專利名稱：：一種防治蠅類害蟲的蠟蚧輪枝菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種殺蠅類害蟲的真菌蠟階輪枝菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蠅類是重要的衛(wèi)生害蟲，它不僅能通過其機體攜帶病原微生物傳播疾病，而且在其種群密度高時，還能對視覺環(huán)境造成嚴(yán)重的"污染"。就蠅類防治工作來講，它不但是預(yù)防醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容，同時也是建設(shè)文明衛(wèi)生城鎮(zhèn)的重要內(nèi)容，為發(fā)展旅游事業(yè)、創(chuàng)造良好的投資環(huán)境、吸引外資所必需。經(jīng)過幾代科學(xué)家的努力，衛(wèi)生害蟲的分類、生活史及生態(tài)習(xí)性己基本明確，同時，殺蟲劑的研制也從第一代有機氯開發(fā)到了第四代擬除蟲菊酯衛(wèi)生殺蟲劑?；瘜W(xué)殺蟲劑雖然具有見效快、成本低的優(yōu)點，但蠅類的生活周期短(15-18天)，分布范圍廣，繁殖能力強，無滯育現(xiàn)象。若常年用藥防治次數(shù)過多，不僅會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且易殺死蠅類的天敵，并使目標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性。這些負面影響使人們在防治中更加關(guān)注起生物防治。生物防治對人、畜、植物安全，害蟲極少或不產(chǎn)生抗性，有利于環(huán)境保護。因此，研究蠅類的生物防治，避免或減少因不合理使用化學(xué)農(nóng)藥所帶來的抗藥性問題，已成為蠅類科學(xué)治理和可持續(xù)控制的重要課題。蠟蚧輪枝菌(KeW"7/!'MW/ecam'0作為一種昆蟲病原真菌，屬于半知菌亞綱絲孢菌類輪枝菌屬匍匐組，其寄主范圍包括鞘翅目、鱗翅目、半翅目、纓翅目、直翅目、膜翅目和彈尾目、癭螨、線蟲，甚至還能寄生植物病菌。遺傳穩(wěn)定性較好，對人、畜、禽類、植物均未發(fā)現(xiàn)毒害，本菌在蠅類害蟲防治方面還未見報道。因此，在防治衛(wèi)生害蟲時又有很大的發(fā)展前景。
發(fā)明內(nèi)容'本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法的不足，提供了一種高效、無毒、安全、無殘留、使用簡便的防治蠅類害蟲的蠟蚧輪枝菌。本發(fā)明所提供的蠟蚧輪枝菌(Fert/c/〃z'wm/ecah/OKMZW-1已于2008年10月29閂保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為No.2728。從罹病棕尾別麻蠅成蟲上分離獲得蠟蚧輪枝菌野生菌株，將野生菌株回接于棕尾別麻蠅成蟲上復(fù)壯得到蠟階輪枝菌菌株，對該菌株采用按常規(guī)方法進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的蠟蚧輪枝菌。在光學(xué)顯微鏡(400倍)可以看到在該菌株的菌絲上長著分生孢子梗，分生孢子梗直立，錐形瓶頸輪生于菌絲體中間或頂部。分生孢子呈橢圓至圓柱形，大小為(2.4-)3.24.8(-6.4)x1.6一2.0(-2.8)pm。在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形展開，白色，氣生菌絲絨毛狀致密如絮，背面微顯黃，奶油黃至淺褐色，氣生菌絲無色，有隔，寬1.1-2.5pm，分生孢子梗單生、對生或3-5根輪生，在菌絲末端孢子梗數(shù)較多。蠟蚧輪枝菌菌落直徑平均每天都有1cm左右的生長速度，屬于快速生長的類型。從第七天開始產(chǎn)孢量就可以達到lxl()8孢子/ml，產(chǎn)孢量較高。24小時孢子的萌發(fā)率可以達到80%左右。該菌分生孢子對棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲致死中濃度(LC50)為9.50x105、4.58x107、4.06><107、4.10x103、1.05><107孢子/ml。本發(fā)明的有益效果為該菌株是分離得到的新菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其孢子懸浮液對棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲致病力較好，環(huán)保無污染、不易產(chǎn)生抗藥性，可以廣泛地用于蠅類的防治。具體實施例方式實施例一、病原菌的分離、鑒定1.1材料與方法1.1.1材料在昆明市采集到被一種蟲生真菌侵染后的罹病棕尾別麻蠅Boe"c/^&rapefegr!'we(Diptera:Sarcophagidae)成蟲。馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(PDA):200g馬鈴薯+1720g瓊脂+17~20g葡萄糖+1000ml水。無菌操作條件所有的器皿和用具均經(jīng)高溫滅菌鍋(12rC，30min)，接種等操作均在超凈工作臺內(nèi)進行。培養(yǎng)條件置于29'C光照(12L:12D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到試管PDA斜面，培養(yǎng)23天，轉(zhuǎn)入4'C冰箱儲存。