專利名稱：反應液用容器，使用這種容器的反應促進裝置，及其方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可以在基因工程學或酶工程學等生物學領域中使用的用于促進需要 進行溫度管理的生物學反應的反應用容器和使用這種容器的反應促進裝置。
背景技術：
1983年發(fā)明了 PCR法(聚合酶鏈式反應)這種劃時代的基因分析技術，并且用這 種技術完成了人類基因組計劃。但是，基因分析技術在實用速度和實用穩(wěn)定性方面還處于 研究室水平，需要提高其實用的速度和實用的穩(wěn)定性從而適于應用于臨床或生產(chǎn)的現(xiàn)場。例如，前述PCR法是能夠在短時間內(nèi)將作為目標的特定DNA區(qū)域擴增到10萬倍以 上的技術，但也需要花費數(shù)十分鐘，離臨床現(xiàn)場的“數(shù)分鐘”這樣的需求相差甚遠。從實用 穩(wěn)定性這種觀點來看，在用于進行核酸擴增的加熱工序中，由于熱傳遞上不穩(wěn)定等原因，在 擴增時常常失敗。如果是研究用分析，要是失敗可以重做，但在考慮實用性時就是個無法回 避的問題。也即是說，這種核酸擴增速度遲緩和擴增穩(wěn)定性的缺乏，對于現(xiàn)場普及而言，還 有很大困難。首先，考慮核酸擴增速度的問題。例如，通常，為了能夠在醫(yī)療現(xiàn)場利用這種PCR法，需要“通過將急救診斷領域所 必需的300bp(以下項中說明)左右的核酸穩(wěn)定在5分鐘以內(nèi)進行穩(wěn)定擴增的技術”。如果 核酸的擴增和鑒定可以穩(wěn)定在5分鐘左右，則需要緊急性的急救醫(yī)療的現(xiàn)場中可以拯救很 多人的生命，也可以在手術中通過核酸進行病理診斷，也可以在防疫現(xiàn)場，現(xiàn)場防止感染癥 的蔓延。這里，通過核酸進行的診斷法由“核酸擴增工序”和“擴增核酸的鑒定工序”構成。 所謂核酸擴增，是用熱循環(huán)反應或等溫反應將核酸(DNA或RNA)擴增到數(shù)百萬倍的技術，其 是可以通過增加數(shù)量進行分析的這樣的一種重要技術。分析對象的核酸是數(shù)個至數(shù)十萬個 堿基相連接，為了在診斷等中使用，通過復制該長核酸的特征部分進行核酸擴增。復制的長 度，通常根據(jù)目的的不同使用由100 300個堿基相連接的核酸(稱為100 300bp)。在描述現(xiàn)有技術的文獻等之前，為了理解，將重點落在核酸擴增的形態(tài)的分類示 于

圖1。如該圖所示，核酸擴增法1可分為榮研化學的LAMP法等“等溫擴增法”2和PCR(聚 合酶鏈式反應)或LCR (連接酶鏈式反應)等伴隨高溫熱解離的“熱循環(huán)擴增法” 3?！暗葴財U增法”是在一定溫度下只進行酶反應的擴增方法，理論上，要比目前的技 術更為高速是困難的?！盁嵫h(huán)擴增法”是給反應液提供熱循環(huán)從而促進核酸擴增反應的擴 增方法，所需時間的一大半都花費在溫度的升降上，因此能夠通過升溫或冷卻的效率改善 達到高速化的余地大。而且，從運作穩(wěn)定化這種觀點來看，由于都是熱反應，因此熱源和反 應容器的穩(wěn)定接觸是穩(wěn)定性的關鍵。因此，以下，就熱循環(huán)擴增法進行詳細的說明。“熱循環(huán)擴增法”中有PCR法，LCR法和其它方法，就其中具有代表性的PCR法進行 說明。
4
這種PCR法中，準備混合了決定復制起點和復制終點的引物和模板DNA以及DNA 延伸酶(聚合酶)的反應液，在55°C左右的溫度(以下稱為“低溫”)下形成引物與模板DNA 的雙螺旋。然后，在75°C左右的溫度(稱為中間溫度”)下通過聚合酶，復制DNA在起點到 終點間延伸，制成復制DNA。進而，加熱到95°C左右(以下表示為“高溫”)，復制DNA的雙 鏈解離，形成單鏈DNA。以這樣的低溫、中間溫度、高溫作為1個熱循環(huán)，重復進行30次左右 這樣的循環(huán)，理論上可以制成近23°的復制DNA?！盁嵫h(huán)擴增法” 3根據(jù)其實行形態(tài)可以分成“靜止型” 4和“流動型” 5。所謂流動型，是指通過使反應容器內(nèi)中容納的反應液在流路內(nèi)移動，使之通過不同溫度的熱區(qū)域，從 而提供熱循環(huán)的方式。由于反應液在容器內(nèi)流動，因此被稱為流動型。另一方面，所謂靜止 型，是指通過使反應容器而不是反應液相對于熱源移動，來給這種反應液提供熱循環(huán)的方 式。由于反應容器中的反應液不移動，因此被稱為靜止型。此外，“靜止型” 4還根據(jù)反應槽是否面向空氣開放，被分為“開放型” 6和“密閉型”7。熱循環(huán)擴增法中有在90°C以上通過熱使雙鏈DNA解離的工序，此時水分蒸發(fā)，“開放 型”中液體濃度改變，在穩(wěn)定性上存在致命的缺點。因此，“開放型”在現(xiàn)場實用性上存在問 題，我們認為在臨床診斷領域最合適的是“密閉型”。如上所述，臨床應用上需要高速化和穩(wěn)定性。因此，圖2以高速化作為重點，列出 了現(xiàn)有技術。該圖2將核酸擴增的市售裝置A F，以及其加熱方式和速度匯總于表中。而且， 圖3中，給予裝置A F適當?shù)奈恢茫礋嵩捶绞胶头磻獣r間來表示。PCR法是一種甚至可稱為核酸擴增的世界標準的技術，即使把核酸擴增的歷史說 成是PCR法的歷史也不為過。作為代表性PCR裝置，有將容器置于“固體熱源”上，使熱源 溫度升降的方式，但熱源自身的溫度升降需要一定時間，這成為高速化的瓶頸。例如A—般 被稱為高速機，但即使是它也需要1小時。另一方面，如果使用熱容量小的“氣體熱源”，熱源自身的溫度升降時間事實上可 以無視，因此通過“氣體熱源”進行加熱的PCR裝置成為今后高速化研究的重點。其結果是 開發(fā)了同一表格的裝置B D，PCR的高速化向數(shù)十分鐘水平發(fā)展。而且，通過C，E等，高速 化發(fā)展到接近10分鐘的程度，但也未達到臨床診斷市場真正需求的“5分鐘”以內(nèi)，在“高 速性”和“穩(wěn)定性”之外，還需要“低價”、“操作性”，因此只單獨改良熱源是不夠的，已經(jīng)到了 必需要進行熱源·容器·控制·酶等涉及PCR的所有要素的綜合改良的時候。最近，只是在速度這方面，如美國專利第6472186號(文獻1)中所示的那樣，提出 了使用高壓氦或二氧化碳氣體的高速機。但是，由于利用高壓的氦或二氧化碳氣體，因此從 急救診斷領域的實用性方面，穩(wěn)定性和簡便性以及價格方面來看，問題很多。而且，同樣使 用“氣體熱源”的裝置B(特許第3136129號公報文獻2)和裝置D(特表第2000-511435 號公報文獻3)都試圖使用玻璃毛細管(毛細管)進行高速化，但無法調(diào)和到5分鐘以下。另一方面，作為固體熱源 流動型的裝置，有裝置E (美國專利第6780617號文獻 4)。這個例子是，準備PCR所必需的設定在3個溫度的固定熱源，通過多個活塞使管狀容器 的反應液往復移動。通過這種方式，給上述反應液提供熱循環(huán)，但該方法的結構復雜，其結 構上，無法期待速度的提高。固體熱源·靜止型與固體熱源·流動型不同，不使反應液在反應容器內(nèi)移動，通過使反應容器與熱源的相對位置移動，給反應液提供熱循環(huán)。該形式中，裝置F(特表第 2004-504828號公報文獻5)是通過使熱源順次接觸圓盤周邊部的反應室下面而進行PCR 的裝置。但是，該文獻5中，完全沒有對本發(fā)明的目標即高速化進行研究。特開第2006-115742號公報(文獻6)公開了，在組合有微細溝的硅橡膠板和玻璃 板而形成的流路中提供反應液后，使之在設定在PCR必需的溫度的3組固定熱源之間水平 往復，在容器來到1組熱源之間時，通過從雙面都加上熱源，進行PCR的技術。在該技術中， 由于填滿了反應液的反應槽面向大氣開放，因此無法擋住氣化的水蒸氣的流出，在反應的 穩(wěn)定性上有問題。而且，根據(jù)文獻6，需要200個堿基的30個循環(huán)的擴增需要10分鐘，在高 速性上無法達到市場需求。以下，列出上述所示的文獻。特許文獻1 美國專利第6，472，186號公報特許文獻2 特許第3136129號公報特 許文獻3 特表第2005-511435號公報特許文獻4 美國專利第6，780，617號公報特許文獻 5 特表第2004-504828號公報特許文獻6 特開第2006-115742號公報如以上說明的那樣， 以往的裝置，在臨床的現(xiàn)場等情形中，在實用的用于進行核酸擴增的條件，即在高速化和穩(wěn) 定化上有各種問題，都無法實現(xiàn)實用化。因此，對進行能夠勝任現(xiàn)場利用的反應的促進裝置的需求很強。發(fā)明內(nèi)容用于解 決問題的方法本發(fā)明鑒于以上事實而形成，根據(jù)其第1個主要觀點，提供一種使之接觸預定溫 度的加熱器，用于促進反應液的核酸擴增反應的反應液用容器，其特征在于其具有表面和 里面，還具有按前述兩個面中的任一面或者這兩面保持在對向加熱器的狀態(tài)的方式構成的 基板，和在該基板的面方向相互分離，獨立設置的，分別容納前述反應液，用密封液密閉的 孔，前述孔由設置在前述基板上的開口部和閉塞該開口部的基板表面?zhèn)纫约袄锩鎮(zhèn)鹊姆忾] 部件構成，至少閉塞與前述加熱器接觸側的面的封閉部件具有厚度為400 ym的伸縮性膜 部分。根據(jù)這種構成，由于閉塞收納反應液的孔的至少與加熱器接觸側的面的封閉部件 是厚度為10 400 ym的伸縮性膜，通過前述加熱器的加熱，密閉孔內(nèi)的空氣膨脹，因此上 述膜延伸，該膜能夠按壓在加熱器上。由于通過這種方式，向孔內(nèi)的傳熱效率提高，反應液 的加熱和冷卻速度可以變快。因此，可以縮短給反應液提供的熱循環(huán)。由此，可以實現(xiàn)5分 鐘以內(nèi)的熱循環(huán)。此外，由于伸縮膜緊貼在加熱器上，因此熱傳導的穩(wěn)定性提高，反應液的熱循環(huán)失 敗的可能性降低。而且，該方法，如果存在于基板上的孔的數(shù)量增多，實用的效果就更大，因此不僅 單獨的對孔的傳熱效率提高，而且通過對多個孔均勻給熱，其傳熱穩(wěn)定性也有顯著效果。而且，根據(jù)1個實施方式，前述膜部分為烯烴類樹脂、聚酯類樹脂、聚氨酯樹脂、硅 類樹脂或氟類樹脂。根據(jù)另一個實施方式，進而，含有前述膜部分的封閉部件是貼在前述基板上膜狀 部件。根據(jù)另一個實施方式，前述基板具有包括構成前述孔的前述開口部與膜部分的與 封閉部件一體形成的伸縮性樹脂材料，和固定在該伸縮性樹脂材料上的限制前述伸縮性材料向表面方向的膨脹的堅硬部件和材料。根據(jù)另一個實施方式，前述孔按反應時內(nèi)壓比大氣壓高的方式構成。根據(jù)另一個實施方式，前述核酸擴增反應是等溫核酸擴增反應。根據(jù)另一個實施方式，前述核酸擴增反應是包括PCR(聚合酶鏈式反應)或 LCR(連接酶鏈式反應)的熱循環(huán)反應。這里，優(yōu)選前述基板按與前述加熱器的相對位置位 移來保持，由此對容納在孔中的反應液提供熱循環(huán)。而且，此時，前述基板按與前述加熱器 的相對位置在旋轉圓周方向位移來保持，更優(yōu)選前述孔在前述基板的旋轉中心周圍形成。而且，前述基板按與前述加熱器的相對位置在直線方向位移來保持，前述孔可以 沿直線方向相互分開方式形成。根據(jù)另一個實施方式，前述孔還按阻礙各孔間的光學干涉的方式構成。此時，優(yōu)選 前述基板的至少一部由遮光性材料形成，或者被遮光著色。前述基板的表面或里面的任意 一面可以具有金屬反射膜。根據(jù)另一個實施方式，還提供了一種反應液用容器，其特征在于，在向前述孔的開 口部加入反應液后，通過在基板上貼上任意一個封閉部件，用密封液密閉該孔的開口部而 構成，前述開口部內(nèi)壁的上述一個封閉部件的鄰近部、前述封閉部件的對向前述開口部的 面中的任意一者或二者是疏水性。根據(jù)該發(fā)明的第2個主要側面，提供一種具備加熱到預定溫度的加熱器，通過加 熱在反應液用容器中形成的獨立孔中容納的反應液，用于促進該反應液的核酸擴增反應的 反應促進裝置，其特征在于前述孔由設置在基板上的開口部和封閉該開口部的基板表面?zhèn)?和里面?zhèn)鹊姆忾]部件構成，至少封閉與前述加熱器接觸側這一面的封閉部件具有厚度為 10 400 y m的伸縮性膜部分，該反應促進裝置是按照如下方式被控制，即通過前述加熱器 對孔內(nèi)加熱，伸縮性膜由此由于膨脹而緊貼在加熱器上。本發(fā)明的第3個主要側面，提供了用加熱到預定溫度的加熱器對在反應液用容器 中形成的獨立孔中容納的反應液進行加熱，用于促進該反應液的核酸擴增反應的反應促 進方法，其特征在于前述孔由設置在基板上的開口部和封閉該開口部的基板表面?zhèn)群屠?面?zhèn)鹊姆忾]部件構成，至少封閉與前述加熱器接觸側這一面的封閉部件具有厚度為10 400 ym的伸縮性膜部分，該方法有以下工序，即在預定溫度以下，在獨立孔內(nèi)封入反應液 的工序，和通過加熱前述加熱器將孔內(nèi)溫度加熱到前述預定溫度以上，設法使伸縮性膜由 于這種加熱導致的膨脹而緊貼在加熱器上的工序。本發(fā)明的第4個側面提供了一種反應液用容器，其特征在于其按以下方式構成， 即在構成反應容器的基板上設置加液用空隙，和連結該加液用空隙和前述各孔的多條連結 通路，使得該空隙中的反應液通過前述連結通路移送到前述孔中。此時，優(yōu)選，前述多條連結通路中的至少一條比其它的通路形成得淺，這條較淺的 連結通路在將反應液移送到孔時，被用作排空氣。而且，可以在前述基板上形成大氣開放孔，形成連結該大氣釋放孔和前述孔的連 結溝。用于對加液用空隙或大氣開放孔進行密閉的栓上，在插入栓時容器內(nèi)的空氣逸出 到大氣中，優(yōu)選在密封面(側面部)的一部分上形成用于設法在栓完全插入時能夠密閉的 溝。
