專利名稱：植物類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶-查爾酮異構(gòu)酶編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物花色素苷形成相關(guān)的酶編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)背景花的顏色是決定花觀賞價值的重要因素之一，花色主耍由類黃酮(flavonoids)、類胡蘿卜素 (carotenoids)、生物堿(alkaloid)三大類物質(zhì)7央定(Tanaka Y,S Tsuda，T Kusumi. Metabolic Engineering to modify flowers color.Plant Cell Physioloy, 1998(1 l):l 119-1126.)?；ㄉ剀?anthocyanins)是類黃酮中一類主要色素，控制著花的粉紅色、紅色、磚紅色、藍色、紫 色等花色，植物中基本的花色素苷有3種，即花葵素、花青素、花翠素，以及這些花色素的甲基化衍 生物等。(徐紀尊，王麗輝,潘慶玉.觀賞植物花色基因轉(zhuǎn)化的研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2006, 8 (5): 56 60.)。CHI是類黃酮代謝途徑中的第2個關(guān)鍵酶，催化分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)，其底物為CHS催化合成的查 爾酮(4， 2，， 4，， 6，-四羥基查爾酮)或6，-脫氧査爾酮(4， 2，， 4'一三羥査爾酮)。在CHI的作用下，底物 的2'位羥基失氫與p位斷裂的碳碳雙鍵形成"-O-"鍵，從而分別形成分子內(nèi)環(huán)化的(2S)-黃烷酮(5， 7， 4'， -三羥査爾酮)或(2S)-5-脫氧黃烷酮(7， 4'， -二羥查爾酮)，其環(huán)化反應(yīng)都需耍底物具有2'位羥基基團(Jez J M，Bowman M E，Dixon R A,et al.Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone isomerase.Nat Struct Biol, 2000,7:786-791.)。 CHI催化活性具有立體異構(gòu)性，并且具有pH依賴 性，pH為7.5時，催化活性為90%,而在pH為6.0時的催化活性只有50%(Jez J M， Noel J P.Reaction mechanism of chalcone isomerase .J Biol Chem,2002,277:1361-1369)。 CHI —般被分成兩種類型， 一類是 存在于豆科植物中，能催化6'-脫氧查爾酮和6'羥基査爾酮生成異黃酮類化合物和黃酮類化合物(類型 I);一類是存在于非豆科植物中，僅能催化6'脫氧査爾酮轉(zhuǎn)變成5'羥基黃烷酮(類型II)(ShimadaN.Aoki T.Sato S.et al. A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in the biosynthesis of general flavonoids and legume-specific 5-deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus.Plant Physiol. 2003, 131: 941-951.)。CHI蛋白具有三明治樣的三維折疊形式，這種特殊的折疊形式在植物中是獨特的，也被看成植物 特有的基因標記。雖然fi.ram"/^中的CHI蛋白具有異構(gòu)化柚皮素、紫瑯因、異甘草素的活性，但植 物中的CHI蛋白末梢的a-螺旋區(qū)域包含幾個可以使植物CHI發(fā)生二聚作用的氨基酸殘基，在細菌等低 等生物鐘不含有這些氨基酸殘基，因此低等生物中雖然有CHI-like的蛋白，但不會形成相似的二聚體 (Gensheimer M,Mushegian A.Chalcone isomerase family and fold:No longer unique to plants.Protein Sci, 2004,13:540-544.)。1987年從法國豌豆(Frawc/z 6ea")中采用抗體技術(shù)分離出C77/基因(Mehdy M C,Lamb C J. Chalcone isomerase cDNA cloning and mRNA indiction by fungal elicitor.wounding and infection.EMBO丄6:1527-31533,)。 1988年，在矮牽牛(尸e&"/a /^6W&)中以相同的方法得到CW/(VanTunen A J.Koes R E.Spelt C E.et al.Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from /Ww"'》外Zv7血'coordinate，light-regulated and differential expression of flavonoid genes. 1988.五M50 J.7:1257-1263,)。后來又用同源克隆的方式相繼 在擬南芥(/^6油戸'"/!<3//""0!)、 菜旦(p/zoseo/iw vw/gan、)、 苜蓿(MWcago sa"ra)、 翠菊(Ca〃/We/ /7"s c/H力emW、橙(CVm^W"ms!; )、煙草(A7cor""a tateeww)和玉米(zea wa》w)等多種植物中克隆得到。