專利名稱：產(chǎn)紅霉素多孢放線菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵液中能夠分離得到新的化合
物的微生物菌株。
背景技術(shù)：
紅霉素的類衍生物有很多種，以紅霉素C進(jìn)行分析，在其14元大環(huán)結(jié)構(gòu)中14位上 沒有羥基，6和18位間沒有形成三元環(huán)。紅霉素類藥物的合成與開發(fā)主要集中于對(duì)14元環(huán) 上的3、5、6、11和12位等活潑羥基的取代上以及取代基的再取代反應(yīng)，并獲得了很好的紅 霉素臨床藥物。但隨著臨床耐藥菌的不斷出現(xiàn)及這些菌的耐藥性的增強(qiáng)，臨床使用的紅霉 素藥物療效正逐步降低，需要進(jìn)一步開發(fā)新的抗生素藥物。因此，新的結(jié)構(gòu)及在此基礎(chǔ)上進(jìn) 行的衍生化反應(yīng)所得到的系列化合物將為新一代紅霉素藥物開發(fā)提供很好的基礎(chǔ)。這正是 該技術(shù)領(lǐng)域亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離得到的、其發(fā)酵液中能 夠分離得到新的化合物的微生物菌株——產(chǎn)紅霉素多孢放線菌。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌命名為產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC M 208243。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌系從中國(guó)新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離獲得的。 現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏單位地址中國(guó)，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏日期為2007年10月9日，保藏編 號(hào)為CCTCC M 208243。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YM 90600Tj
類地位為細(xì)菌域、放線菌門、放線菌綱、多孢放線菌屬Actinopolyspora。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌是從新疆艾丁湖鹽湖土樣中，用纖維素酪素復(fù)
合鹽培養(yǎng)基Cellulose-casein multi-salts (復(fù)合鹽包括NaCl， KC1 and MgCl2)medium.，采用平板稀釋涂布法，分離到一株嗜鹽放線菌YM 90600T。 分離步驟為取鹽湖土樣2g、放入20ml已滅菌的含10 % NaCl溶液，37 °C振蕩
(lOOr. p. m) 30分鐘，取0. 2ml 10—2溶液、涂布于纖維素酪素復(fù)合鹽平板培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)3
周，挑單菌落于ISP 4培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化2次，確認(rèn)為純菌株后，用于科研和保藏。菌種采用
凍干物安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。
培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基ISP 4培養(yǎng)基
(1%可溶性淀粉，0. 4% (NH4)2S04，0. 2% K2HP04，0. 2% MgS04 7H20，0. 4% CaC03，
10 % NaCl ， 1 % MgCl2 6H20， 1 % KC1 ， 2 % Agar)。 NaCl生長(zhǎng)耐受范圍2-25X，最適生長(zhǎng)NaCl 5_10%。 最適生長(zhǎng)pH :7-7. 5。 最適生長(zhǎng)溫度37t:。 好氧。 繁殖 用接種針取少量菌絲于ISP 4瓊脂培養(yǎng)基，37t:培養(yǎng)7天后，基內(nèi)菌絲開始生長(zhǎng)、
為白色，氣生菌絲還未發(fā)育；培養(yǎng)12天后，氣生菌絲發(fā)育生長(zhǎng)、為白色；培養(yǎng)20天到其生長(zhǎng)
的對(duì)數(shù)期，基內(nèi)菌絲白色、氣生菌絲為白色到黃白色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌
種描述 好氧、革蘭氏陽(yáng)性、中度嗜鹽放線菌?；鶅?nèi)菌絲和氣生菌絲生長(zhǎng)良好，基內(nèi)菌絲會(huì) 發(fā)生斷裂、氣生菌絲成熟形成長(zhǎng)孢子鏈、孢子橢圓形。最適生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基， 中度生長(zhǎng)在察氏瓊脂培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基，較弱生長(zhǎng)在酵母 膏/麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基、甘油/天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。基內(nèi)菌絲顏色 為白色，氣生菌絲顏色為白色到黃白色，沒有可溶性色素產(chǎn)生。明膠液化陽(yáng)性，降解淀粉、纖 維素和脲陰性。NaCl生長(zhǎng)耐受范圍2-25% (w/v)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度、pH和溫度分別為 5-10^、7-7.5和37。C。全細(xì)胞水解產(chǎn)物含meso-二氨基庚二酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯 糖和核糖。優(yōu)勢(shì)甲基奈醌為MK-9(H4)。主要脂肪酸含iso-C化。，iso-C則和anteiso-C^。。 DNA基因的G+C含量是67mol%。 本發(fā)明所述菌株的發(fā)酵液中能夠分離得到新的紅霉素類似物，具有抗菌、腫瘤細(xì) 胞活性(MTT法)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例 用本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T 制備新化合物6， 18-環(huán)氧-14羥基紅霉素內(nèi)酯B。 —、產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌株的發(fā)酵處 理 a、斜面培養(yǎng)ISP 4+10% NaCl，37。C下培養(yǎng)15天至氣生孢子長(zhǎng)出； b、種子培養(yǎng)ISP 4(無(wú)瓊脂)+10% NaCl，37t:下，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)IO天； c、發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中，37攝氏度下，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30天，發(fā)酵培養(yǎng)基
