一種苯二胺與檸檬酸制備細(xì)胞顯影用碳量子點(diǎn)標(biāo)記探針的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是生物材料的制備和應(yīng)用，具體是由苯二胺與檸檬酸為原料制備納米熒光顯影材料，與普通碳量子點(diǎn)多藍(lán)色熒光發(fā)光相比，具有多色熒光顯影的效果，是材料學(xué)技術(shù)與熒光技術(shù)的交叉應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，可以通過(guò)將熒光物質(zhì)與待測(cè)物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)以共價(jià)鍵連接，通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀等儀器的檢測(cè)，利用熒光物質(zhì)，在受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，由可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光的原理，來(lái)達(dá)到定位、示蹤、含量測(cè)定等目的。這一技術(shù)稱為熒光標(biāo)記技術(shù)，是分子影像技術(shù)中重要的一部分，當(dāng)下已經(jīng)在生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子
生物學(xué)、病理學(xué)和診斷學(xué)等方面得到了廣泛的運(yùn)用，極大的推動(dòng)諸如癌癥早期診斷，藥物傳輸，病原體檢測(cè)，誘導(dǎo)干細(xì)胞療法，影像引導(dǎo)手術(shù)等新興醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展。而熒光標(biāo)記技術(shù)中所使用的熒光物質(zhì)除了傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)之外，還出現(xiàn)了新興的納米熒光物質(zhì)。納米熒光物質(zhì)相較于傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)，有著其獨(dú)特的特性:1、熒光納米粒子具有更高的亮度和光穩(wěn)定性，也能更加容易地實(shí)現(xiàn)水分散性和生物相容性。2、對(duì)納米粒子的尺度的精確控制及對(duì)粒子功能化手段的日臻完善，使得熒光發(fā)射光譜在一定程度上實(shí)現(xiàn)可控，同時(shí)激發(fā)光譜寬且連續(xù)。3、由于本身納米尺度的大小，使得其具有較大表面積，其可通過(guò)與其它分子上的化學(xué)基團(tuán)形成共價(jià)鍵，連接諸如:蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)改性或功能化。納米熒光材料包括諸多種類，其中碳量子點(diǎn)材料在近年得到了廣泛關(guān)注。碳量子點(diǎn)材料由于其具有尺寸相關(guān)熒光性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于納米熒光材料領(lǐng)域。碳量子點(diǎn)的傳統(tǒng)合成方法可分為自上而下合成法和自下而上合成法兩大類，自上而下法包括激光銷蝕法[1]、電化學(xué)法[2]、弧光放電法[3]等；自下而上合成法包括化學(xué)氧化法[4]、模板法[5]、微波法[6]和熱分解法[7]等。以多種材料為碳源，如以碳水化合物為原材料，先用濃硫酸脫水，再加入硝酸進(jìn)行氧化，最終得到具有微弱熒光的CQD[8];在高溫下碳化處理西瓜皮，得到粒徑為2 ml的具有熒光效應(yīng)的CQD [9]。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種由苯二胺及檸檬酸制備兩溶性碳量子點(diǎn)材料的方法。
[0004]一種苯二胺與檸檬酸制備細(xì)胞顯影用碳量子點(diǎn)標(biāo)記探針的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)苯二胺-檸檬酸碳量子點(diǎn)的制備:將不同結(jié)構(gòu)的苯二胺包括鄰苯二胺、間苯二胺與對(duì)苯二胺分別加入無(wú)水乙醇中，在室溫條件下避光攪拌，直至得到均勻的乙醇-苯二胺溶液，濃度為0.05-0.1Mol/L ;將檸檬酸加入超純水中攪拌，直至獲得確定濃度透明均勻溶液，濃度為0.05-0.1Mol/L ;將苯二胺乙醇溶液及檸檬酸溶液以3:1-1:1比例混合，待溶液充分混合均勻后，分別得到無(wú)色、灰藍(lán)色、淺粉色的溶液，將混合溶液置于四氟乙烯水熱反應(yīng)釜中，溶液體積不超過(guò)反應(yīng)釜的2/3，在密閉條件下高溫靜置反應(yīng)；待反應(yīng)充分后，緩慢冷卻至室溫，最終得到色、色和色的苯二胺-檸檬酸碳量子點(diǎn)乙醇溶液；
