專利名稱：：小麥-簇毛麥新種質(zhì)山農(nóng)05078的ssr標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明在對(duì)Am3和硬簇麥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和性狀特點(diǎn)鑒定的基礎(chǔ)上，利用二者進(jìn)行雜交，在其后代中選育出了高抗白粉病的種質(zhì)系山農(nóng)030713，利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)另一個(gè)從Am3和硬簇麥雜交后代獲得的籽粒蛋白質(zhì)含量高且高抗白粉病、銹病的種質(zhì)系山農(nóng)05078進(jìn)行了標(biāo)記，屬于作物遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：簇毛麥(Dasypyr咖villos咖，VV，2n=14)屬禾本科小麥族小麥亞族簇毛麥屬，分蘗力比較強(qiáng)，多花，籽粒蛋白質(zhì)含量高，耐旱，抗寒性好，高抗銹病、全蝕病和白粉病(孔凡晶，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位畢業(yè)論文，2001，22-23)。硬簇麥(AABBVV，2n=42)是利用硬粒小麥和簇毛麥雜交人工合成的雙二倍體，保留了簇毛麥的優(yōu)良性狀和特點(diǎn)，是進(jìn)行小麥遺傳改良的優(yōu)良中間材料(劉大鈞等，作物學(xué)報(bào)，1986，12(3):155-162;傅杰等，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001,29(6):1-8)。人工合成小麥Am3(AABBDD，2n=42)是利用波斯小麥與粗山羊草雜交后染色體加倍而形成的雙二倍體，但它所具有的A、B、D染色體組可能與經(jīng)過多年分化的普通小麥所含的A、B、D染色體組不同，Am3對(duì)銹病、白粉高抗或免疫(陳尚安等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990,23(4):17-21)。是進(jìn)行小麥遺傳研究的優(yōu)良材料。利用Am3與硬簇麥進(jìn)行雜交，有可能綜合二者優(yōu)良特性，創(chuàng)制出兼具二者優(yōu)良性狀的新種質(zhì)材料。
發(fā)明內(nèi)容本研究的目的是本實(shí)驗(yàn)室在一些三屬雜種自交的較早世代(F4、F3代)就篩選出部分細(xì)胞學(xué)穩(wěn)定的株系，其中部分材料對(duì)白粉病、條銹病等病害具有良好的抗性(李興鋒等，遺傳，2004，26(4):481-485)。但是尚缺乏對(duì)這些材料進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定、分析和評(píng)價(jià)。因此本研究對(duì)種質(zhì)系030-1經(jīng)多年大田和溫室鑒定表明對(duì)白粉病免疫，對(duì)其白粉病抗性基因性質(zhì)和來源進(jìn)行分析，并建立白粉病抗性基因的分子標(biāo)記，將會(huì)為其在小麥遺傳改良中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。小麥_簇毛麥新種質(zhì)山農(nóng)05078的SSR標(biāo)記實(shí)驗(yàn)材料所用實(shí)驗(yàn)材料包括硬簇麥、Am3、山農(nóng)030713、山農(nóng)05078、中國春、簇毛麥、954072和馬奎斯，其中硬簇麥和Am3均由中國農(nóng)科院作物所提供，山農(nóng)030713(AABBDD，2n=42)和山農(nóng)05078是由本實(shí)驗(yàn)室選育的新種質(zhì)系。954072是由山東農(nóng)科院選育的小麥新品系，馬奎斯是加拿大春小麥品種，以上材料均由本實(shí)驗(yàn)室種植保存。山農(nóng)05078的SSR標(biāo)記為進(jìn)一步明確山農(nóng)05078的染色體組成，隨機(jī)選取位于1A-7A、1B-7B染色體上的特異SSR引物41對(duì)，每個(gè)染色體選取3個(gè)引物(一般每個(gè)染色體的短臂上隨機(jī)選取1個(gè)引物，長臂上隨機(jī)選取2對(duì)引物，只有7A是長短臂各取一個(gè)引物)，對(duì)山農(nóng)05078、山農(nóng)030713、硬簇麥、Am3、中國春及簇毛麥進(jìn)行SSR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分引物都可以在山農(nóng)05078、山農(nóng)030713、硬簇麥、Am3及中國春中擴(kuò)增出預(yù)期的特異帶，而簇毛麥不能擴(kuò)增出這些帶(圖1)。雖然部分引物擴(kuò)增出的目標(biāo)片段長度有所變化，可能是由于個(gè)別片段發(fā)生了缺失或其他變化，但此結(jié)果說明山農(nóng)05078含有A、B染色體基組的全部染色體。為了明確山農(nóng)05078是否含有D基組基因，選用包括Xgwm、麗C、Xgdm、BARC系列的共180對(duì)D基組SSR引物和51對(duì)SWES系列的EST-SSR引物，對(duì)其進(jìn)行了SSR分析。