專利名稱：：雜合融合報道子及其應用的制作方法專利說明與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2007年11月5日提交的美國申請60/985,585的權(quán)益,其公開內(nèi)容援引加入本文。背景螢光素酶生物傳感器已被描述。例如Sa:[a-Newbyetal.(1991)揭示了Photinuspvralis螢光素酶cDNA被體外擴增以產(chǎn)生環(huán)狀AMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點。特別地，第217位的纈氨酸被突變?yōu)榫彼嵋援a(chǎn)生位點RRFS，七肽kemptide，豬丙酮酸激酶的磷酸化位點，被加入到螢光素酶的N或C末端。Sala-Newbyetal.涉及攜帶磷酸化位點的蛋白質(zhì)由它們的比活性、Pi、PH對發(fā)射光顏色的作用及蛋白激酶A的催化亞基在ATP存在下的作為而鑒定。他們發(fā)現(xiàn)僅--個重組蛋白(RRFS)顯著不同于野生型螢光素酶，RRFS突變體具有更低比活性，更低PH最佳值，在低pH發(fā)射更綠的光，當磷酸化時降低其活性高達80%。后一作用被揭示由磷酸酶逆轉(zhuǎn)。Waudetal.(1996)將蛋白激酶識別序列及蛋白酶位點工程化入Photinuspyralis螢光素酶cDNA中。螢光素酶的兩個結(jié)構(gòu)域被Waudetal.修飾；一個位于氨基酸209-227之間，另一個在C末端，在氨基酸537-550之間。Waudetal.揭示殘基290-227之間氨基酸突變降低生物發(fā)光活性至野生型重組體的1%以下，而在C末端工程化肽序列導致在野生型重組螢光素酶的0.06%-1.20%的比活性。Waudetal.還揭示了向變體螢光素酶中加入環(huán)狀AMP依賴性蛋白激酶催化亞基導致30%活性降低,所述變體螢光素酶摻入激酶識別序列LRRASLG(SEQIDNO:80)，在氨基酸位置543具有絲氨酸。堿性磷酸酶處理恢復活性。Waudetal.進一步揭示含有凝血酶識別序列LVPRES(SEQIDNO:81)在氨基酸542-543之間具有裂解位點的變體螢光素酶的生物發(fā)光活性當在凝血酶存在下保溫時降低50%。Ozawaetal.(2001)描述了生物傳感器，其基于合理設(shè)計的螢火蟲螢光素酶片段的蛋白質(zhì)剪接誘導的互補。蛋白質(zhì)剪接是翻譯后蛋白質(zhì)修飾,通過其intein(內(nèi)部蛋白)從前體融合蛋白被切掉,側(cè)翼extein(外部蛋白)被連接成連續(xù)多肽。揭示了來自Synechocystissp.PCC6803的N和C末端inteinDnaE分別各自融合螢光素酶的N和C末端片段。蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用激發(fā)DnaEintein的折疊，導致蛋白質(zhì)剪接，由此連接的螢光素酶的extein恢復其酶活性。Ozawaetal.揭示已知結(jié)合配偶體磷酸化胰島素受體底物UIRS-1)與其靶PI:3-激酶的N末端SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用用分離(split)螢光素酶在胰島素存在下監(jiān)測。Paulmuruganetal.(2002)采用基于分離(split)螢火蟲螢光素酶的測定在細胞培養(yǎng)物中及在小鼠中監(jiān)測兩種蛋白質(zhì)即MyoD和Id之間的相互作用，使用互補策略及intein介導的重構(gòu)策略。為保持報道子活性,在互補策略中，融合蛋白需要蛋白質(zhì)相互作用，即經(jīng)過蛋白質(zhì)配偶體MyoD和Id的相互作用，而在重構(gòu)策略中，經(jīng)intein介導的剪接形成的新的完整甲殼蟲螢光素酶保持其活性，甚至在蛋白質(zhì)配偶體之間持續(xù)相互作用不存在下也如此。蛋白質(zhì)片段互補測定在Michnicketal.(U.S.PatentNos.6，270，964,6，294，330and6，428，951)中揭示。特別地，Michnick描述了基于分離鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的測定，其中DHFR的N末端片段及DHFR的C末端片段各自融合GCN4亮氨酸拉鏈序列。DHFR活性在表達兩個融合蛋白的細胞中檢測。Michnicketal.還描述了另一種互補途徑，其中氨基糖苷激酶(AK)基因中S1核酸酶產(chǎn)生的缺失的嵌套組被導入亮氨酸拉鏈構(gòu)建體，所得構(gòu)建體組被導入細胞并篩選AK活性。另外，一些酶可以被環(huán)狀變換(circularlypermuted)并可以保留活性(參見例如Cheltsovetal.,2003,jougardetal.,2002,andNagaietal.，2001)o因此,酶可以保留催化活性，甚至當它們的結(jié)構(gòu)被實質(zhì)改變時也可如此,例如通過環(huán)狀變換它們的氨基酸序列或者將酶分離成兩個片段。發(fā)明概述融合蛋白對(雜合蛋白系統(tǒng))可用于揭示及分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用,例如當--個融合蛋白具有融合于(第一個)異源氨基酸序列(--種被選擇與另一個(第二個)異源氨基酸序列相互作用或可疑與其相互作用的序列)的報道蛋白的一部分(片段)，另一個融合蛋白具有功能不同蛋白質(zhì)的一部分，其互補所述報道蛋白部分的活性并融合于所述第二個異源氨基酸序列。所述片段的N和/或C末端在全長野生型蛋白質(zhì)序列的耐受修飾的一個殘基或-一個區(qū)域。“功能不同的蛋白質(zhì)(functionallydisctinctiveprotein)”是一種蛋白質(zhì)，相對于報道蛋白，其來自不同的催化類別，是作用于結(jié)構(gòu)獨立的非重疊底物的酶，具有不同的生理學功能，具有小于大約80%、包括小于大約70%、60%、50%、40%、30%或更低氨基酸序列相同性，或者其任何組合,所述報道蛋白例如突變的水解酶或生物發(fā)光酶如突變的脫鹵素酶或螢光素酶。例如，鹵代烷脫鹵素酶與Renilla螢光素酶的氨基酸序列對比揭示它們具有大約30%相同性，因此是功能獨立的。另外，鹵代烷脫鹵素酶的生理學功能是通過裂解鹵素基團代謝鹵代烷，而Renilla螢光素酶的生理學功能是產(chǎn)生光。鹵代烷脫鹵素酶屬于水解酶催化類別，而Renilla螢光素酶屬于單氧化酶催化類別。鹵代烷脫鹵素酶作用于鹵代烴，而Renilla螢光素酶作用于腔腸素(coelenterazine)。由于這些原因的每種，鹵代烷脫鹵素酶和Renilla螢光素酶是功能獨立的。蛋白質(zhì)如報道蛋白例如生物發(fā)光酶的“片段”或“部分”,如本文所用，是小于相應野生型蛋白全長序列的序列，具有實質(zhì)降低的或無報道子活性，但是其與功能獨立的蛋白質(zhì)片段緊密鄰近，顯示實質(zhì)增加的報道子活性。在一個實施方案中,報道蛋白的片段(部分)有相應全長報道蛋白的至少20個、例如至少50個連續(xù)殘基，可非必須包括相應全長報道蛋白的N末端或C末端殘基或N末端或C末端序列。例如，300個氨基酸的全長生物發(fā)光蛋白的片段,所述片段可以由功能獨立蛋白質(zhì)的片段互補,可包括生物發(fā)光蛋白的殘基1-225、5-250、150-300或150-295,因為相應于生物發(fā)光蛋白的殘基1-大約10,大約145-大約155,大約145-大約155,大約220-大約230或大約290-300的區(qū)域中的殘基耐受修飾。在一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)互相相互作用例如結(jié)合。在另一個實施方案中，第一個感興趣蛋白質(zhì)與樣品中的生理學分子相互作用，該相互作用抑制或增強第一個感興趣蛋白質(zhì)與第二個感興趣蛋白質(zhì)的相互作用。在另一個實施方案中,物質(zhì)(一或多個感興趣物質(zhì))或一定條件的存在改變感興趣蛋白質(zhì)的相互作用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了雜合蛋白系統(tǒng)，其具有美國公申請20060024808(其引入本文做參考)中揭示的突變的水解酶的一部分及生物發(fā)光酶的互補部分。盡管突變的水解酶不是酶，但是水解酶底物與其穩(wěn)定結(jié)合依賴于正確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并且當兩個融合蛋白物理鄰近時發(fā)生。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了雜合蛋白系統(tǒng)，其具有生物發(fā)光酶的一部分以及功能獨立蛋白的互補部分，所述功能獨立蛋白例如脂酰基連接酶，脂?；D(zhuǎn)移酶，親脂性結(jié)合蛋白等等，見例如NCBI登錄號AAF56245,P02690,P02696和P29498，其揭示引入本文做參考。作為突變的水解酶的例子,突變的脫鹵素酶提供了在活細胞或其裂解物內(nèi)有效標記。這個標記在蛋白質(zhì)表達及標記的底物存在下僅僅是條件性的。具有突變的脫鹵素酶的一部分(片段)的融合蛋白的標記依賴于發(fā)生在細胞或裂解物內(nèi)的特異蛋白質(zhì)相互作用，所述相互作用在該融合蛋白與具有功能不同蛋白質(zhì)的互補部分的第二個融合蛋白之間，其為相應野生型水解酶的標記底物。例如，f3-視紫紅質(zhì)抑制蛋白可以與突變的水解酶的C末端部分融合,G偶聯(lián)受體可以與功能不同的蛋白質(zhì)的互補片段例如ReniLla螢光素酶的N末端部分融合。在存在標記的脫鹵素酶底物的情況下發(fā)生受體刺激時，卩-視紫紅質(zhì)抑制蛋白結(jié)合受體導致突變的水解酶部分的標記。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了多個表達載體。所述載體包括第一個表達載體，其包含第一個多核苷酸，該多核苷酸包含與第一個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的啟動子,所述第一個融合蛋白具有報道蛋白的片段和第一個異源氨基酸序列,所述片段具有相應全長報道蛋白的至少50個連續(xù)氨基酸殘基但是比其少至少50個氨基酸殘基。第二個表達載體包括第二個多核苷酸,該多核苷酸包含與第二個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的啟動子,所述第二個融合蛋白具有相對于報道蛋白功能不同的蛋白質(zhì)的片段和第二個異源氨基酸序列，所述片段具有相應功能不同的蛋白質(zhì)的至少50個連續(xù)氨基酸殘基但是比其少至少50個氨基酸殘基。報道蛋白片段的報道活性在功能不同的蛋白質(zhì)片段的存在下增加，并且依賴于第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用。一個實施方案中，所述報道蛋白是突變體鹵代烷脫鹵素酶。一個實施方案中，所述報道蛋白是水解酶。一個實施方案中，所述報道蛋白是生物發(fā)光酶。一個實施方案中,所述功能不同的蛋白質(zhì)是珊瑚蟲螢光素酶,例如Renilla螢光素酶。一個實施方案中，所述功能不同的蛋白是單氧化酶。一個實施方案中，所述報道蛋白是Oplophorus螢光素酶，所述功能不同的蛋白質(zhì)不是生物發(fā)光蛋白，例如所述功能不同的蛋白質(zhì)是親脂轉(zhuǎn)運蛋白，視黃醇結(jié)合蛋白，脂肪酸結(jié)合蛋白，或FABP樣家族蛋白中的蛋白質(zhì)。一個實施方案中,所述第--和第二表達載體在相同的核酸分子上，例如所述核酸分子是質(zhì)粒。