專利名稱：：一種防治作物真菌病害的大環(huán)內(nèi)脂類組合物及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)藥生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種防治作物真菌病害的農(nóng)用抗生素制備工藝和用途。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，人類對環(huán)境的要求越來越嚴(yán)格，而化學(xué)農(nóng)藥的開發(fā)難度也越來越大，成功率越來越低。經(jīng)過幾十年的篩選，幾乎已遍及了人們可想象的化學(xué)結(jié)構(gòu)。為此，世界工業(yè)發(fā)達(dá)國家及各大農(nóng)藥公司紛紛尋找新的開發(fā)點(diǎn)，同時(shí)也為了尋找新的先導(dǎo)化合物，農(nóng)藥的研究開發(fā)進(jìn)入了回歸自然的時(shí)代，即從天然產(chǎn)物中尋找可開發(fā)的農(nóng)藥或先導(dǎo)化合物。由于天然產(chǎn)物在分子大小與性質(zhì)等方面已經(jīng)過長期與生物分子相互作用的進(jìn)化選擇，因而具有良好的類藥性；另外，作為生態(tài)系統(tǒng)的一部分，天然產(chǎn)物具備一種特別的優(yōu)勢環(huán)境的適應(yīng)性和兼容性。如何從天然產(chǎn)物中尋找新農(nóng)藥化合物或先導(dǎo)化合物，已成為當(dāng)今農(nóng)藥開發(fā)的主題之一。大量研究表明，通過生物合成的微生物次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜和多樣化，它們不僅以獨(dú)特的作用機(jī)理作用于靶標(biāo)生物，而且具有內(nèi)在的生物可降解性，低殘留的明顯優(yōu)勢，在有效防治作物病害的同時(shí)對非靶標(biāo)生物的副作用較小。因此可以從微生物次生代謝產(chǎn)物中開發(fā)出高效的殺菌劑，以克服由許多老品種化學(xué)合成殺菌劑引致的抗性和污染問題。目前國內(nèi)外已成功開發(fā)出各種微生物源的農(nóng)用殺菌劑，例如滅瘟素S，春雷霉素，多抗霉素，有效霉素、米多霉素、硝吡咯菌素和嗜球果傘素等，用于防治植物真菌病害。另外，微生物源的抗真菌物質(zhì)還可以作為合成高活性類似物的先導(dǎo)化合物，例如分別以硝吡咯菌素及嗜球果傘素作為先導(dǎo)化合物，合成出活性更高的拌種咯和氟咯菌腈，以及嘧菌酯和甲基醚菌酯，并且都已成功上市。近來，不斷有新的抗生素化合物從各種微生物次生代謝產(chǎn)物中分離到，如gopalamicin和thiobutacin等，可用于防治某些作物病害。另外，持續(xù)增長的天然化合物數(shù)量表明，自然界中多樣性的巨大潛力還遠(yuǎn)未發(fā)掘完。放線菌是各種抗生素的最豐產(chǎn)微生物，它產(chǎn)生如氨基糖苷、蒽環(huán)、糖肽、13-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯、核苷、肽、多烯和聚醚等作用機(jī)理獨(dú)特與結(jié)構(gòu)多樣化的抗生素，其產(chǎn)生的抗生素占天然抗生素的75%以上。尤其值得注意的是，鏈霉菌產(chǎn)生的新抗生素在數(shù)量和結(jié)構(gòu)多樣性方面均超過放線菌的其它屬，特別是在農(nóng)業(yè)上使用的抗生素中，約60%分離自鏈霉菌，表明鏈霉菌擁有更強(qiáng)的新抗生素合成能力。本發(fā)明就是在此背景下創(chuàng)制的。
發(fā)明內(nèi)容1.發(fā)明目的本發(fā)明提供一種有效成分為阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素組合物的殺真菌農(nóng)用抗生素，命名為WYLZ-1349，并提供一種從鏈霉菌屬的微生物中發(fā)酵、分離、提取阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素組合物，再添加適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑和助劑制備成殺真菌農(nóng)用抗生素產(chǎn)品的方法，以及利用該產(chǎn)品進(jìn)行防治作物真菌病害的應(yīng)用，從而開發(fā)出一種穩(wěn)定性好、高效、安全低毒的新農(nóng)藥。本發(fā)明人為了尋找比以往更有效的殺真菌農(nóng)用抗生素，從土壤中分離各種微生物來篩選微生物次生代謝產(chǎn)物，然后對這些次生代謝產(chǎn)物分別進(jìn)行精制、鑒定和開發(fā)應(yīng)用。