CHI 也不全是植物的專利，最近在人類糞便厭氧細菌raw/w中也純化到了 CHI蛋白，該蛋白 具有異構(gòu)化柚皮素、紫柳因、異甘草素的活性，能將這些物質(zhì)異構(gòu)化，然后還原、脫水，最后降解成 間苯三酚和3-(4-羥基)-丙氨酸(Heeles C.Braune A.Blaut M.2004.First bacterial chalcone isomerase isolated from ^6a"eW腦raww/肌Arch Microbiol. 181:428-434.)。來源于不同物種的C/Z/基因在不同發(fā)育期和不同部位的時空表達特性有所不同，并具有損傷誘導(dǎo) 表達特性。在矮牽牛中，2個C/7/基因的表達方式不同，C///-A(AF233637)在花冠、導(dǎo)管、成熟的花粉 和經(jīng)紫外線照射的幼苗中表達，而(^//-8(乂145卯)僅在未成熟的花粉中表達。在其花冠、球莖和花藥 的發(fā)育過程中，C/ -A、 C/7S-J與CHI酶的積累和消失受光調(diào)控和紫外輻射誘導(dǎo)，并存在協(xié)同性，有 人認為，這種協(xié)同性積累效應(yīng)是C/7/基因和基因mRNA協(xié)同表達的結(jié)果(van Tunen AJ,Hartman SA，Mur LA,Mol JN. Regulation of chalcone flavonone isomerase(CHI)gene expression in/y^r/iia: the use of alternative promoters in corolla, anthers and pollen .Plant Mol Biol, 1989， 12 :539 551 ,)。光葉百 脈根中，用還原型谷胱甘肽(glutathione， GSH)誘導(dǎo)幼苗后，在10h時C/f/基閑表達量達到最高，其各 成員間也存在表達差異。在另外兒種豆科植物中，細胞在誘導(dǎo)后3-4h其mRNA表達就可達到最大水平。 真菌病原體(Co〃eto的'cAww /Z"cfewW/z!'amOTO侵染胚軸和胚軸受到機械損傷后，細胞內(nèi)C77/基因的mRNA 明顯積累，在受傷后感染的田菁、苜蓿和豌豆根部和根瘤處也能檢測到C/7/表達(Goormachtig S，Lievens S,Herman S,van Montagu M,Holsters M.Chalcone reductase-homologous transcripts accumulate during decelopment of stem-borne nodules on the tropical legume S&y6awz'a roWra a.Planta， 1999,209:45-52.; Kim HK,Jang YH,Baek IS,Lee JH，Park MJ，Chung YS,Chung JI，Kim JK. Polymorphism and expression of isoflavone synthase genes from soybean cultivars.Mol Cells'2005,19:67-73.)。在矮牽牛中C/Z/基因由Po編碼，突變的花粉因杏爾酮的積累而變成黃色或綠色，而在矮牽?；ㄍ蛔凅w中，花藥中c/z/的啟動子突變后使aw表達下降，并導(dǎo)致花粉顏色變成黃色或綠色。而由于轉(zhuǎn)座子的插入失活造成CH/和DFW的突變同樣導(dǎo)致康乃馨的花色變?yōu)辄S色(Itoh Y,HigetaD，Suzuki A,Yoshida H,Ozeki Y.Excision of transposable elements from the chalcone isomerase and dihydroflavonol 4-reductase genes may contribute to the variegation of the yellow-flowered carnationcao^~//z^.Plant Cell Physiol,43:578-585.)CHI在大麥、洋蔥的失活則導(dǎo)致黃酮含量急劇下降和査爾酮 含量增加，洋蔥出現(xiàn)黃色球根(Reuber S, Jende-Strid B,Wray V,Weissenbock G.Accumulation of the chalcone isosalipurposide in primary leaves of barley flavonoid mutants indicates a defective chalcone isomerase.Physiol Plant, 1997,101:827-832.)上述C77/基因的表達特征清楚的表明，C77/廣泛參與類黃酮 代謝過程，在植物花色和其他器官顏色的形成中起作用，它與異黃酮植保素的合成緊密相關(guān)，并涉及到豆科植物對外界的抗脅迫能力。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與植物花色素苷形成相關(guān)的酶編碼基因.本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關(guān)的酶，名稱為CHI，來源于蘋果屬王族海棠(Afa/船 i o^a/0;)，是如下l)或2)的蛋白質(zhì)1) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2) 將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物 花色素苷形成相關(guān)的由l)衍生的酶。上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。 