專利名稱：用于快速競(jìng)爭(zhēng)性同質(zhì)性分析的裝置、組合物和方法
用于快速競(jìng)爭(zhēng)性同質(zhì)性分析的裝置、組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2007年9月10日提交的序號(hào)為60/993，034和2007年9月25日提交的序號(hào)為60/995，186的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益，其通過(guò)引用整體并入本文。領(lǐng)域本文實(shí)施方案一般涉及用于快速檢測(cè)和/或確定樣品中靶分子的濃度和/或存在 的裝置、方法和/或組合物。某些實(shí)施方案涉及使用本文公開的裝置和系統(tǒng)檢測(cè)和確定靶 分子的濃度和/或存在。方法、組合物和/或裝置對(duì)于寬濃度范圍的靶分子的檢測(cè)和/或 濃度測(cè)量有效。背景檢測(cè)低濃度蛋白在醫(yī)藥、食品檢驗(yàn)、生物研究和生物戰(zhàn)劑檢測(cè)領(lǐng)域是至關(guān)重要的。 測(cè)量蛋白質(zhì)的最常用工具之一是抗體，例如免疫分析。對(duì)于使用完整抗體分子的一種常用 替代方法是只使用抗體的結(jié)合區(qū)。例如，多種抗原結(jié)合抗體片段是已知的，例如Fab片段、 Fab'片段、F(ab)2片段、F(ab' )2片段或scFv片段。對(duì)于測(cè)量靶分子的抗體的另一近期替代物是適體。適體是能夠被獲得用于測(cè)量靶 分子的核酸分子。適體提供一些優(yōu)點(diǎn)在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)體外生成、具有長(zhǎng)的貯存期限、易 于化學(xué)修飾以及可能表現(xiàn)出比抗體更好的結(jié)合特征，但適體生成的成本高并且通常在一些 生物流體中穩(wěn)定性低。用于檢測(cè)和/或確定溶液中分子濃度的現(xiàn)有方法未能將短分析時(shí)間、高靈敏度和 檢測(cè)和/或定量非常低濃度存在的靶分子所需的分析較大樣品容量的能力結(jié)合起來(lái)。概述本文實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)和/或確定靶分子的設(shè)備、方法和組合物。在某些實(shí) 施方案中，本文方法涉及檢測(cè)和/或確定寬濃度范圍的蛋白質(zhì)或其它靶分子。根據(jù)這些實(shí) 施方案，組合物和方法可以涉及使用結(jié)合劑，例如抗體、適體、生物受體或設(shè)計(jì)的小分子結(jié) 合劑，用于使用本文公開的方法和設(shè)備來(lái)檢測(cè)和/或確定靶分子濃度。其他實(shí)施方案涉及通過(guò)未標(biāo)記靶分子和可追蹤劑-靶分子復(fù)合物與軛合于捕獲 劑的溶液相劑(solution phase agent)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)檢測(cè)樣品中的靶分子。在某些實(shí)施 方案中，溶液相劑可以是已經(jīng)軛合于捕獲分子的抗體、抗體片段、生物受體、適體或特別選 擇的小分子結(jié)合劑。在某些實(shí)施方案中，捕獲分子可以是抗生物素蛋白，例如鏈霉抗生物素 蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、寡核苷酸引物或肽核酸(PNA)引物。根據(jù)這些實(shí) 施方案，溶液相劑可以結(jié)合與捕獲分子軛合物軛合的溶液相聚合物，并降低凝膠電泳中溶 液相劑的電泳遷移率。因此，結(jié)合的可追蹤劑-靶分子復(fù)合物在分子分離技術(shù)(例如電泳) 中容易與未結(jié)合的可追蹤劑-靶分子復(fù)合物分離，提供兩個(gè)群體的靶分子。此外，這兩個(gè)群 體可以被測(cè)量，提供與靶分子濃度成反比和成正比的信號(hào)。靶分子/溶液相劑/聚合物復(fù) 合物與未結(jié)合靶分子之間的電泳遷移率差異允許該過(guò)程既快速又有效。在某些實(shí)施方案中，特異性抗體可以結(jié)合與捕獲分子軛合的溶液相聚合物以降低 抗體的電泳遷移率。因此，結(jié)合的可追蹤劑-靶蛋白分子復(fù)合物可通過(guò)分離方法(例如電泳)與未結(jié)合的可追蹤劑-靶蛋白分子分離。然后，這兩個(gè)群體可使用特異性單克隆或多克隆抗體測(cè)量，提供與靶蛋白分子濃度成反比和成正比的信號(hào)。根據(jù)這些實(shí)施方案，靶/抗 體/聚合物復(fù)合物與未結(jié)合靶之間可以產(chǎn)生大的電泳遷移率差異，允許感興趣靶分子的分 離、快速檢測(cè)和確定。在某些實(shí)施方案中，所公開的方法將夾心免疫分析從異質(zhì)性分析轉(zhuǎn)變?yōu)橥|(zhì)性分 析，從而消除了許多通常伴隨異質(zhì)性分析(例如夾心ELISA分析)的勞動(dòng)密集和高成本的 步驟。在其他實(shí)施方案中，所公開的方法獲得完全在溶液相中進(jìn)行分析所具有的動(dòng)力學(xué)優(yōu) 點(diǎn)。本文實(shí)施方案可以允許夾心免疫分析在數(shù)分鐘而非數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行并且具有降低的成 本。其他實(shí)施方案涉及用以評(píng)估、讀取和/或記錄本文公開方法所提供數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。 在某些實(shí)施方案中，本文公開的設(shè)備提供對(duì)感興趣靶分子的存在或不存在和/或定量的實(shí) 時(shí)的視覺檢測(cè)和評(píng)估。本文涵蓋的一些實(shí)施方案允許靶分子在無(wú)凝膠系統(tǒng)中分離。根據(jù) 這些實(shí)施方案，本文涵蓋的裝置可以是反應(yīng)室。在某些示例性反應(yīng)室中，靶分子的存在或 不存在和/或濃度的評(píng)估可以在小于一小時(shí)或小于45分鐘或小于30分鐘或小于15分鐘 內(nèi)評(píng)估。一個(gè)示例性反應(yīng)室可以包括但不限于至少兩個(gè)電極(例如，陽(yáng)極和陰極鉬電極) (901)、至少兩個(gè)電極端子(902)、至少兩個(gè)緩沖液貯器(903)、至少兩個(gè)橡膠墊片(例如， 硅)(904)、位于反應(yīng)室上端和下端的透析膜(905)、至少一個(gè)石英反應(yīng)通道(906)、至少兩 個(gè)通道托架(907)、以及位于至少兩個(gè)緩沖液貯器和至少一個(gè)反應(yīng)通道之間的至少兩個(gè)電 壓傳送通道(908)。本文公開的其他實(shí)施方案包括作為系統(tǒng)的部分而涵蓋的裝置。根據(jù)這 些實(shí)施方案，系統(tǒng)可以包括裝置、電壓源(例如，提供約lOv/cm至約1，ΟΟΟν/cm的電壓源)、 激光器(例如，連續(xù)波激光器)(1001)、激光束(1002)、整形棱鏡(例如，激光線束整形棱 鏡)(1003)、反應(yīng)室(900)、反應(yīng)通道(906)、光發(fā)射(例如，發(fā)射的熒光)(1006)或顏色發(fā) 射、透鏡和過(guò)濾器(1007)、照相機(jī)(例如，電荷耦合器件照相機(jī))(1008)和任選的、接收系統(tǒng) 數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)。在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還可以包括加載設(shè)備(例如自動(dòng)化的)(1101)、滾 筒(1102)和用于分析多個(gè)分析(multiple assay)的多個(gè)反應(yīng)室(1103)。在某些實(shí)施方案中，本文使用的涵蓋的膜(例如，透析膜)可以包括任何透析膜， 例如商業(yè)上可獲得的透析膜。根據(jù)這些實(shí)施方案，透析膜位于反應(yīng)室的頂部并任選位于底 部。在某些實(shí)施方案中，透析膜與反應(yīng)室的頂部和底部直接接觸。本文預(yù)期公開的反應(yīng)室被布置為單通道分析或多通道分析。單通道反應(yīng)室分析可 以是能夠位于工作臺(tái)上的獨(dú)立的反應(yīng)室或手持式可移動(dòng)反應(yīng)室設(shè)備。預(yù)期單通道反應(yīng)室允 許將受治療者的樣品放入無(wú)凝膠反應(yīng)室，并且樣品的分離結(jié)果可以容易地在實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn) 室環(huán)境外分析。本文涵蓋的其他實(shí)施方案可以包括計(jì)算機(jī)和計(jì)算機(jī)軟件，用于接收、記錄、處理和 /或顯示從本文公開的組合物和方法獲得的數(shù)據(jù)。在某些實(shí)施方案(例如，

圖12所示的實(shí) 施方案)中，示例性軟件的截屏可以包括照相機(jī)(1008)捕獲的圖像。本文涵蓋的軟件程序 的進(jìn)一步實(shí)施方案可以允許選擇待分析區(qū)域，例如用于條帶強(qiáng)度分析和/或評(píng)價(jià)靶分子復(fù) 合物濃度。根據(jù)這些實(shí)施方案，預(yù)期計(jì)算機(jī)軟件程序?qū)⒃试S評(píng)價(jià)和分析多個(gè)反應(yīng)室實(shí)驗(yàn)和 多種樣品中的靶分子分析。如圖12右窗口所示，每一分析運(yùn)行的參數(shù)可以被設(shè)置，例如暴 露時(shí)間、暴露間隔時(shí)間、暴露次數(shù)，然后數(shù)據(jù)可以被顯示，允許在線分析數(shù)據(jù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)軟件程序可以用于評(píng)估樣品中靶分子的存在或濃度。 在另一實(shí)施例中，可以評(píng)估多樣品中靶分子的存在或不存在。樣品的參數(shù)，例如與受治療者 有關(guān)的來(lái)源和從受治療者的取樣，可以用于確認(rèn)每個(gè)樣品。此外，可以相對(duì)于其他樣品分析 樣品制備的相關(guān)參數(shù)和用于確認(rèn)樣品的結(jié)合劑。可以從本文涵蓋的軟件程序獲得最佳條件 以增加樣品制備和分析中的重現(xiàn)性和一致性。此外，樣品分析獲得的數(shù)據(jù)可以用于評(píng)估獲 得樣品的受治療者中病況的存在、污染物的存在、物質(zhì)的存在，或者物質(zhì)的存在或不同濃度 所代表的病況的進(jìn)展。本文涵蓋的受治療者可以是人或動(dòng)物?？蛇x擇地，樣品可以獲自地 點(diǎn)或表面而非受治療者。分析本文公開的分析而獲得的數(shù)據(jù)可以用于評(píng)估受治療者施用至 少一種治療劑的治療的需要。如果靶分子的存在、不存在或濃度水平與受治療者的病況相 關(guān)，則這些分析可以在患者的整個(gè)治療性處理過(guò)程中使用，以連續(xù)分析治療進(jìn)展。在另一實(shí) 施方案中，這些測(cè)試可以與其他測(cè)試一起使用，以獲得對(duì)受測(cè)試的受治療者的總體病況更 全面的理解。附圖簡(jiǎn)述圖1表示可追蹤分子(101)(例如熒光素)與靶分子(102)連接形成可追蹤靶分 子(103)的示例性示意圖。圖2表示捕獲成分(104)(例如生物素)與結(jié)合劑(202)(例如抗體)連接形成捕 獲成分_結(jié)合劑復(fù)合物(203)的示例性示意圖。圖3表示可追蹤靶分子(103)、捕獲成分_結(jié)合劑(203)和游離靶分子(102)結(jié)合 形成復(fù)合物(301，302)和過(guò)量可追蹤劑-靶分子復(fù)合物(103)的示例性示意圖。圖4表示圖3所示反應(yīng)的可追蹤產(chǎn)物與過(guò)量中性抗生物素蛋白(401)混合產(chǎn)生可 追蹤劑(403)或游離靶分子(402)與捕獲成分-結(jié)合劑和多價(jià)劑(例如，中性抗生物素蛋 白)(401)的復(fù)合物以及過(guò)量的可追蹤劑-靶分子復(fù)合物(103)和中性抗生物素蛋白的示 例性示意圖。圖5表示圖4所示反應(yīng)產(chǎn)物與過(guò)量多價(jià)劑(例如，中性抗生物素蛋白)和過(guò)量基 本不帶電的可捕獲聚合物(例如，生物素軛合的聚合物)混合產(chǎn)生靶分子(502)或可追蹤 劑-靶分子復(fù)合物(503)與捕獲成分-結(jié)合劑和多價(jià)劑和可捕獲聚合物的復(fù)合物，以及過(guò) 量的可捕獲聚合物(501)和過(guò)量的可追蹤劑-靶分子復(fù)合物(103)的示例性示意圖。圖6A表示從頂部到底部三層的反應(yīng)室初始狀態(tài)的示意圖分別是樣品層、捕獲層 和堆積層。樣品層可以包括圖3所示反應(yīng)左側(cè)的任何或所有組分，反應(yīng)緩沖液中含有過(guò)量 多價(jià)劑(例如，中性抗生物素蛋白)。捕獲層含有在反應(yīng)緩沖液中基本不帶電的可捕獲聚合 物(例如，生物素軛合的聚合物)。堆積層含有基本不帶電的聚合物(例如，線性聚丙烯酰 胺)。每個(gè)圖中室左側(cè)顯示的灰色跡線表示在每個(gè)點(diǎn)可檢測(cè)量的信號(hào)生成抗體。圖6B表示能夠在示例性樣品層中自組裝的、示例性圖3和圖4所示反應(yīng)所示復(fù)合 物的示意圖。圖6C表示垂直方向上的電壓應(yīng)用示意圖，導(dǎo)致所有組分電泳進(jìn)入捕獲層并形成 圖5所示反應(yīng)所示的復(fù)合物。圖6D表示所有組分由于電壓進(jìn)一步應(yīng)用而遷移的示意圖，導(dǎo)致所有未結(jié)合基本 不帶電的可捕獲聚合物(例如，生物素軛合的聚合物)的復(fù)合物移動(dòng)進(jìn)入并通過(guò)堆積層，而 結(jié)合的復(fù)合物濃縮在捕獲層和堆積層的界面。