的組成及比例大豆粉20g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，淀粉5g，酵母膏2g， NaCl 74g， K2HP04
0. 5g， MgS04 7H20 0. 5g， Na2S04 10H20 25g， KC115g， MgCl2 6H20 10g， CaS04 2H20 5g，
CaC03 2g，去離子水1000ml ， pH 7. 8 ; 操作過程取一接種環(huán)長(zhǎng)好的菌株孢子，接入溫?zé)釡缇^的種子培養(yǎng)基中 (50ml/250ml三角燒瓶)，置于搖床上37。C下，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)10天，制備種子培養(yǎng)液；再 將種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500ml/2000ml三角燒瓶)，發(fā)酵搖瓶于37。C下，250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30天；
二、制備提取物及化合物分離 發(fā)酵終止后，fC下4000轉(zhuǎn)/分離心將菌絲體與發(fā)酵液分開，向發(fā)酵液中加入甲乙 酮萃取三次，每次用量為1/3體積，減壓除去甲乙酮，得發(fā)酵粗提取物，菌絲體用丙酮浸泡3 次，每次用量約2000ml ;減壓除去丙酮，將丙酮浸出物與甲乙酮提取物合并，得菌株粗提取 物；粗提取物經(jīng)硅膠柱層析、S印hadex LH-20柱層析、ODS柱層析及HPLC制備得6， 18_環(huán)氧 紅霉素內(nèi)酯B。 6，18-環(huán)氧紅霉素內(nèi)酯8外觀呈白色粉末，分子式為(:21113608，結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 5</formula> 上述化合物為紅霉素母核的一個(gè)新的衍生物，具有兩個(gè)不同于已知紅霉素結(jié)構(gòu)的 特點(diǎn)，一是獨(dú)特的含氧三元環(huán)狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，二是14位上的羥基取代。這兩個(gè)特點(diǎn)在研究開 發(fā)新一代的紅霉素藥物中有很重要的意義，14位上活潑的羥基為發(fā)生新的取代反應(yīng)提供了 更多的反應(yīng)位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以在3位、5位和14位的羥基可以進(jìn)行各種取代反應(yīng)，產(chǎn)生 出不同于已知和臨床上使用的新的紅霉素藥物。本化合物具有抗腫瘤、抗菌的作用，臨床可 用于敏感菌所致的各種感染。上述化合物可用于合成新一代紅霉素類藥物的前體物質(zhì)，為 合成新的紅霉素提供了一種新的骨架。 以上述化合物5個(gè)濃度對(duì)H1299、 A549、 MCF10A、 DU145、 SK0V-3、 NCI-H460、 HT29、 HCT-15、MCF7等多種腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行了抗腫活性的篩選，表明該物質(zhì)在0. lmg/mL對(duì)腫瘤細(xì) 胞株具有一定的抑制活性。同時(shí)，抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在目標(biāo)菌株中，對(duì)枯草芽孢桿菌(細(xì)菌，抑 菌圈直徑3mm)、肺炎鏈球菌(細(xì)菌，抑菌圈直徑5mm)、棒束孢菌(真菌，抑菌圈直徑lmm)等 具有抑制作用，但對(duì)真菌的抑制作用較弱。 本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001的 16S rRNA部分基因由679個(gè)堿基組成，其序列如下 1 ggcgcgcttc acacatgcaa gtcgagcgat ggcgccggtt ttcggatcgg tgtgcagagc
61 ggcggacggg tgagtaacac gtgagtaacc tgccctgggc gtggggataa ccctgggaaa121ctggggcteataccggatggccctgcctattcgcatggatgggtgggg朋aggttcatct181tcgtaagggggtgttccggcttggg鄉(xiāng)ggctcgcggcccatcagcttgttggtgcggtg241agggcgtacc朋ggcgatg3cgggtagccggcctg卿gggtgatcggcc3C3Ctggg3C301tgagacacggcccagactcctacgggaggc3gC3gtggggaattttgcgcElEltgggCggEl361agcctgacgcagcgacgccgtgtggggg3ggacggccttcgggttgte朋cctctttcgg421ccctgacgaatgtgacggtaggggcte朋gaagcgccggctaactacgtgccagcagccg481cggt朋tecgtagggcgcgagcgttgtccggatttactgggcgte朋gggctcgtaggcg541gtttgtcgcgtcggtcgtgga朋tgtctggcttaactgggcacgtgcggctgatacgggc601agactcgagggcggteggggc朋gcgg朋ttcctggtgtagCggtg朋Eltgcgcagatet
661 caggaggaac accgatggcc
權(quán)利要求
一種產(chǎn)紅霉素多孢放線菌，其特征在于命名為產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC M 208243。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵液中能夠分離得到新的化合物的微生物菌株。本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌命名為產(chǎn)紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC M208243。本發(fā)明所述的產(chǎn)紅霉素多孢放線菌系從中國(guó)新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離獲得的?，F(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址中國(guó)，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏日期為2007年10月9日。本發(fā)明所述菌株的發(fā)酵液中能夠分離得到新的紅霉素類似物，具有抗菌、腫瘤細(xì)胞活性(MTT法)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101748081SQ200810233710
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者唐蜀昆, 姜成林, 徐麗華, 李文均, 趙立興 申請(qǐng)人:云南大學(xué)