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測分子相互作用的測定,或者可改變分子相互作用的物質(zhì)或條件。所述測定包括分別融合于分子結(jié)構(gòu)域的功能不同蛋白質(zhì)的片段，其中分子結(jié)構(gòu)域的相互作用通過至少一個不同的蛋白質(zhì)的活性重構(gòu)檢測。本發(fā)明還提供了測試分子相互作用的方法。所述方法包括提供包含第一個蛋白質(zhì)的片段及第一個異源氨基酸序列的第一個融合蛋白，及包含相對于第一個蛋白質(zhì)功能不同的蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列的第二個融合蛋白，所述第二個異源氨基酸序列與第一個異源氨基酸序列相互作用或可疑與其相互作用。第一個和第二個異源氨基酸序列互相接觸，然后確定第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用產(chǎn)生的第一個蛋白質(zhì)的活性和/或第二個蛋白質(zhì)的活性。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了組合物。所述組合物包括第一個多核苷酸,該多核苷酸包含與編碼第一個融合蛋白的幵放讀框，所述第一個融合蛋白具有來自相應全長脫鹵素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列，所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用。所述脫鹵素酶片段在相對于脫鹵素酶功能不同蛋白質(zhì)的片段的存在下能穩(wěn)定結(jié)合相應全長野生型脫鹵素酶的脫鹵素酶底物，所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基。所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的一個殘基或區(qū)域中，所述脫鹵素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段，其包含在相應于玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)脫鹵素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基包含至少一個氨基酸取代，所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成一個鍵，該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。在一個實施方案中，組合物包括第二個多核苷酸,其包含編碼第二個融合蛋白的開放讀框，所述第二個融合蛋白包含功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段結(jié)合增加，其中功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的一個殘基或區(qū)域中。一個實施方案中，所述第一個或第二個異源氨基酸序列長度至少5個氨基酸殘基。一個實施方案中，所述第一個異源氨基酸序列位于脫鹵素酶片段的N末端。一個實施方案中，所述第一個異源氨基酸序列位于脫鹵素酶片段的C末端。一個實施方案中，所述第二個異源氨基酸序列位于功能不同的蛋白質(zhì)片段的N末端。一個實施方案中,所述第二個異源氨基酸序列位于功能不同的蛋白質(zhì)片段的C末端。一個實施方案中,所述突變脫鹵素酶相對于相應的全長野生型脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代，其中第二個取代位于全長野生型脫鹵素酶的活性位點腔中的氨基酸殘基。一個實施方案中，第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175,176或273的位置，例如相應于氨基酸殘基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，纈氨酸，谷氨酸，門冬氨酸，丙氨酸,亮氨酸,絲氨酸或半胱氨酸,其中在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸，甘氨酸，門冬酰胺，門冬氨酸，蘇氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于對應氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。一個實施方案中,所述突變體還包含第三個或可選的第四個位于全長野生型脫鹵素酶的活性位點腔中的氨基酸殘基的取代。一個實施方案中，突變體脫鹵素酶的序列與野生型脫鹵素酶具有至少85%的氨基酸序列相同性。還提供了包含多核苷酸的分離的宿主細胞。一個實施方案中，所述第一個和第二個多核苷酸在相同的核酸分子上，例如質(zhì)粒。還提供了包含一或多個編碼的融合蛋白的分離的宿主細胞。在--個實施方案中,本發(fā)明提供了組合物,其具有第一個融合蛋白，所述第一個融合蛋白包含具有來自相應全長脫鹵素酶的c末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列,所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用。所述脫鹵素酶片段在相對于脫鹵素酶功能不同蛋白質(zhì)的片段的存在下能穩(wěn)定結(jié)合相應全長野生型脫鹵素酶的脫鹵素酶底物,所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基。所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的一個殘基或區(qū)域中，所述脫鹵素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段，其包含在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基的至少一個氨基酸取代，所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成一個鍵，該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。在一個實施方案中，組合物進一步包括第二個融合蛋白，所述第二個融合蛋白包含功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列,其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段結(jié)合增加，其中功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的殘基或區(qū)域中。一個實施方案中，所述第一個或第二個異源氨基酸序列長度至少5個氨基酸殘基。一個實施方案中，所述第一個異源氨基酸序列位于脫鹵素酶片段的N末端。一個實施方案中，所述第一個異源氨基酸序列位于脫鹵素酶片段的C末端。一個實施方案中，所述第二個異源氨基酸序列位于功能不同的蛋白質(zhì)片段的N末端。一個實施方案中，所述第二個異源氨基酸序列位于功能不同的蛋白質(zhì)片段的C末端。一個實施方案中，所述功能不同的蛋白質(zhì)是Renilla螢光素酶。一個實施方案中，所述突變脫鹵素酶相對于相應的全長野生型脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代，其中第二個取代位于全長野生型脫鹵素酶的活性位點腔中的氨基酸殘基。一個實施方案中,第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175,176或273的位置，例如相應于氨基酸殘基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸,纈氨酸,谷氨酸，門冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，絲氨酸或半胱氨酸，其中在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸，甘氨酸，門冬酰胺，門冬氨酸，蘇氨酸，丙氨酸或精氨酸,或其中位于對應氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。一個實施方案中,所述突變體還包含第三個或可選的第四個位于全長野生型脫鹵素酶的活性位點腔中的氨基酸殘基的取代。一個實施方案中，突變體脫鹵素酶的序列與野生型脫鹵素酶具有至少85%的氨基酸序列相同性。還提供了包含融合蛋白的分離的宿主細胞。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了多個表達載體。一個表達載體具有與第一個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的啟動子,所述第一個融合蛋白包含具有來自相應全長脫鹵素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列，所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用。所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的殘基或區(qū)域中,所述脫齒素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段,其包含在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基的至少一個氨基酸取代。所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成一個鍵，該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。組合物還包括第二個表達載體,其包含與第二個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的第二個啟動子,所述第二個融合蛋白包含相對于脫鹵素酶功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基。所述功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的一個殘基或區(qū)域中,其中其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段結(jié)合增加。一個實施方案中，脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代。一個實施方案中，第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175，176或273的位置。在一個實施方案中，編碼本發(fā)明雜合系統(tǒng)的兩個融合蛋白的載體被導入細胞、細胞裂解物、體外轉(zhuǎn)錄/翻譯混合物或上清中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中兩個蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。所述方法包括在有效允許第一個和第二個異源氨基酸序列締合的條件下,提供樣品,所述樣品具有表達由多個本發(fā)明表達載體編碼的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄！翻譯反應，以及報道蛋白如水解酶例如脫鹵素酶的底物，具有至少一個官能團的底物。