圖7A表示其中樣品中的未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標(biāo)記的運(yùn)鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競(jìng)爭(zhēng)的劑量-響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的示例性曲線圖。這些示例性曲線圖 代表從頂部到底部約30秒間隔的時(shí)間點(diǎn)。每個(gè)曲線圖左側(cè)最接近陰極，因此大多數(shù)物類向 右遷移。圖7B表示其中樣品中的未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標(biāo)記的運(yùn)鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競(jìng)爭(zhēng)的劑量-響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的示例性曲線圖。條件與圖7A相同， 除了將26nM未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白與圖7A的所有組分一起混入樣品層。圖7C表示其中樣品中的未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標(biāo)記的運(yùn)鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競(jìng)爭(zhēng)的劑量-響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照運(yùn)行數(shù)據(jù)的示例性曲線圖。條件與圖 7A相同，除了抗體(結(jié)合劑)被置于樣品層之外。圖8表示圖7A-7C的示例性曲線圖以及介于0和102nM之間的其他未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白(靶分子)濃度在各濃度10分鐘計(jì)算的峰面積的示例性圖。表示了典型的競(jìng)爭(zhēng)曲線。圖9A-9C表示示例性反應(yīng)室(900)。9A表示反應(yīng)室的示例性俯視圖，包括但不限于 (901)鉬電極、(902)電極端子、(903)緩沖液貯器、(904)硅橡膠墊片、(905)透析膜、(906) 石英反應(yīng)通道、(907)通道托架、(908)緩沖液貯器和反應(yīng)通道之間的電壓傳送通道。9B表 示反應(yīng)室的示例性前視圖，包括但不限于(906)石英反應(yīng)通道和(904)硅橡膠墊片。9C表 示反應(yīng)室的示例性側(cè)視圖，包括但不限于(907)通道托架、(903)緩沖液貯器、(902)電極端 子、(905)透析膜、(904)硅橡膠墊片、(908)緩沖液貯器和反應(yīng)通道之間的電壓傳送通道。圖10表示本文涵蓋的裝置(1000)的示例性示意圖，包括但不限于(1001)473nm 連續(xù)波激光器、(1002)激光束、(1003)激光線束整形棱鏡、(900)反應(yīng)室、(901)鉬電極、 (906)石英反應(yīng)通道、(1004)發(fā)射的熒光、(1005)透鏡和過(guò)濾器、和(1006)電荷耦合器件 (CCD)照相機(jī)。圖11表示本文涵蓋的具有多個(gè)反應(yīng)室的系統(tǒng)(1100)的示例性示意圖，包括但不 限于(1001)473nm連續(xù)波激光器、(1006)CCD照相機(jī)、(1101)自動(dòng)加載設(shè)備、(1102)滾筒、 和(1103)反應(yīng)室。圖12表示本文涵蓋的一些實(shí)施方案的軟件的示例性截屏。左窗口表示CXD照相 機(jī)(1102)捕獲的圖像，并允許選擇待分析區(qū)域。右窗口設(shè)置本文涵蓋的分析的參數(shù)(例如 暴露時(shí)間、暴露間隔時(shí)間、暴露次數(shù))，顯示一個(gè)或多個(gè)分析的代表性數(shù)據(jù)，并允許在線分析 數(shù)據(jù)。圖13A-13B表示本文涵蓋的一些實(shí)施方案的示例性軟件截屏。圖14表示本文涵蓋的一些實(shí)施方案的示例性軟件截屏。圖15表示圖13的曲線圖以及介于0和102nM之間的其他未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白濃度 在各濃度10分鐘計(jì)算的峰面積的示例性數(shù)據(jù)，描繪了得到的圖。圖16表示本文公開的示例性系統(tǒng)的視圖。該示例性圖表示反應(yīng)室(900)、照相 機(jī)(1006)、激光器(1001)、與激光器可操作連接的光束定向器(例如，45度光束定向器) (1601)、和光束擴(kuò)展器(例如，Galilean光束擴(kuò)展器AR涂層350-650nm) (1602)的側(cè)視圖。 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，圖16所示系統(tǒng)可以是面包盒尺寸，例如5-6英寸X16英寸，或 甚至小5倍或10倍，以便例如以實(shí)現(xiàn)便攜性。圖17表示本文公開的示例性系統(tǒng)的視圖。該示例性圖表示反應(yīng)室(900)、照相機(jī)(1006)和光束擴(kuò)展器(例如，Galilean光束擴(kuò)展器AR涂層350-650nm) (1602)的俯視圖。圖18表示本文公開的示例性裝置的視圖。該示例性圖表示帶有室支架板(例如， Delrin室支架板)(1801)的反應(yīng)室(900)、貯器(Delrin緩沖液貯器)(903)和基板(例如， Delrin基板)(1802)的俯視圖，A指示圖19放大視圖所表示的圖解圓圈。圖19表示本文公開的示例性裝置的視圖，還在圖18中以縮小尺寸表示為A。該示 例性圖表示反應(yīng)室(900)的側(cè)視圖，其具有石英反應(yīng)室(906)、室密封件(例如，硅反應(yīng)室密 封件)(1901)、支架(例如，Delrin反應(yīng)室支架)(1801)、窗(例如，尺寸調(diào)節(jié)窗)(1902)、膜 (例如，透析膜)(905)、墊片(例如，硅反應(yīng)室墊片)(904)、與1902不同的窗(例如，藍(lán)寶 石窗)(1903)、窗密封件(例如，硅藍(lán)寶石窗密封件)(1904)和窗架(例如，Safire窗架) (1905)。圖20表示示例性計(jì)算設(shè)備。圖21表示用于評(píng)估樣品中靶分子存在或濃度的示例性方法的流程圖，具有用于 產(chǎn)生根據(jù)本文公開的一些實(shí)施方案的標(biāo)準(zhǔn)曲線的示例性操作。定義如本文使用，〃一個(gè)〃或〃一種〃可以表示一個(gè)或多于一個(gè)的項(xiàng)目。如本文使用，器皿(vessel)可包括但不限于管、通道或容器(container)。詳述在以下章節(jié)中，描述了各種示例性組合物和方法以詳細(xì)說(shuō)明各種實(shí)施方案。對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，實(shí)施各種實(shí)施方案不需要采用本文列出的具體細(xì)節(jié)的全部或甚 至某些，而是濃度、時(shí)間和其他具體細(xì)節(jié)可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)修改。在一些情況下，公知的 方法或組分未包括在說(shuō)明書中。本文實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)和/或確定靶分子的設(shè)備、方法和組合物。在某些實(shí) 施方案中，本文方法涉及檢測(cè)和/或確定樣品中寬范圍濃度的蛋白質(zhì)或其他靶分子。根據(jù) 這些實(shí)施方案，組合物和方法可以涉及使用結(jié)合劑例如抗體、抗體片段、適體、生物受體或 設(shè)計(jì)的小分子結(jié)合劑，用于使用本文公開的方法和設(shè)備來(lái)檢測(cè)和/或確定靶分子。分子運(yùn)動(dòng)的理論處理如本文涵蓋的，粒子(其可以是分子)經(jīng)流體的運(yùn)動(dòng)經(jīng)歷與其速度、其尺寸(由其 流體動(dòng)力學(xué)半徑描述)和流體粘度成正比的摩擦力。方程1(參見示例性方程)所示的該 正式表達(dá)被稱為斯托克斯方程。稱為遷移率的量由方程1定義，以便粒子速度除以遷移率得到摩擦力。對(duì)于球形 分子，流體動(dòng)力學(xué)半徑等于半徑。對(duì)于非球形分子，其可以定義為在蠕動(dòng)流條件下有等效表 現(xiàn)的球形分子的半徑(如果分子形狀已知，則其可以被理論推導(dǎo))。從方程1獲得的遷移率 在方程2a中表達(dá)。如果假定已知分子量的分子為球形，則半徑如方程2b所示計(jì)算。將方 程2b代入方程2a產(chǎn)生依照分子密度、分子量和流體粘度的遷移率的表達(dá)，如方程2c所示。粒子以恒定速度運(yùn)動(dòng)，此時(shí)歸因于該運(yùn)動(dòng)的摩擦力等于施加力(例如重力、電壓 梯度)。設(shè)置摩擦力等于施加力并求解速度，將粒子速度表示為施加力乘以遷移率，如方程 3所示。因此，遷移率提供計(jì)算粒子速度的方便的方式。分子在電場(chǎng)中經(jīng)受的力與分子上的 電荷和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。因此，分子速度由方程4給出，其中"u “表示的量稱為電泳遷移 率(單位為cm2/V sec)，由方程5定義。方程5中的因子107將電荷e伏特(其為m_kg-S單位)轉(zhuǎn)換成cm-g-s單位。注意，方程4暗示，帶負(fù)電的分子(負(fù)離子)以與正離子相反的方向運(yùn)動(dòng)。在方程4的更一般形式中，粒子速度和電場(chǎng)(其是電壓梯度)是向量并因此具有與其相伴的方向。遷移率還與斯韋柏系數(shù)s密切相關(guān)，斯韋柏系數(shù)s被定義為粒子在離心機(jī)中20°C 水中的沉降速度除以離心加速度。斯韋柏系數(shù)以10_13秒的單位表達(dá)。使用方程3的浮力 來(lái)發(fā)現(xiàn)速度，斯韋柏系數(shù)作為遷移率的函數(shù)由方程6a給出。因此，遷移率可以如方程6b所 示從斯韋柏系數(shù)導(dǎo)出。在一些實(shí)施方案中，可以使用與感興趣的靶分子特異性締合或結(jié)合的結(jié)合劑。在 一些更具體的實(shí)施方案中，可以使用結(jié)合感興趣的靶分子的抗體、適體或其他特別設(shè)計(jì)的 分子。在某些實(shí)施方案中，血清中發(fā)現(xiàn)的抗體的最常見類型之一可以被導(dǎo)向結(jié)合靶分子，例 如免疫球蛋白G(IgG或γ球蛋白)。IgG的分子量為大約150kDa(1320氨基酸殘基)。不 同IgG分子的等電點(diǎn)范圍從6至7. 5，暗示在中性pH下中等負(fù)電荷至輕微正電荷。IgG的 斯韋柏系數(shù)為大約7。假設(shè)密度約1. 2g/cm3，根據(jù)方程2b計(jì)算的遷移率為2. IX 107s/g，而 根據(jù)方程6b計(jì)算的遷移率為1. 7X10Ts/g。這兩種計(jì)算之間的差異來(lái)自至少三個(gè)原因(1) IgG不是完美球形分子，因此通過(guò) 沉降計(jì)算的遷移率應(yīng)該較低；(2) IgG的密度不是精確已知的，并且這種不確定性在第二種 計(jì)算中被放大而在第一種計(jì)算中被縮小；和(3)第二種計(jì)算中使用的斯韋柏系數(shù)僅是大約 已知的。在某些實(shí)施方案中，IgG的遷移率可以估計(jì)為2X107s/g?？煽繙y(cè)量的蛋白質(zhì)濃度已導(dǎo)致許多涉及抗體或抗體樣分子的分析的發(fā)展。多種多 樣的免疫分析是本領(lǐng)域已知的并且涵蓋在本文中。以下一些描述使用抗體作為結(jié)合劑，但 是許多其他物質(zhì)涵蓋在本文中，例如適體、特別設(shè)計(jì)的結(jié)合劑以及抗體片段例如Fab片段 或適體。在某些實(shí)施方案中，選擇信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于本文公開的方法而言是重要的但不一定是 核心的。熒光標(biāo)簽可以軛合于本文公開的結(jié)合劑。例如，諸如FITC或若丹明的分子可以軛 合于抗體以提供熒光信號(hào)。在其他實(shí)施方案中，軛合的酶可以軛合于結(jié)合劑，例如堿性磷酸 酶或辣根過(guò)氧化物酶(如果需要比色分析)，或者諸如碳酸酐酶或脲酶的酶(如果需要電導(dǎo) 率分析)。根據(jù)這些實(shí)施方案，酶分析通常需要添加適合的酶底物。免疫分析免疫分析可以被表征為“異質(zhì)性的”或“同質(zhì)性的”。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)這些術(shù)語(yǔ)的 含義存在一些困惑。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)性的”可以暗示結(jié)合的復(fù)合物在檢測(cè)前與未 結(jié)合的分子分離(通過(guò)任何方式)，而術(shù)語(yǔ)“異質(zhì)性的”暗示很少或沒有分離發(fā)生?？蛇x地， 本文涵蓋的術(shù)語(yǔ)“異質(zhì)性的”可以表示分析可以使用固相和溶液相兩者，其中復(fù)合物與固相 的連接允許未結(jié)合分子在檢測(cè)復(fù)合物之前被洗掉(或者結(jié)合的分子被洗掉，取決于相)。此 夕卜，如本文所涵蓋的，術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)性的”可以表示結(jié)合、分離(如果有)和檢測(cè)步驟發(fā)生在溶 液相。在許多情況下，這些不同的定義在分析如何分類中產(chǎn)生很少差異，因?yàn)榇蟛糠址蛛x或 洗滌步驟涉及結(jié)合至固相支持體，因此涉及分離或洗滌的分析通過(guò)任一定義都將被分類為 異質(zhì)性的。一個(gè)例外是通過(guò)電泳的分離，其中分析可能根據(jù)第一套定義而被分類為異質(zhì)性 的，并根據(jù)第二套定義而被分類為同質(zhì)性的。預(yù)期本公開的實(shí)施方案可能主要根據(jù)第二套 定義。因此，如在本文某些實(shí)施方案中公開的，異質(zhì)性分析包括將抗體_靶分子復(fù)合物在測(cè)試過(guò)程中結(jié)合至表面，然后洗掉未結(jié)合的靶分子、樣品中的其他物質(zhì)和未結(jié)合的抗體，然后測(cè)定樣品中靶分子的存在和/或測(cè)量其量。另一方面，異質(zhì)性分析允許樣品和抗體混 合在一起并確定待確定樣品中靶分子的存在和/或測(cè)量其量，不需要結(jié)合至表面或洗滌。異質(zhì)性分析可以具有高靈敏度和特異性，并且能以提供極高通量測(cè)試系統(tǒng)的形式 進(jìn)行。