在此過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)屬于鏈霉菌屬的馬來西亞鏈霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對多種作物病害有良好的防治效果，通過對有效成分的精制、鑒定，并與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)化合物的譜圖數(shù)據(jù)相比較，發(fā)現(xiàn)有效成分中3個(gè)主要活性成分的平面結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的阿扎霉素F3(AzalomycinF3)、阿扎霉素F4(AzalomycinF4)和尼菲霉素(Niphimycin)相同(Chem.Pharm.Bull.，1967,15:1657-1661，1726-1732;1982,30:1653-1657，1658-1668，1669-1673，4006-4014.J.Antibiot.，1970,23:107-112;1981,34:1107-1118;1982,35:1480-1494;1984,37:103-109，1167-1169，1170-1186;1985,38:1363-1369;1986,39:713-716;1990,43:639-647;1993,46:1912-1915;1994，47:688-696;1995,48:293-299，896-898，1173-1175，1350-1352;1996,49:765-769;1997，50，194-200，484-489，965-969.J.BasicMicrobiol.，1998，38:415-419.J.Am.Chem.Soc.，1982，104:4129-4141)，均為36元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類化合物。2.技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。WYLZ-1349的制備工藝、活性成分的精制與鑒定方法，其特征在于按如下步驟依次進(jìn)行(1)種子培養(yǎng)過程采用馬來西亞鏈霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，保藏登記入冊編號(hào)為CGMCCNo.1680，在種子罐中加入下列成分，按重量百分含量計(jì)酵母膏0.40.8，葡萄糖0.41.O，麥芽膏1.02.O，復(fù)合維生素0.0010.002，微量鹽0.0050.01，以及0.051.0%(V/V)有機(jī)硅消泡劑，其余含量為水，12rC高壓滅菌40分鐘后備用。培養(yǎng)條件在種子罐中培養(yǎng)3648小時(shí)，培養(yǎng)溫度為2632°C，pH6.57.0，通氣量1:(0.50.8)(V/V)，罐壓0.030.05Mpa，攪拌速率100150轉(zhuǎn)/分鐘。(2)抗生素發(fā)酵過程在發(fā)酵罐內(nèi)加入下列成分，按重量百分含量計(jì)甘露醇2.03.O，大豆粉2.04.O，磷酸氫二鉀0.01%以及0.051.0%(V/V)有機(jī)硅消泡劑，其余含量為水。在上述物料放入發(fā)酵罐后，滅菌前調(diào)整pH值為7.5，12rC高壓滅菌40分鐘備用。將步驟(1)培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵罐，上罐接種量為10%20%(V/V)。培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間7296小時(shí)，培養(yǎng)溫度為2632。C，pH6.57.O，通氣量1:(0.51.0)(V/V)，罐壓0.030.05Mpa，攪拌速率100-200轉(zhuǎn)/分鐘。(3)發(fā)酵產(chǎn)物后處理，按以下步驟依次進(jìn)行A.將發(fā)酵液進(jìn)行過濾，過濾得上清液和菌絲體；B.將菌絲體放入提取罐中，加入丙酮或甲醇等有機(jī)溶劑攪拌破壁610小時(shí)后，過濾得菌絲體的提取液；C.將菌絲體的提取液抽入到濃縮罐中，在700mmHg真空度，蒸氣壓0.02MPa，溫度203(TC條件下減壓濃縮回收丙酮；待丙酮回收完后，將菌絲體的提取清液與步驟A.所得的上清液一起采用大孔吸附樹脂吸附，用丙酮或甲醇等有機(jī)溶劑洗脫，含活性組分的洗脫液經(jīng)濃縮后得到WYLZ-1349的粗提物；D.在粗提物中加入適當(dāng)比例的各種農(nóng)藥通用載體或助劑后得成品WYLZ-1349。(4)WYLZ-1349中活性成分的精制與鑒定取步驟(3)中步驟C.得到的部分粗提物經(jīng)過硅膠及S印hadexLH-20凝膠柱層析，可得到半精制品。