可以是在前述基板上設置連結前述孔的大氣開放用溝狀空隙，和用于使密封用液 體流動態(tài)填滿密封液的密封液用空隙，和連結密封液用空隙和前述大氣開放用溝狀空隙和 前述加液用空隙的溝狀空隙，使得在反應液從前述加液用空隙送到反應用空隙后，通過從 裝入了密封液的空隙中輸送密封液，密封液進入反應用空隙的加液用空隙側的溝狀空隙和 大氣開放側的溝狀空隙這兩者中。而且，上述情況下，優(yōu)選前述密封液為含有硅潤滑油的潤滑油狀高粘度液或UV硬 化性樹脂或熱硬化性樹脂。而且，上述反應液用容器中，前述孔為流路狀，該流路狀孔的一側形成流入反應液 的入口，另一側向大氣開放或保持高于大氣壓，可以通過前述反應液從流入口持續(xù)流入，設 法使反應時的前述孔的內(nèi)壓高于大氣壓。而且，前述反應為核酸擴增，可以在核酸擴增時連續(xù)進行電泳。還可以在前述流路狀的孔中具有對向設定為使RNA逆轉錄的溫度的加熱器的部 分，和接著對向設定為逆轉錄酶由于加熱而失活的溫度的加熱器的部分，然后對向設定為 對應于核酸擴增反應的溫度的加熱器的部分。本發(fā)明的第5個主要側面是利用反應液用容器促進反應液的反應的反應促進裝 置，其提供了一種反應液用容器，其特征在于構成如下其在前述核酸擴增終止的部分的流 路狀孔的終端和其跟前的一處合起來兩處配置施加電泳電壓的電極，配置有與前述流路狀 孔的電極之間的部分交叉的新流路，該新流路的兩端設置開放端，在各個開放端上也配置 設置在電泳電壓的電極，以便進行核酸擴增，反應液到達流路的終端時，停止送液，電泳用 凝膠從前述新流路的開放端中流入，一直輸送直到其它開放端出現(xiàn)凝膠時停止，接著，在前 述流路的終端和其跟前的一處之間設置電壓，然后對前述新流路施加電壓。根據(jù)1個實施方式，前述光學測定裝置按如下方式構成具有夾著前述基板的珀 耳帖元件和透明部件，通過前述珀耳帖元件控制在對應于通過熱循環(huán)進行的核酸擴增反應 的溫度，促進反應液的核酸擴增反應，這樣光通過上述透明部件照射在反應液上，該裝置就 可以測定發(fā)生的光學變化。本發(fā)明的第6個主要側面，提供了一種反應容器，其特征在于，在具有平板部的 容器的平板部設置凹部，在凹部中裝入水溶液的反應液后通過密封凹部來密封反應液，使 平板部與設定在對應于反應必需的溫度的固體熱源相接觸，進行作為熱反應的核酸擴增反 應，在該反應容器中的凹部上端面上設置至少一個周狀的段差，通過使該周狀的段差部分 和密封部件下表面都呈疏水性，通過反應液的表面張力防止反應液進入密封部，設法穩(wěn)定 地進行核酸擴增反應。根據(jù)1個實施方式，前述核酸擴增反應是PCR(聚合酶鏈式反應)或LCR(連接酶 鏈式反應)等需要熱循環(huán)的核酸擴增反應。此時優(yōu)選核酸擴增反應為在乳液狀態(tài)進行的反應。根據(jù)另一個實施方式，前述核酸擴增反應是LAMP法等等溫核酸擴增反應。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，在反應用空隙中進行逆轉錄反應，接 著加熱到使逆轉錄酶失活的溫度使逆轉錄酶失活，進行核酸擴增。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，其具有旋轉中心，具有反應用空隙的 平板部位于圓周上，在跨相對于前述旋轉中心的半徑方向和圓周方向相互隔離 獨立地設置多個反應用空隙。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，前述容器具有旋轉中心，具有反應用空隙的平板部位于圓周上，在圓周狀平板部的整個面上配置反應用空隙。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，容器平板部的反應用空隙的至少一 側為10 400 μ m的膜狀。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，通過用遮光性材料修飾容器平板部， 或者用金屬膜包被反應用空隙的周圍壁面中的任意一種方法隔絕光對鄰接的反應用空隙 的影響。根據(jù)另一個實施方式，前述容器的特征在于，其具有使射入到容器平板部的反應用空隙的光反射的金屬膜。本發(fā)明的第7個主要側面，提供一種核酸擴增裝置，其特征在于，在使用前述反應容器進行熱循環(huán)反應的裝置中，存在使反應容器旋轉的構造，和對應于熱循環(huán)反應的多個 固體熱源，存在將前述固體熱源調(diào)節(jié)成對應于熱循環(huán)反應的多個溫度的控制裝置，至少一 側具有用作為前述熱源的區(qū)域從兩側壓住容器平板部的構造，通過控制從兩側壓住前述旋 轉構造和容器平板部的前述構造，重復使平板部依次接觸調(diào)節(jié)在熱循環(huán)必需的溫度的前述 熱源，將容器平板部內(nèi)的反應用空隙內(nèi)的反應液控制在熱反應必需的溫度和熱反應必需的 時間，從而伴隨目的熱循環(huán)進行核酸擴增。根據(jù)1個實施方式，前述核酸擴增裝置的特征在于，對前述固定熱源的幾個只進 行溫度過度設定控制，在升溫時比目標溫度高出下式表示的溫度差以上，冷卻時比目標溫
度低下式表示的溫度差以上Y = 5，000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a)Y =最
低過度設定溫度X =反應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)(所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表面和反應液之間所夾 的膜狀部分。)。根據(jù)另一個實施方式，前述核酸擴增裝置還具有測定反應用空隙的光學變化的光 學測定構造。根據(jù)另一個實施方式，前述核酸擴增裝置的特征在于，所述的從兩側壓住平板部 的區(qū)域中，前述區(qū)域是固體熱源和透明部件，前述生物化學的反應是核酸擴增反應，存在對 反應液照射光的發(fā)光部和測定發(fā)生的光學變化的受光部構成的光學測定裝置，通過上述透 明部件進行光學測定。本發(fā)明的第8個主要側面，提供包括前述容器和裝入了生物化學的反應用酶的反 應液的生物化學反應用試劑盒。本發(fā)明的第9個主要側面，提供一種反應促進裝置，其特征在于其是對容器中收 納的反應液提供預定的熱循環(huán)，促進PCR(聚合酶鏈式反應)或LCR(連接酶鏈式反應)等 熱循環(huán)反應的反應促進裝置，其具有通過在預定熱循環(huán)時間內(nèi)將前述容器中收納的反應液 溫度調(diào)節(jié)到高溫側的目標溫度和低溫側的目標溫度來提供前述熱循環(huán)的對向前述容器配 置的熱循環(huán)加熱器，和溫度控制部，該控制部以與前述預定循環(huán)時間相關對前述熱循環(huán)加 熱器進行溫度控制，使高溫側與前述高溫側的目標溫度偏離預定溫度差以上，和使低溫側 與前述低溫側的目標溫度偏離預定溫度差以下，前述偏離溫度控制成由下式表示的溫度差 以上Y = 5，000Χ3-900Χ2+50Χ+2. 8..........(a) Y =最低過度設定溫度X =反應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)。(所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表面和反應液之間所夾的膜狀部分。)。根據(jù)1個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于，其具有從表面和里面壓迫容 器平板部的裝置，該壓迫裝置構造的至少一側是固體熱源，前述平板部的反應用空隙的至 少一側形成厚度為10 400 μ m的膜狀傳熱面，使固體熱源與前述膜狀傳熱面對向并通過 前述壓迫裝置使之接觸來加熱，該促進裝置還具有控制壓迫裝置的結構以便穩(wěn)定地推進由 于反應用空隙的內(nèi)壓上升而膨脹的膜狀傳熱面與前述熱源的緊貼。根據(jù)另一個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于，為了向高速反應部加壓導 入反應液，前述容器中還具有帶開放端的加液用空隙，在反應用空隙和容器內(nèi)部通過送液 用溝狀空隙連結，在從加液用空隙的開放端加入反應液后，通過送液用溝狀空隙將反應液 輸送到反應用空隙后，用密封栓密封開放端，該裝置具有壓迫結構以便對密封栓施加壓力 的狀態(tài)下進行反應使得反應中前述密封栓不脫落。根據(jù)另一個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于前述固體熱源的至少一個具 有設定在熱啟動PCR或可以使逆轉錄酶失活的90°C以上的熱源中的至少一個。根據(jù)另一個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于，其還具有用于根據(jù)反應液 的光學變化讀取前述反應進行的好壞的光學檢測裝置。根據(jù)另一個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于還具有在進行核酸擴增反應 后，通過用于判斷反應進行是否適當?shù)倪B續(xù)電泳來分離核酸擴增產(chǎn)物的電泳用電源裝置。根據(jù)另一個實施方式，前述反應促進裝置的特征在于還具有用于控制輸送反應液 速度的送液控制裝置，該裝置是平板部內(nèi)的容納反應液的部分形成流路狀，用于進行在反 應液流動態(tài)同時進行核酸擴增的流動型核酸擴增反應的裝置。本發(fā)明的第10個主要側面提供了熱循環(huán)反應的促進方法，該方法是進行PCR(聚 合酶鏈式反應)或LCR (連接酶鏈式反應)等伴隨熱循環(huán)的核酸擴增反應的反應促進方法， 其特征在于在使用具有設定在對應于熱循環(huán)的預定溫度的特定溫度的多個固體熱源，具有 存在容納反應液的反應用空隙的平板部，反應用空隙的至少1個的平板部的表面使用形成 傳熱面的容器，向前述容器的反應用空隙加入反應液的工序，和只使之依次以循環(huán)數(shù)次數(shù) 重復接觸對應于熱循環(huán)的預定溫度的前述固體熱源的工序的反應中，存在前述特定的溫度 被過度設定為在升溫時比目標溫度高出下式表示的溫度差以上，冷卻時比目標溫度低下式
表示的溫度差以上的熱源Y = 5，000Χ3-900Χ2+50Χ+2. 8..........(a) Y =最低
過度設定溫度X =反應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)(所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表面和反應液之間所夾 的膜狀部分。)。根據(jù)1個實施方式，前述方法的特征在于為了確保反應的高速性，使用Takara的 Z-Taq或東洋紡的KOD-Dash等100堿基/秒以上的聚合酶。根據(jù)另一個實施方式，前述方法的特征在于在核酸類型的擴增對象為RNA時，該 方法具有以下工序，即，使之依次接觸設定在為了變換成可以擴增的DNA的逆轉錄溫度的 固定熱源的工序，和接著使之接觸設定在使逆轉錄酶失活的溫度的固定熱源的工序，以及 然后接觸溫度設定在熱循環(huán)用的固定熱源的工序。