這些形式還可適以測(cè)試大多數(shù)靶分子。一個(gè)限制包括緩慢的測(cè)試時(shí)間需要相對(duì)精密 的儀器以大量進(jìn)行以及伴隨表面結(jié)合和洗滌步驟增加的成本。同質(zhì)性分析可以是非?？斓?，可容易適用于新的蛋白質(zhì)、肽或其他分子和平臺(tái)，并 且可以是非常具有成本效益的。限制可包括可能較低的特異性和靈敏度。此外，這些形式 可能局限于小的靶抗原。因此，同質(zhì)性和異質(zhì)性分析兩者在本文根據(jù)需要、被分析的樣品和 感興趣的靶分子而被考慮。定量競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的一個(gè)實(shí)施方案可以包括與固相支持體結(jié)合的抗體以及溶 液中被允許結(jié)合至抗體的標(biāo)記的和未標(biāo)記的靶。標(biāo)記的靶可以與未標(biāo)記的靶競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)目 的抗原結(jié)合位點(diǎn)。靶分子上的標(biāo)記可以是放射性同位素、酶或熒光分子。使用該類型免疫 分析產(chǎn)生的信號(hào)與未標(biāo)記的靶濃度成反比。本領(lǐng)域存在許多同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。一般，同質(zhì)性免疫分析是有利的，因?yàn)榻Y(jié) 合的和游離的配體的分離通常不是必要的，因此簡(jiǎn)化了儀器。這里，所有結(jié)合發(fā)生在溶液相 中，因此這些方法往往是快速的。這些技術(shù)的一般優(yōu)點(diǎn)包括(1)由于僅需要單一結(jié)合劑(例如抗體)而簡(jiǎn)化了分 析的開發(fā)，(2)通常比傳統(tǒng)的雙位點(diǎn)分析更快的分析時(shí)間，(3)跨寬分析范圍的定量測(cè)量， 和(4)有能力對(duì)太小以致于不允許同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗體的靶有效(例如，夾心分析)。同質(zhì)性免疫分析提供與靶濃度成反比的一種或多種信號(hào)。該事實(shí)導(dǎo)致很難以該技 術(shù)測(cè)量小濃度，因?yàn)樾⌒盘?hào)中的小變化能夠比大信號(hào)中的小變化更可靠地測(cè)量。特異性僅 源自單一結(jié)合事件，而同質(zhì)性分析的靈敏度可以使用高品質(zhì)抗體來(lái)提高。下文是一些常用技術(shù)的一些描述。該列表不是窮盡性的，并且不意味著排除可能 在本領(lǐng)域已知的任何其他同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性分析。一些最早的同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性分析涉及監(jiān)測(cè)不溶性抗原_抗體復(fù)合物的形成，例如使 用多克隆抗體。簡(jiǎn)言之，因?yàn)榘刑禺愋远嗫寺】贵w可以識(shí)別靶上的多個(gè)表位并且是二價(jià)的， 靶和抗體的大型復(fù)合物可以在靶和抗體濃度大致相等時(shí)形成。這些復(fù)合物的尺寸可以長(zhǎng)至 它們變成不溶性的點(diǎn)。這些不溶性復(fù)合物阻礙或散射穿過(guò)樣品基質(zhì)的光。這些散射的光可 以通過(guò)濁度法測(cè)量，或者相反地，通過(guò)樣品的光衰減可以通過(guò)比濁法測(cè)量。產(chǎn)生的信號(hào)與樣 品中存在的靶的量成正比。該技術(shù)對(duì)于以相對(duì)高水平存在并且尺寸足以具有多個(gè)抗原結(jié)合 位點(diǎn)的分析物非常有效。注意，隨著靶濃度逐漸超過(guò)抗體結(jié)合位點(diǎn)，多個(gè)抗體同時(shí)結(jié)合同一 抗原的能力下降。因此，通過(guò)在分析混合物中加入已知濃度的純化抗原以使抗體_抗原復(fù) 合物形成最大化，可以使分析成為競(jìng)爭(zhēng)性的；待分析樣品中添加抗原可以導(dǎo)致復(fù)合物形成 的減少。一些限制可能包括需要多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和低濃度測(cè)量的不適合性。該方法還可能受 到樣品基質(zhì)改變和特異性缺乏的影響。另外的同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析是熒光偏振免疫分析(FPIA)。FPIA取決于溶液中 分子或復(fù)合物的轉(zhuǎn)速。較大的分子或復(fù)合物比較小的分子或復(fù)合物旋轉(zhuǎn)更慢。當(dāng)適合波長(zhǎng) 的偏振光穿過(guò)樣品時(shí)，如果分子或復(fù)合物旋轉(zhuǎn)足夠慢，則熒光發(fā)射光的偏振被保持。如果未結(jié)合的熒光標(biāo)記靶足夠小以致于其轉(zhuǎn)速足夠快，則發(fā)射光消偏振。如果熒光標(biāo)記的靶結(jié)合至特異性IgG，則復(fù)合物的質(zhì)量增加，減緩轉(zhuǎn)速并保持發(fā)射光的偏振。在某些系統(tǒng)中，F(xiàn)PIA分析系統(tǒng)包括靶特異性抗體、熒光標(biāo)記的靶和待定量的未標(biāo) 記的靶。標(biāo)記的和未標(biāo)記的靶競(jìng)爭(zhēng)特異性IgG上有限數(shù)目的結(jié)合位點(diǎn)。偏振熒光信號(hào)與未 標(biāo)記靶的濃度成反比。該方法因其簡(jiǎn)單性和速度而受到關(guān)注。FPIA限于小分子靶并且因?yàn)?靈敏度而犧牲了分析范圍。有許多其他競(jìng)爭(zhēng)性同質(zhì)性分析，例如CEDIA ，EMIT 、輔基免疫分析 (prosthetic-group immunoassay) λf^^^^tiT (enzyme-channelingimmunoassay)禾口 底物標(biāo)記的熒光免疫分析。這些方法是競(jìng)爭(zhēng)性的，并且一般涉及抗體與靶結(jié)合后酶或酶復(fù) 合物的活化或失活。這些方法具有與FPIA相似的益處和限制。親和探針毛細(xì)管電泳(APCE)毛細(xì)管電泳涉及借助帶正電和帶負(fù)電的電極在填充有離子緩沖液的長(zhǎng)毛細(xì)管的 兩端施加電壓，從而導(dǎo)致帶電分子向一個(gè)電極或另一個(gè)電極遷移(Oda和Landers，1997)。 一個(gè)常見的伴隨現(xiàn)象被稱為“電滲流”。玻璃毛細(xì)管往往具有帶負(fù)電的表面，其與溶液中接 近表面的帶正電的離子結(jié)合。這些帶正電的離子向負(fù)電極(陰極)遷移，隨其拖帶主體溶 液。該電滲流導(dǎo)致所有離子向陰極遷移(盡管以不同速率)并通常被良好利用，因?yàn)閱我?檢測(cè)器可以分析所有離子物類，而不論它們流過(guò)時(shí)的電荷。電滲流可以通過(guò)改變毛細(xì)管壁 的電特征而被消除或甚至逆轉(zhuǎn)。對(duì)于APCE，靶分子與已經(jīng)軛合至檢測(cè)分子(通常為熒光探針)的同源抗體一起孵 育。然后將混合物注射入毛細(xì)管并施加電壓，建立電滲流。游離靶、游離抗體和靶/抗體復(fù) 合物將以不同速率遷移，并可以因此通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)為單獨(dú)的峰(游離靶不應(yīng)該產(chǎn)生 信號(hào))。電泳電泳是可以用于替代洗滌結(jié)合至固相支持體的復(fù)合物、從而將正常為異質(zhì)性蛋白 質(zhì)分析的分析轉(zhuǎn)化為同質(zhì)性分析的技術(shù)。電泳通常用于根據(jù)分離尺寸和電荷來(lái)分離分子 (例如，諸如蛋白質(zhì)或核酸的大分子)。正電極和負(fù)電極可以放入含有待分離分子的溶液 中，并在電極之間施加電壓降。一般，帶正電的分子會(huì)向帶負(fù)電的電極遷移，而帶負(fù)電的分 子會(huì)向帶正電的電極遷移。一般，分子遷移的速度與它們的電荷成正比并且與它們的尺寸 成反比。例如，小的高電荷分子比大的較少電荷分子移動(dòng)快。然而，致密分子比松散分子移 動(dòng)快，使得具有相同質(zhì)量和電荷的兩個(gè)分子可以不同速率遷移。較高的電壓降導(dǎo)致更快的 遷移，而溶液中其他帶電分子的較高濃度導(dǎo)致較慢的遷移。有許多本領(lǐng)域已知的電泳的改變。分子移動(dòng)通過(guò)的溶液可以是通常在毛細(xì)管中自 由的，或者其可以嵌入基質(zhì)中。常見基質(zhì)包括聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和濾紙。基質(zhì)用 于根據(jù)尺寸篩分分子，導(dǎo)致更好的分離。溶液Ph(酸度)影響分子電荷，并且可以被改變 (甚至從基質(zhì)一端至另一端)以影響分子的遷移速率。溶液可以包括引起蛋白質(zhì)和核酸分 子解折疊以使相同質(zhì)量和電荷的分子的遷移率相同的變性劑，例如尿素。待電泳的樣品可 以用洗滌劑(例如SDS)預(yù)處理，所述洗滌劑包裹所有蛋白質(zhì)以消除電荷差異，以便遷移速 率取決于質(zhì)量而非電荷。然而，對(duì)于需要結(jié)合劑(例如抗體、抗體片段或適體)的大多數(shù)分 析而言，蛋白質(zhì)和結(jié)合劑都可能需要保持為其天然狀態(tài)，以使改變PH或變性蛋白質(zhì)的過(guò)程通常不是可行的選擇。蛋白質(zhì)的檢測(cè)本文某些實(shí)施方案涉及將異質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性分析轉(zhuǎn)化為同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，異質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析可以轉(zhuǎn)化為同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。在一些實(shí)施方案 中，這些轉(zhuǎn)化的某些優(yōu)點(diǎn)包括減少了通常伴隨異質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的勞動(dòng)密集和高成本 步驟和限制。此外，這些轉(zhuǎn)化允許同質(zhì)性免疫分析的幾種形式。在其他實(shí)施方案中，幾乎或 完全在溶液相中進(jìn)行本文涵蓋的分析可以具有其他潛在的動(dòng)力學(xué)優(yōu)點(diǎn)。而在其他實(shí)施方案 中，涵蓋了同質(zhì)性競(jìng)爭(zhēng)性分析較大分子的組合物、方法和裝置。例如，這些分析可以是免疫 分析或使用其他結(jié)合劑的分析。在某些實(shí)施方案中，競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析可以在數(shù)分鐘而非數(shù) 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行并且具有降低的成本和對(duì)靶分子提高的靈敏度。在示例性實(shí)施方案中，使用的物質(zhì)可以包括下述的一種或多種aplidin、阿扎 立濱、阿那羅唑、氮胞苷、博來(lái)霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑制素-1、白消安、刺孢 霉素、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬、伊立替康(CPT-Il)、 SN-38、卡鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、多西他齊(docetaxel)、更生霉 素、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星 (2P-D0X)、氰基-嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫 司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3' ,5' -0-二油酰 基-FudR(FUdR-dO)、氟達(dá)拉濱、氟他米特、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥 脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氫葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲孕酮 (medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6_巰基嘌呤、氨甲蝶呤、 米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、 PSI-341、司莫司汀鏈脲菌素、三苯氧胺、紫杉烷類、紫杉酚、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、 塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、velcade、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、蓖麻毒 蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase, rapLRU DNA酶I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商 陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單孢菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、反義寡核苷酸、干 擾RNA或其組合。適體在某些實(shí)施方案中，使用的結(jié)合劑可以是適體。構(gòu)建和確定適體結(jié)合特征的方法 是本領(lǐng)域公知的。例如，這樣的技術(shù)描述于美國(guó)專利第5，582，981、5，595，877和5，637，459 號(hào)，每一個(gè)通過(guò)引用并入本文。