所用SSR引物為已被定位到小麥D基組染色體上的特異引物，所用SWES系列EST-SSR引物是陳海梅等根據(jù)普通小麥EST數(shù)據(jù)庫中序列信息開發(fā)出的引物，并利用小麥缺體_四體法定位到小麥D基組染色體上。結(jié)果表明共有196對(duì)引物能在山農(nóng)05078和含有D基組的材料間擴(kuò)增出差異帶，約占85%，其中54對(duì)引物能穩(wěn)定地在所有含有和不含有D基組的材料間擴(kuò)增出差異帶，部分電泳結(jié)果如下(圖2，圖3)?？梢钥闯?，大多數(shù)引物能在山農(nóng)05078和含有D基組的材料間擴(kuò)增出差異帶。其余35對(duì)引物中有4對(duì)SSR引物在山農(nóng)05078和含有D基組的材料間擴(kuò)增出了相同的帶紋(圖4)，有31對(duì)引物在山農(nóng)05078或部分親本中擴(kuò)增不出帶紋。綜合SSR和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，推測(cè)山農(nóng)05078中雖然不含有粗山羊草D基組的全部染色體，但可能有粗山羊草D基組遺傳物質(zhì)的滲入。為了進(jìn)一步確定山農(nóng)05078中是否含有簇毛麥的遺傳物質(zhì)，選用M2、Xgwm301和phv29等三個(gè)簇毛麥特異引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果只有引物phv29能在含有簇毛麥遺傳物質(zhì)的材料中擴(kuò)增出一條大約430bp的特異帶(圖5)，而此帶在不含有簇毛麥遺傳物質(zhì)的材料中均不存在，這說明該特異帶是簇毛麥遺傳物質(zhì)的擴(kuò)增產(chǎn)物，而山農(nóng)05078也能擴(kuò)增出此特異帶，推測(cè)山農(nóng)05078中含有簇毛麥的遺傳物質(zhì)。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。圖1.引物Xgwm5-3A、Xgdml45_4A、BARC003-6AS和Xgwm400_7B的擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2000Marker，1:中國春；2:山農(nóng)030713，3.Am3，4:山農(nóng)05078,5:硬簇麥，6:簇毛麥，箭頭示差異帶)。圖2.引物SWES76-4D、SWES80-6DL、SWES121-2D和SWES231-6A/6DL的擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2000Marker，1:簇毛麥，2:硬簇麥，3:山農(nóng)05078，4:Am3，5:山農(nóng)030713，6:中國春，箭頭示差異帶)。圖3.引物BARC021-6DL、BARC095-2D、BARC123-6DS和BARC172-7DL的擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2000Marker，1:簇毛麥，2:硬簇麥，3:山農(nóng)05078，4:Am3，5:山農(nóng)030713，6:中國春，箭頭示特異帶)。圖4.引物BARC062-6DL、xgwm428-7D、wmc27-2DS和SWES76-4D的擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2000Marker，1:中國春，2:山農(nóng)030713,3:Am3，4:山農(nóng)05078，箭頭示特異帶)。圖5.引物phv29的擴(kuò)增結(jié)果(M:DL2000Marker，1:中國春，2:Am3，3:山農(nóng)030713，4:山農(nóng)05078，5:硬簇麥，6:簇毛麥)。具體實(shí)施例方式農(nóng)藝性狀鑒定按照國家區(qū)域試驗(yàn)小麥品種田間性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)株高、株型、莖稈、穗型、穗長、每穗小穗數(shù)、穗粒數(shù)、不結(jié)實(shí)小穗數(shù)、芒的有無等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。白粉病的鑒定利用小麥白粉菌優(yōu)勢(shì)菌株15號(hào)分別在田間和溫室進(jìn)行苗期和成株期人工接種鑒定。以感病品種銘賢169為對(duì)照并種成感染行，在感染行內(nèi)接種白粉病15號(hào)菌種，當(dāng)其大量繁殖后采集菌種抖灑在待鑒定材料葉片上，同時(shí)借助感染行進(jìn)行誘發(fā)感染。反應(yīng)型按照盛寶欽提出的0-4級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載。其標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)免疫；植株無病斑，無侵染癥狀；1級(jí)高抗；病斑小，倒四葉菌絲小而少，菌絲層稀薄可見綠色葉面，偶見較大病斑，但仍透綠，產(chǎn)孢量極少；2級(jí)中抗；倒三葉、倒二葉感病，葉片病斑直徑小于lmm，下部葉片菌絲少而??