表達蛋白的存在、量或位置，或者樣品中附著底物的至少一個官能團被檢測，由此檢測兩個異源序列是否相互作用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測改變兩個蛋白質(zhì)的相互作用的物質(zhì)的方法。所述方法包括在有效允許第一個和第二個異源序列締合的條件下提供樣品，所述樣品具有表達由多個本發(fā)明表達載體編碼的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應，報道蛋白的底物例如具有至少一個官能團的脫鹵素酶的底物，以及可疑改變第--個和第二個異源氨基酸序列的相互作用的物質(zhì)。所樣品中報道蛋白的存在或量、或者附著于底物的至少一個官能團相對于不含該物質(zhì)的樣品被檢測。一個實施方案中，所述物質(zhì)促進相互作用。一個實施方案中，所述物質(zhì)抑制相互作用。一個實施方案中,所述底物是式(I)接頭所示的化合物,其中R是一或多個官能團，接頭是分離R和A的基團；A-X是脫鹵素酶底物；X是鹵素,其中接頭是多原子直鏈或支鏈，包括C，N,S，或0或包含一或多個環(huán)的基團。一個實施方案中，所述第一個或第二個異源氨基酸序列是選擇標記蛋白，膜蛋白，細胞溶質(zhì)蛋白，細胞核蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，酶，酶底物，受體蛋白,轉(zhuǎn)運蛋白，轉(zhuǎn)錄因子,通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein),激酶，信號蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體結(jié)合蛋白，核酸結(jié)合蛋白，細胞外基質(zhì)蛋白，分泌的蛋白，受體配體，血清蛋白，免疫原性蛋白，熒光蛋白，或具有反應性半胱氨酸的蛋白。一個實施方案中，所述突變脫鹵素酶相對于相應的全長野生型脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代，一個取代位于全長野生型脫鹵素酶活性位點腔中的氨基酸殘基。一個實施方案中,位置272的一個取代氨基酸是苯丙氨酸，甘氨酸,丙氨酸，谷氨酰胺或門冬酰胺。一個實施方案中,位置106的一個取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一個實施方案中，第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175，176或273的位置。第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175,176或273的位置,例如相應于氨基酸殘基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸,纈氨酸,谷氨酸，門冬氨酸,丙氨酸,亮氨酸，絲氨酸或半胱氨酸，其中在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸，甘氨酸，門冬酰胺，門冬氨酸，蘇氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于對應氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測改變兩個蛋白質(zhì)的相互作用的條件的方法。所述方法包括提供樣品置于一種條件，其中所述樣品包含由多個本發(fā)明表達載體編碼的的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應,將報道蛋白的底物例如具有至少一個官能團的脫鹵素酶的底物加入到樣品。樣品中報道蛋白的存在或量、或者附著于底物的至少一個官能團相對于不在該條件下的樣品被檢測。一個實施方案中，所述條件促進相互作用。一個實施方案中，所述條件抑制相互作用。一個實施方案中,所述底物是式(I)接頭所示的化合物,其中R是一或多個官能團，接頭是分離R和A的基團；A-X是脫鹵素酶底物；X是鹵素,其中接頭是多原子直鏈或支鏈，包括C，N,S，或O或包含一或多個環(huán)的基團。一個實施方案中，所述第一個或第二個異源氨基酸序列是選擇標記蛋白，膜蛋白，細胞溶質(zhì)蛋白，細胞核蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，酶，酶底物，受體蛋白,轉(zhuǎn)運蛋白，轉(zhuǎn)錄因子,通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein),激酶,信號蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體結(jié)合蛋白，核酸結(jié)合蛋白，細胞外基質(zhì)蛋白，分泌的蛋白，受體配體，血清蛋白，免疫原性蛋白，熒光蛋白，或具有反應性半胱氨酸的蛋白。一個實施方案中，所述突變脫鹵素酶相對于相應的全長野生型脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代，一個取代位于全長野生型脫鹵素酶活性位點腔中的氨基酸殘基。一個實施方案中,位置272的一個取代氨基酸是苯丙氨酸,甘氨酸，丙氨酸,谷氨酰胺或門冬酰胺。一個實施方案中,位置106的一個取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一個實施方案中，第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175，176或273的位置。第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175,176或273的位置，例如相應于氨基酸殘基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，纈氨酸,谷氨酸，門冬氨酸,丙氨酸,亮氨酸,絲氨酸或半胱氨酸，其中在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸，甘氨酸，門冬酰胺，門冬氨酸，蘇氨酸，丙氨酸或精氨酸,或其中位于對應氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法。所述方法包括在有效允許第一個和第二個異源氨基酸序列締合的條件下提供樣品，所述樣品具有表達由多個本發(fā)明表達載體編碼的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應。一個融合體包括生物發(fā)光報道蛋白的片段,另一個融合體包括功能不同的蛋白質(zhì)的互補片段。然后測量生物發(fā)光。--個實施方案中，所述底物是式(I):R-接頭-A-X所示的化合物，其中R是一或多個官能團，接頭是分離R和A的基團；A-X是脫鹵素酶底物；X是鹵素，其中接頭是多原子直鏈或支鏈，包括C，N,S,或0或包含一或多個環(huán)的基團。一個實施方案中,所述第一個或第二個異源氨基酸序列是選擇標記蛋白，膜蛋白，細胞溶質(zhì)蛋白，細胞核蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，酶,酶底物,受體蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，轉(zhuǎn)錄因子，通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein)，激酶，信號蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體結(jié)合蛋白，核酸結(jié)合蛋白，細胞外基質(zhì)蛋白，分泌的蛋白，受體配體，血清蛋白，免疫原性蛋白，熒光蛋白，或具有反應性半胱氨酸的蛋白。一個實施方案中，所述突變脫鹵素酶相對于相應的全長野生型脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代,一個取代位于全長野生型脫鹵素酶活性位點腔中的氨基酸殘基。一個實施方案中，位置272的一個取代氨基酸是苯丙氨酸，甘氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺或門冬酰胺。一個實施方案中，位置106的一個取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一個實施方案中，第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175,176或273的位置。第二個取代在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175，176或273的位置，例如相應于氨基酸殘基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，纈氨酸，谷氨酸，門冬氨酸,丙氨酸,亮氨酸,絲氨酸或半胱氨酸,其中在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸,甘氨酸，門冬酰胺，門冬氨酸，蘇氨酸,丙氨酸或精氨酸，或其中位于對應氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測改變兩個蛋白質(zhì)的相互作用的物質(zhì)的方法。所述方法包括在有效允許第一個和第二個異源序列締合的條件下提供樣品,所述樣品具有表達由多個本發(fā)明表達載體編碼的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應，報道蛋白的底物例如具有至少一個官能團的脫鹵素酶的底物，以及物質(zhì)。一個融合體包括生物發(fā)光報道蛋白的片段，另一個融合體包括功能不同的蛋白質(zhì)的互補片段。所述物質(zhì)可疑改變第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用。然后測量生物發(fā)光。在一個實施方案中，本發(fā)明提供檢測改變兩個蛋白質(zhì)相互作用的條件的方法。所述方法包括提供樣品置于一種條件,其中所述樣品包含由多個本發(fā)明表達載體編碼的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物或者表達由所述多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應。一個融合體包括生物發(fā)光報道蛋白的片段，另一個融合體包括功能不同的蛋白質(zhì)的互補片段。然后測量生物發(fā)光。因此,不同的蛋白質(zhì)的兩個片段,其中一個是報道蛋白，一起提供雜合報道系統(tǒng)。在一個實施方案中,報道蛋白片段是生物發(fā)光酶的片段,其結(jié)構(gòu)上與全長野生型(天然)生物發(fā)光酶相關(guān)(基本上序列相應)。在一個實施方案中，報道蛋白片段是突變的水解酶片段，其結(jié)構(gòu)上與全長野生型(天然)水解酶相關(guān)(基本上序列相應)，但是相對于相應全長野生型水解酶包括至少一個氨基酸取代,在一些實施方案中至少2個氨基酸取代。全長突變的水解酶相對于相應全長野生型水解酶缺乏或具有降低的催化活性，特異性結(jié)合可被相應全長野生型水解酶結(jié)合的底物，但是，在導致相應全長野生型水解酶和底物之間反應形成產(chǎn)物的條件下，從突變的水解酶和底物之間的相互作用不形成產(chǎn)物，或者形成實質(zhì)較少的產(chǎn)物,例如少2、10、100或1000倍。突變的水解酶缺乏產(chǎn)物形成或者產(chǎn)物形成量降低是由于在全長突變的水解酶中至少一個取代所致,所述取代導致在突變的水解酶中與底物形成的鍵臂相應全長野生型水解酶與底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。