. 9636II和2n = 42 = 0. 11111+20. 944411。它們與普通小麥煙農(nóng) 15(ynl5)的雜種巳的絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體均聯(lián)會形成21個二價(jià)體或20個二價(jià)體和2個 單價(jià)體，兩種聯(lián)會方式的細(xì)胞數(shù)目大體相當(dāng)(圖lc，2c)，僅個別細(xì)胞內(nèi)形成三價(jià)體，平均染 色體構(gòu)型為2n = 42 = 1. 53701+20. 1481II+0. 0556III和2n = 42 = 0. 53971+20. 730211。 推測山農(nóng)05081和山農(nóng)05083為異代換系或易位系，代換或易位的外源染色體(或染色體 片段)在小麥背景下可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且外源染色體可能在一定程度上能與小麥染色 體發(fā)生聯(lián)會。 山農(nóng)05086的PMC MI的平均染色體構(gòu)型分別為2n = 42 = 0. 10531+20. 947411， 絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體聯(lián)會形成21個二價(jià)體(圖3b)，僅在少數(shù)細(xì)胞內(nèi)觀察到2個單價(jià) 體。其與煙農(nóng)15(yn15)的雜種F工的大部分細(xì)胞內(nèi)染色體聯(lián)會形成2n = 2011+21構(gòu)型(圖 3c，)，少數(shù)形成2n = 42 = 2111的構(gòu)型或三價(jià)體或四價(jià)體，平均染色體構(gòu)型為2n = 42 = 1. 50621+20. 1481II+0. 0494III+0. 0123IV ;推測山農(nóng)05086為外源染色體的異代換系或易 位系；同時(shí)，代換或易位的外源染色體(或片段)與小麥某一染色體有較高的同源配對的能 力，可能同時(shí)還伴有染色體的結(jié)構(gòu)變異，外源染色體(或染色體片段)的導(dǎo)入，在一定程度 上抑制或降低了小麥染色體減數(shù)分裂過程中同源染色體的聯(lián)會。 山農(nóng)05099的細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體均聯(lián)會形成21個二價(jià)體(圖 5b)，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體形成20個二價(jià)體和2個單價(jià)體，平均染色體構(gòu)型為2n = 42 = 0.15381+20.923111。它們與普通小麥煙農(nóng)15 (ynl5)的雜種F工的絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)染色體 聯(lián)會形成20個二價(jià)體和2個單價(jià)體(圖5c)，僅個別細(xì)胞內(nèi)形成21個二價(jià)體，平均染色體 構(gòu)型為2!1 = 42 = 1.03641+20. 481811。推測山農(nóng)05099為異代換系或易位系，代換或易位 的外源染色體(或染色體片段)在小麥背景下可能處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且外源染色體可能在 一定程度上能與小麥染色體發(fā)生聯(lián)會。 對山農(nóng)05094的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I (PMC MI)染色體構(gòu)型觀察結(jié)果(表1) 表明，它的PMC Ml平均染色體構(gòu)型為2n = 56 = 5. 04551+25. 4091II+1. 0455111，絕大部分 花粉母細(xì)胞內(nèi)會觀察到6個左右的單價(jià)體(圖4b)，個別細(xì)胞內(nèi)還可觀察到多價(jià)體；在山農(nóng) 05094與普通小麥煙農(nóng)15(ynl5)雜種巳的多數(shù)花粉母細(xì)胞內(nèi)，觀察到多數(shù)細(xì)胞內(nèi)含有多個單價(jià)體或者多價(jià)體(圖4c)，平均染色體構(gòu)型為2n = 56 = 5. 07461+21. 3284II+0. 3433III +0.0597IV。 綜上所述，在5個多屬雜交后代種質(zhì)系中，山農(nóng)05094根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n =56，大多細(xì)胞內(nèi)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體構(gòu)型為2n = 56 = 2511+61，染色體組 成比較復(fù)雜；山農(nóng)05081、05083、05086和05099等根尖細(xì)胞染色體數(shù)目均為2n = 42， PMC MI染色體基本構(gòu)型為2n = 42 = 2111，且在細(xì)胞學(xué)上具有一定的穩(wěn)定性，但它們分別與普 通小麥的雜種&的染色體構(gòu)型具有不同的特點(diǎn)，推測它們均為外源染色體的異代換系或易 位系。但由于外源染色體代換了小麥的染色體，可能導(dǎo)致了有些種質(zhì)系與小麥的雜種^減 數(shù)分裂過程的異常，使其染色體構(gòu)型發(fā)生了變化，也可能這些種質(zhì)系同時(shí)伴有染色體的結(jié) 構(gòu)變異，其遺傳組成有待于進(jìn)一步鑒定。
表l.多屬雜交后代種質(zhì)系的染色體構(gòu)型
材料染色體IIIIIIIV紊亂系
Materias中/f 數(shù)II rodII ring數(shù)
NO. ofRCC
chromos
omc
山 農(nóng)420.07273.272717.690000.0035
050819
山 農(nóng)420.11113.277817.666000.0053
05083
山 農(nóng)420.10531.921119.026000.0050
050863
