專利名稱：：癌癥早診和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)(HCCR和RhoGDI2)基因檢測試劑盒和相關(guān)檢測方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因預(yù)測試劑盒及相關(guān)基因的檢測方法，具體涉及一種與肝癌、子宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌及其他人類癌癥的早期診斷和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測相關(guān)的試劑盒，以及相關(guān)基因的原位雜交檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
：根據(jù)我國權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥新增人數(shù)160萬，患者人數(shù)600萬，到2020年這一數(shù)字將翻一番。男性癌癥發(fā)生部位以肺、肝、胃依次排列、女性是乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌依次排列，以上幾種癌癥已占總癌癥病例一半以上。癌癥從發(fā)病到治療后生存期間，以肝癌為例，突破五年生存期都有一定的難度，特別是轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病患，治療效果不理想，這主要與癌癥的發(fā)病機制有關(guān)。癌癥是一種多基因失衡的分子病理生理演變過程，由致癌基因與抑癌基因失得能，及癌癥轉(zhuǎn)移基因與癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因的失得能失控而致。要做到早期預(yù)防，早期診斷及早期治療，就要從以上癌癥多基因失衡時做出預(yù)防、診斷、治療等干預(yù)方法。目前醫(yī)學(xué)影像學(xué)的2cm以下的腫塊屬于早期癌癥這一界限科學(xué)性不夠嚴(yán)謹(jǐn)，從細(xì)胞學(xué)的角度，lcm腫塊約有1億個腫瘤細(xì)胞，2cm的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個腫瘤細(xì)胞。事實上，從單克隆癌細(xì)胞到2cm以下的腫塊可能是相當(dāng)長的病理演變過程，可能是一年或兩年，從癌變前期到癌細(xì)胞形成和生成2cm腫塊要經(jīng)過相當(dāng)長的病理演變過程，在這個病理演變過程中，難以證實早先形成癌細(xì)胞克隆腫塊是唯一的癌塊，可能在最早形成克隆腫塊的同時，癌細(xì)胞通過不同的途徑遷移到其它部位克隆生長。這在臨床上已得到證實，一旦切除腫塊后，其他地方復(fù)發(fā)或其它多發(fā)的腫塊先后形成或轉(zhuǎn)移。因此，依照傳統(tǒng)的影像醫(yī)學(xué)和其它生化指數(shù)的診斷認(rèn)定的"早期診斷"這一概念值得認(rèn)真討論，在臨床上以2cm以下的腫塊大小來界分早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正理由。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益完善，從基因水平做到早期診斷和侵襲轉(zhuǎn)移早期檢測，以及治療后及早檢測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)狀況已經(jīng)成為可能。只有做到這一點，才能扭轉(zhuǎn)人們認(rèn)為"抗癌大戰(zhàn)失敗"的觀點，才能徹底根治癌癥惡疾。現(xiàn)有的癌癥診斷試劑盒多采用蛋白標(biāo)記物的抗原抗體檢測方法(癌胚抗原、糖類抗原等)，臨床上檢測一種特異基因的方法未見報道，用核酸原位雜交方法檢測目的基因工作，都應(yīng)用在科學(xué)研究中。使用核酸原位雜交方法能在癌變前期和癌細(xì)胞形成之前，就能做出診斷，并預(yù)測癌癥的演變過程，能在真正的早期做出診斷，比醫(yī)學(xué)影像學(xué)方法、病理學(xué)診斷、蛋白標(biāo)記物檢測都要早期。人宮頸癌癌基因(HumanCervicalCancerOncogene,HCCR)是近年用差異顯示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種新的癌基因，在宮頸癌、肝癌、白血病、淋巴瘤和胃腸道癌等腫瘤組織中有HCCR的過量表達(dá)。雖然HCCR最初是在人宮頸癌組織中被發(fā)現(xiàn)，但研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及各類腺癌中HCCR基因高度表達(dá)，因此，把HCCR作為以上癌癥的腫瘤診斷標(biāo)志物，對于實現(xiàn)癌癥的早診，具有重要意義。韓國DR丄W.KIM用HCCR的相關(guān)蛋白來檢測早期肝癌，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，比AFP要敏感。從理論來說基因檢測方法要比蛋白更敏感，更早期。RhoGDI2已被公認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，我們在研究中證實，RhoGDI2基因與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測了750例各種類型癌癥病患血液標(biāo)本和750例正常對照人群，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，癌癥患者體內(nèi)平均表達(dá)量10%左右，正常人群表達(dá)量平均50%;病例組中有600多例該基因表達(dá)量為0。同時檢測家族性好發(fā)癌癥的直系親屬，該基因的表達(dá)量比正常人都低。針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明根據(jù)HCCR基因和RhoGDI2基因的特點，提供一種癌癥早診和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測的檢測試劑盒以及相關(guān)基因的檢測方法，同時用二種基因探針來檢測癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)狀況，從基因水平上在癌變前期或癌細(xì)胞增殖前檢測有關(guān)基因的異常表達(dá)，在未形成腫瘤之前，更早做到有關(guān)基因表達(dá)異常的信息采集。