適體可以通過(guò)包括合成、重組和純化方法在內(nèi)的任何已知方法制備，并且可以單 獨(dú)使用或者與特異性針對(duì)相同靶的其他配體組合使用。一般，最少約3個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少 5個(gè)核苷酸是實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合所必要的。比10個(gè)堿基短的序列的適體可能是可行的，盡管 10,20,30或40個(gè)核苷酸的適體可能是優(yōu)選的。適體需要含有賦予結(jié)合特異性的序列，但可以側(cè)翼區(qū)擴(kuò)展和以其他方式衍生。在 進(jìn)一步實(shí)施方案中，側(cè)翼序列可以包含優(yōu)先識(shí)別或結(jié)合部分以增強(qiáng)適體固定于底物的特異 性序列。適體可以如常規(guī)DNA或RNA分子一樣被分離、測(cè)序和/或擴(kuò)增或合成。可選地，感 興趣的適體可以包含修飾的寡聚體。通常存在于適體中的任何羥基可以被膦酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)替代，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)，或者被活化以制備與其他核苷酸的額外鍵合，或者可以軛合于固相支持體。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可以被可選的連接基團(tuán)所替代，例如P(O)0被P(0) S、P(O)NR2, P(0)R、P(O)OR’、CO或CNR2替代，其中R是H或烷基(1-20C)并且R’是烷基 (1-20C)；此外，該基團(tuán)可以通過(guò)0或S連接于相鄰核苷酸。并不是寡聚體中所有的鍵合都 需要相同。用作確定特異性結(jié)合序列的本發(fā)明方法中起始材料的適體可以是單鏈或雙鏈DNA 或RNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述序列可以是單鏈DNA，其比RNA較不易受核酸酶降解。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，起始適體將含有隨機(jī)化的序列部分，一般包括約10至400個(gè)核苷酸、更優(yōu) 選20至100個(gè)核苷酸。隨機(jī)化序列側(cè)翼為引物序列，所述引物序列允許擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)與靶結(jié)合 的適體。為了合成隨機(jī)化區(qū)，可以在合成過(guò)程中在希望隨機(jī)化的位置添加核苷酸混合物。與感興趣的特定靶分子結(jié)合的適體的制備和篩選方法是本領(lǐng)域公知的并涵蓋在 本文中。技術(shù)一般涉及從候選適體混合物選擇和分步重復(fù)結(jié)合、分離結(jié)合適體與未結(jié)合適 體以及擴(kuò)增。因?yàn)榛旌衔镏袃H存在少數(shù)對(duì)應(yīng)于最高親和力適體的序列(可能僅一個(gè)適體分 子)，一般希望設(shè)置劃分標(biāo)準(zhǔn)以使混合物中顯著量的適體(大約5-50%)在分離過(guò)程中被 保留。每個(gè)循環(huán)導(dǎo)致對(duì)靶高親和力的適體的富集。三至六個(gè)選擇和擴(kuò)增循環(huán)的重復(fù)可以用 于產(chǎn)生與感興趣的靶分子高親和力和特異性結(jié)合的適體。成像劑和放射性同位素在某些實(shí)施方案中，靶分子(例如肽或蛋白質(zhì))可以連接于用于成像和診斷各種 患病器官、組織或細(xì)胞類型的成像劑。許多適合的成像劑以及它們連接至蛋白質(zhì)或肽的方 法是本領(lǐng)域已知的。某些連接方法可以涉及使用金屬螯合劑絡(luò)合物，采用例如有機(jī)螯合劑 例如DTPA與蛋白質(zhì)或肽連接。靶分子也可在偶合劑(例如戊二醛或高碘酸鹽)存在下與 酶反應(yīng)。與熒光素標(biāo)志物的軛合物在這些偶合劑存在下或通過(guò)與異硫氰酸鹽反應(yīng)制備。可能用作成像劑的順磁離子的非限制性實(shí)例包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵 (II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、 鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)，釓是特別優(yōu)選的。用于其他環(huán)境例如X射線成像中的離子 包括但不限于鑭(III)、金(III)、鉛(II)和特別是鉍(III)?？赡苡米鞒上駝┗蛑委焺┑姆派湫酝凰匕?11、14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、 銅 62、銅 64、銅 fV52EiU氟 18、鎵 67、鎵 68、3 氫、碘 123、碘 124、碘 125、碘 131、銦 m、52 鐵、59 鐵、32 磷、 33磷、錸186、錸188、Sc47、75硒、銀m、35硫、锝-、锝 、釔86和釔9°。125I通常優(yōu)選用于某些實(shí) 施方案，并且锝99m和銦111也由于其低能量和適合遠(yuǎn)程檢測(cè)而通常是優(yōu)選的。放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法生成。例如，它們可以通過(guò) 與碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑(例如次氯酸鈉)或酶氧化劑(例如乳過(guò)氧化物酶)接 觸而被碘化。蛋白質(zhì)或肽可以通過(guò)配體交換過(guò)程或直接標(biāo)記技術(shù)而被锝"""標(biāo)記，所述配體 交換過(guò)程例如通過(guò)用亞錫溶液還原高锝酸鹽、將還原的锝螯合至葡聚糖凝膠柱并將肽施加 于該柱，所述直接標(biāo)記技術(shù)例如通過(guò)孵育高锝酸鹽、還原劑(例如SNCl2)、緩沖溶液(例如 酞酸鈉_鉀溶液)和肽。通常用于將作為金屬離子存在的放射性同位素結(jié)合至肽的中間官 能團(tuán)包括二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、D0TA、ΝΟΤΑ、卩卜啉螯合劑和乙二胺四乙酸(EDTA)。還 考慮使用的有熒光標(biāo)記物，包括若丹明、異硫氰酸熒光素和腎造影劑。在某些實(shí)施方案中，要求保護(hù)的蛋白質(zhì)或肽可以連接至第二結(jié)合配體或酶(酶標(biāo)簽)，其在與生色底物接觸后會(huì)產(chǎn)生帶色產(chǎn)物。適合的酶的實(shí)例包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)氫過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的第二結(jié)合配體是生物素和抗生物素蛋白或鏈霉 抗生物素蛋白化合物。這種標(biāo)記物的使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。這些熒光標(biāo) 記物對(duì)于體內(nèi)使用而言是優(yōu)選的，但也可以用于體外應(yīng)用、特別是內(nèi)窺鏡或血管內(nèi)檢測(cè)程序。在可選實(shí)施方案中，靶分子可以用熒光標(biāo)志物標(biāo)記?？晒鈾z測(cè)標(biāo)記物的非限制 性實(shí)例包括 Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、B0DIPY630/650、BODIPY 650/665、 B0DIPY-FL、B0DIPY-R6G、B0DIPY-TMR、B0DIPY-TRX、5-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二 甲氧基熒光素、5-羧基-2'，4'，5'，7' _四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基若丹明、 6_羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、級(jí)聯(lián)藍(lán)(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、6_FAM、丹磺 酰氯、熒光素、HEX、6-J0E、NBD (7-硝基苯_2_氧-1，3- 二唑)、俄勒R綠488、俄勒岡綠 500、俄勒網(wǎng)綠514、太平洋藍(lán)、酞酸、對(duì)酞酸、異酞酸、甲酚紫(cresyl fast violet)、甲 酚藍(lán)紫(cresyl blue violet)、亮甲酚藍(lán)、對(duì)氨基苯甲酸、藻紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃 嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴合物(rare earth metal cryptates)、銪三聯(lián)吡啶二胺 (europiumtrisbipyridine diamine)、銪穴合物或螯合物、二胺、雙花青苷、La Jolla藍(lán)染 料、別藻藍(lán)蛋白(allopycocyaninhallococyanin B、藻藍(lán)蛋白C、藻藍(lán)蛋白R(shí)、硫胺素、藻紅 藍(lán)蛋白、藻紅蛋白R(shí)、REG、若丹明綠、異硫氰酸若丹明、若丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四 甲基若丹明異硫醇)、四甲基若丹明和德克薩斯紅。這些和其他發(fā)光標(biāo)記物可以獲自商業(yè)來(lái) 源例如 Molecular Probes (Eugene, OR)。使用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物可以包括魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶 鹽和草酸酯或生物發(fā)光化合物例如熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白?？梢岳缭谑中g(shù)中、 內(nèi)窺鏡或血管內(nèi)腫瘤或疾病診斷中使用診斷免疫軛合物。在各種實(shí)施方案中，使用的標(biāo)記物可以包含金屬納米粒子。制備納米粒子的方法 是已知的。納米粒子可以獲自商業(yè)來(lái)源(例如，Nanoprobeslnc.，Yaphank，NY)。修飾的納 米粒子可商業(yè)獲得，例如來(lái)自Nanoprobes，Inc. (Yaphank，NY)的Nanogold 納米粒子。用 于軛合蛋白質(zhì)或肽的功能化納米粒子可以商業(yè)獲得。交聯(lián)劑在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或肽可以使用本領(lǐng)域已知的各種交聯(lián)試劑標(biāo)記，所述 交聯(lián)試劑例如同-雙官能、異-雙官能和/或可光活化的交聯(lián)試劑。這樣的試劑的非限制 性實(shí)例包括雙酰亞胺酯；1，5-二氟-2，4-( 二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯；酒 石酸二琥珀酰亞胺酯；二甲基_3，3' - 二硫-雙丙亞氨酸酯；N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶 基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯基疊氮基苯；和4-疊氮乙二醛。在示例性實(shí) 施方案中，碳二亞胺交聯(lián)劑(例如DCCD或EDC)可以用于交聯(lián)酸性殘基與氨基或其它基團(tuán)。 這樣的試劑可以被修飾以連接各種類型的標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物。雙官能交聯(lián)試劑已經(jīng)廣泛用于各種目的。攜帶兩個(gè)相同官能團(tuán)的同雙官能試劑證 明高效誘導(dǎo)相同和不同大分子或大分子亞基之間的交聯(lián)以及多肽配體與其特異性結(jié)合位 點(diǎn)的交聯(lián)。異雙官能試劑含有兩個(gè)不同的官能團(tuán)。通過(guò)利用兩個(gè)不同官能團(tuán)的差別的反應(yīng) 性，交聯(lián)可以被選擇地并順序地控制。雙官能交聯(lián)試劑可以根據(jù)它們的官能團(tuán)的特異性來(lái) 衍生，所述官能團(tuán)例如氨基、巰基、胍基、吲哚、羧基特異性基團(tuán)。這些中，針對(duì)游離氨基的試劑已經(jīng)特別流行，因?yàn)樗鼈兊目缮虡I(yè)獲得性、容易合成以及并且它們可以被應(yīng)用的溫和反 應(yīng)條件。大部分異雙官能交聯(lián)試劑含有伯胺_反應(yīng)性基團(tuán)和硫醇_反應(yīng)性基團(tuán)。在另一實(shí)例中，異雙官能交聯(lián)試劑和使用所述交聯(lián)試劑的方法被描述(美國(guó)專利 5，889，155，通過(guò)引用并入本文)。交聯(lián)試劑組合了親核酰胼殘基與親電馬來(lái)酰亞胺殘基，在 一個(gè)實(shí)例中允許乙醛偶聯(lián)至游離硫醇。交聯(lián)試劑可以被修飾以交聯(lián)各種官能團(tuán)。如本領(lǐng)域已知，任何可區(qū)別的組分可以任何方式與樣品中待檢測(cè)的感興趣的靶分 子共價(jià)連接或結(jié)合。符號(hào)a =離心加速度[cm/s2]e=電子或質(zhì)子的單位電荷[1.6X10-19C(庫(kù)倫)]f =施加力[g cm/s2]ff =摩擦力[g cm/s2]r =分子的流體動(dòng)力學(xué)半徑[cm]m=遷移率[s/g]M=分子量[g/摩爾]N =阿伏加德羅常數(shù)(6. 023 X 1023/摩爾)s =斯韋柏系數(shù)[10-13s]u =電泳遷移率[cm2/s_V]v =粒子通過(guò)流體的速度[cm/s]z=分子上的凈電荷n =流體粘度[g/cm-s]p =分子密度[g/cm3]pf =流體密度[g/cm3]V=電場(chǎng)[伏/cm]ff = 6 3i r n v(方程 1)m = v/ff = 1/(6 3i rn) (方程 2a)<formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 16</formula>