與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因具體可為如下l) -4)中任一所述的基因 1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-660位脫氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1;3) 在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的 酶的DNA分子；4) 與l)的基因具有95%以上的同源性，且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的DNA分子。 序列表中的序列1由660個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第l-660位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的CHI。擴增上述C/Z堪因全長或任一片段的弓I物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由上海生工生物 技術(shù)服務(wù)有限公司完成。T叫酶，T4DNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司，pBS-T-Vector Kit 載體試劑盒購自天為時代生物公司，BD SMART RACE cDNA Amplification Kit購自Clontech公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、DEPC、 DNA Marker II、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨 均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。一、MrC/Z/基因3'端序列的獲得以王族海棠(Ma/^i ^a/zy)(北京農(nóng)學(xué)院海棠種質(zhì)資源圃)為實驗材料，提取其葉的總RNA, 將提取得到的總RNA用5(^1的DEPC水溶解，電泳檢測。經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所 示。從圖中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA兩條帶，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大約為 1:1-2:1。結(jié)果表明，提取得到的RNA是完整的，染色結(jié)果顯示，提取得到的總RNA可以用來進行反 轉(zhuǎn)錄。以上述提取得到的葉總RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以此cDNA為模板，跟據(jù)近緣物種植 物查爾酮合成酶基因保守區(qū)段序列，設(shè)計3'race上游引物CHDF擴增A^C77/基因的3'端序列。Master Mix 預(yù)混物體系如下5預(yù)混物體積(HL)ddH2025.810 PCR緩沖液4證P Mixture(2.5 mM)3.2T叫酶(5U/ 1)1總體積34pl，將上述Master Mix預(yù)混物平均分成2管，按照下表加入引物:雙引物對照 樣品CHI3F (序列表中序列三)模板 一 1 ^PCR反應(yīng)條件先95'C預(yù)變性3min;然后95'C變性15S; 68'C退火6min，共30個循環(huán)；最后 72'C延伸10min。取lOpL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，其中，M為MARKER II的DNA 分子量標準，1為樣品組的PCR擴增結(jié)果，2為CHI3F和3R雙引物對照。結(jié)果表明，雙引物對照組 沒有擴增出特異條帶，只有樣品組擴增得到600bp左右的片段。切下B的條帶，純化回收后按照pBS-T-Vector Kit載體試劑盒(大為時代生物公司)說明書將PCR 產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進行測序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的618bp片段即是MrC/Z/基因的 3'端序列。二、 M"C/Z/基因5'端序列的獲得以步驟一獲得的保守序列為模板，在其5'端設(shè)計引物，進行PCR反應(yīng)，擴增MrC7/堪因的5'端序列。 Master Mix預(yù)混物體系如下預(yù)混物體積ddH2025.810 PCR緩沖液4dNTP Mixture(2.5 mM)3.2T叫酶(5U/ 1)1總體積34 ^d，將上述Master Mix預(yù)混物平均分成2管，按照下表加入引物:雙引物對照 樣品5FCHI5R (序列表中序列三)l)al模板 一 1 ^PCR反應(yīng)條件先95。C預(yù)變性3min;然后95。C變性15S; 64'C退火6min，共30個循環(huán)；最后 72。C延伸7min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍，取lpL作為模板，以CHI5R1和CHI5R2 (序列表中序列5和6) 為引物，進行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取l(VL第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠 電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，其中，M為MARKER II的DNA分子量標準，1為樣品組的PCR擴增結(jié) 果，2為CHI5R2和5F雙引物對照。