優(yōu)選地，底物和全長突變的水解酶之間或者底物和互相鄰近的兩個融合蛋白(一個具有突變的水解酶片段，另一個具有功能不同的蛋白質(zhì)的互補片段)之間形成的鍵的半衰期(即t1/2)比相應全長野生型水解酶和底物之間在導致相應全長野生型水解酶形成產(chǎn)物的條件下形成的鍵的t1/2高,例如高至少2倍，更優(yōu)選高至少4倍或甚至10倍，直至高100倍、1000倍或10000倍。優(yōu)選地，底物和全長突變的水解酶之間或者底物和融合蛋白之間形成的鍵的t1/2為至少30分鐘，優(yōu)選至少4小時,直至至少10小時，以及抗洗滌、蛋白質(zhì)變性劑和/或高溫的破壞,例如所述鍵對于在SDS中煮沸是穩(wěn)定。本發(fā)明水解酶片段的至少一個末端的氨基酸序列是在耐受修飾的一個位點(殘基)或區(qū)域中，例如耐受插入、缺失、環(huán)狀交換或其任何組合。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括具有水解酶片段的洗脫，所述片段在相應于如下區(qū)域的殘基的N或C末端,所述區(qū)域包括水解酶如SEQIDNO1的DhaA的殘基14-24、殘基25-35、殘基52-62、殘基73-83、殘基93-103、殘基131-141、殘基149-159、殘基175-185、殘基190-200、殘基204-220、殘基230-268或殘基289-299。在一個實施方案中，本發(fā)明包括具有水解酶片段的系統(tǒng)，所述片段具有在相應于水解酶如DhaA的殘基73-83、93-1.03或204-220的區(qū)域中的殘基的N或C末端。相應位置可以通過對比水解酶序列鑒別。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述系統(tǒng)具有生物發(fā)光酶片段，所述片段具有在耐受修飾的區(qū)域中的殘基的N或C末端，如在如下殘基或區(qū)域中，其相應于Renilla螢光素酶的殘基2-12、26-47、殘基64-74、殘基86-116、殘基146-156、殘基164-174、殘基188-198、殘基203-213、殘基218-234、殘基246-264、殘基269-279或殘基301-311,Gaussia螢光素酶的殘基43-53、殘基63-73、殘基79-89、殘基95-105、殘基105-115、殘基109-119、殘基1.21-1.31或殘基157-168,Oplophorus螢光素酶的殘基45-55、殘基79-89、殘基108-188或殘基130-140,螢火蟲螢光素酶的殘基2-12、殘基32-53、殘基70-88、殘基112-126、殘基139-165、殘基183-203、殘基220-247、殘基262-273、殘基303-313、殘基353-408、殘基485-495或殘基535-546。相應位置可以通過對比螢光素酶序列鑒別。在一個實施方案中,水解酶片段的一個末端相應于全長野生型水解酶的N末端或C末端內(nèi)部的位點或區(qū)域,另--個可以位于或鄰近全長水解酶序列的N末端或C末端。在一個實施方案中，水解酶片段與4個或更多個，例如5、10、20、50、100、200、300或更多個、但少于大約1000個、例如大約700個或者之間的任何整數(shù)個異源氨基酸殘基融合。在一個實施方案中，水解酶片段包括5%，10%,1.5%,25%,33%或50%或更多的全長水解酶序列，例如全長水解酶序列的1-20個殘基、1-50個殘基、1-75個殘基、1-100個殘基、1-125個殘基或者1至從50至125的任何整數(shù)個。在一個實施方案中，一個水解酶片段是脫鹵素酶的片段，相應于全長脫鹵素酶的C末端50、75、100、150、200或250個或者之間任何整數(shù)個殘基。在一個實施方案中，生物發(fā)光蛋白片段的一個末端相應于全長野生型生物發(fā)光蛋白的N末端或C末端內(nèi)部的位點或區(qū)域,另一個可以位于或鄰近全長生物發(fā)光蛋白序列的N末端或C末端。在一個實施方案中，生物發(fā)光蛋白片段與4個或更多個，例如5、10、20、50、100、200、300或更多個、但少于大約1000個、例如大約700個或者之間的任何整數(shù)個異源氨基酸殘基融合。在一個實施方案中，生物發(fā)光蛋白片段包括5%,10%,1.5%,25%,38%或50%或更多的全長生物發(fā)光蛋白序列,例如全長生物發(fā)光蛋白序列的1-20個殘基、1-50個殘基、1-75個殘基、1-100個殘基、1-125個殘基或者1至從50至125的任何整數(shù)個。在一個實施方案中，生物發(fā)光蛋白的片段是全長生物發(fā)光蛋白的C末端50、75、100、150、200或250個或者之間任何整數(shù)個殘基。在一個實施方案中，任選地在一或多種外源物質(zhì)不存在下,異源序列基本上相同并且互相特異性結(jié)合，例如形成二聚體。在另一個實施方案中，任選地在一或多種外源物質(zhì)不存在下，異源序列不同并且互相特異性結(jié)合。在一個實施方案中，報道蛋白片段融合于異源序列，該異源序列與細胞分子相互作用。例如,在雷帕霉素存在下,融合于雷帕霉素結(jié)合蛋白(FRB)和來自功能不同的蛋白質(zhì)的另一片段的水解酶片段與Π(506結(jié)合蛋白(FKBP)融合，產(chǎn)生兩種融合蛋白的復合物。在一個實施方案中，在外源物質(zhì)存在下或者在不同條件下，融合蛋白的復合物不形成。在一個實施方案中，一個異源序列包括例如3或更多個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域，其任選地可被共價修飾,例如磷酸化,其與在另一個異源序列中的結(jié)構(gòu)域非共價相互作用。報道蛋白片段和功能不同的蛋白質(zhì)可以被用于檢測可逆的相互作用，例如兩或多個分子的結(jié)合，或者其它構(gòu)象變化或條件變化，如ΡΗ、溫度或溶劑疏水性，或者不可逆相互作用。用于本發(fā)明的異源序列包括但非限于體外和/或體內(nèi)相互作用的那些。例如，融合蛋白可以包含水解酶片段和感興趣的酶,例如螢光素酶、RNasin或RNase,和/或通道蛋白，受體，膜蛋白，細胞溶膠蛋白，核蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，磷蛋白，激酶，信號蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體相關(guān)蛋白，熒光蛋白，酶底物，轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)運蛋白和/或靶向序列，例如十四烷基化序列，線粒體定位序列，或者核定位序列或者，其指導水解酶片段例如融合蛋白到特定位置。與報道蛋白片段或互補蛋白片段融合的感興趣的蛋白質(zhì)可以是野生型蛋白質(zhì)的片段,例如蛋白質(zhì)的功能或結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，如激酶結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子等。感興趣的蛋白質(zhì)可以融合于報道蛋白片段或互補蛋白片段的N末端或C末端。任選地,融合體中的蛋白質(zhì)由連接(connector)序列分隔,例如該序列優(yōu)選具有至少2個氨基酸殘基,如具有13-17個氨基酸殘基。本發(fā)明融合蛋白中連接序列的存在相對于每個蛋白質(zhì)的功能基本上不改變?nèi)诤象w中每個蛋白質(zhì)的功能。對于融合體中蛋白質(zhì)的任何特定組合，可以采用許多種連接序列。在一個實施方案中，連接序列是由酶識別的序列，例如可裂解序列,或者是光裂解序列。舉例的異源序列包括但非限于這樣的序列’如在FRB和FKBP中的那些序列，蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基(PKa-R)和蛋白激酶的催化亞基(PKa-C),src同源性區(qū)域(SH2)及能被磷酸化的序列，例如含有酪氨酸的序列，14-3-3的同種型,例如14-3-3t(參見Milsetal.，2000),及能被磷酸化的序列,具有WW區(qū)域(蛋白質(zhì)中結(jié)合富含脯氨酸分子的序列)的蛋白質(zhì)(參見Ilsleyetal.，2002；andEinbondetal.，1996)及能被磷酸化的異源序列，例如含有絲氨酸和/或蘇氨酸的序列，以及二氫葉酸還原酶(DHFR)和促旋酶B(GyrB)中的序列。編碼融合蛋白的表達載體以及具有一或多個載體的宿主細胞及包含載體的試劑盒也被提供。宿主細胞包括原核細胞或真核細胞如植物或脊椎動物細胞，例如哺乳動物細胞，包括但非限于人類、非人靈長類、犬、貓、牛、馬、綿羊或嚙齒類(例如兔、大鼠、雪貂或小鼠)細胞。優(yōu)選地，表達載體包含啟動子，例如組成型或調(diào)節(jié)型啟動子，可操縱地與融合蛋白之一的編碼區(qū)連接。在一個實施方案中,表達載體含有誘導型啟動子。任選地,本發(fā)明核酸分子中采用編碼融合蛋白的優(yōu)化的核酸序列,例如人類密碼子優(yōu)化的序列。核酸序列的優(yōu)化是本領(lǐng)域已知的，例如參見WO02/16944。在一個實施方案中，提供了宿主細胞，其瞬時、可控制、組成型或穩(wěn)定表達本發(fā)明的一種表達載體。載體或其基因產(chǎn)物可以通過轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染、細胞融合或任何其它方式提供。在--個實施方案中,水解酶是突變水解酶,如突變脫齒素酶,其在相應于野生型脫鹵素酶例如SEQIDNO1的5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124’128，134’136，150’151，155’157，160’167，172’175，176’187，195,204，221,224,227,231,250，256，257,263,264,273,277,282,291或292,或其多個的位置具有突變。突變脫鹵素酶因此可以具有多個取代,包括在相應于SEQIDNO:1的位置5,11,20,30,32,47,58,60,65,78,80,87,88,94,109，113，117，118，124,128，134,136，150，151，155，157，160，167，172，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，277，282，291或292的位置的多個取代,其中至少一個賦予改良的表達或結(jié)合動力學,并且可以包括在耐受取代的位置的進--步取代。在一個實施方案中，突變脫鹵素酶可以具有多個取代,包括在相應于SEQIDNO1的位置5,7,11，12，20，30，32，47，54，55，56，58，60，65，78，80，82，87，88，94，96，109，113，116，117，118，121，124,128,131，134，136,144，147，150,151,155，157，160，161,164,165,167,172,175,176,180,182,183,187,195,197,204,218,221,224,227,231,233,250,256,257,263,264,273,277,280,282,288,291,292,和/或294的位置的多個取代。本發(fā)明的雜合融合蛋白系統(tǒng)可以用于測量或檢測各種條件和/或感興趣分子。例如，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對于細胞生物學的幾乎所有方面均是關(guān)鍵的，范圍包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、信號轉(zhuǎn)導和細胞分裂和分化。蛋白質(zhì)互補測定(PCA)是用于監(jiān)測蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的若干方法之一。