<formula>formula see original document page 16</formula>/
<formula>formula see original document page 16</formula>
<formula>formula see original document page 17</formula><formula>formula see original document page 17</formula>計(jì)算機(jī)軟件在本文涵蓋的某些實(shí)施方案中，用于本文公開方法的有關(guān)反應(yīng)室和具有一個(gè)或多 個(gè)反應(yīng)室的系統(tǒng)的軟件應(yīng)用(例如，EVEIA分析和EVEIA儀器)可以使用本領(lǐng)域已知用于 此類方法的任何軟件編寫?？梢允褂密浖_發(fā)程序，例如Java Developers Kit (例如JDK 1.5. 06)和Eclipse集成開發(fā)環(huán)境(例如版本3. 2)，包括與隨購(gòu)買的硬件提供的驅(qū)動(dòng)器連 接的一些適配軟件。本文使用的軟件是高度模塊化的，由超過(guò)一百個(gè)編寫的類(軟件模塊) 組成，其轉(zhuǎn)而取決于JDK中包含的數(shù)百個(gè)類。Eclipse IDE組合了先進(jìn)的代碼編輯器與編譯 器和文件管理系統(tǒng)。軟件用戶將看到一套至少三個(gè)不同的應(yīng)用。在一個(gè)應(yīng)用中，軟件控制裝置，收集并 保存數(shù)據(jù)至文件，并提供運(yùn)行中的實(shí)時(shí)顯示。在另一應(yīng)用中，軟件提供運(yùn)行中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)顯 示。此外，第三個(gè)應(yīng)用允許比較來(lái)自不同運(yùn)行的數(shù)據(jù)。所有應(yīng)用允許簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分析(峰 高和峰面積)。在其他實(shí)施方案中，控制器應(yīng)用由兩個(gè)或更多個(gè)窗口組成。至少一個(gè)窗口顯示照 相機(jī)捕獲的圖像，并為用戶提供選擇感興趣區(qū)域進(jìn)行圖像分析的工具。至少第二個(gè)窗口提 供對(duì)于分析數(shù)據(jù)獲得的控制，包括暴露時(shí)間、暴露間隔時(shí)間和運(yùn)行總長(zhǎng)。在這時(shí)，對(duì)儀器的 控制限于在規(guī)定時(shí)間打開激光器并持續(xù)規(guī)定時(shí)長(zhǎng)(或控制快門來(lái)實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果)，請(qǐng)求照 相機(jī)捕獲規(guī)定暴露時(shí)間的圖像，并且請(qǐng)求圖像下載到計(jì)算機(jī)?；€數(shù)據(jù)也可被獲取或從之 前保存的運(yùn)行載入。每次運(yùn)行保存的文件包括順序保存的每個(gè)單獨(dú)時(shí)間點(diǎn)的原始數(shù)據(jù)。改 變數(shù)據(jù)顯示方式(下一段詳述)不改變保存的數(shù)據(jù)。在某些實(shí)施方案中，控制器應(yīng)用的第二個(gè)窗口(參見圖13A-13B)也能實(shí)時(shí)顯示數(shù) 據(jù)，并且提供改變數(shù)據(jù)顯示方式的工具。數(shù)據(jù)可以顯示為每次暴露的感興趣區(qū)域的原始圖 像(例如參見圖12，左圖)，為強(qiáng)度跨感興趣區(qū)域與軸向位置放射狀平均的圖像曲線，或兩 者。每個(gè)曲線的高度(y_刻度)和相鄰曲線之間的y_重疊量(從無(wú)重疊到完全重疊)可 以全部通過(guò)圖形用戶界面實(shí)時(shí)改變。此外，曲線上的區(qū)域可以被用戶選擇進(jìn)行簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)分 析(峰高和峰面積)，其被實(shí)時(shí)顯示。該數(shù)據(jù)顯示特征對(duì)于程序組內(nèi)所有應(yīng)用是常見的，并 且是軟件模塊基礎(chǔ)的實(shí)例，因?yàn)橄嗤念愑糜谒星闆r。在其他實(shí)施方案中，第二個(gè)應(yīng)用允許控制器應(yīng)用中保存的任何運(yùn)行的重放(參見 例如圖13B)。外觀上，這與控制應(yīng)用的第二窗口基本相同；然而，必須處理運(yùn)行控制的按鈕 和域被檢索保存的運(yùn)行并控制其顯示方式所必需的按鈕和域替代。例如，通過(guò)將顯示的曲 線數(shù)目限制為一個(gè)并通過(guò)使一系列曲線(代表單個(gè)時(shí)間點(diǎn))以200毫秒的間隔顯示，保存 的運(yùn)行可以重新顯示為影片。而在其他實(shí)施方案中，第三個(gè)應(yīng)用允許顯示和比較不同運(yùn)行所保存的數(shù)據(jù)的曲線 (參見例如圖14)。目前，從大約十次不同運(yùn)行保存的文件可以被選擇來(lái)顯示。來(lái)自每次運(yùn)行的任何單曲線(代表單個(gè)時(shí)間點(diǎn))可以與來(lái)自所有其他選擇的運(yùn)行的單曲線一起顯示。 對(duì)于單獨(dú)運(yùn)行或?qū)τ诓秸{(diào)一致的所有運(yùn)行，時(shí)間點(diǎn)可以正向或反向的順序顯示。系統(tǒng)本文公開的其他實(shí)施方案涉及到被設(shè)計(jì)來(lái)運(yùn)行分析、收集分析數(shù)據(jù)并分析本文涵 蓋的分析信息的系統(tǒng)。其他實(shí)施方案涉及評(píng)估、讀取、記錄和/或處理本文公開方法所提供 數(shù)據(jù)的系統(tǒng)。根據(jù)這些實(shí)施方案，可以是本文公開的系統(tǒng)的部分的裝置可以是反應(yīng)室。一 個(gè)示例性反應(yīng)室可以包括但不限于至少兩個(gè)電極(例如鉬電極，陰極和陽(yáng)極)(901)，每一 個(gè)可操作連接到至少一個(gè)電極端子(902)。此外，每個(gè)電極位于反應(yīng)室一端(例如頂部和底 部)的至少一個(gè)緩沖液貯器(903)中，其中每個(gè)緩沖液貯器具有至少一個(gè)橡膠墊片(例如 硅)(904)。根據(jù)可構(gòu)成反應(yīng)室的這些組件，反應(yīng)室可以還包括一個(gè)或多個(gè)透析膜(905)(例 如在反應(yīng)室的頂部和底部)、至少一個(gè)石英反應(yīng)通道(906)、至少一個(gè)通道托架(907)和位 于至少一個(gè)緩沖液貯器與至少一個(gè)反應(yīng)通道之間的至少兩個(gè)電壓傳送通道(908)。本文公開的其他實(shí)施方案包括一種裝置，所述裝置包括作為系統(tǒng)的部分的反應(yīng) 室。本文涵蓋的系統(tǒng)可以包括但不限于電壓源、定位成與反應(yīng)室(900)相互作用的激光器 (例如，連續(xù)波激光器)(1001)、從激光器發(fā)射的激光束(1002)、能夠指導(dǎo)反應(yīng)室(900)內(nèi)可 追蹤劑_靶分子復(fù)合物的偏轉(zhuǎn)激光束的光束發(fā)射的整形棱鏡(例如，激光線束整形棱鏡) (1003)、反應(yīng)通道(906)、光發(fā)射(例如發(fā)射的熒光)(1006)、與照相機(jī)(例如，電荷耦合器 件照相機(jī))(1008)可操作連接的透鏡和過(guò)濾器(1007)以及任選地從系統(tǒng)接收數(shù)據(jù)的計(jì)算 機(jī)。在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還可包括用于將樣品加載入反應(yīng)室的加載設(shè)備(例如自動(dòng)化 的加載設(shè)備)(1101)、能夠從一個(gè)反應(yīng)室旋轉(zhuǎn)至下一個(gè)反應(yīng)室的滾筒(1102)和置于滾筒周 圍的多個(gè)反應(yīng)室(1103)。該系統(tǒng)的一個(gè)特征是有能力使用可追蹤劑和檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量靶分子 的存在或不存在，其中靶分子的檢測(cè)或濃度測(cè)量可以在一小時(shí)或更短時(shí)間、45分鐘或更短 時(shí)間、30分鐘或更短時(shí)間、或者15分鐘或更短時(shí)間內(nèi)評(píng)估。本文涵蓋的其他實(shí)施方案可以包括用于記錄、處理和顯示從本文公開的組合物和 方法獲得的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)和計(jì)算機(jī)軟件。在某些實(shí)施方案中，例如圖12所示的實(shí)施方案 中，示例性軟件的截屏可以包括照相機(jī)(1008)捕獲的圖像。本文涵蓋的軟件程序的進(jìn)一步 實(shí)施方案可以允許選擇待分析的區(qū)域，例如進(jìn)行條帶強(qiáng)度分析和/或評(píng)估靶分子復(fù)合物濃 度。根據(jù)這些實(shí)施方案，預(yù)期計(jì)算機(jī)軟件程序?qū)⒃试S評(píng)估和分析多個(gè)反應(yīng)室實(shí)驗(yàn)和多種樣 品的靶分子分析。如圖12所示，每次分析運(yùn)行的右窗口參數(shù)(例如暴露時(shí)間、暴露間隔時(shí) 間、暴露次數(shù))可以被設(shè)置，然后數(shù)據(jù)可以被顯示，允許在線分析數(shù)據(jù)。光的軸向傳遞本文涵蓋的一些實(shí)施方案涉及其中激發(fā)光可以包括軸向傳遞至反應(yīng)室并且經(jīng)反 應(yīng)室壁進(jìn)行檢測(cè)的系統(tǒng)或裝置。該技術(shù)相對(duì)于光經(jīng)圓柱體或器皿壁的傳遞的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在 于原始光源的完全強(qiáng)度可以傳遞貫穿圓柱體的完整長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，如果光經(jīng)圓 柱體壁傳遞，則光可能需要散布以有效覆蓋圓柱體長(zhǎng)度，從而降低其強(qiáng)度。在其他實(shí)施方 案中，待傳遞的光(例如，激光或其他相當(dāng)?shù)墓?可能需要根據(jù)貫穿圓柱體平均強(qiáng)度分布 來(lái)校準(zhǔn)。光可以從光源直接軸向瞄準(zhǔn)穿過(guò)圓柱體，或者光源可以通過(guò)鏡子或棱鏡來(lái)導(dǎo)向。 任選地，如果光經(jīng)圓柱體底部傳遞，則任選地，透明窗(例如藍(lán)寶石、石英、玻璃或光學(xué)透明 塑料)或等價(jià)物可能需要置于圓柱體的底部以允許光進(jìn)入。在其他實(shí)施方案中，如果光經(jīng)圓柱體頂部傳遞，則可能需要額外步驟以處理圓柱體頂部流體組分形成的彎液面的透鏡效應(yīng)。示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)概述本發(fā)明實(shí)施方案包括各種元素，其中許多可以由硬件組件執(zhí)行或者可以機(jī)器可執(zhí) 行指令實(shí)現(xiàn)，所述計(jì)算機(jī)可執(zhí)行指令可用于使得編有所述指令的通用或?qū)Ｓ锰幚砥鲗?shí)現(xiàn)所 述元素(參見例如圖21)。可選地，步驟可以通過(guò)硬件、軟件和/或穩(wěn)固件的組合來(lái)執(zhí)行。 因此，圖20是實(shí)施方案可以利用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2000的實(shí)例。根據(jù)一個(gè)示例性方法，計(jì)算機(jī) 系統(tǒng)包括總線2001、至少一個(gè)處理器2002、至少一個(gè)通信端口 2003和主存儲(chǔ)器2004。系統(tǒng) 2000還可以包括可移動(dòng)存儲(chǔ)介質(zhì)(未顯示)、只讀存儲(chǔ)器2005和/或大容量?jī)?chǔ)存器組件/ 設(shè)備2007。處理器2002可以是任何已知的處理器，包括但不限于Intel Itanium 或 Itanium 2 處理器、或AMD Opteron .或 Athlon MP 處理器、或Motorola 行處理 器。通信端口 2003可以用于基于調(diào)制解調(diào)器的撥號(hào)連接的任何RS-232端口、10/100以太 網(wǎng)端口或使用銅或光纖的千兆端口。通信端口 2003可以根據(jù)網(wǎng)絡(luò)選擇，所述網(wǎng)絡(luò)例如局域 網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)或計(jì)算機(jī)系統(tǒng)2000連接的任何網(wǎng)絡(luò)。主存儲(chǔ)器2004可以是隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)或者本領(lǐng)域公知的任何其他動(dòng)態(tài)存 儲(chǔ)設(shè)備。只讀存儲(chǔ)器2005可以是任何靜態(tài)存儲(chǔ)設(shè)備，例如用于存儲(chǔ)靜態(tài)信息(例如處理器 2002的指令)的可編程只讀存儲(chǔ)器(PR0M)芯片。大容量?jī)?chǔ)存器2006可用于存儲(chǔ)信息和指令。例如，可以使用硬盤(諸如 Adaptec 系列的SCSI設(shè)備)、光盤、磁盤陣列(諸如RAID，諸如Adaptec系列RAID設(shè)備) 或任何其他大容量存儲(chǔ)設(shè)備?？偩€2001將處理器2002與其他存儲(chǔ)器、儲(chǔ)存器和通信塊通信偶聯(lián)。根據(jù)使用的 存儲(chǔ)設(shè)備，總線2001可以是基于PCI/PCI-X或SCSI的系統(tǒng)總線?？