根據(jù)另一個實施方式，前述方法的特征在于，其具有為了確認核酸擴增的進行狀 態(tài)，伴隨前述熱循環(huán)的進行，進行多個光學測定，確認核酸擴增的進行狀態(tài)的工序。根據(jù)另一個實施方式，前述方法的特征在于，該方法具有為了確認核酸擴增正常 進行，在前述核酸擴增反應后，在反應液的溫度慢慢上升的同時通過讀取前述反應液的光 學變化，鑒定核酸擴增產(chǎn)物的工序。根據(jù)另一個實施方式，前述方法的特征在于在前述核酸擴增反應后進行電泳。根據(jù)另一個實施方式，前述方法的特征在于前述核酸擴增反應是乳液PCR反應。根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的前述傳熱面形成厚度為10 400 μ m的膜 狀。
根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的特征在于，為了避免與反應用空隙的光學 干涉，該容器由遮光性材料構成、或用黑色或金屬皮膜對前述反應用空隙的內(nèi)壁進行遮光， 前述反應用空隙不與周圍的反應用空隙發(fā)生光學干涉。根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的特征在于，為了提高前述光學靈敏度，在前 述平板部的任意一側設置金屬反射膜，使激發(fā)光的光路長度為往返2倍。根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的特征在于，前述反應用空隙部分設計為反 應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)為0. 001 0. 2。根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的特征在于，向按以下方式形成的凹部滴下 填充反應液后，用10 400 μ m的膜密封，形成彼此獨立的多個封閉的反應空隙通過在容 器的平板部上預先形成凹部，或在容器平板部預先開連通孔，再用膜密封其一側的開口部 進行密封的方法。此時，前述反應容器優(yōu)選，前述凹部的外周壁面上設置至少一個圓周狀的 段差，其段差部分為疏水性。而且此時，前述反應容器優(yōu)選具有旋轉中心，前述彼此獨立的20 200個封閉的 反應空隙以圓周狀分布在整個容器平板部上。根據(jù)另一個實施方式，前述反應容器的特征在于，前述平板部還具有有開放端的 加液用空隙，在前述反應用空隙和容器內(nèi)部通過送液用溝狀空隙連結，在向該加液用空隙 加入反應液后，通過送液用溝狀空隙向反應用空隙輸送反應液。此時優(yōu)選，前述反應用空隙 再通過大氣釋放用溝狀空隙與大氣開放口相連，前述容器中還有密封用空隙，在容器的內(nèi) 部，前述的送液用溝狀空隙與大氣釋放用溝狀空隙相連，反應液由前述加液用空隙出發(fā)通 過送液用溝狀空隙輸送到反應用空隙后，從密封用空隙中輸送出密封液，密封前述送液用 溝狀空隙和大氣釋放用溝狀空隙。而且，此時優(yōu)選，前述密封液為含有硅潤滑油的潤滑油狀 高粘度液、或UV硬化性樹脂或熱硬化性樹脂。本發(fā)明的第10個主要側面，提供一種在前述反應促進裝置中使用的試劑盒，其含 有具有容納含有聚合酶或連接酶的反應液的平板部的容器的試劑盒。本發(fā)明的第11個主要側面，提供一種反應促進裝置，其特征在于該裝置是在具有 容納反應液的反應部的容器中，給該反應液提供預定的熱循環(huán)的用于促進PCR(聚合酶鏈 式反應)或LCR(連接酶鏈式反應)等熱循環(huán)反應的反應促進裝置，該裝置有對向前述容器 的反應部配置的熱循環(huán)加熱器和溫度控制部，所述熱循環(huán)加熱器通過在預定熱循環(huán)時間內(nèi) 將前述容器中容納的反應液的溫度調(diào)節(jié)在高溫側的目標溫度，中溫的目標溫度和低溫側的 目標溫度來提供前述熱循環(huán)，所述控制部將前述熱循環(huán)加熱器的溫度控制在使高溫側與前述高溫側的目標溫度偏離預定溫度差以上，并使低溫側與前述低溫側的目標溫度偏離預定 溫度差以下。 而且，根據(jù)1個實施方式，提供了一種反應促進裝置，其特征在于其將前述偏離溫
度控制在下式Y = 5, 000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a)X =反應液的深度
(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)(所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表 面和反應液之間所夾的膜狀部分)表示的溫度差以上。根據(jù)另一個實施方式，前述熱循環(huán)加熱器具有高溫部、中溫部、低溫部，還具有通 過使該熱循環(huán)加熱器與前述容器的相對位置移位，給前述反應部中容納的反應液提供預定 的熱循環(huán)的驅(qū)動部，使該驅(qū)動部與前述預定的熱循環(huán)時間相關地控制前述容器和前述加熱 器的對向時間。此外，根據(jù)另一個實施方式，前述高溫部、中溫部、低溫部在圓周方向配置，前述驅(qū) 動部驅(qū)動容器或加熱器以使得前述容器和前述加熱器的相對位置在旋轉圓周方向移位。根據(jù)另一個實施方式，前述驅(qū)動部在使前述熱循環(huán)加熱器與反應容器相互接觸的 狀態(tài)下使它們間歇地相對移位，使上述容器中容納的反應液在前述熱循環(huán)加熱器的高溫 部、中溫部、低溫部中分別停留預定時間。根據(jù)另一個實施方式，前述控制部通過調(diào)整前述容器上的多個反應部相對移動到 對向前述低溫部的速度，和從低溫部移動到中溫部的速度和從中溫部出來的速度，使與至 少施加在前述反應部的低溫和中溫相關的熱過程固定。根據(jù)另一個實施方式，前述驅(qū)動部使前述熱循環(huán)加熱器與反應容器在相互接觸的 狀態(tài)下連續(xù)地相對移位。根據(jù)另一個實施方式，前述高溫部、中溫部、低溫部沿直線方向配置，前述驅(qū)動部 驅(qū)動容器或加熱器使得前述容器與前述加熱器的相對位置在直線方向移位。根據(jù)另一個實施方式，前述控制部進行驅(qū)動使得在使前述熱循環(huán)加熱器和反應容 器移位時，使上述循環(huán)加熱器與反應容器分離，并在分離的狀態(tài)移位后，使上述循環(huán)加熱器 與反應容器相接觸。根據(jù)另一個實施方式，該裝置還具有用于根據(jù)反應液的光學變化讀取前述反應進 行的好壞的光學檢測裝置，前述容器為了防止多個反應液的光學干涉，至少一部分用遮光 性材料形成，或被遮光著色。根據(jù)另一個實施方式，一種反應促進裝置，其特征在于在權利要求10所述的反應 促進裝置中，前述容器中使用光學透明的壓迫部件作為壓迫該容器的部件，通過該透明的 壓迫部件進行光學測定。根據(jù)另一個實施方式，提供一種反應促進裝置，其特征在于具有從表面和里面壓 迫容器平板部的裝置，該壓迫裝置結構的至少一側是固體熱源，前述平板部的反應部的至 少一側形成厚度為10 400 μ m的膜狀傳熱面，使前述固體熱源與前述膜狀傳熱對向，并通 過前述壓迫裝置使之接觸來加熱，膜狀傳熱面由于前述反應部的內(nèi)壓上升而膨脹，從而確 保前述容器與前述熱源的穩(wěn)定的接觸。根據(jù)另一個實施方式，前述容器是具有平板部，該平板部中設有凹部，向該凹部中 加入水溶液的反應液后，通過密封該凹部密封反應液，通過使設定在對應于反應必需的溫 度的溫度的固體熱源與前述平板部接觸，進行作為熱反應的核酸擴增反應的反應容器，前述凹部上端面設置有至少一個圓周狀的段差，通過使該圓周狀的段差部分和密封部件下面 為均為疏水性，從而進行穩(wěn)定的核酸擴增反應。根據(jù)另一個實施方式，為了向反應部中加壓導入反應液，前述容器還有具有開放 端的加液用空隙，在前述反應部和容器內(nèi)部中以送液用溝狀空隙相連結，從加液用空隙的 開放端加入反應液后，通過送液用溝狀空隙將反應液輸送到反應用空隙后，再用密封栓密 封開放端，該容器具有壓迫結構以便對密封栓施加壓力的狀態(tài)下進行反應使得反應中前述 密封栓不脫落。根據(jù)另一個實施方式，前述密封栓在該密封栓側面部的中位部到下位部中有空氣溝。根據(jù)另一個實施方式，前述容器中設置有與前述反應部相連的大氣開放用溝狀空 隙，和用于倒入密封用液的充滿了密封液的密封液用空隙，連結密封液用空隙和前述大氣 開放用溝狀空隙以及前述加液用空隙的溝狀空隙，其被構成為在從前述加液用空隙向反應 用空隙輸送反應液后，通過從加入密封液的空隙輸送密封液，在反應用空隙的加液用空隙 側的溝狀空隙和大氣開放側的溝狀空隙兩者中加入密封液。根據(jù)另一個實施方式，前述密封液由含有硅潤滑油的潤滑油狀高粘度液或UV硬 化性樹脂或熱硬化性樹脂構成。根據(jù)另一個實施方式是平板部內(nèi)的容納反應液的部分形成流路狀，用于進行反應 液一邊流一邊進行核酸擴增的流動型核酸擴增反應的裝置，為了控制輸送反應液的速度還 有送液控制裝置。用于實施發(fā)明的最佳方式以下，參照附圖對本發(fā)明的一個實施方式進行說明。如前所述，為了進行市場上所需要的5分鐘以內(nèi)的高速核酸擴增，需要對熱源的 種類·容器的形狀·裝置的控制·使用的酶等與PCR相關的所有要素進行綜合改良。(本 發(fā)明中改良的基本技術事項)那么，首先以PCR為例，為高速而穩(wěn)定實施的必要技術要素列 舉如下。a.盡量縮短為了升降熱源溫度所需要的時間...高速化b.盡量縮短熱源的溫度 升降和反應液的溫度升降的延遲...高速化b-Ι.確保熱源與反應容器的接觸...穩(wěn)定化 b-2.為了確保由容器表面向反應液的熱傳導而減小容器表面層的厚度，為了確保反應液內(nèi) 的熱傳導而減小液體的厚度...高速化b-3.用于加速反應液內(nèi)的熱傳導的控制...高速 化(固體熱源·靜止型的采用)有關項目a，本發(fā)明采用固體熱源·靜止型，準備設定在對 應于各溫度的設定溫度的不同的多個固體熱源，使反應容器相對移動，給反應液提供熱循 環(huán)。由此，觀察到熱源自身的升溫或冷卻的時間為0，只是向反應容器內(nèi)的反應液傳熱所需 要的時間為反應液的溫度升降所必需的時間。圖4為表示本發(fā)明的第1個實施方式的反應促進裝置的整體概括的側面圖。圖4中，參照符號10表示固體熱源、11表示反應容器。反應容器11，如圖6所示， 從上面看時為圓盤狀，圖中12表示的部分為裝滿反應液的反應槽。而且，前述固體熱源10， 如圖7所示的那樣，由按對應于該反應容器11的形狀的方式形成扇形狀的、分別設定在低 溫、中間溫度和高溫的3個不同的區(qū)域IOa IOc構成，這樣構成使得通過使前述反應容器 11與之相對旋轉，給反應槽12內(nèi)的反應液提供熱循環(huán)?；氐綀D4，前述固體熱源10按以下方式配置用上側的熱源10'和下側的熱源10"夾著前述反應容器11。上側的熱源10'通過設置在上蓋13上的上側框架14上的彈簧15和放熱區(qū)域16來保持，下側的熱源10"通過主體側17的框架18上相同的彈簧19和 放熱區(qū)域20來保持。該熱源10，從控制的容易性或正確性上考慮，在該實施方式中采用珀 耳帖元件。鉸鏈部件21連接上蓋13和主體17，如圖5所示，通過該鉸鏈部件21，上蓋13可以對著主體17開閉，通過打開上蓋13，可以使得前述反應容器11開放。另一方面，如圖4 所示，前述主體框架18上的用于旋轉驅(qū)動反應容器11的主發(fā)動機22以在旋轉軸22a向上 方延伸出的狀態(tài)保持，在上述旋轉軸22a的上端上設置有用于保持上述反應容器11的保持 平臺23。在該保持平臺23上以位置指定的狀態(tài)設置反應容器11，合上上蓋13，這樣可以使 得上述上側和下側的放熱區(qū)域10'、10"能夠夾著反應容器11的周邊部。而且，使反應容器11的中央部分通過前述保持平臺23和設置在上蓋框架14上的上側保持區(qū)域24來保持。該上側保持區(qū)域24具有用于壓住容器中心部的第一面24a，和高 于該面形成的后述用于壓住密封栓的第二面24b。該保持區(qū)域24通過上述上側框架14上 的彈簧26來保持，這樣構成使得上述反應容器11可以彈性地擠壓著上述保持平臺23。而且，該裝置在上述主體框架18上具有用于測定反應的反應液的反應的熒光測定裝置27。該熒光測定裝置27是通過向反應容器11內(nèi)的反應液照射激發(fā)熒光再測定其反 射光來檢測反應液中發(fā)生的反應的裝置。