在PCA中，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用使酶的兩個非功能半?yún)^(qū)(halves)互相物理接近,使得重折疊成功能酶。相互作用因此被酶活性監(jiān)測。在蛋白質(zhì)互補標記(PCL)中,檢測酶被突變以捕獲底物,例如經(jīng)?；蛔兊拿钢虚g體。因此,在底物和重構(gòu)的突變酶之間產(chǎn)生共價鍵，使得隨時間累積標記，因此增加檢測弱蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的敏感性。附圖簡述圖IA顯示DhaA.H272F蛋白的分子模型。螺旋帽結(jié)構(gòu)域(helicalcapdomain)以淺藍色示出。α/β水解酶核心結(jié)構(gòu)域(深藍色)含有催化三聯(lián)體殘基。鄰近帽及核心結(jié)構(gòu)域界面的紅色陰影殘基代表H272F及D106親核體。黃色陰影殘基表示Ε130位置及鹵化物螯合殘基W107。圖IB示出玫瑰色紅球菌脫鹵素酶(DhaA)蛋白的序列(Kulakovaetal.,1997)(SEQIDΝ0:1)ο催化三聯(lián)體殘基Asp(D),Glu(E)和His(H)下劃線。組成帽結(jié)構(gòu)域的殘基斜體示出。DhaA.H272F和DhaA.D106C蛋白突變體能與烷基鹵化物底物產(chǎn)生共價連接，含有分別由Phe(F)和Cys(C)置換的催化三聯(lián)體His(H)和Asp(D)殘基。圖IC示出DhaA.H272F與烷基鹵化物底物形成共價中間體的機制。鹵化物基團由Aspioe的親核置換后接共價酯中間體的形成。用Phe殘基置換His272防止水激活并且捕獲共價中間體。圖ID描繪了DhaA.D106C與烷基鹵化物底物形成共價中間體的機制。鹵化物由Cysl06硫醇鹽(thiolate)的親核置換產(chǎn)生水解穩(wěn)定的硫醚中間體。圖IE描繪了DhaA.H272F變體與位于活性位點活性的共價附著的羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl配體的結(jié)構(gòu)模型。鄰近帽及核心結(jié)構(gòu)域界面的紅色陰影殘基代表H272F及D106親核體。黃色陰影殘基表示E130位置及鹵化物螯合殘基W107。圖IF示出DhaA.H272F底物結(jié)合通道(tunnel)的結(jié)構(gòu)模型。圖2A-B示出DhaA.H272F的位置175、176和273的hits的序列(組A)及DhaA.D106C的位置175和176的序列hits(組B)。圖3提供了本發(fā)明范圍內(nèi)的突變的脫鹵素酶的舉例序列(SEQIDNo.4-19和50-58)。作為克隆結(jié)果兩個額外殘基在3'末端編碼(Gln-Tyr)。具有那兩個額外殘基的密碼子的編碼突變的脫鹵素酶的核酸分子表達水平類似于或高于不具有那些殘基的突變的脫鹵素酶的表達水平。圖4示出在pHT2中的DhaA.H272H11YL的核苷酸序列(SEQIDNO2)及氨基酸序列(SEQIDNO:3)。列出的限制位點被摻入以促進產(chǎn)生功能性N和C末端融合。圖5提供額外取代，其改良具有那些取代的DhaA突變體在大腸桿菌中的表達。圖6示出蛋白質(zhì)互補標記(PCL)的示意圖。圖7描繪了Renilla螢光素酶和脫鹵素酶序列的對比。圖8A示出突變的脫鹵素酶的結(jié)構(gòu)示意圖及用于修飾的舉例位點。圖8B描繪了預期的PCL結(jié)果。圖8C示出使用脫鹵素酶的PCL結(jié)果。圖9示出本發(fā)明雜合融合蛋白的FluoroTect(A)和TexasMethylRed(TMR)(B)凝膠。M1(FluoroTect)從上至F155，98，63，40，32，21，和IlkDa0M2(TMR)從____h至T=200,97,66,42,28/20,和HkDa0泳道1)全長突變的DhaA(IiTvT)；泳道2)FRB-HTv7(l-78)+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全長Renilla螢光素酶(hRL)；泳道5)FRB-hRL(1-91)+FKBP-hRL(92-311)；泳道6)FRB-HTvT(1-78)+FKBP-hRL(92-311)；泳道7)FRB-hRL(1-91)+FKBP-HTv(79-297)；泳道8)無DM。NA不適用于這個實驗。HTv7和Renilla螢光素酶的催化部分位于各自的C末端部分(分別為殘基78-297或者98-297及殘基92-31.1或者11.2-311)。注意每個樣品第一個泳道不具有雷帕霉素(rapamycin),每個樣品第二個泳道具有雷帕霉素。圖10示出本發(fā)明雜合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝膠。M1(FluoroTectandTMR)從上至下155，98，63，40,32，和21kDa。泳道1)無DNA;泳道2)全長突變的DhaA(HTv7)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全長ReniIla螢光素酶(hRL)；泳道5)FRB-hRL(1-111)+FKBP-hRL(112-311)；泳道6)FRB-HTvT(1-98)；泳道7)FRB-hRL(1-111)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道8)FRB-HTvT(1-98)+FKBP-hRL(112-311)；泳道9)FKBP-ΗΤν7(99-297)；泳道10)FRB-hRL(1-111)；泳道11)FKBP-hRL(112-311)。注意每個樣品第一個泳道不具有雷帕霉素,每個樣品第二個泳道具有雷帕霉素。圖IlA-B描繪了PCARenilla螢光素酶測定中的RLU。圖12示出本發(fā)明雜合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝膠。M1(FluoroTect)從上至下155，98，63，40,32，21，和IlkDa0M2(TMR)從上至下200，97,66，42，36，28/20，和HkDa0泳道1)全長突變的DhaA(HTv7)；泳道2)HTv7(1-78)-FRB+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)HTv7(1-98)-FRB+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全長Renilla螢光素酶(hRL)；泳道5)hRL(1-91)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道6)hRL(1-111)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道7)HTv7(1-78)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道8)HTv7(1-98)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道9)hRL(1-91)-FRB+FKBP-HTv7(79-297)；泳道10)hRL(1-111)-FRB+FKBP-HTv7(99-297)；泳道11)無DNA。注意每個樣品第--個泳道不具有雷帕霉素,每個樣品第二個泳道具有雷帕霉^^ο圖13示出本發(fā)明雜合融合蛋白的RLU。圖14提供了本發(fā)明的雜合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝膠。M1(FluoroTect)從上至下155,98,63,40,32,21,和IlkDa0M2(TMR)從上至下200,97,66,42，36，28/20，和14kDa。泳道1)全長HTv7；泳道2)HTv7(79-297)-FKBP+FRB-HIV7(1-78)；泳道3)HTv7(99-297)-FKBP+FRB-HTv7(l-98)；泳道4)全長Renilla螢光素酶(hRL)；泳道5)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-91)；泳道6)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-111)；泳道7)HTv7(79-297)-FKBP+FRB-hRL(1-91)泳道8)HTv7(99-297)-FKBP+FRB-hRL(1-111)泳道9)hRL(92-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-78)；泳道10)hRL(112-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-98)；泳道11)無DNA。圖1.5示出本發(fā)明雜合融合蛋白的RLU。圖16提供了本發(fā)明的雜合融合蛋白的Fluorotect(A)和TMR⑶凝膠。樣品M1(FluoroTect)從....h至F155，98，63，40，32，21，1IkDa,M2(TMR)從上至下:200，97,66,42,36,28/20，HkDa0泳道1)全長HTv7；泳道2)FRB-HIV7(1-78)+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)luc8(1-91)_FRB+Rluc8(92-311)-FKBP；泳道5)Rluc8(1-111)-FRB+Rluc8(112-311)-FKBP；泳道6)Rluc8(1-91)-FRB+FKBPHTv7(79-297)；泳道7)Rluc8(1-111)-FRB+FKBPHTv7(99-297)；泳道8)Rluc8(92-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-78)；泳道9)R！uc8(112-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-98)；泳道10)R！uc8(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-78)；泳道11)Rluc8(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-98)；泳道12)FLRluc8；泳道13)無DNA(僅+雷帕霉素在SDS-PAGE上電泳)。HTv7和Renilla螢光素酶的催化部分分別位于(residedandreside)C末端(殘基78-297，98-297,92-311和112-311)片段上。每個樣品第一個泳道不具有雷帕霉素，每個樣品第二個泳道具有雷帕霉素,泳道13除外,其僅有+雷帕霉素電泳。圖17示出PCARenilla螢光素酶測定中的RLU。圖18示出本發(fā)明的雜合融合蛋白的FluoroTect凝膠。樣品M1(FluoroTect)從上至下155,98,63，40,32,21,llkl)a。泳道1)全長Renil:[a螢光素酶(FL-hRL)；泳道2)hRL(1-91)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道3)hRL(1-111)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道4)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-91)；泳道5)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-111)；泳道6)hRL(1-13)-(HTv7(2-78)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道7)hRL(1-13)-(HTν7(2-98)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道8)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(2-78)；泳道9)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(2-98)；泳道10)無DNA。