梢苿?dòng)存儲(chǔ)介質(zhì)可以是任何類型的外部硬盤、軟盤、IOMEGA Zip驅(qū)動(dòng)器、只 讀存儲(chǔ)光盤(CD-ROM)、可重寫光盤(CD-RW)、只讀存儲(chǔ)數(shù)字視頻光盤(DVD-ROM)。顯示器(未 顯示)可以是可操作來(lái)提供參數(shù)模型的視覺展示(例如分析的實(shí)時(shí)運(yùn)行顯示)并允許用戶 觀看、改變和根據(jù)本文實(shí)施方案與參數(shù)模型互動(dòng)的任何設(shè)備，包括但不限于圖形網(wǎng)絡(luò)界面 和計(jì)算機(jī)監(jiān)視器。上文描述的組件意為示例一些類型的可能性。前述實(shí)例絕不應(yīng)該限制本發(fā)明范 圍，因?yàn)樗鼈儍H是示例性實(shí)施方案。在其他實(shí)施方案中，在樣品(例如，可能具有感興趣的靶分子)被制備并載入示例 性反應(yīng)室后，接收操作2101接收來(lái)自結(jié)合的可追蹤劑_靶分子復(fù)合物或未結(jié)合的可追蹤 劑-靶分子復(fù)合物的發(fā)射數(shù)據(jù)。另一個(gè)接收操作2103接收數(shù)據(jù)并可以計(jì)算感興趣靶分子的 對(duì)照濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些實(shí)施方案2100中，每個(gè)接收操作可以使用所公布的方程的一 個(gè)或多個(gè)來(lái)計(jì)算樣品中靶分子的濃度。每個(gè)系統(tǒng)可被配置以基于操作員輸入來(lái)分析一種或 多種感興趣的靶分子。本文預(yù)期某些公開的方法和或裝置可簡(jiǎn)單測(cè)量結(jié)合的可追蹤劑-靶 分子復(fù)合物而不是未結(jié)合的可追蹤劑_靶分子復(fù)合物。產(chǎn)生操作2103或2105基于接收的數(shù)據(jù)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線或遷移率曲線。另一個(gè)產(chǎn)生 操作2107產(chǎn)生感興趣的靶分子(如果存在)的濃度曲線。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解如何能在產(chǎn)生操作2103和2105中產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。推導(dǎo)操作2107推導(dǎo)樣品中存在的靶分子的量。一般，推導(dǎo)操作2107基于操作員 選擇的數(shù)據(jù)點(diǎn)或選擇的發(fā)射值產(chǎn)生代表樣品的模型數(shù)據(jù)。免疫分析以可靠方式測(cè)量蛋白質(zhì)濃度的重要性已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)了許多涉及抗體或抗體樣分 子的分析。Gosling(1990)深入描述了目前使用的許多免疫分析，通過(guò)引用并入本文。以下 描述使用抗體作為結(jié)合劑，但在許多情況下，F(xiàn)ab片段或適體可以替代使用。然而，本文描 述的方法和組合物不受此限制，并且在其他實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是例如生物受體。許多 這樣的受體(例如胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體、乙酰膽堿受體、GABA受體、血管 緊張素(antiotensin)受體、胰高血糖素受體、趨化因子受體、細(xì)胞因子受體、等等)是本領(lǐng) 域公知的，并且任何此類已知受體或其配體結(jié)合片段可用于實(shí)施要求保護(hù)的方法。檢測(cè)和/或確定濃度通常如下提供用信號(hào)部分(signal moiety)標(biāo)記抗體或其 它結(jié)合分子，所述信號(hào)部分例如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性或本領(lǐng)域已知的其他標(biāo)簽；使結(jié)合 分子與靶結(jié)合；并檢測(cè)或測(cè)量與結(jié)合的抗體關(guān)聯(lián)的發(fā)射、放射性等的量。在大多數(shù)情況下， 信號(hào)系統(tǒng)的選擇對(duì)于方法而言不是核心的。為熒光信號(hào)與抗體軛合的分子(例如FITC或 若丹明)可通常被例如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶的酶替代(如果需要比色分析)或者 被諸如碳酸酐酶或脲酶的酶替代(電導(dǎo)率分析)。然而，酶分析需要添加適當(dāng)?shù)牡孜?。針?duì)將信號(hào)分子直接軛合于結(jié)合靶蛋白的抗體(一級(jí)抗體)所普遍采用的可選方 法是采用與信號(hào)分子軛合的二級(jí)抗體。二級(jí)抗體是被開發(fā)以結(jié)合來(lái)自某些物種的所有抗體 的抗體(并因此必然來(lái)自不同的物種)。例如，抗體可以從已經(jīng)注射了兔抗體的山羊獲得。 如果這些二級(jí)抗體與信號(hào)分子軛合，則二級(jí)抗體與一級(jí)抗體的結(jié)合提供信號(hào)分子與一級(jí)抗 體的連接而無(wú)化學(xué)軛合。該二級(jí)抗體可以用于連接信號(hào)分子與衍生自相同物種的任何一級(jí) 抗體，從而為分析增加一定的模塊性。異質(zhì)性免疫分析在沒有規(guī)定結(jié)合發(fā)生的固相支持體類型下被描述。然而，使用的 固相支持體的類型代表任何免疫分析過(guò)程的顯著差異，影響不同步驟所需程序和時(shí)間并且 有時(shí)影響將要使用的檢測(cè)類型。例如，在其最常見形式中，夾心ELISA涉及將復(fù)合物結(jié)合至 微量滴定板中孔的底表面，這實(shí)現(xiàn)了容易手工引入洗滌試劑并容易讀取熒光或比色信號(hào)。 然而，分析可能由于質(zhì)量轉(zhuǎn)移的限制而進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)。蛋白質(zhì)需要時(shí)間在主體溶液和表面 停滯層(stagnant layer)之間平衡，并且通常需要多次洗滌。這些問(wèn)題可以通過(guò)使用微珠 作為結(jié)合表面而在一定程度上得到緩解，所述微珠使表面與主體溶液更加緊密接觸并顯著 增加了每單位體積溶液可用于結(jié)合的表面積。然后，固相(珠上)與溶液相在洗滌過(guò)程中 經(jīng)過(guò)濾或離心分離?？梢酝ㄟ^(guò)使用順磁珠而使該過(guò)程更適于自動(dòng)化，所述順磁珠容易與溶 液相磁分離。幾乎所有異質(zhì)性免疫分析可以被調(diào)整以利用這些不同的表面。有兩種常見類型的用于檢測(cè)和/或確定樣品中分子濃度的免疫分析，其在某種程 度上與本文描述的方法相似。首先，就特異性而言，夾心ELISA被認(rèn)為是免疫分析的金標(biāo) 準(zhǔn)。該高度特異性通過(guò)要求兩個(gè)單獨(dú)抗體與感興趣靶同時(shí)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)，一種還用于下述方 法的技術(shù)。其次是親和探針毛細(xì)管電泳分析(APCE)。該分析由以下組成感興趣的靶與單 一一級(jí)抗體結(jié)合，然后經(jīng)毛細(xì)管電泳設(shè)備運(yùn)行混合物，以分離結(jié)合抗體與未結(jié)合抗體。電泳 分離允許整個(gè)分析在溶液中進(jìn)行，一種也在下述方法中使用的技術(shù)。
試劑盒本文涵蓋用于進(jìn)行本文方法的試劑盒。試劑盒可以包括但不限于實(shí)現(xiàn)所公開方法的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)室組合物和用于產(chǎn)生反應(yīng)室的容器?？蛇x地，試劑盒可以除了樣品外僅 包括用于進(jìn)行所公開的分析的試劑。夾心ELISA夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)早先被開發(fā)并已被認(rèn)為是蛋白質(zhì)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)出非常高的特異性和精確性作為其主要優(yōu)點(diǎn)。一些缺點(diǎn)是檢測(cè)蛋白所需時(shí)間和需要大 量步驟。根據(jù)洗滌的嚴(yán)格性和次數(shù)以及孵育步驟的時(shí)長(zhǎng)，Elisa通常進(jìn)行2至6小時(shí)。Elisa的第一步是使靶蛋白的一級(jí)抗體與孔底表面結(jié)合，所述表面已經(jīng)被預(yù)處理 以增加蛋白質(zhì)結(jié)合。所述表面然后用封閉劑例如牛血清白蛋白(BSA)處理以封閉任何剩余 活性位點(diǎn)，從而防止任何其他蛋白質(zhì)結(jié)合和影響測(cè)試的特異性。孔被洗滌多次以去除游離 抗體和封閉劑。推測(cè)含有靶蛋白的樣品被加入孔并孵育預(yù)定時(shí)間。理想地，僅該靶蛋白會(huì)結(jié)合至 表面抗體，并且沒有其他蛋白會(huì)結(jié)合至封閉表面或結(jié)合至表面抗體。進(jìn)行多次洗滌以去除 任何非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。如果有任何非特異性蛋白質(zhì)確實(shí)結(jié)合了，則下一步使它們的 作用最小化。與檢測(cè)分子軛合的靶蛋白的二級(jí)抗體被加入孔并允許結(jié)合。因?yàn)樵摽贵w的特異 性，其很少結(jié)合與表面或第一抗體非特異性結(jié)合的任何蛋白。進(jìn)行多次洗滌以去除任何未 結(jié)合的第二抗體。因?yàn)樵摰诙贵w與檢測(cè)分子軛合，該第二抗體的濃度可以被確定并與原 始樣品中靶蛋白的濃度相關(guān)聯(lián)。親和探針毛細(xì)管電泳(APCE)毛細(xì)管電泳涉及借助帶正電和帶負(fù)電的電極在填充有離子緩沖液的長(zhǎng)毛細(xì)管的 兩端施加電壓，從而導(dǎo)致帶電分子向一個(gè)電極或另一個(gè)電極遷移。一個(gè)常見的伴隨現(xiàn)象被 稱為“電滲流”。玻璃毛細(xì)管往往具有帶負(fù)電的表面，其與溶液中接近表面的帶正電的離子 結(jié)合。這些帶正電的離子向負(fù)電極(陰極)遷移，隨其拖帶主體溶液。該電滲流導(dǎo)致所有 離子向陰極遷移(盡管以不同速率)，并且因?yàn)閱我粰z測(cè)器可以分析所有離子物類，而不論 它們流過(guò)時(shí)的電荷。電滲流可以通過(guò)改變毛細(xì)管壁的電特征而被消除或甚至逆轉(zhuǎn)。對(duì)于APCE，靶分子與已經(jīng)軛合至檢測(cè)分子(通常為熒光探針)的同源抗體一起孵 育。然后將混合物注射入毛細(xì)管并施加電壓，建立電滲流。游離靶、游離抗體和靶/抗體復(fù) 合物將以不同速率遷移(被電滲流放大)，并可以因此通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)為單獨(dú)的峰(游 離靶不應(yīng)該產(chǎn)生信號(hào))。盡管毛細(xì)管電泳比ELISA分析更快速，但可以分析的樣品的小體積 (由于毛細(xì)管的小尺寸)限制了該方法檢測(cè)樣品中極低濃度存在的蛋白質(zhì)或其它靶分子的 靈敏度。用于靶分子檢測(cè)和定量的增強(qiáng)速度的電免疫分析(EVEIA)本文實(shí)施方案提供檢測(cè)和確定樣品中靶分子存在或不存在和/或濃度的快速、高 靈敏度方法，該方法涉及垂直堆積的電泳。因?yàn)镋VEIA技術(shù)的電泳部分發(fā)生在體積和橫截 面積比毛細(xì)管大得多的容器中，這些實(shí)施方案已經(jīng)實(shí)現(xiàn)樣品中低濃度存在的靶分子的檢測(cè) 方法。這里，電泳可以發(fā)生在流體動(dòng)力學(xué)半徑(橫截面積除以周長(zhǎng)再乘以2)為0.5mm或更 大的管、通道或其他容器中。在一些實(shí)施方案中，示例性管內(nèi)部體積為單位長(zhǎng)度管2mm3或更大。在其他實(shí)施方案中，最小流體動(dòng)力學(xué)半徑可以是橫截面積除以周長(zhǎng)再乘以2，為0. 5mm 或更大。例如，約0.75mm的流體動(dòng)力學(xué)半徑提供2mm3/mm長(zhǎng)度。對(duì)于圓管，流體動(dòng)力學(xué)半 徑可以與半徑相同。該實(shí)施方案可用于示例說(shuō)明經(jīng)不規(guī)則形狀通道的流動(dòng)。在本文公開的其他實(shí)施方案中，基本不帶電的聚合物劑可以包括以下的一種或多 種線性聚丙烯酰胺、部分交聯(lián)的聚丙烯酰胺(例如，在組合物保持為流體或液體的固體 凝膠形成點(diǎn)之下交聯(lián))葡聚糖或聚乙二醇或其他類似物質(zhì)或物質(zhì)組合。在其他實(shí)施方案 中，基本不帶電的聚合物劑在本文公開的條件下很少遷移，例如這些物質(zhì)可以在施加電力 lOOv/cm下遷移約0. 1至約1. 0mm/seco在某些實(shí)施方案中，管、通道或容器內(nèi)增加的密度 梯度可以是1. 0至1. lg/ml。在其他實(shí)施方案中，所述梯度可以包括但不限于密度1. 0至 1. 02g/ml的樣品層、密度1. 002至1. 05g/ml的捕獲層和密度1. 01至1. lg/ml的堆積層。 在本文涵蓋的所有實(shí)施方案中，堆積層具有比捕獲層更高的密度，并且捕獲層具有比樣品 層更高的密度。任選地，粘度也可以從頂部到底部增加，以在界面產(chǎn)生堆積效應(yīng)。在某些實(shí) 施方案中，粘度可以是1厘泊但不超過(guò)1. 3。在其他實(shí)施方案中，2厘泊可以是底層粘度的 最大上限值。在本文某些方面中，質(zhì)荷比在公開的復(fù)合物形成時(shí)增加，導(dǎo)致靶分子電泳遷移 率的降低。因?yàn)閺?fù)合物含有非常高的質(zhì)荷比，其在堆積層變得基本不動(dòng)，而未結(jié)合組分遷移 經(jīng)過(guò)堆積層并與復(fù)合物分離。這可以提供能夠短時(shí)間檢測(cè)非常低的靶分子濃度的非?？焖?且靈敏的分析。在一些實(shí)施方案中，本文公開方法可以由以下組成1.獲得感興趣靶分子的第一結(jié)合劑并使可追蹤劑或可跟蹤劑與靶分子的一些以 不干擾感興趣靶分子特異性結(jié)合的方式軛合(但不與其他靶分子軛合)。