(2)苯二胺-朽1檬酸碳量子點(diǎn)的提純:
將不同苯二胺-檸檬酸碳量子點(diǎn)乙醇溶液置于旋蒸儀器中，于45攝氏度旋蒸至乙醇及水完全揮發(fā)，得到苯二胺碳量子點(diǎn)粗產(chǎn)，向得到的油狀粘稠液體中加入層析溶液，攪拌至油狀液體均勻分散在層析溶劑之中，將所得溶液緩慢轉(zhuǎn)移入硅膠層析柱之中，靜置等待碳量子點(diǎn)粗產(chǎn)由于溶液極性逐漸分層，通過(guò)紫外光檢測(cè)確定碳點(diǎn)層所在位置，并采集碳點(diǎn)溶液，待采集完畢后，將所得到的碳量子點(diǎn)有機(jī)溶液通過(guò)旋蒸的方法去除其中的層析有機(jī)溶劑，隨后向所得固體產(chǎn)物中加入1%的乙醇溶液，將所得溶液冷凍干燥，得到最后所需的苯二胺_朽1檬酸碳量子點(diǎn)。
[0005]所述的細(xì)胞及組織顯影用碳量子點(diǎn)，此種碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)可以克服熒光效率低，易淬滅等問(wèn)題，同時(shí)具有良好的生物相容性。
[0006]本發(fā)明提供的碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率采用常規(guī)的參比法測(cè)定，即在相同激發(fā)條件下，分別測(cè)定待測(cè)焚光試樣、已知量子產(chǎn)率的參比焚光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的積分焚光強(qiáng)度和同一激發(fā)波長(zhǎng)的入射光的吸收度，再將這些值代人下列公式:
Q= Qr x i/iR x Ar/A x η2/ n 2R
其中，Q和％分別為待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率和IR分別為待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光積分強(qiáng)度4和AR為待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)在該激發(fā)波長(zhǎng)的入射光的吸收度；η和nR分別為待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的折射率。以硫酸奎寧作為參比物，經(jīng)測(cè)定本發(fā)明提供的碳量子點(diǎn)熒光為15°/『30%，可滿足于生物監(jiān)測(cè)用途。
[0007]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是顯影用碳量子點(diǎn)的合成制備問(wèn)題，提供一種具有光學(xué)穩(wěn)定性好、生物相容性高、熒光效率高的制備方法，同時(shí)工藝簡(jiǎn)單、材料轉(zhuǎn)化率高、易重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明有如下優(yōu)勢(shì):
1、檸檬酸的存在使得反應(yīng)能夠更加完全，提高了能源的利用效率，得到了更高的碳量子點(diǎn)產(chǎn)率。
[0009]2、該方法使用苯二胺及檸檬酸為碳量子點(diǎn)原料，原料簡(jiǎn)單易得，以水熱法為高溫碳化方法制備水溶性的碳點(diǎn)熒光材料，操作簡(jiǎn)單，易于商業(yè)化。
[0010]3、該碳點(diǎn)的生物相容性良好，在體內(nèi)使用的安全性好，可以應(yīng)用于細(xì)胞及組織熒光成像。
【附圖說(shuō)明】
[0011 ]圖1為實(shí)施例的制備方法流程。
[0012]圖2為實(shí)施例制備所得碳量子點(diǎn)的TEM照片。
[0013]圖3為實(shí)施例1所得碳量子的熒光光譜。
[0014]圖4為實(shí)施例2所得碳量子的熒光光譜。
[0015]圖5為實(shí)施例3所得碳量子的焚光光譜。
[0016]圖6為碳量子點(diǎn)的HEK293細(xì)胞毒性曲線。
[0017]圖7為碳量子點(diǎn)的U87mg細(xì)胞毒性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]苯二胺-檸檬酸碳點(diǎn)的制備過(guò)程如圖1所示，以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例1:
將鄰苯二胺0.lg溶于10ml乙醇中避光于常溫下攪拌，直至苯二胺固體全部溶解，得到均勻的溶液；將0.lg檸檬酸溶于10ml純水中，于室溫下攪拌，直至檸檬酸完全溶解，將苯二胺溶液及檸檬酸溶液混合，置于100ml