該熒光測定裝置27保持在移動平臺28上，在上 述反應容器的半徑方向上可以進行位置指定的驅(qū)動。而且，該裝置在上述主體17內(nèi)配備有加熱器溫度控制部29，和旋轉發(fā)動機控制部 30，以及熒光測定裝置控制部31和電源32。以下，對該裝置的詳細構成與其運作一起進行說明。(反應容器)首先，參照圖6 和圖8 圖10，對上述反應容器11進行詳細的說明。如圖6所示，該反應容器11中，在跨圓周方向120度的范圍內(nèi)相互間隔約25度分 開設置的4個反應槽12。在對應于各反應槽12的反應容器的中心部側上設置有用于將反 應液輸送到前述各反應槽12的送液孔33。該反應槽12和送液孔33通過送液通路34和大 氣釋放通路35連接。圖8A、8B表示上述反應槽12中的1個反應槽，和與之對應的部位的截面。該反應 容器11由聚碳酸酯制的主體基板37和層積在該基板37的上表面上的相同的聚碳酸酯制 的閉塞板38，和粘貼在下面的厚度為200 μ m的伸縮性膜部件39構成。上述反應槽12和 送液孔33按貫通前述主體基板37的方式形成，分別形成上述送液通路34作為主體基板 37的里面?zhèn)戎猩鲜錾疃葹?00 μ m的溝，形成大氣開放通路35作為上面?zhèn)戎猩疃葹镮OOym 的溝。而且，通過用閉塞板38和伸縮性膜39分別覆蓋前述上面和下面，分別劃分成反應槽 12、送液孔33。一方面，構成上述送液孔33的部分的上面構成為向上方突出的突起部33a， 使得上述大氣開放通路35與該突出的部分33a連通。之所以形成這種結構，是為了，在圖 中40所示的密閉栓排出反應容器11內(nèi)部的空氣的同時從送液孔33通過送液通路34將反 應液輸送到反應槽12，通過大氣釋放通路35排出上述反應槽12內(nèi)的空氣。下面，參照圖9A C，對送液、排出空氣、密閉的流程進行說明。首先，如圖9A所示，在送液孔33中加入了反應液的狀態(tài)下，在主體側的保持平臺 23上設置反應容器11。此時，密閉栓40在送液孔33內(nèi)插入前端，通過密閉栓40的排空氣通路40a，以前述容器11的大氣連通孔向大氣開放的狀態(tài)來供給。此時，上蓋13如圖5所 示那樣開放，上述反應容器11可以設置在主體側上。接下來，如果蓋上上蓋13，如圖9B所示，密閉栓40通過上側保持區(qū)域24向反應容 器11的送液孔33內(nèi)壓入。對該狀態(tài)進行擴大表示的圖為圖8B。供給到送液孔33內(nèi)的反 應液通過送液通路34移動到反應槽12，反應液在該反應槽12內(nèi)逐步填滿(箭頭(I))。此 時，反應空隙的空氣通過在上部閉塞板38和基板37之間形成的大氣釋放通路35，導出到前 述送液孔33內(nèi)(箭頭(II))，通過前述密閉栓40的排空氣通路40a，逸出到大氣中(箭頭 (III))。如圖9C所示，如果上蓋13完全蓋上，密閉栓40通過設置在前述保持區(qū)域24上的 彈簧26的復原力進一步下降，前述密閉栓40的空氣逸出溝40a埋沒在送液孔33內(nèi)，這之 后空氣就逸不出了。然后，進而隨著密閉栓40完全被壓入，送液通路34和反應槽12內(nèi)呈 適度加壓狀態(tài)、即較大氣壓加壓的狀態(tài)。
而且，此時，由于該密閉栓40壓著前述保持區(qū)域24的第二面24b上，第一面24a上 壓在反應容器11的上面，因此該反應容器11包括上述密閉栓40，處于完全被把持的狀態(tài)。 由此，可以旋轉驅(qū)動該反應容器11，同時防止密閉栓40在這種旋轉中脫落。這樣一來，通過在反應槽12內(nèi)充滿反應液且對該反應槽12內(nèi)加壓，本發(fā)明中，上 述反應槽12內(nèi)反應液的加熱效率提高。圖10中表示了這種原理。該反應容器11的第一研究在于，通過用上下的熱源10'、10〃夾著上述反應槽12 的部分，傳熱效率提高。尤其是，封閉該反應槽12的上下面中兩者或任意一者變成薄片，該 薄片部件各自作為傳熱面。在該實施方式中，在上下設置固體熱源10'、10"，形成使得這 些熱源壓迫反應容器11的結構，但固體熱源可以在兩側也可以在一側，關鍵在于熱源可以 對向接觸傳熱面接觸反應液。在此例中，傳熱面設定于存留反應液的下面?zhèn)?，但構成該傳?面的部件要薄。如果過薄，就有在反應中破損的危險，因此需要有10 μ m的最低厚度。如果 比400 μ m厚的話，熱傳導效率降低，就無法期待高速化。因此，該傳熱面的厚度為ΙΟμπι 400μπι，優(yōu)選50μπι 300μπκ最優(yōu)選150μπι左右。而且，考慮到向反應液的傳熱，為了不 擴大每單位傳熱面積的液體的熱容量，反應槽12內(nèi)反應液的液深度優(yōu)選在Imm以下，合適 的是500 μ m左右。此外，在本發(fā)明中，為了提高熱傳導效率，用伸縮性膜39構成上述傳熱面，處理 中，通過使反應槽12至高于大氣壓的高壓，在熱源10"側使該膜39膨脹，這樣構成使得與 該熱源10的密接性提高。這一點下面將作更詳細的說明。(接觸穩(wěn)定性的確保)也就是 說，為了實現(xiàn)PCR的高速化，在至30個循環(huán)和移動中，必須維持固體熱源10與容器11的反 應槽12部分的確實的接觸。因此，本技術這樣的，在通過固體熱源10和反應容器11進行 的反應中，其接觸的穩(wěn)定性成為重要的因素。通常，為此而壓接容器11和固體熱源10。但是，由于容器11和固體熱源10均為 固體，因此表面的一點點凹凸都會妨礙，產(chǎn)生少許間隙。這樣，熱傳導率極低的空氣就會介 入，而極大阻礙兩者的熱傳導穩(wěn)定性。即，由于經(jīng)過30個循環(huán)以上，多數(shù)的反應槽經(jīng)歷相同 的熱過程，因此只通過通常的平面的壓接，基本無法期待能使二者完全密接。這種接觸確保 對于像本方法這樣的使用固體熱源和固體容器的生物化學的反應，是一項決定性的重要技 術。
而且，在診斷用途中，為了保證結果的確實性，可以同時檢查如果沒有檢查目的物 則為沒有檢測到(陰性對照)，和用于了解即使沒有檢查目的物，檢查仍正常地進行(陽性 對照)。也就是說，在檢查1個試樣的1個項目時，一個項目進行3個檢查。而且，對試樣一 次進行多項檢查的需求也很大。因此，在平板部配置多個反應空隙時，這些反應部的傳熱面 自身多少產(chǎn)生凹凸，由于這種凹凸競爭，實際上產(chǎn)生了接觸的反應部和不接觸的反應部。與之相對，本發(fā)明中，通過提高反應槽12內(nèi)部的壓力，封閉部件為伸縮性膜39，該 膜39由于內(nèi)部壓力而向外側方向膨脹，從而可以使得多個反應槽的膜39穩(wěn)定地與固體熱 源10相接觸。在本發(fā)明的預備研究階段，將氟樹脂膜、厚度為0. 5mm和0. Imm的聚碳酸酯 膜這3種作為前述伸縮性膜39，固定熱循環(huán)條件，進行實驗。其結果是，在使用0. 5mm的聚 碳酸酯膜時，8個反應槽12中，3個沒有進行反應，而在氟樹脂膜和0. Imm的聚碳酸酯膜中， 在所有的反應槽12中可以確認良好的反應。
由以上內(nèi)容清楚了，為了所有的反應槽12中實現(xiàn)容器11中形成的多個反應槽12 與固體熱源10的均一穩(wěn)定的接觸，穩(wěn)定地進行核酸擴增反應，反應空隙的傳熱面由又薄又 軟具有伸縮性的膜狀封閉部件(在該實施方式中為伸縮性膜39)提供，通過反應槽12內(nèi)壓 至少在反應時達到高于大氣壓的條件，從而能夠確保反應的穩(wěn)定性。也就是說，通常，由于容器基板11本身硬，而且在平面度上有問題，因此通過存在 于其上的多個反應槽12的容器封閉部件(伸縮膜39)膨脹，具有使相互的接觸力以封閉膜 39的變形量自動地沿著固體熱源10使得可以接觸所有的反應槽12這樣的效果。該實施方式中，其它材料的伸縮性膜39粘合在容器11的基板37上，但并不限于 此?？梢允牵词古c基板37為相同材料，可以通過將其厚度變薄，而保持其伸縮性的封閉部 件。而且，伸縮性膜可以選自于烯烴類樹脂、聚酯類樹脂、聚氨酯樹脂、硅類樹脂或氟類樹脂 等，其中，從柔軟度和強度的觀點來看，最優(yōu)選氟類樹脂。具備伸縮性膜39的反應容器11的制造法有如下的各種方法。例如，有如下這種 實施方式，即在具有反應槽12的容器基板11上貼上伸縮性膜39的方法。而且，還有如下 方法，即用可以期待變薄和伸縮性的材料形成容器基板37，通過一體成型形成前述伸縮性 膜39的方法。而且，在該實施方式中，通過使反應槽12內(nèi)的壓力高于大氣壓，確保前述伸縮性 膜與固體熱源的接觸，但使反應槽12內(nèi)高壓的方法不限于該實施方式。也就是說，該實施 方式中，通過使用密閉栓40和送液通路34實現(xiàn)高壓，但并不限于此。不具有送液通路等的 容器11，具有獨立的反應槽，常溫·常壓下加入反應液后，通過用表面封閉部件簡單密封各 個反應槽來就可以實現(xiàn)。這是因為，核酸擴增反應整個過程都高于常溫，反應空隙的液體或 氣體受熱膨脹，因此可以確保與固定熱源的接觸。本發(fā)明人為了更為確實，進行了以下方法。即，在向容器11中加入反應液時，通過 容器下面減壓，使下面的閉塞膜39向下側突出，加入反應液，再粘著上面?zhèn)鹊姆忾]部件后， 再停止減壓。通過該方法制成的反應容器11由于在提供給反應前開始，反應槽12的內(nèi)壓 就超過大氣壓，因此熱反應中進行了更為確實的反應穩(wěn)定化。(熱源溫度控制的研究)在 該實施方式中，除了上述反應容器11的形狀等相關改良，還進行了熱源溫度控制方法的改 良，因此在說明該裝置的運作前，就其原理先進行說明。在以前的專利或文獻中提及容器底面的厚度或反應液的深度的例子很多。但是，僅僅依賴于這種厚度或深度，熱循環(huán)的高速化還是有限。因此，本發(fā)明人，返回到傳熱的根 本，著眼于熱源與被加熱部件的溫度差，對高速化進行了研究。也就是說，現(xiàn)有技術都是將熱源的設定溫度設定在正好反應液的加熱目的溫度或 其附近，進行加熱，但本發(fā)明中，通過在升溫時，以比目標溫度高溫側只偏離預定溫度的方 式設定熱源溫度，冷卻時以比目標溫度低溫側只偏離預定溫度的方式設定，從而給反應液 提供熱循環(huán)，發(fā)現(xiàn)可以大幅縮短時間。將此模式化示于圖11。也就是說，如果熱循環(huán)時間縮短，低溫側熱源IOa和高溫側熱源IOc之間的熱能差 不變大，就會進行高速的升溫和降溫。在該圖中，高溫側熱源IOc的設定溫度THl比反應液 高溫側目標溫度THO只高出預定的偏離溫度分δ th，低溫側熱源IOa的設定溫度TLl比反 應液低溫側目標溫度TLO只低預定的偏離溫度分5tl。然后，通過使之在熱循環(huán)時間內(nèi)傳 動，使前述容器11進行1次循環(huán)，實現(xiàn)圖中43所示的這種溫度推移。通過傳熱相關數(shù)值計算來分析該偏離溫度δ th、δ tl要進行何種設定，即在臨床 領域理想的在5分鐘以內(nèi)可以進行核酸擴增的偏離溫度的設定。這樣所獲得的，容器傳熱面的厚度X反應液深度與必需的最低過度設定溫度之 間的關系示于圖12。對這樣獲得的結果，對于30個循環(huán)5分鐘這樣的結果，制成近似式，獲 得了以下結果。Y = 5，000X3-900X2+50X+2. 8 ..........(a) Y =最低過度設定溫度 X
=反應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)。所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表面和反應液之間所夾的 膜狀部分。該式通過以下方式求得?！睬疤帷臣俣ǎ琓i°C的熱源中，IVC下通過單位面積為Icm2的厚度為Lpcm的樹脂 膜，有厚度為Llcm的PCR反應液。每單位cm2的通過熱量Q通常用下式表示。Q=A /Lp* (Ti-To)其中、移動熱量 Q :cal/sec 熱傳導率 λ :cal/cm · sec · °C樹 脂膜厚Lp:cm反應液(水、液體)的熱傳導率為PC或ABS樹脂的熱傳導率的數(shù)倍，而且由 于液體有流動性，呈薄膜狀，因此假定通過樹脂壁傳遞的熱直接用于液體的升溫。微小時間 St秒中通過的熱量為δ Qlcal。δ Ql =入/14)*(11-110)*5 0欠的比熱和比重為1，升溫為(111 = (101/115 02 = X/Lp*(Ti-To+dTl) St 為了通過數(shù)值計算進行傳熱，SQn= λ/Lp X (Ti-(Το-Σ dTl
η)) X δ t · · (b) δ Tn = δ Qn/Ll.....................(c)采用