在某些實(shí)施方案 中，第一結(jié)合劑可以是單克隆抗體、抗體片段(例如Fab)、適體或表現(xiàn)出與感興趣靶特異性 結(jié)合的任何其他分子或分子復(fù)合物。感興趣的靶可以是蛋白質(zhì)、肽、蛋白復(fù)合物或可溶于水 溶液的任何分子?？勺粉檮┗蚩筛檮┛梢允菬晒夥肿印⒎派湫詷?biāo)記物、產(chǎn)生比色產(chǎn)物的 酶、金屬離子、產(chǎn)生可電檢測(cè)產(chǎn)物的酶、或可容易直接或間接檢測(cè)和定量的任何分子或分子 復(fù)合物。2.獲得感興趣的靶分子的第二結(jié)合劑并使捕獲劑與其以不干擾感興趣的靶的 特異性結(jié)合的方式軛合。該第二結(jié)合劑可以是單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如 Fab)、適體或表現(xiàn)出與感興趣靶特異性結(jié)合的任何其他分子或分子復(fù)合物。捕獲劑可以是 生物素、鏈霉抗生物素蛋白、單鏈核酸或能夠高特異性和親和力結(jié)合的任何其他分子或分 子復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，第二結(jié)合劑是多克隆抗體，捕獲劑是與中性抗生物素蛋白復(fù) 合的生物素。3.獲得推測(cè)含有一定量的所述感興趣的靶的樣品，所述量希望被確定。4.準(zhǔn)備由導(dǎo)電水溶液堆積的層組成的垂直電泳室，一些層含有不帶電的聚合物， 這些層以從頂部到底部增加的密度或粘度布置以抑制混合。最頂層由待測(cè)量樣品組成(“ 樣品層")。例如，頂層可以具有l(wèi)g/ml的密度，這些層中每個(gè)隨后層的密度增加約0.2至 5%，并且進(jìn)展為與樣品層的密度或粘度相比密度或粘度約0. 5%、或2%或10%的密度或 粘度增加。樣品層之下的層中的至少一個(gè)將含有與捕獲劑的同源結(jié)合劑軛合的聚合物(“ 捕獲層")。任選地，捕獲層之下的層中的至少一個(gè)將含有相對(duì)高濃度的不帶電的聚合物， 該聚合物用于阻礙與聚合物結(jié)合的復(fù)合物的遷移率(“堆積層")。不帶電的聚合物的濃度可以是約0. 5%至20%重量/體積。5.將所述第一結(jié)合劑、所述第二結(jié)合劑和所述感興趣的靶一起混合并孵育以允許 形成三元復(fù)合物，該三元復(fù)合物由與信號(hào)劑(signalingagent)軛合的第一結(jié)合劑組成，所 述信號(hào)劑結(jié)合至感興趣的靶，所述感興趣的靶與第二結(jié)合劑結(jié)合，所述第二結(jié)合劑與捕獲 劑軛合。6.從一電源(例如，能夠產(chǎn)生10-1，OOOv/cm的電源)在含有混合物的電泳室的垂 直距離兩端施加電勢(shì)。因此，靶分子遷移進(jìn)入捕獲層，其中復(fù)合物將結(jié)合與捕獲劑同源物軛 合的聚合物，顯著降低這些復(fù)合物的遷移率。7.持續(xù)施加電勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)與聚合物結(jié)合的低遷移率復(fù)合物與所有其他分子分 離，因此在時(shí)間和空間上從所有其他信號(hào)劑集中與感興趣的靶締合的信號(hào)劑。8.任選地，持續(xù)施加電勢(shì)，從而使所有靶分子遷移進(jìn)入其中復(fù)合物的遷移率被進(jìn) 一步降低的堆積層，導(dǎo)致含有這些復(fù)合物的條帶壓縮，并實(shí)現(xiàn)與聚合物結(jié)合的低遷移率復(fù) 合物與所有其他分子的進(jìn)一步分離。9.測(cè)量這些所述化合物組的一個(gè)或多個(gè)中的信號(hào)劑，從而確定所述樣品中所述感 興趣的靶的量。
實(shí)施例下述實(shí)施例被包括以說(shuō)明本文提出的某些實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解， 隨后實(shí)施例中公開的技術(shù)代表在本文公開的實(shí)施中作用良好的公開的技術(shù)，并因此被認(rèn)為 構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以對(duì)公開的 具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變并依然獲得類似或相似的結(jié)果而不背離本文精神和范圍。實(shí)施例1在某些實(shí)施方案中，本文的組合物和方法涉及測(cè)量推測(cè)含有靶分子的樣品中靶分 子濃度的組合物和方法。例如，下文可包括下述步驟的全部或一些獲得感興趣的靶分子并將可追蹤分子以不干擾下述結(jié)合劑特異性結(jié)合的方式軛 合至所述靶分子。本文涵蓋的靶分子可以是蛋白質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)復(fù)合物或水溶液中可溶的任 何其他分子。本文涵蓋的可追蹤分子可以是熒光分子、放射標(biāo)記物、產(chǎn)生信號(hào)(例如比色產(chǎn) 物或發(fā)光產(chǎn)物)的酶、產(chǎn)生可電檢測(cè)產(chǎn)物的酶、或可容易直接或間接檢測(cè)和定量的任何分 子或分子復(fù)合物。一個(gè)示例性方法描述于示例性圖1，靶分子是運(yùn)鐵蛋白，并且可追蹤分子 是熒光素。獲得能夠結(jié)合靶分子的結(jié)合劑，并將捕獲劑以不干擾與靶分子特異性結(jié)合的方式 軛合至靶分子。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是抗體、抗體片段(例如Fab)、適體或能夠 特異性結(jié)合靶分子的任何其他分子或分子復(fù)合物。在各種實(shí)施方案中，捕獲劑可以是生物 素、寡核苷酸引物或表現(xiàn)出與同源分子穩(wěn)定、高親和力結(jié)合的任何分子。一個(gè)示例性方法可 以描述于圖2，結(jié)合劑是抗體，并且捕獲劑是生物素-中性抗生物素蛋白復(fù)合物。獲得推測(cè)含有靶分子的樣品并確定靶分子的存在和/或濃度。在一個(gè)示例性方法 中，準(zhǔn)備了垂直電泳室。根據(jù)該方法，室可以由導(dǎo)電水溶液的堆積的層組成。這些層中一些 含有不帶電的聚合物。在某些實(shí)施方案中，這些層可以布置為從頂部到底部具有增加的密 度或粘度以減少層的混合。在該實(shí)施例中，最頂層由待測(cè)量樣品組成(“樣品層")。樣品層以下的層中至少一個(gè)層可含有與捕獲劑的同源結(jié)合劑軛合的聚合物(“捕獲層")。任 選地，捕獲層以下的層中至少一個(gè)層將含有相對(duì)高濃度的不帶電的聚合物。在某些實(shí)施方 案中，不帶電的聚合物可以添加至一層或多層，實(shí)現(xiàn)不帶電的聚合物與靶分子或靶分子復(fù) 合物結(jié)合，與不帶電的聚合物的締合可用于阻礙與聚合物結(jié)合的復(fù)合物的遷移率(“堆積 層〃)。下述步驟代表用于制備可能含有靶分子的樣品并分析樣品中靶分子的存在和/ 或濃度的示例性方法和組合物。例如，第一步可包括將結(jié)合劑、可追蹤劑-靶分子和感興趣 的靶分子(作為待分析樣品的組分)一起混合并孵育以允許形成復(fù)合物。將這些組分混合 可產(chǎn)生包括結(jié)合劑的復(fù)合物，所述結(jié)合劑與樣品中可追蹤劑-靶分子或未標(biāo)記的靶結(jié)合。 在其中結(jié)合劑是多價(jià)的情況下，結(jié)合劑可以結(jié)合至可追蹤劑-靶分子或未標(biāo)記的靶之一或 兩者。這描述于圖3。在可選實(shí)施方案中，結(jié)合劑、可追蹤劑_靶分子、感興趣的靶分子(作為待分析樣 品的組分)與所述捕獲層的組分可以一起混合并孵育，以允許形成復(fù)合物，所述復(fù)合物由 與樣品中所述標(biāo)記的靶或所述未標(biāo)記的靶結(jié)合的所述結(jié)合劑組成，所述結(jié)合劑還經(jīng)由聚合 物締合的捕獲劑的同源結(jié)合劑結(jié)合至所述聚合物。然后，可以在含有混合物的電泳室的兩端施加電勢(shì)以分離復(fù)合物與未結(jié)合的可追 蹤劑_靶分子，因此在時(shí)間和空間上集中這些不同的含有可追蹤劑的化合物組。在一個(gè)實(shí) 施方案中，復(fù)合物將集中在捕獲層和堆積層的界面。測(cè)量與一個(gè)或多個(gè)復(fù)合物締合的或未結(jié)合的可追蹤劑-靶分子。在某些實(shí)施方案 中，樣品中靶分子的存在和/或濃度可以通過(guò)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性分析動(dòng)力學(xué)來(lái)測(cè)量。在一個(gè) 實(shí)施方案中，可以進(jìn)行靶分子濃度的分析確定。例如，來(lái)自其中預(yù)期復(fù)合物占優(yōu)勢(shì)的電泳室 的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的總體信號(hào)可以與來(lái)自其中預(yù)期未結(jié)合可追蹤劑-靶分子占優(yōu)勢(shì)的電 泳室的區(qū)域的總體信號(hào)相比較。這樣的比較可以提供信號(hào)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，因此導(dǎo)致對(duì)樣品 中靶分子濃度的更準(zhǔn)確確定。實(shí)施例2:靶和IgG-靶_捕獲聚合物復(fù)合物的具體遷移率的計(jì)算在一個(gè)示例性方法中，在之前研究中發(fā)現(xiàn)示例性靶蛋白(運(yùn)鐵蛋白)的電泳遷移 率為約9X10_5cm2/s V。根據(jù)方程3C和5并使用80千道爾頓的分子量，可以計(jì)算每個(gè)運(yùn)鐵 蛋白分子的大約帶電荷為_3。IgG具有大約150千道爾頓的分子量。因?yàn)榉肿拥目勺儏^(qū)，電荷范圍可以是負(fù)至略正。該實(shí)施例中使用的電荷的一個(gè)估 計(jì)值為-5。在一個(gè)實(shí)施例中，線性聚丙烯酰胺(LPA)分子可以被使用并與多個(gè)生物素分 子軛合。在多價(jià)中性抗生物素蛋白存在下，聚合物網(wǎng)絡(luò)包括通過(guò)生物素_中性抗生物素蛋 白_生物素鍵合形式交聯(lián)結(jié)合的LPA分子，并且這些網(wǎng)絡(luò)的分子量可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)道爾頓。 由此形成的網(wǎng)絡(luò)的分子量在本實(shí)施例中被認(rèn)為是107道爾頓。根據(jù)方程2C，遷移率與分子 量的立方根成反比。根據(jù)方程5，電泳遷移率與電荷成正比。盡管忽略諸如蛋白質(zhì)和LPA之間密度差 異和LPA水合狀態(tài)等事實(shí)，LPA網(wǎng)絡(luò)分子量的不確定性超過(guò)了這些其他影響，因此對(duì)于大致 估計(jì)的目的而言，這些影響在本示例性方法中將不被考慮?；谟坞x運(yùn)鐵蛋白的電泳遷移 率，運(yùn)鐵蛋白-抗體-LPA網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物的電泳遷移率可由以下表示u= (9X10_5) ((-3+-5)/(-3)) (80/(80+150+10, 000)1/3 = 2Xl(T5cm2/sV。未結(jié)合的運(yùn)鐵蛋白比運(yùn)鐵蛋白-抗體-LPA網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物移動(dòng)快4至5倍。在某些 實(shí)施例中，該差異可以是比這大的數(shù)量級(jí)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，使用毛細(xì)管電泳電壓可以高達(dá)500V/cm。一個(gè)限制是由 于熱產(chǎn)生，熱產(chǎn)生與施加電壓的平方成正比。根據(jù)該示例性方法，通過(guò)施加lOOV/cm，游離分 子以大約0. 5cm/min向陽(yáng)極(正電極)遷移，而完整復(fù)合的運(yùn)鐵蛋白以0. lcm/min沿相同 方向移動(dòng)，允許游離靶分子與那些復(fù)合的靶分子明顯分離。實(shí)施例3 在一個(gè)示例性方法中，感興趣的靶分子是蛋白質(zhì)運(yùn)鐵蛋白。為了測(cè)試本文公開的 某些實(shí)施方案，特異性結(jié)合人運(yùn)鐵蛋白的抗體被獲得并軛合至多價(jià)劑生物素。然后純化抗 運(yùn)鐵蛋白抗體-生物素復(fù)合物。接下來(lái)，純化的人運(yùn)鐵蛋白使用普遍可用的技術(shù)用熒光素 共價(jià)標(biāo)記，所述技術(shù)還允許抗運(yùn)鐵蛋白抗體(例如兔衍生抗體)的特異性結(jié)合。熒光素連接 的運(yùn)鐵蛋白和生物素軛合的抗體與過(guò)量中性抗生物素蛋白和推測(cè)含有濃度約50pM的未標(biāo) 記運(yùn)鐵蛋白的樣品混合。最終混合物具有100pM與生物素軛合的抗運(yùn)鐵蛋白抗體和100pM 熒光素連接的運(yùn)鐵蛋白。該混合物在37°C下孵育5分鐘。樣品/抗體/標(biāo)記的靶混合物被注射進(jìn)入電泳池，施加lOOV/cm的電勢(shì)5分鐘。例 如，參見圖6A-6D。捕獲層中的熒光信號(hào)可以例如使用熒光檢測(cè)器測(cè)量。任選地，捕獲層外 區(qū)域的熒光信號(hào)可以被測(cè)量，代表部分由于樣品中存在未標(biāo)記的運(yùn)鐵蛋白而未與抗體結(jié)合 的熒光素連接的運(yùn)鐵蛋白。這兩種信號(hào)的比較允許更準(zhǔn)確估計(jì)樣品中的靶濃度。在另一實(shí) 施例中，這些步驟可以使用推測(cè)含有多種濃度的靶分子(例如100pM靶分子、200pM靶分子 或無(wú)靶分子)的樣品來(lái)重復(fù)。數(shù)據(jù)可以制表并繪圖，如示例性圖8所述利用與靶濃度成反 比的信號(hào)。此外，含有未知量的靶分子(例如運(yùn)鐵蛋白)的樣品可以按照上述方案來(lái)分析。 使用該實(shí)施例，可以從已知運(yùn)鐵蛋白濃度分析數(shù)據(jù)構(gòu)建的圖(例如，圖8所示"標(biāo)準(zhǔn)濃度曲 線"圖)外推確認(rèn)運(yùn)鐵蛋白濃度。實(shí)施例4 在一個(gè)示例性方法中，來(lái)自概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)示于圖7A-7C。