l丄2病原菌的分離和純化分離從罹病棕尾別麻蠅成蟲尸體上分離病原菌。將棕尾別麻蠅成蟲尸體按順序依次經(jīng)過70%酒精浸泡30秒、再經(jīng)過0.1%升汞溶液浸泡3分鐘(徹底消毒)、最后用無菌水沖洗三次，將處理好的棕尾別麻蠅成蟲尸體接種于PDA培養(yǎng)基上。在溫度為29'C條件下培養(yǎng)，長出菌絲后按常規(guī)方法進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的菌株蠟蚧輪枝菌，轉(zhuǎn)移到PDA斜面上生長34天，在4'C冰箱儲存。復(fù)壯將分離到的菌株在PDA上培養(yǎng)12~14天后，加入含1%吐溫-80的無菌水收集孢子，后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，用玻璃棒攪拌均勻，得到適當(dāng)濃度(108孢子/ml)的孢子懸浮液，用小型噴霧器均勻噴于棕尾別麻蠅成蟲體表(以蟲體表面濕潤為度)，保持相對濕度90%以上。收集死蟲并保濕，得到的成蟲蟲尸再按以上方法分離得到致病力更強的菌株。'純化挑取培養(yǎng)基上菌落邊緣上的菌絲，再次接種在新的培養(yǎng)基上。如此多培養(yǎng)幾代，菌株就得到了純化。l丄3病原菌的鑒定根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲和分生孢子的形態(tài)進行鑒定。利用40x10倍顯光學(xué)微鏡，鏡檢菌絲和分生孢子的形態(tài)。1.2結(jié)果從被蟲生真菌自然侵染的棕尾別麻蠅成蟲蟲體上分離獲得野生菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)，并回接于棕尾別麻蠅成蟲復(fù)壯獲得一菌株，對該菌株進行單菌絲分離獲得純化的菌株，即KeW/c/〃/wm/eow//KMZW-1CGMCCNo.2728。在光學(xué)顯微鏡(400倍)可以看到在該菌株的菌絲上長著分生孢子梗，分生孢子梗直立，錐形瓶頸輪生于菌絲體中間或頂部。分生孢子呈橢圓至圓柱形，大小為(2.4-)3.2~4.8(-6.4)x1.6—2.0(-2.8)nm。在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形展開，白色，氣生菌絲絨毛狀致密如絮，背面微顯黃，奶油黃至淺褐色，氣生菌絲無色，有隔，寬1.1-2.5pm，分生孢子梗單生、對生或3-5根輪生，在菌絲末端孢子梗數(shù)較多。根據(jù)觀察到的菌落、菌絲和孢子形態(tài)，與《昆蟲真菌學(xué)》上的有關(guān)蠟蚧輪枝菌的形態(tài)特征描述和圖譜進行對比分析，鑒定為蠟蚧輪枝菌。實施例二、蠟蚧輪枝菌純化菌株生物學(xué)特性2.1材料與方法2丄1供試菌株選擇純化后長得均勻且生長旺盛的一皿作為供試菌株。取菌絲再次接種到PDA上，于29'C的恒溫光照(12L:12D)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2丄2菌落生長速率和產(chǎn)孢量的測定將事先培養(yǎng)好的蠟蚧輪枝菌取一皿用8mm的打孔器打孔，接種于新的培養(yǎng)基上，做三個重復(fù)，置于29'C的恒溫光照(12D:12L)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時測定其直徑并記錄，直到菌落長滿培養(yǎng)基為止。用直徑為8mm的打孔器在培養(yǎng)基相同的位置取菌餅，加1%吐溫-80和20ml無菌水，將孢子洗下，制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量。2.1.3孢子萌發(fā)率的測定將菌株培養(yǎng)12~14天，分別用無菌水收集分生孢子，制成懸浮液，用帶凹槽的載玻片測定孢子萌發(fā)率。將孢子懸浮液直接滴在無菌載玻片上，置于底鋪濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加幾滴無菌水保持濕度在100%RH，培養(yǎng)24小時后鏡檢，每個處理三次重復(fù)。2.2結(jié)果由表1可以看出，8天內(nèi)菌落直徑平均生長速度為0.89cm/d，屬于快速生長的類型。而第二天及第三天生長緩慢，是因為菌株剛接種時需要一段時間適應(yīng)，菌落從第0天開始直徑以O(shè).7cm/d的速度生長。由表2可以看出，從第七天開始產(chǎn)孢量就可以達到lxl()8孢子/ml。產(chǎn)孢量較高。由表3可以看出，24小時孢子的萌發(fā)率可以達到80%左右。這些均說明該菌株的生物學(xué)特性較好，生長情況較好。表l菌落直徑的生長速度生長速率(cm/d)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2產(chǎn)孢量測定結(jié)果不同時間的產(chǎn)孢量(分生孢子/ml)重復(fù)-6d-7d8d9dOdlld10.93x1081.01x10s1.02x1081.01xl081.02xl081.01xl081.05xl081.12xl0!30.89xl081.03x10s1.04xl081.07x1081.09"0)平均0.89xl081.01xl081.04x1081.09xl()i表3分生孢子萌發(fā)率(24小時)重復(fù)_觀察孢子個數(shù)(個)_萌發(fā)數(shù)(個)分生孢子萌發(fā)率(％)135929381.62241231977.43343234880.56平均120396079.80實施例三、蠟階輪枝菌純化菌株對棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅的室內(nèi)致病性測定3.1材料與方法3丄1供試蟲源選擇剛羽化4天同一批次、無病、大小一致的棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲作為試蟲，將供試用蟲單獨分開裝入小型養(yǎng)蟲籠里，喂以水和白砂糖，在29±1匸和12L:12D的光周期條件下飼養(yǎng)。