然后運(yùn)用高效液相色譜制備分別得到3個(gè)主要活性成分的純品，純度可達(dá)98-99%。分別測定這3個(gè)主要活性成分純品的一維(力、13〇NMR)和二維(HMQC、C0SY、HMBC、R0ESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波譜、質(zhì)譜(MS)、紅外光譜(IR)和紫外光譜(UV)，以及熔點(diǎn)、旋光和溶解性等理化常數(shù)。通過詳細(xì)分析各種譜圖數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的譜圖數(shù)據(jù)相比較，確定這3個(gè)主要活性成分即阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，其分子式分別為C56H95N3017、C57H97N3017和C59H103N3018，分子量分別為1082.36、1096.39和1142.46，推定其分別具有如下的平面結(jié)構(gòu)R=H，阿扎霉素F3尼菲霉素R=CH3，阿扎霉素F4阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素屬于具有胍基及丙二酸基的36元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類結(jié)構(gòu)的殺真菌農(nóng)用抗生素，其理化性質(zhì)分別見表1表3，核磁共振分析數(shù)據(jù)分別見表4表6。表1阿扎霉素F3的理化性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5阿扎霉素F4的^、"C核磁共振分析數(shù)據(jù)(溶劑甲醇_d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6尼菲霉素的^、"C核磁共振分析數(shù)據(jù)(溶劑甲醇_d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所述的WYLZ-1349的制備工藝，其特征在于由種子罐接入發(fā)酵罐的接種量為10%20%(V/V);菌株在種子罐的培養(yǎng)時(shí)間為3648小時(shí)；種子罐和發(fā)酵罐中均加入0.051.0%(V/V)有機(jī)硅消泡劑。所述的WYLZ-1349中活性成分的的精制與鑒定方法，其特征在于WYLZ-1349中3個(gè)主要活性成分阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的分子式分別為C^ft^0『(^H^NA7和C^H皿N^8，分子量分別為1082.36、1096.39和1142.46，分別具有如下的平面結(jié)構(gòu):R=CH3,阿扎霉素F4所述的WYLZ-1349的制備工藝，其特征在于阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素組合物用于防治作物真菌病害。3.優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡單，原料來源穩(wěn)定，且成本低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在保證原料穩(wěn)定的同時(shí)，可以通過嚴(yán)格控制各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)來控制成品的質(zhì)量，從而形成科學(xué)完整的質(zhì)量體系。本產(chǎn)品不剌激皮膚、眼等，對人、畜無毒害；對農(nóng)作物無藥害，耐雨水沖刷；對光、熱穩(wěn)定。本產(chǎn)品防治作物真菌病害效果明顯。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1—種可產(chǎn)生殺真菌農(nóng)用抗生素的菌株，其學(xué)名為馬來西亞鏈霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，該菌株已于2006年4月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記入冊編號(hào)為CGMCCNo.1680。該菌株細(xì)胞壁含有L，L-二氨基庚二酸，全細(xì)胞糖水解物含有半乳糖和阿拉伯糖，胞壁I型。該菌株在高氏一號(hào)、甘油-天門冬酰胺、酵母膏-麥芽膏、燕麥片、馬鈴薯浸汁和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好；在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)特征為菌落白色，圓形，表面毛絨狀，邊緣有較多菌絲生長；基內(nèi)菌絲和氣生菌絲為絲狀，不規(guī)則分支，一般不斷裂；氣生菌絲上形成長孢鏈，直形、波形或螺旋形，孢子圓形、橢圓形至桿狀。