該(b) (c)式的數(shù)值計算結果中，加進機械的空閑時間，根據(jù)與30個循環(huán)必需的時間(反應 液的深度X容器傳熱面的厚度)的關系，得到所需要的過度設定溫度的圖，示于圖12。用 黑圓點表示(λ使用樹脂中熱傳導率較高的硅樹脂的0.001cal/cm*sec*°C)圖4的5分 鐘的計算結果，用白圓點表示近似式的計算結果。根據(jù)以上內(nèi)容，作為加速項目b_3的熱傳導的控制，用毫米表示的液深度乘以傳 熱面的封閉部件厚度的值作為X，對應于熱循環(huán)時間，將其代入(a)式中獲得的溫度，可以 進行使熱源溫度偏離該溫度以上的高速反應。這里，對X的值沒有限制，優(yōu)選為0.001 0. 2。更優(yōu)選為0. 01 0. 15。
下面描述具體設定的例子。通常的PCR中需要高溫95°C、低溫55°C、中間溫度 75°C左右。此時，按照上述(a)式的值以上這種意思，根據(jù)熱循環(huán)時間設定為3 30°C左右 的偏離溫度。這里，在偏離設定溫度差S th、δ tl設為15°C的例子中，設定在THl =IlO0C, TLl :40°C、TMl :75°C，使之依次接觸各個固定熱源IOa 10c，重復進行30 40個這樣的 循環(huán)。由于向各熱源IOa IOc的移動需要的時間有0.6秒左右，因此在300bp左右時，在 各熱源上的停止時間為TH 0秒、TL 0. 5秒、TM 3秒左右。這樣大概2分半左右就完成了 擴增。這樣一來，即使在臨床急救領域，也可以實現(xiàn)足夠的快速。(向各溫度熱源的移動速度)此外，本發(fā)明人還對向各溫度熱源的移動速度反復 進行了研究。圖40是表示需要這種研究的模式圖。在該圖中，如上所述，低溫側固定熱源IOa 高溫側固定熱源IOc沿圓周方向配 置，設法使得上述圓形的反應容器11與這些固定熱源IOa IOc相接觸地進行旋轉。在這 種結構中，容器11從固體熱源的高溫側固定熱源IOc向低溫側固定熱源IOa移動，由低溫 側固定熱源IOa向中溫側固定熱源IOb移動、從中溫側固定熱源IOb向高溫側固定熱源IOc 移動時，由于該反應容器11旋轉，容器11在移動前的熱源中獲得的熱量對移動前方的固體 熱源IOa IOc造成影響，進而會對容器11的溫度均一性造成影響。具體而言，例如，如箭頭I所示，被高溫側固定熱源IOc加熱的容器11的部分靠近 低溫側固定熱源IOa時，容器11的熱量被快速吸收到低溫側固定熱源10a，低溫側固定熱 源IOa的溫度降低。于是，進而，如箭頭II所示的那樣，在該容器11的部分到達低溫側固 定熱源IOa的前端部時，出現(xiàn)比當初高溫下加熱的溫度降低的狀態(tài)。其結果，容器11所具 有的熱量導致的低溫側固定熱源IOa前端部的溫度上升，但比低溫側固定熱源IOa的后部 的溫度上升小，如圖40所示，低溫側固定熱源IOa前端部(43°C)和后部(46°C )之間產(chǎn)生 溫度差，隨之，容器的反應孔受到的冷卻速度上也會產(chǎn)生差異。也就是說，由于熱源自身受到溫度控制，這種溫度差隨時間解除，但在利用動態(tài)的 熱移動態(tài)超高速PCR裝置中，擔心這種微小的熱源溫度差會引起多個孔的反應結果上產(chǎn)生 差異。該現(xiàn)象是接觸旋轉式超高速PCR特有的問題，是為了確保各反應孔中PCR反應等的 穩(wěn)定性而應當避免的重要問題。有關這種熱源的溫度差，通常的熱循環(huán)PCR裝置中，通過將各熱源溫度設定在目 標溫度，而且使之與設定溫度的熱源長時間接觸，使所有的反應孔即使多少存在時間差，也 會由于處于相同的溫度，因此不會成為問題。然而，本實施方式涉及的超高速PCR中，為了使溫度快速升降，熱源設定溫度設定 在比目標溫度過度加熱或冷卻的溫度(偏離溫度)，由于是利用動態(tài)的熱移動的方式，因此 擔心使之預先停止在熱源上，延長時間，反應孔的溫度就會超過目標溫度，直至變化到熱源 設定溫度(目標溫度+偏離溫度)。作為這種例子，向各熱源的移動時間固定在0. 8秒，將低溫側固定熱源IOa與高溫側固定熱源IOc之間設定偏離溫度的實驗例示于圖41A和41B。圖41A表示各熱源的溫度 設定以及向各熱源的移動時間。如該圖所示，由于各熱源間的移動速度(時間)固定，因此 低溫側固定熱源IOa和高溫側固定熱源IOc都會受到動態(tài)的熱移動的影響。因此，如圖41B 所示，在表示通過這種結構獲得的溫度控制的結果的圖中，在旋轉方向后端側和前端側，產(chǎn) 生低溫谷底(50°C以上)與高溫峰點(90°C以上)之間的溫度差。
而且，該圖中所示的線(III)和(IV)分別表示，在容器11停止在特定的固定熱源 時，位于旋轉方向后端側的反應槽12(111)和位于旋轉方向前端側的反應槽12 (IV)的溫度 曲線(縱軸為溫度、橫軸為經(jīng)過時間)。因此，為了解決該問題，本發(fā)明人做了以下這樣的研究。即認為，考慮到動態(tài)熱移動，如果各孔與低溫側固定熱源IOa接觸的時間改變，可以使得容器11的各部分(反應槽 12)受到的熱量相同。如果容器11勻速移動，一旦停止，勻速移動到下個熱源，由于各反應槽12配置在 相同的容器11上，因此只在相同的時間接觸熱源。因此，如果熱源上存在動態(tài)溫度差，就不 可避免各反應槽12受到的熱量對熱源的動態(tài)溫度差的影響。因此，本發(fā)明人為了改變存在于相同容器11上的各個反應槽12與特定的熱源接 觸的時間，改變?nèi)萜?1的特定的部分進入該熱源的速度和出熱源的速度。參照圖42A和42B對這個例子進行說明。在該例中，低溫側固定熱源IOa 高溫側固定熱源IOc的溫度設定和容器11在該 熱源的停止時間、在熱源間的移動時間如圖42A的表格所示設定。也就是說，首先，由于將 高溫側的目標反應溫度設定在90°C以上，因此將高溫側固定熱源IOc的溫度設定在110°C， 比目標溫度偏離20°C。此外，該高溫側固定熱源IOc的停止時間設定為0. 7秒，將由中溫側 固定熱源IOb向該高溫側固定熱源IOc的移動的移動時間設定為0. 8秒。而且，由于將低溫側的目標反應溫度設定在50°C，因此將該低溫側固定熱源IOa 的溫度設定在43°C，比目標溫度低7°C偏離。并且，將在該低溫側固定熱源IOa的停止時間 設定為2. 80秒，將由高溫側固定熱源IOc向該低溫側固定熱源IOa移動的移動時間設定為 1.0 秒。另一方面，對于中溫側固定熱源10b，不設定溫度偏離，停止時間設為2. 90秒，由 低溫側固定熱源IOa向該中溫側固定熱源IOb的移動時間設為0. 90秒。也就是說，使移動速度改變，使得相對于由中溫側固定熱源IOb向高溫側固定熱 源IOc的移動時間為0. 8秒，由高溫側固定熱源IOc向低溫側固定熱源IOa的移動設定得 長0. 2秒，為1. 0秒，由低溫側固定熱源IOa向中溫側固定熱源IOb的移動設定得長0. 1秒， 為0. 9秒。由此，通過這種實施方式，使得上述這種溫度差消除或減少到最小。圖42B表示這種構成形成的溫度控制的結果。該圖中所示的線(V)和(VI)分別表示，在容器11停止在特定的固定熱源時，位于 旋轉方向后端側的反應槽12 (V)和位于旋轉方向前端側的反應槽12(IV)的溫度曲線(縱 軸為溫度、橫軸為經(jīng)過時間)。如該圖所示，盡管在低溫側將偏離溫度設定在7°C，但2個反應槽12都達到50°C 這樣相同的低谷溫度。而且，在中溫下，2個反應槽12的溫度都被控制在75°C。另一方面， 盡管在高溫側，相對于目標溫度90度以上，2個反應槽12間產(chǎn)生溫度差，但高溫為通過熱量 使雙鏈DNA解離的反應，即使在90°C以上在溫度上有差異，也不會造成反應上的問題。該實 施方式中，通過利用這種方式，設定低溫和中溫都達到設定溫度的移動時間。也就是說，一般而言，如果關注于各熱源中存在溫度差，改變移動速度，由于是相 同容器上的反應槽，因此即使改變一個反應槽相對于熱源的移動時間，這種改變對于其他 部分也是一樣的。也就是說，考慮到第1個和第2個熱源的動態(tài)熱移動的各自的影響，可以通過速度調(diào)節(jié)來消除，但無法進行避免第3個的相同影響的設定。但是，PCR必需的3個溫 度中，低溫和中溫必需是在固定的溫度，但高溫為通過熱量使雙鏈DNA解離的反應，如果在 900C以上即使在溫度上有差異，也不會有問題。而且，即使熱源的動態(tài)溫度有變化，使各反應孔的熱過程同等的方法，可以通過定速連續(xù)旋轉容器這樣的方法來實現(xiàn)。(酶速度)以上的為了使得核酸擴增高速化是本發(fā)明的主旨，但也應該注意其它 方面。尤其是，要明記的是堿基延伸在上述中間溫度發(fā)生，在熱循環(huán)設定在高速時，如果使 用的聚合酶的堿基延伸能力不充分，也會有不進行目的擴增的情況。PCR中廣泛使用的Taq 具有50堿基/秒左右的能力，在5分鐘以內(nèi)的高速PCR中會有不充分的情況。因此，優(yōu)選 使用Takara的Z-Taq或東洋紡的KOD-Dash等100堿基/秒以上的聚合酶。(熒光測定裝置)下面，對前述熒光測定裝置27的結構進行說明。圖13為將熒光測定裝置27與作為測定對象的反應槽12之間的關系模式化的圖。 該熒光測定裝置27由激發(fā)光發(fā)生部45，反射部46和光電倍增管部47構成。激發(fā)光發(fā)生部 45，在內(nèi)部向上設置LED產(chǎn)生的激發(fā)光源48，發(fā)生的激發(fā)光通過激發(fā)光濾光片49，照射到位 于上方的反應容器11的反應液中。反射部46，反應液發(fā)出的熒光通過鏡子50向光電倍增 管部47反射，通過熒光濾光片51，只縮小成必要的波長光。光電倍增管部47測定這樣由反 射部46引導的熒光。該熒光測定裝置27由沿著上述反應容器11的半徑方向移動的移動平臺28保持， 不進行測量時置于反應容器外，只在熒光測定時才在對著反應槽12的位置移動，并進行測 量。如圖14所示，該熒光測定裝置27和移動平臺28配置為對應于設置于低溫側固定熱源 IOa與中間溫度固定熱源IOb之間的間隙52，這樣就可以在與反應槽12來到該間隙的同時 進行各反應槽12的測定。熒光的測定，通過觀察一定溫度下熒光的時間變化，可以進行所謂的實時PCRJn 果觀察到核酸擴增后慢慢升溫，熒光逐漸消失的溫度(偏離溫度)，可以鑒定擴增的核酸是 什么。而且，熒光測定中有貫通型和反射型，由于測定靈敏度提高，因此優(yōu)選如該實施方 式的反射型。該實施方式中，為了提高反射效率，反應槽12的內(nèi)側面有金屬反射膜54，可以 由遮光性材料形成反應容器基板37或上側閉塞板39。另一方面，下面?zhèn)鹊哪?8的一部分 或整體成透光性。(裝置的操作和控制)下面，對該裝置的操作和運作進行說明。圖15是用于表示該裝置的控制系統(tǒng)的區(qū)域圖。對已經(jīng)說明的構成要素，給出相同符號，省略其說明。該區(qū)域圖中所示的各構成 中，主控制部55、信息表示部56、輸入部57和記憶部58實際上由計算機構成，整合到圖4 中所示的裝置的前面面板54下。信息表示部56具體是液晶面板，輸入部57為設置在該液晶面板上的觸摸傳感器 或鍵輸入部。主控制部55是由CPU或RAM構成的運算裝置，其具有主程序59，溫度偏離運 算部60，旋轉驅(qū)動模式運算部61和實時PCR測定處理部62。主程序59將控制所必需的信 息輸入要求用運算符來表示，通過運算符輸入的信息存儲在硬盤等構成的記憶部58中。也 就是說，該記憶部58存儲運轉模式63、熱循環(huán)時間64、熱循環(huán)次數(shù)65、反應液的溫度調(diào)節(jié)目標溫度66、PCR實時測定結果67。前述加熱器溫度控制部29、旋轉發(fā)動機控制部30和熒光測定控制部31與主控制 部55連接。而且，設置于各熱源IOa IOc的傳感器68a 68e也與前述主控制部連接， 這樣前述主控制部55基于由傳感器得到的檢測值，就會給各構成要素進行反饋控制。(運 作流程)以下，按照流程圖等說明該裝置的運作。并且，圖中的符號Sl S17對應于以下 的步驟Sl S17。圖16是表示操作程序的運作流程圖。首先，一打開電源(步驟Si)，就在操作設定處理工序中設定運轉模式(步驟S2)。 該裝置，通過選擇運轉模式，除了只選擇PCR反應外，還可以選擇是否進行逆轉錄反應，或 是否進行熱啟動，是否進行熱偏離測定。但是，默認狀態(tài)為進行實時熒光測定。在該操作設定處理(步驟S2)中，在反應模式之外，還設定熱循環(huán)時間、熱循環(huán)次 數(shù)和反應液溫度調(diào)節(jié)目標溫度等。這些設定輸入通過前述信息表示部56和輸入部面板57， 對話式地進行，所有的信息通過前述主控制部65存儲在記憶部58中(參照圖15)。