HTv7和Renilla螢光素酶的催化部分分別位于C末端(殘基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。每個樣品第一個泳道不具有雷帕霉素，每個樣品第二個泳道具有雷帕霉素，泳道13除外,其僅有+雷帕霉素電泳。圖19示出PCARenilla螢光素酶測定中RLU。圖20提供了本發(fā)明的雜合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR⑶凝膠。樣品M1(FluoroTect)從上至下:155，98，63,40，32，21，IlkDa；M2(TMR)從上至下-.200,97,66,42，36,28/20,HkDa0泳道1)全長HTv7；泳道2)FRB-H78+FKBP-H79；泳道3)FRB-H98+FKBP-H99；泳道4)FRB-H78+H79-FKBP；泳道5)FRB-H98+H99-FKBP；泳道6)H78-FRB+FKBP-H79；泳道7)H98-FRB+FKBP-H99；泳道8)H78-FRB+H79-FKBP；泳道9)1198-FRB+H99-FKBP；泳道10)FRB-hRL91+FKBP-1179；泳道11)FRB-hRLlll+FKBP-H99；泳道12)FRB-hRL91+H:79-FKBP；泳道13)FRB-hRLl11+H99-FKBP；泳道14)hRL91-FRB+FKBP-H79；泳道15)hRLlll-FRB+FKBP_H99；泳道16)hRL91-FRB+H79_FKBP；泳道17)hRLlll-FRB+H99-FKBP；泳道18)RLuc8-91-FRB+FKBP_H79；泳道19)RLuc8_ll卜FRB+FKBP-1199；泳道20)FRB_RLuc8_91+H79_FKBP；泳道21)FRB-RLucS-111+H99-FKBP；泳道20)無DNA。HTv7和Renilla螢光素酶的催化部分分別位于C末端(殘基78-297,98-297,92-311和112-311)片段上。每個樣品第一個泳道不具有雷帕霉素，每個樣品第二個泳道具有雷帕霉素，泳道13除外，其僅有+雷帕霉素電泳。圖21示出各種雜合融合蛋白的標準化結(jié)果。圖22示出本發(fā)明雜合融合蛋白的Fluorotect(A)和TMR(B)結(jié)果。M1(FluoroTect)從上至下155,98,63,40,32,21,IlkDa;M2(TMR)從上至下200，97,66,42,36,28/20,14kDa。泳道1)全長HTv7；泳道2)FRB_hRL91+H79_FKBP；泳道3)hRL91-FRB+FKBP_H79；泳道4)RLuc8-91-FRB+H79-FKBP；泳道5)RLucS-91-FRB+FKBP-H79；泳道6)FRB-H78+H79-FKBP；泳道7)H78-FRB+FKBP-H79；泳道8)無DNA。HTv7和Renilla螢光素酶的催化片段分別位于C末端(殘基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。圖23示出各種雜合融合蛋白的標準化結(jié)果。圖24提供了舉例的雜合融合蛋白的序列(SEQIDNo.20-46)。圖25提供了?；?CoA連接酶、?；鵢硫醇連接酶、脂?；?CoA合成酶、親脂性轉(zhuǎn)運蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白或脂肪酸結(jié)合蛋白的舉例序列(SEQIDNo.90-99)，它們可用于本發(fā)明的雜合融合蛋白中。還參見NCBI登錄號YP703428，AAX98210，P97524，A1AD19，P0C061,P0C062,CAL16433,Q55DR6,YPOO191167,Q688CK6,P08592,Q5K4L6,P02696,P21760,P55054,NP074045,和AAA686627,其援引加入本文做參考。發(fā)明詳述姓如本文所用，“底物”包括具有反應基團及任選一或多個官能團的底物。包括一或多個官能團的底物通常在本文稱為本發(fā)明底物。底物例如本發(fā)明底物還可任選包括接頭，例如可裂解接頭，其物理分離一或多個官能團和底物中的反應基團，在一個實施方案中，接頭優(yōu)選長度為12-30個原子。接頭可以不總是存在于本發(fā)明底物中，但是在一些實施方案中，反應基團與官能團的物理分離可能是需要的，以便反應基團可以與突變的水解酶中的反應殘基相互作用以形成共價鍵。優(yōu)選地,相對于缺少接頭的相應底物與野生型或突變的水解酶的特異性或反應性，當存在時，接頭基本上不改變例如削弱具有接頭的底物與野生型或突變的水解酶的特異性或反應性。另外,接頭的存在優(yōu)選基本上不改變例如削弱官能團的一或多種性質(zhì)例如功能。例如，對于一些突變的水解酶,即具有深催化口袋的那些，本發(fā)明底物可以包括足夠長度和結(jié)構(gòu)的接頭，以便本發(fā)明底物的一或多個官能團不干擾相應蛋白質(zhì)例如水解酶蛋白(野生型或突變的)的3D結(jié)構(gòu)。如本文所用，“官能團”是可檢測或能檢測的分子，例如可通過直接或間接手段測量的分子(例如光活化分子、地高辛、鎳NTA(次氮基三乙酸)、生色團、熒光團或發(fā)光團)，可以結(jié)合或附著于第二種分子(例如生物素、半抗原或交聯(lián)基團)，或者可以是固體支持物。官能團可具有一種以上性質(zhì)如能檢測或能結(jié)合另一種分子。如本文所用，“反應基團”是由特定野生型或本發(fā)明突變的水解酶特異識別的底物中最小數(shù)目原子。底物中反應基團與野生型水解酶的相互作用產(chǎn)生產(chǎn)物及野生型水解酶的再生。如本文所用，術(shù)語“異源”核酸序列或蛋白質(zhì)是指相對于參照序列具有不同來源的序列，例如源自外來物種,或者如果來自相同物種，其可以從原始形式實質(zhì)上修飾。術(shù)語“融合多肽”或“融合蛋白，，是指嵌合蛋白，其含有在N和/或C末端與一或多個異源序列連接的參照蛋白(例如報道蛋白如水解酶或者生物發(fā)光蛋白)。在一些實施方案中，在不存在感興趣外源物質(zhì)或分子時，或者在一定條件F，融合多肽中的異源序列可以保留相應于異源序列的相應全長(非融合)多肽的至少一些或基本上相同的活性。在其它實施方案中，在存在感興趣外源物質(zhì)或分子時或者在一定條件下，融合多肽中的異源序列可以保留相應于異源序列的相應全長(非融合)多肽的至少--些或基本上相同的活性?！吧锇l(fā)光蛋白”包括介導在發(fā)光生物體中發(fā)現(xiàn)的發(fā)光反應的酶。例子是甲殼蟲螢光素酶,其全部催化ATP介導的甲殼蟲螢光素的氧化；珊瑚蟲(anthozoan)螢光素酶，其全部催化coelenterazine的氧化；Ca(2+)-調(diào)節(jié)的光蛋白，其也全部催化coelenterazine的氧化。螢光素酶可以分離或得自各種發(fā)光生物，如Photinuspyralis的螢火蟲螢光素酶或者Renillareniformis的Renilla螢光素酶。本文所用“螢光素酶”應指任何類型的螢光素酶，源自任何天然、合成或遺傳改變的來源，包括但非限于來自螢火蟲Photinuspyralis的螢光素酶或者其它甲殼蟲螢光素酶(如得自clickbeetles(例如Pyrophorusplagiophthalamus)或glowworms(Pheogodidaespp.)的螢光素酉每)，海腎Renillareniformis,Vargula物種,例如Vargulahilgendorfii，橈腳亞綱的動物，例如Gaussia或Metridia物種，卜足類,例如Oplophorus物種，帽貝Latianeritoides,和發(fā)光細菌例如XenorhabdusIuminescens禾口Vibriofisherii?！坝H核體”是提供電子的分子。如本文所用，“標記基因”或“報道基因”是賦予表達該基因的細胞獨特表型的基因，因此允許具有該基因的細胞與不具有該基因的細胞區(qū)分開。這種基因可編碼可選擇或可篩選的標記,這根據(jù)標記是否賦予可以通過化學手段“選擇”的性狀，即通過使用選擇劑(例如除草劑、抗生素或類似物)選擇，或者是否其簡單地是可以通過觀測或測試即通過“篩選”鑒別的“報道”性狀。本發(fā)明的元件通過使用特定標記基因舉例示出。當然，合適標記基因或報道基因的許多例子是現(xiàn)有技術(shù)已知的并且可以用于本發(fā)明實踐。因此,應理解下述討論是舉例的而非除外的?；诒疚慕忉尩募夹g(shù)及本領(lǐng)域已知的-一般重組技術(shù)，本發(fā)明使得改變?nèi)魏位蚍Q為可能。舉例的修飾的報道蛋白由包含修飾的報道基因的核酸分子編碼，其包括但非限于如下基因的修飾neo基因、β^gal基因、gus基因、cat基因、gpt基因、hyg基因、his!)基因、b:[e基因、mprt基因、bar基因、腈水解酶基因、半乳糖吡喃糖苷基因、木糖苷酶基因、胸苷激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突變的乙酰乳酸合酶基因(ALS)或乙酰乙酸合酶基因(AAS)、氨甲喋呤抗性dhfr基因、茅草枯脫鹵素酶基因、賦予對5甲基色氨酸抗性的突變的氨基苯甲酸合酶基因(WO97/26366)、R-基因座基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、xylE基因、α-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因、螢光素酶(Iuc)基因(例如Renillareniformis螢光素酶基因、螢火蟲螢光素酶基因或者clickbeetle螢光素酶(Pyrophorusplagiophthalamus)基因、水母發(fā)光蛋白基因、紅色熒光蛋白基因或者綠色熒光蛋白基因。術(shù)語內(nèi)包括的選擇或篩選標記基因還是編碼“分泌標記”的基因，其分泌可以作為鑒別或選擇轉(zhuǎn)化細胞的手段而被檢測。例子包括編碼可通過抗體相互作用鑒別的分泌抗原的標記,或者甚至可以通過它們的催化活性檢測的分泌酶。分泌蛋白落入許多類別,包括小的可擴散蛋白，可以例如通過ELISA檢測，及插入或捕獲在細胞膜中的蛋白質(zhì)。“選擇標記蛋白，，編碼酶活性，賦予細胞在缺乏否則是必需營養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生長的能力(例如酵母細胞中的TRPl基因)，或者在具有抗生素或其它藥物的培養(yǎng)基中生長的能力，即編碼選擇標記蛋白的基因在細胞中的表達賦予該細胞相對于無該基因的相應細胞對抗生素或藥物的抗性。當宿主細胞必須表達選擇標記以在選擇性培養(yǎng)基中生長時，標記被稱為陽性選擇標記(例如抗生素抗性基因，其賦予在合適抗生素存在下生長的能力)。選擇標記也可以用于選擇除去含有特定基因(例如sacB基因，其如果表達則殺死在含有5%蔗糖的培養(yǎng)基中生長的細菌宿主細胞)的宿主細胞；以此方式使用的選擇標記被稱為陰性選擇標記或反選擇標記(counter-selectablemarker)。常用選擇標記基因序列包括編碼對抗生素抗性的那些基因序列，如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、嘌呤霉素、博來霉素、鏈霉素、潮霉素、新霉素、Zeocin,等。可選擇的營養(yǎng)缺陷型基因序列包括例如hisD,其允許在組氨醇存在F在無組氨酸培養(yǎng)基中的生長。