山 農(nóng)565.04555.519.卯90.045500.2004
050941
山 農(nóng)420.15382.025618.897000.0074
050994
山 農(nóng)280.10532.947411000.0075
05078
山農(nóng)1.53703.722216.4250.055600.0790
05081/ynl9
山農(nóng)0.53974.063516.666000.0260
05083/ynl7
山農(nóng)1.50624.913615.2340.04940.1230.0778
05086/ynl6
山農(nóng)5.07466.1940150130.34330.05970.2568
05094/ynl43
山農(nóng)1.03643.463617.018000.0506
05099/ynl2
5 注RCC，相對紊亂系數(shù)二 (單價(jià)體染色體數(shù)目+多價(jià)體染色體數(shù)目)/二價(jià)體染色 體數(shù)目；I ，單價(jià)體；11， 二價(jià)體；111 ，三價(jià)體;IV，四價(jià)體。
以下結(jié)合附圖做進(jìn)一步說明


圖1山農(nóng)05081的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)a :根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，2n = 42 ;b :山農(nóng)05081的
6PMC Ml，2n = 42 = 2111 ;c :山農(nóng)05081/ynl5F丄PMC Ml，2n = 42 = 2011+21 圖2山農(nóng)05083的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)a :根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，2n = 42 ;b :山農(nóng)05083的
PMC Ml，2n = 42 = 2111 ;c :山農(nóng)05083/ynl5F，C Ml，2n = 42 = 2111 圖3山農(nóng)05086的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)a :根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，2n = 42 ;b :山農(nóng)05086的
PMC Ml，2n = 42 = 2111 ;c :山農(nóng)05086/ynl5F，C Ml，2n = 42 = 2111 圖4山農(nóng)05094的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)a :根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，2n = 56 ;b :山農(nóng)05094的
PMC Ml，2n = 56 = 2511+61 ;c :山農(nóng)05094/ynl5FiPMC Ml，2n = 49 = 20II+6I+1III 圖5山農(nóng)05099的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)a :根尖細(xì)胞染色體數(shù)目，2n = 42 ;b :山農(nóng)05099的
PMC Ml，2n = 42 = 2111 ;c :山農(nóng)05099/ynl5F丄PMC Ml，2n = 42 = 2011+2具體實(shí)施例方式
(1)根尖細(xì)胞(RTC)染色體觀察 種子在室溫下浸泡至露白，l-4t:冰箱中冰凍24h，然后在25t:條件下培養(yǎng)，根長 1. 5-2. Ocm時(shí)取根尖，或在溫暖的天氣傍晚將田間生長的材料澆水，第二天上午9-10時(shí)挖 取根尖。根尖先在冰水中處理24h，再用卡諾氏液于l-4t:條件下固定24h以上，1N鹽酸于 6(TC下解離10min，改良卡寶品紅法染色壓片、鏡檢計(jì)數(shù)并照像。
(2)花粉母細(xì)胞(PMC)減數(shù)分裂染色體構(gòu)型分析 鏡檢取處于適宜時(shí)期的花藥，卡諾氏液(酒精乙酸=3 : 1)固定，1N鹽酸于 6(TC下解離10min，改良卡寶品紅染色，鏡檢統(tǒng)計(jì)染色體構(gòu)型并照像。
權(quán)利要求
本發(fā)明小麥多屬雜交后代種質(zhì)系的細(xì)胞學(xué)研究，其特征在于多屬雜交后代種質(zhì)系山農(nóng)05081、山農(nóng)05083、山農(nóng)05086、山農(nóng)05094和山農(nóng)05099，農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，均對條銹病免疫，高抗白粉?。患?xì)胞學(xué)分析結(jié)果表明，山農(nóng)05081、山農(nóng)05083、山農(nóng)05086和山農(nóng)05099染色體數(shù)目均為2n＝42，細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定，推測其為代換系或易位系；山農(nóng)05094染色體數(shù)目為2n＝56，部分細(xì)胞含有較多單價(jià)體，說明其細(xì)胞學(xué)上不太穩(wěn)定。
全文摘要
為了綜合利用不同屬的優(yōu)良性狀和基因，從而豐富小麥的種質(zhì)資源，拓寬現(xiàn)有栽培小麥的遺傳基礎(chǔ)，在利用小麥近緣植物進(jìn)行小麥遺傳改良的過程中，逐漸由過去利用單一的近緣種屬，向綜合利用多種近緣種屬方向發(fā)展，通過多屬雜交，不僅可以創(chuàng)造綜合多屬優(yōu)良特性的新種質(zhì)，而且也可在同一遺傳背景中評價(jià)不同屬染色(組)間的親緣關(guān)系，本研究正是基于此進(jìn)行的。
文檔編號C12Q1/68GK101760511SQ20081016029
公開日2010年6月30日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者李祥 申請人:李祥