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明提供一種癌癥早診和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)基因預(yù)測試劑盒，至少包括雜交探針，標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針由HCCR基因和RhoGDI2基因組成。上述HCCR基因具有序列表中SEQIDNO:1所示的序列，RhoGDI2基因具有序列表中SEQIDNO:2所示的序列。其中HCCR基因長度為626bp,位于染色體12q位點上，RhoGDI2基因長度為605bp，位于染色體12p.3位點上。所述試劑盒中的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、酶及納米材料。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記核酸探針為地高辛標(biāo)記的核酸探針。本發(fā)明還一種癌癥早診和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)基因的核酸原位雜交檢測方法，包括以下步驟(1)在探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將待測試樣中的RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測所述雜交復(fù)合體。所述形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16—24小時。所述檢測底物是人體血液標(biāo)本的白細(xì)胞和癌變組織細(xì)胞。所述血液標(biāo)本和組織細(xì)胞來自癌癥病人和可疑患者。所述的癌癥為宮頸癌、白血病、淋巴瘤、胃腸道癌、肝癌及腺癌。其中優(yōu)選各類腺癌，更優(yōu)選宮頸癌、白血病、淋巴瘤和胃腸道肝癌，最優(yōu)選肝癌、宮頸癌。所述檢測雜交復(fù)合體的方法選自光鏡檢測、電鏡檢測、結(jié)合電子信息技術(shù)的基因表達(dá)芯片檢測。核酸原位雜交的具體操作步驟是標(biāo)本的處理，預(yù)雜交，雜交，免疫組化染色，鏡下進(jìn)行定量分析，結(jié)果報告(具體見試劑盒說明書)。雜交的具體步驟包括l).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中2).儀器自動棄去液體，自動加消化液3).儀器自動棄去液體，自動后固定4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C)5).儀器自動棄去液體，自動清洗6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C)7).儀器自動棄去液體，自動清洗8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色10).取出封片鏡檢HCCR基因是致癌基因，如果形成的雜交復(fù)合體高于正常對照，就表示為癌癥早期或癌癥易感性；RhoGDI2基因是癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因，正常對照為健康人的RhoGDI2基因表達(dá)量的40-50%，該指標(biāo)低于20%是表達(dá)降低，零與不表達(dá)，降低或不表達(dá)表明癌癥已轉(zhuǎn)移。正常的預(yù)防醫(yī)學(xué)檢測表明，受檢人一旦患上癌癥就有轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。本發(fā)明采用原位雜交技術(shù)，它的原理和具體操作如下本發(fā)明試劑原理是將特異性的cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動子的載體，通過選用不同的RNA聚合酶，控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，從而得到與mRNA同序列的同義RNA探針和與mRNA互補的反義RNA探針，用反義RNA探針和被檢測人體白細(xì)胞的待測mRNA進(jìn)行原位雜交，作為反義RNA探針的陰性對照，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，半定量判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明所使用的RNA原位核酸雜交(RNAnucleicacidhybridizationinsitu)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是:在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下,用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則,與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交),所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA，rRNA和tRNA分子。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供的試劑盒和基因檢測方法，可觀察早期癌變及癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程，同時可檢測癌癥治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況，與臨床其它檢測癌癥相關(guān)蛋白和影像醫(yī)學(xué)檢査相比，可在基因水平上檢測基因異常表達(dá)。在影像醫(yī)學(xué)中未發(fā)現(xiàn)腫塊或占位之前，也即未形成腫瘤之前，能及早做到以上有關(guān)基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床腫瘤病人一個真正的早診，做到轉(zhuǎn)移侵襲和治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)測，這樣有可能從源頭上徹底根治癌癥這一惡性疾病。與其他癌癥檢測試劑盒相比，二組基因同時檢測可動態(tài)觀察癌癥變化全過程，可更有效地檢測癌變動態(tài)。