如果操作設定處理結束了，該裝置通過前述溫度偏離運算部60計算必要的偏離 溫度，并且通過前述旋轉驅(qū)動模式運算部61運算和設定向各溫度熱源的移動速度或在各 熱源上的停止時間等適當?shù)男D模式。由此，一旦完成設定(步驟S5)，運作開始，通過前述加熱器溫度控制部29，上述熱 源IOa IOc進行升溫驅(qū)動。熱源IOa IOc到達預定的溫度，達到準備結束的狀態(tài)之后， 打開上蓋13，插入反應容器11，合上蓋后，從前述輸入部面板57指定開始。然后，按照選擇 的模式，如下述說明的那樣，依次進行必要的反應處理。首先，判斷是否是1個方向連續(xù)運轉(步驟S8)。在選擇1個方向連續(xù)運轉時，只 實行PCR反應處理。在一個方向連續(xù)以外的情況下，接著判斷是否有逆轉錄處理(步驟S9)，在有逆轉 錄處理時，在PCR循環(huán)前，實行逆轉錄處理(步驟S10)。在該處理中，首先將低溫側熱源IOa 設定為逆轉錄的溫度，保持預定時間。然后，用高溫側熱源IOc進行高溫處理，使逆轉錄酶 失活。接著，在用該裝置進行熱啟動PCR時，判斷是否由高溫處理(步驟Sll)，在PCR循 環(huán)前用高溫側熱源IOc保持預定時間(高溫處理步驟S12)后，移行到PCR循環(huán)(步驟S13 以下)。接著，進行步驟S13的PCR處理。表示該PCR處理的流程圖示于圖17。通過依次 實行該圖17的各步驟(S18 S24)，可以重復進行設定通過上述溫度偏離運算部60計算的 高溫側熱源溫度TH1、低溫側熱源溫度TL1、中間熱源溫度TM、和用前述旋轉驅(qū)動模式運算 部61確定的在各熱源位置的時間的循環(huán)，同時在各反應槽12移動到低溫側熱源IOa和中 間熱源IOb之間的間隙52時，可以用熒光測定裝置27進行反應液的熒光測定。該測定值依次存儲到前述記憶部中。而且，還可以例如通過網(wǎng)絡實時傳送到其它 計算機。而且，該工序中也可以不進行實時熒光測定，只進行PCR處理。此時，可以在后面 的步驟S16中進行熱偏離測定處理。圖19是表示該熱偏離測定處理的流程圖。該工序一旦開始(步驟S30)，首先將PCR結束停止于低溫側熱源IOa的位置，等待預定時間直到低溫側熱源IOa和中間溫度熱源IOb都達到熱偏離開始溫度，然后保持30 秒(步驟S31)。然后，以設定兩熱源的升溫速度升溫，每到預定的秒數(shù)，在低溫側熱源和中 間溫度熱源之間移動，在移動中進行熒光測定(步驟S32 S35)。而且，該裝置還可以適應于上述實施方式中說明的形狀的反應容器以外的反應容器。例如，在圖6，圖8A，圖8B中所示的容器中，為了給反應槽內(nèi)施加比周圍大氣高的 高壓并密閉，每個都分別使用1個送液孔和密閉栓，例如，如圖20、圖21A，圖21B所示，分別 獨立設置送液孔33和排空氣孔70，這其中分別插入密閉栓40，71。如果通過這種結構，可 以獲得更確實的運作，而且，通過2個密閉栓40，71，內(nèi)壓對照的自由度提高。圖8B的栓40的側面部的一部分上切有溝40a。如果向送液孔中加入反應液，插入 栓40，向下壓，栓40的底到溝40a的部分由于被送液孔壁33密封，反應液隨著下壓從送液 孔送到反應槽12。為了避免伴隨送液的內(nèi)壓的升高，反應槽12內(nèi)的空氣，從排空氣溝35經(jīng)過送液孔 33上部的33a，通過溝40a，空氣逸出到外部。然后，如果繼續(xù)下壓栓40，溝40a就塞住溝35 的通氣孔33a，下壓栓40直到最低，送液一旦結束，就可以施加一定的內(nèi)壓。而且，圖21B是通過其它栓進行送液和內(nèi)壓對照，在溝40a的設計上增加自由度的 例子。 而且，如圖22、圖23A，圖23B所示，除了圖6之外，還可以在送液通路34和大氣釋 放通路35中設置用于導入密封劑的密封劑導入用孔72。如果根據(jù)這種結構，通過向該密封 劑導入用孔72中壓入密閉栓75，可以通過通路73，74將密封劑導入用孔72內(nèi)的密封劑填 充到送液通路34和大氣釋放通路35中。該密封劑是在預定的條件下硬化的材料。由此， 可以進一步提高上述反應槽12的獨立性和密閉性。而且，在上述圖6、圖20、圖21的反應容器11中，預先封閉上述反應槽12的上面 和下面，從送液孔33通過送液通路34填滿反應液，但并不限于此。例如，還可以不使用送 液孔33，在上述反應槽12中直接填充反應液。圖24的例子是，8個反應槽12在相互分離 的狀態(tài)下獨立設置的例子。此時，例如，上面閉塞板38為例如具有柔軟性的薄板，通過將該 薄板貼在主體基板37的上面，可以一起封閉填滿了反應液的各反應槽12。而且，這種反應槽12，如圖25所示，可以沿著整個圓周設置。此時，可以在超多試 樣的檢查等中應用。圖25這種反應容器11的情況下，通過使之在1個方向連續(xù)旋轉，可以 給各反應槽12內(nèi)的反應液提供熱循環(huán)。這樣一來，如果使容器11只在1個方向連續(xù)旋轉， 各反應空隙的熱循環(huán)，只有最初的1個循環(huán)分為從高溫開始，從低溫開始，從中間溫度開始 這3種，但如果適當選擇PCR引物，這種差異不會形成問題，因此可以一次處理超多試樣。適 合該圖25的反應容器的熱源配置的其它例子示于圖26。也就是說，熱源IOa IOc的面積 比任意，如上述實施方式這樣，還可以形成120度間隔，如該圖所示，如果將各熱源的面積 設為溫度滯留時間比(例如高溫側熱源低溫側熱源中間溫度熱源=1:1: 4左右)， 即使是多份試樣也可以在3分鐘左右進行30個循環(huán)的PCR。這種反應容器的反應槽12的部分進行擴大，示于圖27。我們認為，由于多試樣用容器的各反應槽12比較小，因此在加入反應液后貼上表 面的封閉部件38時，反應液一部分灑落在容器基板37上面，不能巧妙地進行粘著。本發(fā)明人為了其對策苦思，嘗試了各種方法，其結果，通過如圖27所示，通過在反應空隙的上面周 圍設置高度為約0. Imm的段差77，對其進行疏水處理，解決了該問題。優(yōu)選也在表面封閉部 件的膜38下面(圖中38a表示的部分)進行疏水處理。有段差部77，而且其是疏水性，用 膜38(39)壓住反應液時，在反應槽12的外周，空氣以環(huán)狀殘留，可以防止反應液侵入粘著 面。通過這種方式，就可以使得消除貼膜失敗。這種防止漏液對策極為重要，在實用方面，對于在圖25所示的這種整個圓周獨立 反應空隙中加入反應液之后，貼表面封閉部件的獨立式容器是必需的。這是因為，此時，一 次在60個反應空隙中加入反應液，但各獨立空隙相互靠近，即使稍有漏液，也會失去結果 的可信度。這也是因為，有時檢查的對象，其結果與生命相關、或者與漏出的液體接觸時，遭 遇到生命危險的情況。而且，使用如圖24或圖25所示的多試樣反應型容器進行熒光測定時，需要使上述 熒光裝置對著各反應槽。表示此時的熒光測定裝置27的控制的圖為圖18的流程圖。也就 是說，如該圖所示，在步驟S25 S29中，通過使熒光測定頭在反應容器11的半徑方向往復 運動，依次使之對向外周側的反應槽12和內(nèi)側的反應槽12，而進行熒光測定。(第2實施方式)下面，參照圖28 圖30對本發(fā)明的第2實施方式 進行說明。圖28A為該第2實施方式中涉及的裝置的平面圖、圖28B是正面圖、圖29為運作 流程圖、圖30為該裝置中使用的矩形平板形狀的反應容器11'。也就是說，在上述第1實施方式中，使用圓板形狀的反應容器，通過使其旋轉，進 行反應和測定，該第2實施方式的裝置，不使圖30的反應容器旋轉，通過使其在一個方向移 動，可以進行與前述第1實施方式的裝置一樣的運作。原理和運作完全與第1實施方式相同，但固定熱源IOa IOc不在圓周上，而是直 線排列的點，從而與第1實施方式不同。熒光測定裝置27具有與第1實施方式相同的構造，設置在熱源部IOa和IOb之間。 容器保持部78設置在熱源IOa IOc的周圍，保持前述矩形平板狀反應容器11'，沿著引 導，如圖中箭頭79所示往復，可以進行PCR反應。而且，容器保持部78的構造是在未圖示 的溝中插入前述反應11'容器，用容器塞子固定，這樣的結構防止移動中的反應容器11的 脫落。通過該裝置進行的PCR反應處理程序 控制方法示于圖29的流程圖，除了上述容 器沿直線移動以外，其余與前述第1實施方式相同，因此省略其說明。(第3實施方式)下面，參照圖31 36對本發(fā)明的第3實施方式進行說明。圖31是表示裝置79的側面圖，圖32是表示該裝置中使用的反應容器81、和對應 于該反應容器的熱源80的平面圖。前述第1、第2實施方式是通過使反應容器81相對熱源80移動而給反應液提供熱 循環(huán)，在該實施方式中，保持反應容器與熱源的位置關系固定，使反應液在反應容器中設置 的流路內(nèi)移動，從而給該反應液提供熱循環(huán)。也就是說，如圖32B所示，前述流路容器是厚度為2. 51mm的矩形平板，通過厚度為 2. 5mm的聚碳酸酯成形品主體部上貼上厚度為10 μ m的聚碳酸酯膜而構成。在容器的一端 部設置插入裝入了反應液的注射器的加液口 93，從該加液口 93導出的流路溝，一直延伸到 設置在反應容器81的另一端部的PCR液著觀察窗96。該流路溝是一條寬為200 μ m深度為50 μ m的流路溝，通過用前述的聚碳酸酯膜封閉上端開口，區(qū)劃并構成反應液的流路。隨著反應液在該流路溝中從上述加液口 93流向PCR液著觀察溝96，就完成了PCR 反應和觀察這一連串的工序。其中，流路形成為如圖32這樣的在容器內(nèi)在寬度方向呈蛇腹 形往復，由此，就構成了 3個區(qū)域，即逆轉錄區(qū)域99、酶失活區(qū)域100、PCR區(qū)域101。在設置了前述PCR液著觀察溝96的反應容器81的另一端部，交替設置用于進行 電泳的泳動液入口 97和泳動液著觀察口 98，它們用與上述不同的其它流路溝連接。而且， 如圖中所示，上述2個流路溝以在泳動液著觀察口 98附近交叉的狀態(tài)相連。此外，在反應 容器81的其他端部設置液著觀察口 94、95。液著觀察口 94、95用于目視流路內(nèi)的液體到達 何處，形成流路內(nèi)的液體積存。此外，在流路容器端面設有電極a d，該電極于容器一側部 露出。各電極a d在容器81內(nèi)分別配線到液著觀察口 a94、泳動液著觀察口 98、PCR液 著觀察窗96、泳動液入口 97，形成與液體接觸的構造。在以下的運作說明中，為了簡化說明，按以下方式表示窗A=加液口 93、窗B = 液著觀察口 a94、窗C =液著觀察口 b95、窗D = PCR液著觀察窗96、窗E =泳動液著觀察口 98、窗F =泳動液入口 97。另一方面，圖32C是用于加熱上述反應容器81的熱源80。該熱源80配置于流路 容器81的正下方，其具有對應于上述反應容器的各部位的逆轉錄用89、酶失活用90、PCR高 溫用91、PCR低溫用92的各熱源部。各熱源部89 92的溫度被溫控器控制在對應于各個 反應的溫度。該裝置，如圖31所示，在前述熱源80上方設置反應容器81，形成用容器鎖83將壓 蓋82與熱源80在相互壓接的方向驅(qū)動的構造。在注射器支持區(qū)域85設置加入了反應液 的注射器84，從壓蓋82上開的孔中插入流路容器81的注射器插入口，通過活塞下壓區(qū)域 87壓下注射器附帶的活塞部86，向容器內(nèi)送液。通過單軸移動平臺88附帶的未圖示的步 進發(fā)動機使活塞下壓區(qū)域87升降。送液速度，換言之，步進發(fā)動機的速度由控制部內(nèi)的微 型計算機控制。就電泳而言，使泳動熱源部發(fā)生所要的電壓，對應于流路容器的電極A d的位置 的未圖示的裝置側電極位于熱源部橫向，形成鎖壓蓋82時，容器與裝置側電極接觸而通電 的構造。用于觀察電泳結果的熒光檢測構造不整合在實施例的機械中，在熒光測定部的孔 中插入Bas Ins公司的USB4000分光光度計和與光源連接的反射光測定探針，進行外部測 定。裝置除此之外，還具有控制整體的控制部或操作部。圖33 圖35是表示該裝置的運作的流程圖。圖33是表示主要的PCR反應處理的流程圖。首先，在該裝置的反應容器中PCR反應等開始時，如上所述，安裝上反應容器，鎖 上壓蓋82后，裝上裝入了反應液的注射器84，按啟動鈕。于是，到反應液到達窗A為止，活 塞下壓區(qū)域87高速下降。操作部的微型計算機根據(jù)預先通過實驗確定的送液時間來判斷 是否到達窗A。然后，繼續(xù)低速下降活塞下壓區(qū)域87以便獲得預定的送液速度。要是經(jīng)過 液體到達窗D的時間，就停止送液，通過蜂鳴器通知反應結束。然后，如圖34所示，取出流路容器81，從窗F注入電泳用瓊脂糖凝膠直到可以在窗 E看見，再安裝到流路裝置中。