該菌株在蛋白胨-明膠培養(yǎng)基上能液化明膠，凝固牛奶，對硝酸鹽還原及脲的利用呈陽性，能水解淀粉，纖維素上不生長，不產(chǎn)生硫化氫及黑色素，能利用葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、甘油、草酸鈉、乙酸鈉和檸檬酸。WYLZ-1349的制備工藝、精制與鑒定方法，按如下步驟依次進(jìn)行(1)種子培養(yǎng)過程采用馬來西亞鏈霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)EC000002，在種子罐中加入下列成分，按重量百分含量計(jì)酵母膏0.4，葡萄糖0.4，麥芽膏1.0，復(fù)合維生素0.001，微量鹽0.005，以及0.05%(V/V)有機(jī)硅消泡劑，其余含量為水，12rC高壓滅菌40分鐘后備用。培養(yǎng)條件在種子罐中培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)溫度為28士rC，pH6.57.O，通氣量1:0.6(V/V)，罐壓0.03Mpa，攪拌速率120轉(zhuǎn)/分鐘。(2)抗生素發(fā)酵過程在發(fā)酵罐內(nèi)加入下列成分，按重量百分含量計(jì)甘露醇2.0，大豆粉2.0，磷酸氫二鉀0.01%以及0.05%(V/V)有機(jī)硅消泡劑，其余含量為水。在上述物料放入發(fā)酵罐后，滅菌前調(diào)整pH值為7.5，12rC高壓滅菌40分鐘備用。將步驟(1)形成的種子液接種入發(fā)酵罐，接種量為15%(V/V)。發(fā)酵時(shí)罐壓控制在0.03Mpa，通氣量1:0.5(V/V)，培養(yǎng)溫度為28士rC，攪拌速率180轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)。(3)發(fā)酵產(chǎn)物后處理，按以下步驟依次進(jìn)行A.將發(fā)酵液進(jìn)行過濾，過濾得上清液和菌絲體；B.將菌絲體放入提取罐中，加入75%的丙酮_水(V/V)溶液攪拌6小時(shí)，過濾得菌絲體的提取液；C.將菌絲體的提取液抽入到濃縮罐中，在700mmHg真空度，蒸氣壓0.02MPa，溫度203(TC條件下減壓濃縮回收丙酮；待丙酮回收完后，將菌絲體的提取清液與步驟A.所得的上清液一起采用大孔吸附樹脂吸附，40%丙酮-水(V/V)洗脫，含活性組分的洗脫液經(jīng)濃縮后得到WYLZ-1349的粗提物I;D.取50份粗提物I與4份拉開粉、2份浸潤劑LS以及56份硅藻土混合、粉碎，即得100份所需含量的可濕性粉劑。(4)WYLZ-1349中活性成分的精制與鑒定取步驟(3)中步驟C.得到的200克粗提物1經(jīng)過硅膠柱層析，85%氯仿-甲醇(V/V)洗脫，收集活性組分，經(jīng)濃縮后得到60克黃色粉末II;取20克II經(jīng)過S印hadexLH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集活性組分，經(jīng)濃縮后得到7克淺黃色粉末III;取200毫克III，運(yùn)用Waters1525高效液相色譜制備，色譜柱HederaODS-P(250X20mm，5iim)，流動(dòng)相:75%甲醇-水(V/V)，流速10.0毫升/分鐘，檢測波長233納米，分別收集保留時(shí)間為22.47分鐘、26.20分鐘和33.84分鐘的單峰，經(jīng)濃縮后分別得到32毫克、29毫克和43毫克純度為99%的IV、V和VI純品。測定IV、V和VI純品的一維(力、13〇NMR)和二維(HMQC、COSY、HMBC、ROESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波譜、質(zhì)譜(MS)、紅外光譜(IR)和紫外光譜(UV)，以及熔點(diǎn)、旋光和溶解性等理化常數(shù)。