結(jié)果表明，雙引物對照組沒有擴增出特異條帶，只有樣品組擴增 得到680bp左右的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時代生物公司)說明書將PCR 產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進行測序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的662bp片段即是MrC/Z/基因的 5'端序列。三、iWrC/7/基因全長cDNA序列的獲得將上述PCR擴增獲得的A^C///基因5'端序列以及3'端序列進行同源性比較，利ffl DNAMAN等 生物軟件進行拼接校正，拼接出MrC/Z/基因全長cDNA序列。根據(jù)拼接的MrC/7/基因全長cDNA序 列設(shè)計引物CHIF和CHIR (序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠葉的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 利用RT-PCR方法擴增全長A^CH/基因，用高保真Pfo酶替換7bg酶，PCR反應(yīng)混合物如下10xPCR緩沖液2.5nldNTP Mixture(2.5 mM )2牟引物CHIF (100ng/|al)0,5nl引物CHIR (100ng/|ul)模板(反轉(zhuǎn)錄的cDNA)1，Pfti酶(5卵)ddH2017，Total25^1PCR反應(yīng)條件先94'C預(yù)變性3min;然后94。C50S， 55°C lmin， 72°C 2min，共35個循環(huán)；再772。C延伸7min, 4。C保存。PCR產(chǎn)物進行P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示，其中，M為MARKER II的DNA分子 量標準，1為A^C/Z/基因全長cDNA序列的PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明獲得約662bp的條帶。切下該目的條 帶，純化回收后按照pBS-T-Vector Kit載體試劑盒(天為時代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T 載體上。對擴增得到的iWK:///基因全長CDNA序列進行測序，測序結(jié)果表明，獲得660bp的條帶，該 660bp的核苷酸片段即為M"C///，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列 表中序列2所示。


圖1為王族海棠葉總RNA的PCR擴增結(jié)果圖2為MrOZ/基因的5'RACE PCR擴增結(jié)果圖3為MK7/f/基因的3'RACE PCR擴增結(jié)果圖4為MK7/f/基因全長cDNA序列的PCR擴增結(jié)果序列表序列二 PRT蘋果屬王族海棠2191MAPPPSLAGLQVGATAFPPS21VKPPGSSNTLFLGGAGMRGL41EIQGNFVKVTAIGVYLEDSA61VPLLAVKWKGKTAEELSESV81EFFRDIVTGPFEKFIQV腿101LPLTGQQYSEKVSENCVFFW121KSVGIYTDLEGKA正QFIDV141FKDQNFPPGASILFTQSPKG161SLTTSFSKDASMPEATNAVI181ENKLLSETVLESIVGKHGVS201PATKQSLAARLSQLLNGCK*序列三DNA人工序列3R和5F: Long (0.4幽5'~CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3' Short (2 nM):5'~CTAATACGACTCACTATAGGGC—3'序列四 DNA人工序列CHI3F: 5，- CACCGGGYGCCTCTATTCT -3，。序列五DNA人工序列CHI5R1: 5'-CATTTACACCCGTTCAATAGTTG -3'。序列六 DNA人工序列CHI5R2:5'-CCTCGCGGCCAAACTT-3'序列七 DNA人工序列CHIF: 5' - ATGGCTCCACCACCATCGCTC -3'序列八 DNA人工序列CHIR: 5，- TCATTTACACCCGTTCAATAGTTG -權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因為 如下l) -4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列l(wèi)的自5'末端第l - 660位脫氧核糖核苷酸；2) 其核苦酸序列是序列表中的序列l(wèi);3) 在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1 所述蛋白的DNA分子；4) 與1)的基因具有95%以上的同源性且編碼編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物類黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶的編碼基因。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能改變植物花色或葉色的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N9/90GK101580827SQ200810225589
公開日2009年11月18日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者姚允聰, 宋婷婷, 沈紅香, 佶 田 申請人:北京農(nóng)學(xué)院;姚允聰