合適的選擇標記基因包括博來霉素抗性基因、金屬硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、AURI基因、腺苷脫氨酶基因、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因、胸苷激酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，等。“核酸”如本文所用是共價連接的核苷酸序列,其中--個核苷酸的戊糖的3'位置通過磷酸二酯基團與下一個的戊糖的5'位置連接，以及其中核苷酸殘基(堿基)以特異序列連接，即核苷酸線性順序，并且包括其類似物，如具有一或多個修飾堿基、糖和/或磷酸骨架的那些?！岸嗪塑账帷比绫疚乃檬呛写蠹s大于100個核苷酸長度序列的核酸?！肮押塑账帷被颉耙铩比绫疚乃檬嵌潭嗪塑账峄蛘叨嗪塑账岬囊徊糠?。術(shù)語“寡核苷酸”或“寡聚物”如本文所用定義為由2或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的分子，優(yōu)選大于3個、通常大于10個、但是小于250個、優(yōu)選小于200個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。寡核苷酸可以任何方式產(chǎn)生,包括化學合成、DNA復制、擴增例如聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄(RT),或其組合?！耙铩笔枪押塑账?，當置于起始引物延伸的條件下時其能作為核酸合成的起始點。選擇引物以便在其3'末端上具有基本互補于靶(模板)的特異序列的區(qū)域。引物必須足夠互補以與靶雜交用于發(fā)生引物延長。引物序列無需反映靶的精確序列。例如,非互補核苷酸片段可以附著于引物的5'末端,引物序列的其余部分與靶基本互補。非互補堿基或更長序列可以散布在引物中，條件是引物序列與靶序列具有足夠互補性以雜交及由此形成復合物用于合成引物延伸產(chǎn)物。與基因序列匹配或互補的引物可以用于擴增反應、RT-PCR等中。核酸分子被稱為具有“5'末端”和“3'末端”是因為核酸磷酸二酯鍵發(fā)生在取代單核苷酸的戊糖環(huán)的5'碳和3'碳。其中新連鍵是5'碳的多核苷酸的末端是其5'末端核苷酸。其中新連鍵是3'碳的多核苷酸的末端是其3'末端核苷酸。末端核苷酸如本文所用是在3'或5'末端的末端位置的核苷酸。DNA分子被稱為具有“5'末端”和“3'末端”是因為單核苷酸反應以制備寡核苷酸，從而一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸在一個方向經(jīng)磷酸二酯鍵附著于其相鄰的3_'氧。因此，如果其5'磷酸未連接單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧，寡核苷酸的一個末端稱為“5'末端”，以及稱為“3'末端”，如果其3'氧未連接后一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸。如本文所用，核酸序列即使位于更大寡核苷酸或多核苷酸內(nèi)部，也可以被稱為具有5'和3'末端。在線性或環(huán)狀DNA分子中，分立的元件被稱為在“下游”或3'元件的“____丨二游”或5'。這個術(shù)語反映了這樣事實，轉(zhuǎn)錄沿DNA鏈以5'至3'方式行進。典型地，指導連接的基因(例如開放讀框或編碼區(qū))轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元件通常位于編碼區(qū)的5'或上游。但是,增強子元件甚至當位于啟動子元件及編碼區(qū)的3'時也可以發(fā)揮其作用。轉(zhuǎn)錄終止及聚腺苷酸化信號位于編碼區(qū)的3'或下游。術(shù)語“密碼子”如本文所用是基本遺傳編碼單位，由3個核苷酸序列組成，限定了摻入多肽鏈的特定氨基酸，或者起始或終止信號。術(shù)語“編碼區(qū)”當用于結(jié)構(gòu)基因時是指編碼在作為mRNA分子翻譯結(jié)果的新生多肽中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的核苷酸序列。典型地,編碼區(qū)在5'側(cè)由核苷酸三聯(lián)體“ATG”限制,其編碼起始甲硫氨酸,在3'側(cè)由終止密碼子限制(例如TAA、TAG、TGA)。在一些情況中，編碼區(qū)也已知由核苷酸三聯(lián)體“TTG”起始。如本文所用，“分離的”是指核酸分子、多肽、肽或蛋白質(zhì)的體外制備、分離和/或純化,從而其不與體內(nèi)物質(zhì)締合。因此,術(shù)語“分離的”當用于與核酸相關(guān)時,如在“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”中，是指從其一般在其來源中締合的至少一種污染物鑒別和分離的核酸序列。分離的核苷酸以不同于其天然發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置存在。相反，未分離的核酸(例如DNA和:RNA)以它們在自然界中存在的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。例如，一給定DNA序列(例如基因)在宿主細胞染色體上發(fā)現(xiàn)鄰近相鄰基因；RNA序列(例如編碼特異蛋白質(zhì)的特異mRNA序列)在細胞中作為與許多其它編碼多種蛋白質(zhì)的mRNA的混合物而發(fā)現(xiàn)。因此，對于包括基因組、cDNA或者合成來源的多核苷酸或者其一些組合的“分離的核酸分子”，“分離的核酸分子”(1)不與其中“分離的核酸分子”在自然界發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的全部或部分締合，(2)可操縱地與其在自然界不連接的多核苷酸連接,或者(3)不在自然界中作為更大序列的部分而發(fā)生。分離的核酸分子可以以單鏈或雙鏈形式存在。當核酸分子被用于表達蛋白質(zhì)時，所述核酸含有至少有義或編碼鏈(即核酸可以是單鏈的)，但是可以含有有義及反義鏈(即核酸可以是雙鏈的)。術(shù)語“分離的”當與多肽相關(guān)使用時,如“分離的蛋白質(zhì)”或“分離的多肽”,是指從其一般在其來源中締合的至少一種污染物鑒別和分離的多肽。因此分離的多肽(1)不與在自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)締合，(2)不含來自相同來源的其它蛋白質(zhì)，例如不含人類蛋白質(zhì)，(3)由來自不同物種的細胞表達，或者(4)不在自然界發(fā)生。因此，分離的多肽以不同于其天然發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置存在。相反,未分離的多肽(例如蛋白質(zhì)和酶)以它們在自然界中存在的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。術(shù)語“分離的多肽”、“分離的肽”或“分離的蛋白質(zhì)”包括由cDNA或重組RNA包括合成來源的或其一些組合編碼的多肽、肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語“基因”是指DNA序列，其包含編碼序列及任選的用于從所述DNA序列產(chǎn)生多肽所需的控制序列。術(shù)語“野生型”如本文所用是指基因或基因產(chǎn)物，其具有分離自天然發(fā)生來源的該基因或基因產(chǎn)物的特征。野生型基因是在群體中最常觀察到的基因，因此被任意指定為該基因的“野生型”形式。相反,術(shù)語“突變體”是指基因或基因產(chǎn)物,其當與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時展示序列和/或功能性質(zhì)中的修飾(即改變的特征)。注意天然發(fā)生的突變體可以被分離；它們由如下事實鑒別，即當與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時它們具有改變的特征。已知核酸含有不同類型突變?！包c”突變是指在來自野生型序列的一個單堿基位置的核苷酸序列中的改變。突變也可以指插入或缺失一或多個堿基,從而核酸序列與參照例如野生型序列不同。術(shù)語“重組DNA分子”是指雜合DNA序列，其包含在自然界不在一起發(fā)現(xiàn)的至少兩個核苷酸序列。術(shù)語“載體”用于指可以插入或克隆DNA片段的核酸分子,其可以用于轉(zhuǎn)移DNA節(jié)段進入細胞中以及能在細胞中復制。載體可以衍生自質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒等等。術(shù)語“重組載體”、“表達載體”或“構(gòu)建體”如本文所用是指DNA或RNA序列，其含有希望的編碼序列及在特定宿主生物體中表達可操縱連接的編碼序列所需的合適的DNA或RNA序列。原核表達載體包括啟動子、核糖體結(jié)合位點、在宿主細胞中自主復制的復制起點及可能的其它序列，例如任選的操縱子序列、任選的限制酶位點。啟動子定義為指導RNA聚合酶結(jié)合DNA及起始RNA合成的DNA序列。真核表達載體包括啟動子，任選地聚腺苷酸化信號及任選地增強子序列。具有“編碼肽、蛋白質(zhì)或多肽”的核苷酸序列的多核苷酸是指包含所述肽、蛋白質(zhì)或多肽的編碼區(qū)的核酸序列。編碼區(qū)可以以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時,寡核苷酸可以是單鏈的(即有義鏈)或者雙鏈的。合適的控制元件如增強子/啟動子、剪接點、聚腺苷酸化信號等可以置于基因編碼區(qū)的緊鄰,如果需要，以允許轉(zhuǎn)錄的合適起始和/或一級RNA轉(zhuǎn)錄物的正確加工?；蛘?用于本發(fā)明表達載體中的編碼區(qū)可以含有內(nèi)源增強子/啟動子、剪接點、間插序列、聚腺苷酸化信號等。在進一步實施方案中，編碼區(qū)可含有內(nèi)源及外源控制元件的組合。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”是指控制核酸序列表達的一些方面的遺傳元件或序列。例如，啟動子是促進可操縱連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)元件。其它調(diào)節(jié)元件包括但非限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、剪接信號、聚腺苷酸化信號、終止信號和增強子元件，以及包括增加或降低連接的序列例如在反式作用元件存在下的轉(zhuǎn)錄的元件。真核生物中的轉(zhuǎn)錄控制信號包括“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子由短DNA序列陣列組成,它們與參與轉(zhuǎn)錄的細胞蛋白相互作用。啟動子和增強子元件已分離自多種真核來源，包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞中的基因。啟動子和增強子元件也已分離自病毒，類似控制元件如啟動子也在原核中發(fā)現(xiàn)。特定啟動子和增強子的選擇依賴于用于表達感興趣蛋白質(zhì)的細胞類型。一些真核啟動子和增強子具有寬宿主范圍,而其它僅在有限細胞類型亞集中有功能。例如SV40早期基因增強子在來自許多哺乳動物物種的許多細胞類型中非常有活性并且已廣泛用于在哺乳動物細胞中表達蛋白質(zhì)。在寬范圍哺乳動物細胞類型中有活性的啟動子/增強子元件的兩個其它例子是來自人延長因子1基因和Rous肉瘤病毒的長末端重復的那些；以及人巨細胞病毒。