此時，直接取下注射器使得反應液不向其以上移動。如圖35所示，接著，一按下電泳啟動鈕，由窗C向窗D加1次電泳電壓，一定時間后停止。接著開始由窗E向窗F施加第2次泳動電壓。然后，要是經(jīng)過設定的2次電壓施加時間，就停止所有處理。(第4實施方式)下面對本發(fā)明的第4實施方式進行說明。前述第1、第2的實施方式，使反應容器移動，在第3實施方式中使反應液移動，從而給反應液提供預定的熱循環(huán)的方式構成，但該第4實施方式的裝置的結構為無論是容器 還是反應液都不移動。 圖36是裝置側面圖、圖37是裝置上面圖、圖38是裝置正面圖。圖36中，110表示的是反應容器。反應容器110為圖27所示的這種形狀，形成1 個以上的獨立型反應槽12。這種形狀的反應容器110以上下相反的狀態(tài)設置在熱源111之上。該裝置中，反應通過給封入在固定容器110的反應液提供預定的熱來進行，其結 構使得在進行PCR時，反應的進行通過熒光裝置來確認，進行LAMP時，通過目視可以判斷是 否形成白濁。加熱，冷卻，熱源111只通過1個珀耳帖元件1進行。容器110置于熱源111上 方，如圖37所示，蓋上貫通孔的開孔的周圍用反射用金屬膜遮光的硬質(zhì)玻璃制玻璃加壓部 件104以便不遮擋激發(fā)光照射光軸102，位于裝置構造左截面圖的鎖構造106中，形成按將 熱源111和固定容器110壓接的方式固定的構造。熒光測定部104，與圖13的構造上下相 反，代替移動平臺，用圖37所示的鉸鏈構造105安裝在基部上。用玻璃透明部件固定反應 容器110后，利用鉸鏈105，用手從上方落下，使之位于玻璃透明部件的上方。裝置，除上述 結構外還具有控制整體的控制部107和操作部108。圖39是表示運作流程的流程圖。如該圖所示，基本的，設定反應條件等，安裝加入了反應液的固定容器，蓋上熒光 測定部后，一按下啟動鈕，就自動地進行反應。LAMP法的情況是，只通過在對應于預定溫度的溫度下保持預定時間，然后根據(jù)有 無白濁判斷反應結果。PCR法的情況是，用對應于高溫一低溫一中間溫度這樣的溫度的熱 源，在預定溫度下保持預定時間，充分進行預定次這樣的循環(huán)。在各個循環(huán)的L溫結束時進 行熒光測定，判斷反應進行。以上，對第1 第4實施方式進行了說明，下面，作為實施例，對反應容器的尺寸、 使用的反應液等進行記載。(圓板裝置用反應容器)“圓板裝置用反應容器”是第1實施方 式中使用的反應容器。均為直徑為120mm厚度為0. 6mm的聚碳酸酯制的通過射出成型制成的圓板，在中 央部開將旋轉軸含在其中的圓形的孔。以下，方便起見，將形狀不同的“圓板裝置用反應容器”分別稱為“8孔容器”、“全 圓周容器”、“a容器、b容器、c容器”?！?孔容器〕是圖24所示的容器，整體為透明的平板，在外周的120度的扇形范圍內(nèi) 有呈圓周狀的每列4個，共2列8個圓形的凹部。各個凹部的底的厚度為0. 2mm，上端面上 儲有2段深度為0. Imm的圓周狀段差，用反射用金屬膜覆蓋后，對段差部分進行疏水處理。向各凹部加入反應液后，粘附厚度為100 μ m的氟樹脂膜，再提供給反應。
〔全圓周容器〕是圖25所示的容器，除了60個凹部沿著容器全圓周配置，以及材料 的顏色為了確保各凹部遮光而為黑色之外，其余與8孔容器相同。"a容器、b容器、c容器”基本由與8孔容器相同的透明聚碳酸酯樹脂制的基板和 氟樹脂膜構成。這些容器除了反應用空隙之外，還有與之對應的送液空隙，與送液時空氣逸 出和之后的反應用空隙周圍的細溝部的密閉方式不同，形成圖6所示的為‘‘a(chǎn)容器”，圖20所 示的為‘‘b容器”，圖22所示的為“C容器”。a, b，c的反應用空隙與8孔容器的不同在于， 凹部上端面不存在段差，也沒經(jīng)過疏水處理，而進行了親水處理。連接各空隙的溝的深度為50 μ m寬為200 μ m,都進行親水處理。反應用空隙以外的空隙都是從基板面上呈圓筒狀升出，形成通過壓下橡膠制的密閉栓進行密閉的構造。粘附在下側的伸縮性膜是100 μ m的氟樹脂膜，添在上側的上側閉塞基底為Imm厚的聚碳酸酯制基板。(平板容器)“平板容器”是第2實施方式中使用的圖30中所示的反 應容器。首先用硬度90度的黑色氨基甲酸乙酯樹脂在真空下澆注成型以下結構的平板容器在正方形的厚度為0. 6mm的平板上有底的厚度為0. 2mm的圓形的4個凹部，在上端面上 設置2段深度為0. Imm的圓周狀段差。用反射用金屬膜包被表面后，對整個凹部進行疏水 處理。向各凹部加入反應液后，附上厚度為Imm的透明聚碳酸酯樹脂平板后，以黑色氨基甲 酸乙酯側作為傳熱面，透明聚碳酸酯側作為熒光測定側，提供給反應。(流路容器)“流路容器”是第3實施方式中使用的圖32所示的反應容器。流路容器是厚度為約2. 5mm的矩形平板。流路圖案如圖32B所示，全體都是寬度為200 μ m，深度為50 μ m。但是，連接液著 觀察窗口 2和PCR流路的流路的IOmm的部分的深度寬度都極劇縮小為10 μ m,而且PCR部 分的深度寬度都為50 μ m。其在本實施例中，為不對流路出口施加壓力而通過液體的流動 背壓對流路內(nèi)加壓的形狀。具有這種溝形狀的2. 5mm的成形品用透明聚碳酸酯樹脂射出成 型。此時，銅制的配線用部件插入在金屬鑄模中成形，在射出成型的同時形成必要的配線部 分。進而，在流路溝側貼上厚度為10 μ m的聚碳酸酯膜，再提供給反應。(固定容器)固定容器是第4實施方式中使用的反應容器。首先用透明聚碳酸酯樹脂射出成型以下結構在正方形的厚度為0. 6mm的平板上 有底的厚度為0. 2mm的圓形的1個凹部，在上端面上設置2段深度為0. Imm的圓周狀段差。 用反射用金屬膜包被表面后，對整個凹部進行疏水處理。向凹部加入反應液后，粘附厚度為 100 μ m的氟樹脂膜，再提供給反應。以上說明的容器與熱源的穩(wěn)定接觸相關的一系列說明，從以下這種觀點來描述 為了獲得位于容器基板上的反應部與熱源的穩(wěn)定接觸，反應部較基板具有柔性而突出。但 是，由于可以具有與之相同的著眼點，但不關注于容器的彈性的其它方法完全相同的成果， 因此對其進行描述。即使反應部不從容器基板上突出，如果熱源自身有彈性，反應部不膨脹也可以得 到相同的效果。因此，發(fā)明人用耐熱彈性體包被前述固體熱源的表面，使用8孔的聚碳酸酯 制基板作為容器，在用無伸縮性的0. 3mm的金屬板代替伸縮性膜封閉反應孔的狀態(tài)下進行 PCR0其結果，8孔都實現(xiàn)了穩(wěn)定的核酸擴增，證明了確保熱源的彈性有助于反應的穩(wěn)定。作 為包被熱源的彈性體，從耐熱性的觀點來看，合適的是氟橡膠或硅橡膠。
而且，由于固體熱源有彈性，將金屬基板弄凹制成容器，用膜包被表面等情況下， 通過不僅使膜側，而且金屬性的容器的底部與熱源接觸，從而可以獲得更優(yōu)的傳熱。
實施例(反應液)提供給反應的反應液的配合使用表1中所示的6種。
<image>image see original document page 27</image>
由于反應所必需的目的溫度和實際熱源設定的溫度有偏離，在以下的實驗例中， 表示為反應目的溫度(熱源設定溫度)。例如要在95°c下反應時，將熱源設定在110°C進行 反應時，表示為95°C (IlO0C ) O〔實驗1〕將反應液1加入于8孔容器，用圓板裝置(第1實施方式)進行PCR反應。進行高溫熱源95°C (118°C )下O. 5秒、低溫熱源55°C (36°C )下O. 5秒的2個溫度的PCR的30個循環(huán)。反應時間包括容器旋轉時間在內(nèi)，整體為1分6秒。通過光電倍增管得 到的實時熒光檢測的8孔平均輸出電壓，在熱循環(huán)前為2. 95mV、反應后為3. 42mV，可以確認 正常地進行了核酸擴增。〔實驗2〕向8孔容器中加入反應液3，在圓板裝置中進行由逆轉錄到檢測這一系 列的PCR反應。在中溫熱源37°C (37°C)放置2分鐘進行逆轉錄反應。接著，在高溫熱源 950C (IOO0C )下保持30秒，使逆轉錄酶失活。進行在低溫熱源55°C (36°C )下0. 5秒、中 溫熱源72°C (77°C )下3秒、高溫熱源95°C (118°C )下0. 5秒這3個溫度PCR的30個循 環(huán)。反應時間，包括容器旋轉時間在內(nèi)總共為5分25秒。核酸擴增PCR單獨為2分54秒。 通過光電倍增管得到的實時熒光檢測的8孔平均輸出電壓在熱循環(huán)前為3. llmV、反應后為 3. 68mV，可以確認正常地進行了核酸擴增。〔實驗3〕在8孔容器中加入反應液2，用圓板裝置繼續(xù)進行PCR反應，畫出融解曲 線，進行擴增物的鑒定。進行高溫熱源95°C (118°C )下0. 5秒、低溫熱源55°C (50°C )下 3.5秒、中溫熱源721 (77°C)下1.5秒3個溫度的PCR的30個循環(huán)。這其中，低溫熱源時 間延長，減少目標溫度與熱源實溫的偏離的設定，是為了通過減少在移行到熱偏離時熱源 溫度的變更幅度來進行正確的熱管理。為了進行雙螺旋核酸的融解曲線分析，置于PCR最 后的循環(huán)的熱源的設定與平常不同。PCR29個循環(huán)低溫處理后，低溫熱源改成設定為55°C。 30個循環(huán)最后的高溫處理后，高溫熱源改設成95°C。其結果是，由于30個循環(huán)結束后的高 溫熱源為98°C，因此直接在高溫熱源上進行1秒熱解離，由于低溫熱源在54°C，因此直接保 持30秒后，以0. 2V /秒使低溫熱源升溫，平均2秒進行1次熒光測定。將獲得的熒光的8 孔的平均值微分圖化，下降到88. 1°C，讀取峰值。由于其與擴增的250bp的DNA解離溫度 88. 2°C基本相同，因此可以確認進行了目的擴增?！矊嶒?〕此外，還進行了使向各溫度熱源的移動速度變化下的DNA擴增。改變移 動速度使得由中溫熱源向高溫熱源的移動用0. 8秒，由高溫熱源向低溫熱源的移動用1. 0 秒，由低溫熱源向中溫熱源的移動用0. 9秒，這樣進行反應。通過該反應，通過電泳確認了 后面和前面的孔都進行了完全等同的DNA擴增?！矊嶒?〕在8孔容器中加入反應液5，進行乳液PCR(emulsionPCR)反應。進行高 溫熱源95°C (118°C )下0. 5秒、低溫熱源55°C (36°C )下0. 5秒、中溫熱源72°C (77°C ) 下0. 5秒的30個循環(huán)，反應后，從乳液中提取DNA，進行電泳，結果確認了可以進行目的核酸 擴增?！矊嶒?〕在a容器的送液空隙中加入反應液2，在送液 密封后進行PCR反應。將 反應液15μ 1加入到送液空隙，壓下送液空隙用密封栓，直接裝于圓板裝置中，在以下條件 下進行PCR反應。進行高溫熱源95°C (118°C )下0. 5秒、低溫熱源55°C (36°C )下0. 5秒、 中溫熱源72°C (77°C )下1.5秒的30個循環(huán)。根據(jù)通過光電倍增管得到的反應前后的電 壓增加0. 52mV,確認了目的擴增?！矊嶒?〕在b容器的送液空隙中加入反應液2，送液·密封后，進行PCR反應。在 送液空隙中加入反應液15 μ 1，壓下送液空隙用密封栓，接著壓下大氣釋放空隙用密封栓， 直接裝到圓板裝置中，在以下條件下進行PCR反應。進行高溫熱源95°C (118°C)下0.5秒、 低溫熱源55°C (36°C )下0. 5秒、中溫熱源72°C (77°C )下1. 5秒的30個循環(huán)。根據(jù)通過光電倍增管得到的反應前后的電壓增加0. 51mV，確認了目的擴增?！矊嶒?〕在b容器的送液空隙中加入反應液2，送液·密封后，進行PCR反應。在 送液空隙中加入反應液15 μ 1，壓下送液空隙用密封栓，接著壓下大氣釋放空隙用密封栓。 然后在密封空隙裝入硅潤滑油，壓下密封空隙用密封栓，直接裝到圓板裝置中，在以下條件 下進行PCR反應。進行高溫熱源95°C (118°C )下0· 5秒、低溫熱源55°C (36°C )下0. 5秒、 中溫熱源72°C (77°C )下1. 5秒的30個循環(huán)。根據(jù)通過光電倍增管得到的反應前后的電 壓增加0. 47mV,確認了目的擴增。〔實驗9〕將反應液1裝入全圓周容器，在圓板裝置中進行PCR反應。在1個方向連續(xù)模式下，進行以高溫熱源95°C (118°C)、低溫熱源55°C (36°C )、中溫熱源72°C (77°C ) 作為1個循環(huán)3. 3秒的30個循環(huán)。反應時間整體為1分39秒。60個反應空隙的光電倍增 管產(chǎn)生的反應前后的電壓增加為平均0. 33mV，標準偏離為0. 03mV，確認了在整個反應空隙 中進行了良好的核酸擴增?！矊嶒?0〕將反應液2裝入平板容器，用平板裝置(第2實施方式)進行PCR反應。進行高溫熱源95°C (102°C )下2秒、低溫熱源55°C (43°C )下2秒、中溫熱源72。C (76V ) 下2秒的30個循環(huán)。反應時間整體為3分59秒。通過光電倍增管得到的反應前后的電壓 增加0. 54mV,由此確認了目的擴增?！矊嶒?1〕在流路裝置(第3實施方式)中使用反應液4進行由逆轉錄到電泳的反應。在流路裝置中裝入流路容器，在專用注射器中裝入反應液4，在流路容器的加液口插 入，使之起動。反應時的送液速度為0.012 μ 1/秒。在逆轉錄熱源37°C (37°C)下進行逆 轉錄反應。經(jīng)計算通過時間為2分鐘。接著的逆轉錄酶失活熱源為95°C (100°C)，經(jīng)計算 通過時間為30秒。PCR部，以55°C (51°C )作為低溫熱源，高溫熱源為95°C (99°C )進行 30個循環(huán)，需要4分鐘左右的通過時間。6分40秒后，取出流路容器，從泳動加液口注入電 泳用瓊脂糖凝膠，送到泳動側著液觀察口。然后，再裝到流路裝置，按下電泳啟動鈕，進行電 泳。此間，通過插入于熒光測定部的反射光測定探針和分光光度計可以觀察與G3PDH區(qū)域 的208bp的條帶同時生成的引物二聚物逐漸分離的狀態(tài)?！矊嶒?2〕向固定容器(第4實施方式)中加入反應液6，密封后進行LAMP反應。 65°C保持1小時后，通過目視確認了白濁，由此表明穩(wěn)定地進行了目的反應。(試劑盒)制 成了 MRSA(甲氧西林耐性葡萄球菌)檢測用的以下構成的試劑盒。使用者使用圓板裝置，采用使用者能夠得到的聚合酶和緩沖液，進行實時 PCR0 5個8孔容器引物MIX 20ml (F引物序列AACTGTTGGCCACTATGAGT、R引物序列: CCAGCATTACCTGTAATCTCG)