通過詳細(xì)分析各種譜圖數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的譜圖數(shù)據(jù)相比較，確定IV、V和VI分別為阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，其分子式分別為C56H95N3017、C57H97N3017和(^H皿NA8，分子量分別為1082.36、1096.39和1142.46，分別具有如下的平面結(jié)構(gòu)R=H，阿扎霉素F3尼菲霉素R=CH3，阿扎霉素F4實(shí)施例2將按實(shí)施例1所制備的WYLZ-1349成品稀釋至50200毫克/升，分別用三環(huán)唑(75%可濕性粉劑)、菌核凈(40%可濕性粉劑)、撲海因(50%可濕性粉劑)和百菌清(75%可濕性粉劑)作為對照藥劑，清水作為空白對照，試驗(yàn)WYLZ-1349成品對水稻稻瘟病、煙草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病的防治效果，試驗(yàn)結(jié)果表明WYLZ-1349可有效防治水稻稻瘟病、煙草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病，用藥劑量明顯低于對照藥劑。試驗(yàn)結(jié)果見表7表10。表7WYLZ-1349防治水稻稻瘟病試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表8WYLZ-1349防治煙草赤星病試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9WYLZ-1349防治番茄灰霉病試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表10WYLZ-1349防治辣椒炭疽病試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求一種農(nóng)用殺菌劑，其特征在于它是以阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素組合物為有效成分的殺菌劑WYLZ-1349，阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素的分子式分別為C56H95N3O17、C57H97N3O17和C59H103N3O18，分子量分別為1082.36、1096.39和1142.46，分別具有如下的平面結(jié)構(gòu)R＝H，阿扎霉素F3尼菲霉素R＝CH3，阿扎霉素F4產(chǎn)生WYLZ-1349所用的菌株是馬來西亞鏈霉菌(Streptomycesmalaysiensis)ECO00002，保藏編號(hào)為CGMCCNo.1680。F2008102334355C0000011.tif2.權(quán)利要求l所述農(nóng)用殺菌劑的制備方法，其特征在于先培養(yǎng)馬來西亞鏈霉菌(Str印tomycesmalaysiensis)ECO00002，再分離提取發(fā)酵培養(yǎng)物，用丙酮或甲醇將菌絲體破壁后，與發(fā)酵上清液合并，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附分離，并用丙酮或甲醇洗脫，洗脫液濃縮或進(jìn)一步純化得新磷氮霉素，再添加載體或助劑后得成品。3.權(quán)利要求1所述農(nóng)用殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述殺菌劑可防治下列作物真菌病害水稻稻瘟病、煙草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病。TR=H，阿扎霉素F3尼菲霉素全文摘要本發(fā)明提供一種以阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素組合物為有效成分的農(nóng)用殺菌劑WYLZ-1349及其制備方法和應(yīng)用。該殺菌劑的制備方法包括先培養(yǎng)保藏編號(hào)為CGMCCNo.1680的馬來西亞鏈霉菌(Streptomycesmalaysiensis)ECO00002，再分離提取發(fā)酵培養(yǎng)物，用丙酮或甲醇將菌絲體破壁后與發(fā)酵上清液合并，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附分離，并用丙酮或甲醇洗脫，洗脫液濃縮或進(jìn)一步純化得WYLZ-1349或阿扎霉素F3、阿扎霉素F4和尼菲霉素，再添加載體或助劑后得成品。試驗(yàn)結(jié)果表明，該殺菌劑特別對防治水稻稻瘟病、煙草赤星病、番茄灰霉病和辣椒炭疽病有良好的效果。與現(xiàn)有藥劑相比，具有用量少、農(nóng)民使用成本低、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12R1/465GK101720772SQ20081023343公開日2010年6月9日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者尚慧,文孟良,李家瑞,李銘剛,楊佩文,趙江源申請人:云南大學(xué);云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院