本發(fā)明的癌癥早期和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)診斷試劑盒的臨床價值和創(chuàng)新點在于能在基因水平，癌變前期或癌變細(xì)胞中檢測與宮頸癌、白血病、淋巴瘤、胃腸道癌、肝癌及各類腺癌密切相關(guān)的HCCR基因和RhoGDI2基因的表達(dá)量。早于蛋白標(biāo)記物產(chǎn)生以前，當(dāng)然更早于腫瘤形成以前，就能檢測HCCR基因和RhoGDI2基因變化信息，做到真正意義上的早期診斷。同時，可檢測癌癥的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)情況。圖1是本發(fā)明實施例中肝癌癥病人HCCR過量表達(dá)圖片。圖2是本發(fā)明實施例中肝癌癥病人RhoGDI2表達(dá)降低圖片。圖3是本發(fā)明實施例中正常人RhoGDI2表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人HCCR表達(dá)圖。具體實施例方式本發(fā)明的方法可從以下具體實施方式了解得更清楚。然而應(yīng)理解以下具體實施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但只是闡述性的，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，依據(jù)這些實施例的詳細(xì)描述所作出的各種變化和修改都在本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)。實施例1癌癥早診和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)基因預(yù)測試劑盒的組成包含以HCCR基因和RhoGDI2基因為檢測的目的基因設(shè)計的雜交探針、標(biāo)記物及以下試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>使用濃度試劑的配制說明1).將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I;2).將20x緩沖液II用三蒸水按l:10稀釋成2x緩沖液II;按1:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成O.lx緩沖液II;3).將10x緩沖液ni用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液m;4).10x緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液IV(取1#，2#，3#各lOmL,加水至100mL既可)實施例2應(yīng)用核酸原位雜交檢測方法對癌癥早期HCCR基因和RhoGDI2基因表達(dá)的實施過程1).取待測標(biāo)本兩張；2).在玻璃缸里加入消化液(消化液lOO^iL加lx緩沖液I99.9ml，即為使用濃度)50mL。37。C水浴預(yù)熱10min。放進(jìn)16張玻片，37。C處理12min，再用lx緩沖液I洗5min;3).用0.2%的保護(hù)液(保護(hù)液lmL加lx緩沖液I,99ml即為使用濃度)洗10min，三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進(jìn)行)，取出玻片，讓其自然干燥；4).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液25^L/片(加在有細(xì)胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42-C恒溫水浴箱中3hr以上；5).取出玻片,棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi),用70%,90%,95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；6).將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25pL/片，另一張加反義雜交液25pL/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴箱中16-24hr;7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液II洗兩次,每次15min在42'C恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次，每次15min在42i:恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液II洗兩次,每次15min;8).用lx緩沖液III洗30s，取出玻片,自然干燥；9).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5%封閉液(lml封閉液加5mLlx緩沖液ni)100pL/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；10).取出玻片，用lx緩沖液III洗30s,自然干燥；11).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1.8mLlx緩沖液III)100iiL/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min。時間不能過長，否則會產(chǎn)生假陽性；(此步驟不需加蓋玻片)12).取出玻片，用lx緩沖液III洗3次,每次15min;13).用lx緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3(iL，顯色劑B157.5^L加到30mLlx緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16hr到18hr以上；14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標(biāo)記，成為RNA核酸探針，將探針與人體白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位,根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表實施例3肝癌病人10名，宮頸癌病人6名、白血病10名、淋巴瘤6名和胃腸道癌10名及各類腺癌8名；正常對照組10名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥患者HCCR基因有過度表達(dá)，細(xì)胞染色；期中臨床診斷轉(zhuǎn)移的病人30例RhoGDI2基因表達(dá)降低，10例病人RhoGDI2基因不表達(dá)，細(xì)胞無染色。