；3級(jí)中感；旗葉感病，葉片病斑多，但病斑不連片，直徑大于lmm，下部葉片菌絲大而厚；4級(jí)高感；穗部或旗葉感病，葉片病斑直徑一般大于lmm，菌絲層厚，產(chǎn)孢量多，病斑連片?；蚪MDNA提取和純化(1)取5g葉片置液氮中速凍后研成粉末，裝入50ml離心管。(2)加入20ml已預(yù)熱到65。C的提取液(lOOmMTris.HC1pH8.5，100mMNaCl，50mMEDTApH8.0，2%SDS)。每管中加入100ii110mg/ml蛋白酶K，混勻。(3)置65t:水浴中l(wèi)-2h，不時(shí)輕輕倒轉(zhuǎn)離心管以混勻。(4)從水浴中取出離心管，加入20ml酚/氯仿(1:1)抽提，輕輕混勻20min。(5)3000轉(zhuǎn)/分離心20min，取上清，加入等體積氯仿，輕輕混勻。(6)3000轉(zhuǎn)/分離心20min，取上清，加入0.6體積異丙醇，輕輕混勻，用玻璃鉤將DNA纏出，70X酒精沖洗，稍氣干，溶于500ml1XTE。(7)加入10ii110mg/mlRNA酶，輕輕混勻，置37°Clh。(8)加入5ml酚/氯仿抽提，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清。(9)加入等體積氯仿抽提，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清。(10)加入1/10體積3M醋酸鈉，混勻，然后加入2倍體積冷乙醇，混勻。(11)用玻璃鉤鉤出DNA，70X酒精沖洗，置于1.5ml離心管，氣干，溶于1XTE，測(cè)DNA濃度經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量。SSR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SSR擴(kuò)增程序擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRaPCRThermalCyclerTP600上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?5。C預(yù)變性5min，95。C變性lmin，50°C、55°C、60°C(因引物不同而異)復(fù)性lmin，72。C延伸lmin，共34個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后，置于4。C保存待檢測(cè)。簇毛麥特異引物M2、Xgwm301和phv29的合成、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別參照遲世華(麥類作物學(xué)報(bào)，2006，26(4):1-5)、劉成(遺傳，2006，28(12):1573-1579)和曹愛忠(西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(6):1078-1084)等方法。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓110V電泳，銀染顯色，然后用TanonGis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。硝酸銀染色步驟(1)電泳完畢，取下膠塊在固定液中固定3min。(2)用去離子水快速?zèng)_洗2-3次，每次30-40S。(3)于銀染液中染色5-7min。(4)用水快速?zèng)_洗(10S)，不超過20S。(5)放入顯影液中顯影至第一條帶出現(xiàn)(一般以泳道出現(xiàn)為準(zhǔn))。(6)最后放入去離子水中停影。數(shù)據(jù)分析根據(jù)最大似然法計(jì)算重組率(莫惠棟，1984)，并按Kosambi(1944)系數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為CentiMorgan(cM)。權(quán)利要求小麥-簇毛麥新種質(zhì)山農(nóng)05078的SSR標(biāo)記，其特征在于山農(nóng)05078來自硬簇麥和Am3的雜交后代，高抗白粉病，SSR分子標(biāo)記結(jié)果證明其染色體組成為AABB，且含有粗山羊草D基組和簇毛麥V基組的遺傳物質(zhì)，山農(nóng)05078可以在小麥的遺傳改良過程中作為優(yōu)良的抗源和優(yōu)質(zhì)源加以利用。全文摘要本發(fā)明利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)從Am3和硬簇麥雜交后代獲得的籽粒蛋白質(zhì)含量高且高抗白粉病、銹病的種質(zhì)系山農(nóng)05078進(jìn)行了SSR標(biāo)記，并對(duì)其白粉病抗性基因性質(zhì)和來源進(jìn)行分析，建立白粉病抗性基因的分子標(biāo)記，為其在小麥遺傳改良中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760509SQ20081016029公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者李祥申請(qǐng)人:李祥