如圖7A-7C所示， 中性抗生物素蛋白用于說(shuō)明三層設(shè)計(jì)如何起作用來(lái)捕獲希望的靶分子并將這些靶聚集成 條帶以檢測(cè)。準(zhǔn)備該分析的電泳池，由三層組成底(〃堆積")層中是tris-乙酸緩沖液 和7. 5%甘油中的線性聚丙烯酰胺；中(〃捕獲")層中是tris-乙酸緩沖液和4%甘油中 的生物素化葡聚糖；和頂(“樣品")層中是tris-乙酸緩沖液中FITC-標(biāo)記的中性抗生 物素蛋白。在對(duì)照運(yùn)行中，捕獲層沒有生物素化的葡聚糖。樣品層在檢測(cè)窗口外集中，在這 些曲線的右側(cè)。當(dāng)向池施加電壓時(shí)，中性抗生物素蛋白遷移(向左)入捕獲層，其在那里結(jié) 合生物素化的聚合物，顯著降低其遷移率。當(dāng)中性抗生物素蛋白-聚合物復(fù)合物到達(dá)堆積 層時(shí)，線性聚丙烯酰胺的存在將復(fù)合的中性抗生物素蛋白的前進(jìn)速度變慢，幾乎到靜止，聚 集條帶。對(duì)照運(yùn)行中的游離中性抗生物素蛋白自由移動(dòng)通過(guò)捕獲層和堆積層。根據(jù)本公開內(nèi)容可以制成并實(shí)施本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法 和/或裝置，而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。雖然已經(jīng)就優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是可以對(duì)本文描述的組合物和/或方法和/或裝置以及方法 中的步驟或步驟的順序進(jìn)行改變，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體說(shuō)，明顯的是，在化學(xué)上和生理上相關(guān)的某些物質(zhì)可以替代本文描述的物質(zhì)，同時(shí)獲得相同或類似的 結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的所有這樣類似的替代物和修飾被認(rèn)為在所附權(quán)利要求限 定的本發(fā)明精神、范圍和概念內(nèi)。
權(quán)利要求
一種組合物，用于分離樣品中的靶分子，所述組合物包括從頂部到底部密度增加或粘度增加的垂直放置的兩個(gè)或更多個(gè)相，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)相的一個(gè)或更多個(gè)相含有一種或更多種基本不帶電的聚合物劑，其中所述基本不帶電的聚合物劑能夠與經(jīng)所述含有所述一種或更多種基本不帶電的聚合物劑的相電泳的結(jié)合劑締合，并且其中所述基本不帶電的聚合物劑能夠與捕獲分子締合。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合劑能夠與靶分子締合。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述結(jié)合劑與靶分子締合形成第一復(fù)合物，并且 所述基本不帶電的聚合物劑與所述第一復(fù)合物的結(jié)合劑締合形成第二復(fù)合物。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中一個(gè)或更多個(gè)相在靶分子向底部遷移時(shí)逐漸降低 所述靶分子的遷移率。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中一個(gè)或更多個(gè)相完全抑制靶分子或靶分子復(fù)合物 的遷移率。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述靶分子包括蛋白質(zhì)或肽。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基本不帶電的聚合物劑選自線性聚丙烯酰 胺、部分交聯(lián)聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙二醇或其組合的一種或多種。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述相具有從頂部到底部粘度增加的梯度，并且 包括樣品層、捕獲層和堆積層。
9. 一種用于確定樣品中靶分子的方法，所述方法包括 獲得可能含有靶分子的第一樣品；使所述第一樣品暴露于結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑能夠結(jié)合所述靶分子而形成靶分 子_結(jié)合劑復(fù)合物；將所述靶分子_結(jié)合劑復(fù)合物與未結(jié)合的靶分子混合而制成混合物； 將所述混合物經(jīng)受垂直堆積的電泳基質(zhì)，其中所述基質(zhì)由從頂部到底部密度增加或粘 度增加的兩個(gè)或更多個(gè)相組成，并且其中所述基質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)相具有不帶電的聚合物 (P)，所述不帶電的聚合物(P)能夠與經(jīng)含有所述聚合物的相電泳的結(jié)合劑締合；和 檢測(cè)所述靶分子-結(jié)合劑復(fù)合物的存在。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述垂直堆積的電泳基質(zhì)包括器皿中垂直堆積的 電泳基質(zhì)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述結(jié)合劑包括可捕獲結(jié)合劑。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述結(jié)合劑包括下述一種或多種能夠結(jié)合所述靶 分子的可捕獲抗體、能夠結(jié)合所述靶分子的抗體的抗原結(jié)合片段、所述靶分子的生物受體、 所述靶分子的生物受體的片段、多價(jià)生物素結(jié)合劑、標(biāo)記的結(jié)合劑或生物素連接的不帶電 的聚合物。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中相對(duì)于未結(jié)合的靶分子測(cè)量與結(jié)合劑締合的靶分子。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中與結(jié)合劑締合的靶分子與未結(jié)合的靶分子電泳分離。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質(zhì)或肽。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述電泳在最小流體動(dòng)力學(xué)半徑為0. 5mm的器皿中進(jìn)行，所述流體動(dòng)力學(xué)半徑等于橫截面積除以周長(zhǎng)再乘以2。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述樣品加載入管、通道或容器，并且所述電泳在 所述管、通道或容器中從頂部到底部密度增加和/或粘度增加的梯度中進(jìn)行，所述梯度包 括密度或粘度增加的至少三個(gè)相。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中測(cè)量與所述未結(jié)合的靶分子有關(guān)的可追蹤劑被用 來(lái)確定所述樣品中所述靶分子的濃度。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其中測(cè)量可追蹤劑-靶分子復(fù)合物和未結(jié)合的靶分子提 供與所述靶分子的濃度成正比和成反比的信號(hào)。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，其中可追蹤劑是熒光的、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的、放射性核 素、金屬離子或產(chǎn)生熒光產(chǎn)物、發(fā)光產(chǎn)物、化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物或有色產(chǎn)物的酶。
21.一種用于檢測(cè)靶分子的裝置，所述裝置包括a)流體動(dòng)力學(xué)半徑為至少0.5mm的垂直布置的器皿；b)所述器皿內(nèi)從1.0至1. lg/ml密度增加的梯度，所述梯度包括密度1. 0至1. 02g/ml 的樣品層、密度1. 002至1. 05g/ml的捕獲層和密度1. 01至1. lg/ml的堆積層，其中所述堆 積層具有比所述捕獲層更高的密度，并且所述捕獲層具有比所述樣品層更高的密度。
22.如權(quán)利要求21所述的裝置，所述裝置還包括i)與可追蹤劑軛合的靶分子和未結(jié)合的靶分子； )與捕獲分子軛合的第二結(jié)合分子，其中所述靶分子、所述未結(jié)合的靶分子、第一和 第二結(jié)合分子能夠在所述樣品層形成復(fù)合物；和iii)在所述樣品層、所述堆積層和所述捕獲層的至少一層中基本不帶電的聚合物，其 中所述基本不帶電的聚合物能夠結(jié)合所述捕獲分子以變成所述復(fù)合物的部分。
23.一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)具有計(jì)算機(jī)可讀指令，所述計(jì)算機(jī)可讀 指令在被計(jì)算機(jī)執(zhí)行時(shí)導(dǎo)致所述計(jì)算機(jī)運(yùn)行包括下述的方法接收表示條帶的發(fā)射的第一數(shù)據(jù)，其中所述條帶包括樣品中的可追蹤劑-靶分子復(fù)合物；接收表示未結(jié)合靶分子水平的第二數(shù)據(jù)；以及比較所述第一數(shù)據(jù)與所述第二數(shù)據(jù)以評(píng)估所述樣品中所述靶分子的存在。
24.如權(quán)利要求23所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，還包括評(píng)估所述樣品中所述靶分子存在的 濃度。
25.如權(quán)利要求23所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中比較所述第一數(shù)據(jù)與所述第二數(shù)據(jù)包 括確定所述第一數(shù)據(jù)與所述第二數(shù)據(jù)的比率。
26.如權(quán)利要求23所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中比較包括為樣品中可能感興趣的每種 靶分子產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
27.如權(quán)利要求26所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中比較還包括比較由結(jié)合的靶分子提供 的直接發(fā)射強(qiáng)度，與未結(jié)合的靶分子濃度的反向比較。
28.如權(quán)利要求23所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中比較所述第一數(shù)據(jù)與所述第二數(shù)據(jù)以 評(píng)估受治療者中靶分子的存在、不存在或濃度包括確定來(lái)自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發(fā)射開始的時(shí)間；確定來(lái)自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發(fā)射結(jié)束的時(shí)間；確定來(lái)自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發(fā)射開始的發(fā)射強(qiáng)度； 確定來(lái)自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發(fā)射結(jié)束的發(fā)射強(qiáng)度； 對(duì)于每種靶分子分析上述強(qiáng)度和時(shí)間的范圍；評(píng)估通過(guò)分析所述靶分子的強(qiáng)度和時(shí)間而提供的信息，并分析所述信息；和 基于所獲得的并經(jīng)分析的數(shù)據(jù)提供的信息來(lái)評(píng)估受治療者的健康、物質(zhì)的存在或樣品 的污染。
29.如權(quán)利要求21所述的裝置，所述裝置還包括 分離樣品的工具，所述樣品包含可追蹤劑_靶分子復(fù)合物； 適于捕獲來(lái)自所述可追蹤劑_靶分子復(fù)合物的發(fā)射的讀取器； 適于記錄來(lái)自所述可追蹤劑_靶分子復(fù)合物的發(fā)射的照相機(jī)； 適于接收來(lái)自所述裝置的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)；和適于分析所述計(jì)算機(jī)從所述可追蹤劑_靶分子復(fù)合物接收的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序。
30.一種試劑盒，該試劑盒包括包括密度增加或粘度增加的至少三層的裝置；和 與所述層的至少一個(gè)締合的基本不帶電的聚合物。
31.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，所述試劑盒還包括感興趣靶分子的至少一個(gè)陽(yáng)性對(duì) 照樣品。
全文摘要
本文實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)和/或確定樣品中靶分子的存在和/或濃度的系統(tǒng)、方法、組合物和裝置。在某些實(shí)施方案中，可以使用非凝膠電泳技術(shù)分離和分析靶分子。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101809166SQ200880106265
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2008年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月10日
發(fā)明者史蒂文·帕特里克·泰瑞爾, 巴里·范特-赫爾 申請(qǐng)人:萊澤爾診斷公司