3丄2孢子懸浮液的制備取長勢良好的純化蠟蚧輪枝菌用無菌水將孢子洗下并過濾(一般濾液內(nèi)孢子數(shù)都能達到1()S孢子/ml)，用無菌毛細滴管取濾液一滴滴于血細胞計數(shù)板上，在顯微鏡下數(shù)孢子并記錄數(shù)據(jù)，用無菌水依次稀釋為108、107、106、105、104五個濃度梯度的孢子懸浮液，以無菌水為對照。孢子懸浮液和對照中均加入1%吐溫-80和5%甘油，用于蠟蚧輪枝菌致病力測定。3丄3噴霧法將制備的濃度梯度孢子懸浮液用小型噴霧器均勻噴于5種蠅成蟲體表(以蟲7體表面濕潤為度)，每個劑量三次重復(fù)，每個重復(fù)30頭試蟲，按下述方法進行接種吸取10ml蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液于小型噴霧器中，用噴霧法對試蟲噴霧，以蟲體表面濕潤為宜，噴好后將養(yǎng)蟲籠放到養(yǎng)蟲室，將空調(diào)溫度調(diào)為29°C、相對濕度控制在85%以上，每天光照培養(yǎng)12小時，暗培養(yǎng)12小時。每天記錄觀察試蟲的死亡率。保持相對濕度85%以上，提供糖和水，觀察并記錄供試蟲的死亡情況。3.2結(jié)果由表4可以看出，蠟蚧輪枝菌對酪蠅成蟲的LC5o最小，為4.10x1(^孢子/ml，其次是棕尾別麻蠅成蟲，為9.50x10S孢子/ml;對棕尾別麻蠅成蟲的LCso最大，為4.58xl(^孢子/mL。由表5可以看出，蠟蚧輪枝菌對果蠅的LTso最小，為3.2天，其次是果蠅和棕尾別麻蠅，絲光綠蠅、家蠅和酪蠅LT5o相差不大，均約為8天。表4蠟蚧輪枝菌對5種蠅致死中濃度LC5o比較供試蠅毒力冋歸方程相關(guān)系數(shù)(r)LCsQ(孢子/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表5蠟蚧輪枝菌對5種蠅致死中時間LT5o比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.3結(jié)果分析我們首次從雙翅目蠅類昆蟲上分離純化獲得蠟蚧輪枝菌(/ecam7)KMZW-1CGMCCNo.2728，該菌株在溫度為28°C~29°C、相對濕度90%以上在PDA培養(yǎng)基上生長快速，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其孢子懸浮液對棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲致病力較好，可以廣泛地用于蠅類的防治。另外，該菌株培養(yǎng)原料來源廣泛，價格便宜，培養(yǎng)技術(shù)簡單，容易大量生產(chǎn)，有很大的發(fā)展?jié)摿?。同時，用該菌株進行蠅類的生物防治，可避免或減少因不合理使用化學(xué)農(nóng)藥所帶來的抗藥性問題，將為蠅類科學(xué)治理和可持續(xù)控制做出重要貢獻。權(quán)利要求1、一種防治蠅類害蟲的蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)KMZW-1，保藏號CGMCCNo.2728。2、權(quán)利要求1所述蠟蚧輪枝菌特征在于從罹病棕尾別麻蠅成蟲上分離獲得蠟蚧輪枝菌野生菌株，將野生菌株回接于棕尾別麻蠅成蟲上復(fù)壯得到蠟階輪枝菌菌株，對該菌株采用按常規(guī)方法進行單孢分離獲得得到純化菌株。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟蚧輪枝菌(KW/c做ww/ecaw7)KMZW-1菌株在防治棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種蟲生真菌蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)，尤其防治常見的雙翅目蠅類害蟲有效。從被蟲生真菌自然侵染的棕尾別麻蠅成蟲蟲體上分離獲得野生菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)，并回接于棕尾別麻蠅成蟲復(fù)壯獲得一菌株，對該菌株進行單菌絲分離獲得純化的菌株，即VerticilliumlecaniiKMZW-1(CGMCCNo.2728)。該菌株在溫度為28℃～29℃、相對濕度90％以上生長狀況良好，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其孢子懸浮液對棕尾別麻蠅、絲光綠蠅、家蠅、酪蠅、果蠅成蟲致病力較好。文檔編號C12N1/14GK101451108SQ20081023378公開日2009年6月10日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者吳國星申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)