附圖的簡要說明[圖1]圖1是表示核酸擴增法的分類的圖。[圖2]圖2是用于說明代表性的現(xiàn) 有高速裝置的說明圖。[圖3]圖3是用于說明現(xiàn)有裝置的根據(jù)不同熱源的PCR時間的說明 圖。[圖4]圖4是表示本發(fā)明的第1實施方式的裝置的概略結構圖。[圖5]圖5是表示 本發(fā)明的第1實施方式的裝置的概略結構圖。[圖6]圖6是表示本發(fā)明的第1實施方式的 反應容器的概略結構圖。[圖7]圖7是表示本發(fā)明的第1實施方式的熱源配置的概略結 構圖。[圖8]圖8A、8B是表示本發(fā)明的第1實施方式的反應槽的概略結構圖。[圖9]圖9A 圖9C是表示本發(fā)明的第1實施方式的反應容器設置工序的概略結構圖。[圖10]圖 10是擴大表示本發(fā)明的第1實施方式的反應槽的概略結構圖。[圖11]圖11是用于說明本 發(fā)明的第1實施方式的原理的模式圖。[圖12]圖12是用于說明本發(fā)明的第1實施方式的 熱偏離式的說明圖。[圖13]圖13是用于表示本發(fā)明的第1實施方式的熒光測定裝置的概 略結構圖。[圖14]圖14是用于表示本發(fā)明的第1實施方式的熒光測定裝置的配置的概略 結構圖。[圖15]圖15是用于說明本發(fā)明的第1實施方式的控制的區(qū)域結構圖。[圖16] 圖16是表示本發(fā)明的第1實施方式的運作的流程圖。[圖17]圖17是表示本發(fā)明的第1 實施方式的運作的流程圖。[圖18]圖18是表示本發(fā)明的第1實施方式的運作的流程圖。
[圖19]圖19是表示本發(fā)明的第1實施方式的運作的流程圖。[圖20]圖20是表示本發(fā) 明的其它實施方式的反應容器的平面圖。[圖21]圖21A、21B是表示其它實施方式的反應 槽的概略結構圖。[圖22]圖22是表示本發(fā)明的其它實施方式的反應容器的平面圖。[圖 23]圖23A、23B是表示其它實施方式的反應槽的概略結構圖。[圖24]圖24是表示本發(fā)明 的其它實施方式的反應容器的平面圖。[圖25]圖25是表示本發(fā)明的其它實施方式的反 應容器的平面圖。[圖26]圖26是表示本發(fā)明的其它實施方式的熱源配置的概略結構圖。 [圖27]圖27是擴大表示本發(fā)明的其它實施方式的反應槽的截面圖。[圖28]圖28A，B是 表示本發(fā)明的第2實施方式的裝置的平面圖和正面圖。[圖29]圖29是表示本發(fā)明的第2 實施方式的裝置的正面圖。[圖30]圖30是表示本發(fā)明的第2實施方式中使用的反應容器 的概略結構圖。[圖31]圖31是表示本發(fā)明的第3實施方式的裝置的側面圖。[圖32]圖 32A 32C是表示本發(fā)明的第3實施方式中使用的反應容器的概略結構圖。[圖33]圖33 是表示本發(fā)明的第3實施方式的運作的流程圖。[圖34]圖34是表示本發(fā)明的第3實施 方式的運作的流程圖。[圖35]圖35是表示本發(fā)明的第3實施方式的運作的流程圖。[圖 36]圖36是表示本發(fā)明的第4實施方式的裝置的側面圖。[圖37]圖37是表示本發(fā)明的 第4實施方式的裝置的平面圖。[圖38]圖38是表示本發(fā)明的第4實施方式的裝置的正面 圖。[圖39]圖39是表示本發(fā)明的第4實施方式的運作的流程圖。[圖40]圖40是表示 熱源中發(fā)生的溫度差的圖。[圖41]圖41是說明各溫度熱源的溫度設定和由這種結構而各 反應槽受到的溫度的圖。[圖42]圖42是說明改善的各溫度熱源的溫度設定和由這種結構 而各反應槽受到的溫度的圖。
權利要求
一種用于促進PCR(聚合酶鏈式反應)或LCR(連接酶鏈式反應)等的熱循環(huán)反應的反應促進裝置，其在具有容納反應液的反應部的容器中，對該反應液給予預定熱循環(huán)，其特征在于該裝置具有對向前述容器的反應部配置的，通過在預定熱循環(huán)時間內(nèi)將前述容器中容納的反應液調(diào)節(jié)在高溫側的目標溫度、中溫的目標溫度和低溫側的目標溫度而給予前述熱循環(huán)的熱循環(huán)加熱器；和使前述熱循環(huán)加熱器的溫度控制成高溫側比前述高溫側的目標溫度偏離預定溫度差以上，以及使低溫側比前述低溫側的目標溫度偏離預定溫度差以下的溫度控制部。
2.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于將前述偏離溫度控制成下式表示 的溫度差以上<formula>formula see original document page 2</formula>X =反應液的深度(mm) X容器傳熱面的厚度(mm)(所謂容器傳熱面，是在容器平板部上與固體熱源接觸的表面和反應液之間夾著的膜 狀部分)。
3.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于前述熱循環(huán)加熱器具有高溫部、 中溫部、低溫部，該裝置具有通過使該熱循環(huán)加熱器和前述容器的相對位置移位，對前述反應部中容納 的反應液給予預定的熱循環(huán)的驅(qū)動部，該驅(qū)動部與前述預定的熱循環(huán)時間相關地控制前述 容器和前述加熱器的對向時間。
4.根據(jù)權利要求3所述的反應促進裝置，其特征在于前述高溫部、中溫部、低溫部配置 在圓周方向，前述驅(qū)動部驅(qū)動容器或加熱器使得前述容器與前述加熱器的相對位置按旋轉 圓周方向移位。
5.根據(jù)權利要求4所述的反應促進裝置，其特征在于前述驅(qū)動部使前述熱循環(huán)加熱器 與反應容器在相互接觸的狀態(tài)下間歇地相對移位，使上述容器中容納的反應液在前述熱循 環(huán)加熱器的高溫部、中溫部、低溫部中分別停留預定時間。
6.根據(jù)權利要求5所述的反應促進裝置，其特征在于前述控制部通過調(diào)整前述容器 上的特定部分至對向前述熱循環(huán)加熱器的前述低溫部的速度，由低溫部至對向中溫部的速 度，以及然后由中溫部至出來的速度，至少固定將與施加于前述特定部分的低溫和中溫相 關的熱過程。
7.根據(jù)權利要求4所述的反應促進裝置，其特征在于前述驅(qū)動部使前述熱循環(huán)加熱器 與反應容器在相互接觸的狀態(tài)下連續(xù)地相對移位。
8.根據(jù)權利要求3所述的反應促進裝置，其特征在于前述高溫部、中溫部、低溫部沿直 線方向配置，前述驅(qū)動部驅(qū)動容器或加熱器使得前述容器和前述加熱器的相對位置按直線 方向移位。
9.根據(jù)權利要求3所述的反應促進裝置，其特征在于在前述控制部使前述熱循環(huán)加熱 器和反應容器移位時，使上述循環(huán)加熱器與反應容器分離，并在分離的狀態(tài)下移位后，驅(qū)動 上述循環(huán)加熱器與反應容器使它們接觸。
10.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于該裝置還具有用于通過反應液 的光學變化讀取前述反應進行的好壞的光學檢測裝置，前述容器為了防止多種反應液的光 學干涉，至少一部分由遮光性材料形成或者被遮光著色。
11.根據(jù)權利要求10所述的反應促進裝置，其特征在于前述容器中使用光學透明的壓 迫部件作為壓迫該容器的部件，通過該透明的壓迫部件進行光學測定。
12.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于，具有從表面和里面壓迫容器平 板部的裝置，該壓迫裝置結構的至少一側是固體熱源，前述平板部的反應部的至少一側形 成厚度為10 400 y m的膜狀傳熱面，使前述固體熱源與前述膜狀傳熱面對向，并通過前述 壓迫裝置使它們接觸來加熱，膜狀傳熱面由于前述反應部的內(nèi)壓上升而膨脹，從而確保前 述容器與前述熱源的穩(wěn)定接觸。
13.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于前述容器具有平板部，該平板部 中設有凹部，在該凹部中加入為水溶液的反應液后，通過密封該凹部密封反應液，通過使設 定在對應于反應必需溫度的溫度的固體熱源與前述平板部接觸，進行作為熱反應的核酸擴 增反應，前述凹部上端面設置有至少一個圓周狀的段差，通過使該圓周狀的段差部分和密封部 件下面均為疏水性，而使進行穩(wěn)定的核酸擴增反應。
14.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于為了向反應部中加壓導入反應 液，前述容器還有具有開放端的加液用空隙，在前述反應部和容器內(nèi)部中以送液用溝狀空 隙相連結，從加液用空隙的開放端加入反應液后，通過送液用溝狀空隙將反應液輸送到反 應用空隙后，再用密封栓密封開放端，該容器具有壓迫結構以便對密封栓施加壓力的狀態(tài) 下進行反應使得反應中前述密封栓不脫落。
15.根據(jù)權利要求14所述的反應促進裝置，其特征在于前述密封栓在該密封栓側面部 的中位部到下位部中有空氣溝。
16.根據(jù)權利要求14所述的反應促進裝置，其特征在于前述容器中設置有與前述反應 部相連的大氣開放用溝狀空隙，用于倒入密封用液的充滿了密封液的密封液用空隙，和連 結密封液用空隙和前述大氣釋放用溝狀空隙以及前述加液用空隙的溝狀空隙，其被構成為在從前述加液用空隙向反應用空隙輸送反應液后，通過從加入密封液的空 隙輸送密封液，在反應用空隙的加液用空隙側的溝狀空隙和大氣釋放側的溝狀空隙兩者中 加入密封液。
17.根據(jù)權利要求16所述的反應促進裝置，其特征在于前述密封液由含有硅潤滑油的 潤滑油狀高粘度液、或UV硬化性樹脂或熱硬化性樹脂構成。
18.根據(jù)權利要求1所述的反應促進裝置，其特征在于是平板部內(nèi)容納反應液的部分 形成流路狀，用于進行反應液一邊流一邊進行核酸擴增的流動型核酸擴增反應的裝置，為 了控制輸送反應液的速度還具有送液控制裝置。
全文摘要
一種用于使反應液與預定溫度的加熱器接觸，促進反應液的核酸擴增反應的反應液用容器，其特征在于該容器有表面和里面且其結構使得前述任意一面或者這兩面以對著加熱器的狀態(tài)被保持的基板，和在該基板的表面方向上相互分離，獨立設立，分別保持前述反應液的液密性密閉的孔，前述孔由設立在前述基板上的開口部和封閉該開口部的基板表面?zhèn)群屠锩鎮(zhèn)鹊姆忾]部件構成，至少封閉與前述加熱器接觸這側的面的封閉部件具有厚度為10～300μm的伸縮性膜部分。
文檔編號C12M1/00GK101802163SQ20088002375
公開日2010年8月11日 申請日期2008年5月23日 優(yōu)先權日2007年5月23日
發(fā)明者兒玉崇, 兒玉知子, 坪井邦雄 申請人:信誠醫(yī)療有限公司