其中圖1是肝癌癥病人HCCR過量表達(dá)圖片，圖2是肝癌癥病人RhoGDI2表達(dá)降低圖片，圖3是正常人RhoGDI2表達(dá)圖片，圖4是正常人HCCR表達(dá)圖。序列表SEQUENCELISTING〈110〉芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司〈120〉癌癥早診和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)(HCCR和RhoGDI2)基因檢測試劑盒和相關(guān)檢測方法與應(yīng)用〈130〉/<150〉200710171744.X〈151〉2007-11-30〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉336<212>腿〈213〉Homosapiens〈400〉1atgtccgtggagacactgtggaaagtctggaccgagctcttggatgttcttggacttgac60gtctccaacctgtcccagtatttcagcccagcctcggtgtccagcagcccggcccgcgcg120ctcctgctggtcggcgtcgtcctcctggcctactggttcttgtccctgaccctgggcttc180actttcagcgtcctgcacgtggtgttcggccgcttcttctggatcgtgcggtcgtcctgt240tttccatgtcctgcgtgtacatcctgcacaagtacgagggcgagccggagaacgcggtgc300tgccgctgtgcttcgtggtggccgtctacttcatga336<210〉2〈211〉606〈212〉DNA<213〉Homosapiens<400>2atgactgaaaaa_gccccagagccacatgtgg3ggaggatgatgatgatgagctggacagc60aagctcaattataagcctccaccacagaagtccctgaaagagctgcaggaaatggacaaa120gatgatgagagtctaattaagtacaagaaaacgctgctgggagatggtcctgtggtgaca180gatccgaaagcccccaatgtcgttgtcacccggctcaccctggtttgtgagagtgccccg240ggaccaatcaccatggaccttactggagatctggaagccctcaaaaaggaaaccattgtg300ttaaaggaaggttctgaatatagagtcaaaattcacttcaaagtgaacagggatattgtg360tcaggcctgaaatacgttcagcacacctacaggactggggtgaaagtggataaagcaaca420tttatggttggcagctatggscctcggcctgaggagtatgagttcctcactccagttgag480gaggctcccaagggcatgctggcgcgaggcacgtaccacaacaagtccttcttcaccgac540gatgacaagcaagaccacctcagctgggagtggaacctgtcgattaagaaggagtggaca600gaatga60權(quán)利要求1.一種癌癥早診、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的原位雜交綜合檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于所述的雜交探針由HCCR基因和RhoGDI2基因組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于HCCR基因具有序列表中SEQIDNO:l所示的序列，RhoGDI2基因具有序列表中SEQIDNO:2所示的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、1251或34中的一種。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。7.—種HCCR和RhoGDI2基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求1所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16—24小時，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒在制備檢測癌癥早期疾病藥物中的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的癌癥為宮頸癌、白血病、淋巴瘤、胃腸道癌、肝癌及各類腺癌，優(yōu)選宮頸癌、白血病、淋巴瘤和胃腸道肝癌，最優(yōu)選肝癌、宮頸癌。全文摘要本發(fā)明涉及一種癌癥早診、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)測的原位雜交綜合檢測試劑盒，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中所述的雜交探針序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。本發(fā)明還提供了一種HCCR(Humancervicalcanceroncogenebindingprotein)和RhoGDI2基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a.將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b.檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明另外還提供了試劑盒在制備檢測癌癥早期疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。文檔編號C12Q1/68GK101429552SQ20081017960公開日2009年5月13日申請日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者張云福,裘建英申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司