術(shù)語“啟動子/增強子”代表含有能同時提供啟動子和增強子功能的序列的DNA節(jié)段(即如—丨二所述啟動子元件和增強子以及提供的功能)。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復同時含有啟動子和增強子功能。增強子/啟動子可以是“內(nèi)源的”或“外源的”或“異源的”。“內(nèi)源的”增強子/啟動子是與基因組中給定基因天然連接的。“外源的”或“異源的”增強子/啟動子是通過遺傳操作(即分子生物學技術(shù))被置于與基因并列的，從而基因的轉(zhuǎn)錄由連接的增強子/啟動子指導。“剪接信號”在表達載體上的存在經(jīng)常導致重組轉(zhuǎn)錄物在真核宿主細胞中更高水平表達。剪接信號介導從一級RNA轉(zhuǎn)錄物中除去內(nèi)含子，并且由剪接供體和受體位點組成(Sambrooketal.,1989)。常用的剪接供體和受體位點是來自SV40的16SRNA的剪接點。重組DNA序列在真核細胞中的有效表達需要指導所得轉(zhuǎn)錄物的有效終止及聚腺苷酸化信號的表達。轉(zhuǎn)錄終止信號通常在聚腺苷酸化信號下游發(fā)現(xiàn),長度為幾百個核苷酸。術(shù)語“poly(A)位點”或“po:[y(A)序列”如本文所用是指指導新生RNA轉(zhuǎn)錄物的終止及聚腺苷酸化的DNA序列。重組轉(zhuǎn)錄物的有效聚腺苷酸化是希望的，引物缺乏poly(A)尾的轉(zhuǎn)錄物是不穩(wěn)定的并迅速降解。表達載體中使用的Poly(A)信號可以是“異源的”或者“內(nèi)源的”。內(nèi)源的poly(A)信號是在基因組中給定基因的編碼區(qū)的3'末端天然發(fā)現(xiàn)的poly(A)信號。異源poly(A)信號是已分離自基因并且位于另一個基因的3'的poly(A)信號。常用的異源poly(A)信號是SV40poly(A)信號。SV40poly(A)信號包含在237bpBamHI/BclI限制片段....匕指導終止及聚腺苷酸化(Sambrooketal.，1989)。真核表達載體還可以含有“病毒復制子”或“病毒復制起點”。病毒復制子是允許病毒在表達合適復制因子的宿主細胞中染色體外復制的病毒DNA序列。含有SV40或多瘤病毒復制起點的載體在表達合適病毒T抗原的細胞中復制到高拷貝數(shù)(直至IO4拷貝/細胞)。相反，含有來自牛乳頭瘤病毒或Epstein-Baxr病毒的復制子的載體以低拷貝數(shù)染色體外復制(大約100拷貝/細胞)。術(shù)語“體外”是指人工環(huán)境及在人工環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過程或反應。體外環(huán)境包括但非限于測試試管及細胞裂解物。術(shù)語“原位”是指細胞培養(yǎng)物。術(shù)語“體內(nèi)”是指天然環(huán)境(例如動物或細胞)及在天然環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過程或反應。術(shù)語“表達系統(tǒng)”是指用于確定(例如檢測)感興趣基因的表達的任何測定或系統(tǒng)。分子生物學領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以使用許多表達系統(tǒng)中的任-一種。許多合適哺乳動物細胞可得自許多來源(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockland,MD)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法及表達載體的選擇依賴于選擇的宿主系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染方法在例如Sambrooketal.,1989中描述。表達系統(tǒng)包括體外基因表達測定,其中感興趣基因(例如報道基因)連接調(diào)節(jié)序列，基因的表達在用抑制或誘導基因表達的物質(zhì)處理后監(jiān)測?；虮磉_檢測可以通過任何合適手段，包括但不限于檢測表達的mRNA或蛋白質(zhì)(例如報道基因的可檢測產(chǎn)物)或者通過表達感興趣基因的細胞表型中的可檢測變化。表達系統(tǒng)還可包含測定,其中檢測裂解事件或者其它核酸或細胞變化。如本文所用，術(shù)語“雜交”是指互補序列與靶核酸的退火，即含有互補序列的兩個核酸聚合物(多核苷酸)通過堿基配對退火的能力。術(shù)語“退火”和“雜交”互換使用，意在包括互補序列和靶核酸之間的任何特異性和可重復相互作用，包括結(jié)合具有僅部分互補性的區(qū)域。在天然核酸中不經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的一些堿基可以包括在本發(fā)明核酸中，包括例如肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員可以考慮一些變量憑經(jīng)驗確定雙螺旋穩(wěn)定性,包括例如互補序列長度、堿基組成及寡核苷酸序列、離子強度和錯配堿基對的發(fā)生。核酸雙螺旋的穩(wěn)定性通過熔融溫度或“Tm”測定。特定核酸雙螺旋在特定條件下的Tm是平均一半堿基對解離的溫度。術(shù)語“嚴格性”用于指進行核酸雜交的溫度、離子強度及存在其它化合物的條件。使用“高嚴格性”條件，核酸堿基配對僅在具有高頻率互補堿基序列的核酸配對之間發(fā)生。因此，當希望互相不完全互補的核酸雜交或退火在一起時，通常需要“中等”或“低”嚴格性條件。本領(lǐng)域熟知可以采用許多等價條件以包括中等或低嚴格性條件。雜交條件的選擇通常對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的,通常由雜交目的、雜交類型(DNA-DNA或DNA-RNA)、兩個序列之間的希望的相關(guān)性水平指導(例如Sambrooketal.,1989；NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress，WashingtonD.C.,1985，方法的一般討論)。核酸雙螺旋的穩(wěn)定性已知隨錯配堿基數(shù)增加而降低，另外根據(jù)雜合雙螺旋中錯配的相對位置而降低至更大或更小程度。因此，雜交嚴格性可以用于最大化或者最小化這種雙螺旋的穩(wěn)定性。雜交嚴格性可以如下改變調(diào)整雜交溫度；調(diào)整雜交混合物中螺旋去穩(wěn)定劑如甲酰胺百分比；調(diào)整洗滌溶液的溫度和/或鹽濃度。對于濾膜雜交，雜交的最終嚴格性經(jīng)常由用于雜交后洗滌的鹽濃度和/或溫度確定?！案邍栏裥詶l件”當用于指核酸雜交時包括等價于如F的條件，在42°c在由5XSSPE(43.8g/lNaCl，6.9g/'lNaH2PO4H2O和1.85g/lEDTA,pH用NaOH調(diào)整至7.4),0.5%SDS，5XDenhardt‘s試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交,隨后在包含0.IXSSPE，1.0%SDS的溶液中在42V洗滌，當采用大約500個核苷酸長度的探針時?！爸械葒栏裥詶l件”當用于指核酸雜交時包括等價于如下的條件，在42在由5XSSPE(43.8g/lNaCl,6.9g/lNaH2PO4H2O和1.85g/lEDTA,ρΗ用NaOH調(diào)整至7.4)，0.5%SDS,5ΧDenhardt‘s試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交,隨后在包含1.OXSSPE，1.0%SDS的溶液中在42V洗滌，當采用大約500個核苷酸長度的探針時?！暗蛧栏裥詶l件”當用于指核酸雜交時包括等價于如下的條件，在42°C在由5XSSPE(43.8g/lNaCl,6.9g/lNaH2PO4H2O和1.85g/lEDTA，ρΗ用NaOH調(diào)整至7.4),0.1%SDS，5XDenhardt‘s試劑[50XDenhardt‘s每500ml含有5gFicoll(Type400,Pharmacia)，5gBSA(FractionV；Sigma)]禾Π100g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在包含5XSSPE，0.1%SDS的溶液中在42°C洗滌，當采用大約500個核苷酸長度的探針時?！半摹?、“蛋白質(zhì)”和“多肽”是指任何氨基酸鏈,無論長度或翻譯后修飾(糖基化或磷酸化)。除非另有說明，術(shù)語是可互換的。本發(fā)明的核酸分子編碼水解酶片段或者功能不同的蛋白質(zhì)，包括天然發(fā)生的(野生型)或野生型蛋白質(zhì)的變體(突變體)的序列，其具有與相應突變體或野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列基本相同、例如至少85%、優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%或99%相同的氨基酸序列。術(shù)語“同源性”是指互補性程度?？梢杂胁糠滞葱曰蛲耆葱?即相同性)。同源性經(jīng)常用序列分析軟件測量(例如SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup.UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter.1710UniversityAvenue.Madison,ffl53705)。這種軟件通過給各種取代、缺失、插入和其它修飾賦值(assigning)同源性程度而匹配相似序列。保守取代典型包括下組內(nèi)的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；苯丙氨酸,酪氨酸。多肽分子被稱為具有“氨基末端”(N末端)和“羧基末端”(C末端)是因為在第一個氨基酸殘基的骨架氨基基團和第二個氨基酸殘基的骨架羧基基團之間發(fā)生肽鍵。術(shù)語“N末端”和“C末端”與多肽序列相關(guān)時是指分別包括多肽的N末端和C末端區(qū)域的多肽區(qū)域。包括多肽的N末端區(qū)域部分的序列包括主要來自多肽鏈的N末端半?yún)^(qū)(half)的氨基酸，但是非限于這種序列。例如,N末端序列可包括多肽序列的內(nèi)部部分,包括從多肽的N末端和C末端半?yún)^(qū)的堿基。這同樣適用于C末端區(qū)域。N末端和C末端區(qū)域可以但非必須包括分別限定多肽的最N末端和最C末端的氨基酸。術(shù)語“重組蛋白質(zhì)”或“重組多肽”如本文所用是指從重組DNA分子表達的蛋白質(zhì)分子。相反,術(shù)語“天然蛋白質(zhì)”是指分離自天然發(fā)生(即非重組)來源的蛋白質(zhì)。分子生物學技術(shù)可用于產(chǎn)生重組形式的蛋白質(zhì)，其與該蛋白質(zhì)的天然形式相比具有相同性質(zhì)。術(shù)語“細胞”、“細胞系”、“宿主細胞”如本文所用可互換使用，所有這種命名均包括這些命名的后代或潛在后代?！稗D(zhuǎn)化細胞”是指其中(或者其祖先中)已導入本發(fā)明的核酸分子的細胞。任選地,本發(fā)明的核酸分子可以被導入合適細胞系以產(chǎn)生能產(chǎn)生由所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。構(gòu)建這種細胞系的載體、細胞和方法是本領(lǐng)域熟知的。詞語“轉(zhuǎn)化體”或“轉(zhuǎn)化細胞”包括衍生自原始轉(zhuǎn)化細胞的原代轉(zhuǎn)化細胞，不考慮轉(zhuǎn)移次數(shù)。所有后代由于有意或無意突變在DNA含量中可以不精確相同。然而,具有與原始轉(zhuǎn)化細胞篩選的相同的功能性的突變的后代包括在轉(zhuǎn)化體定義中。術(shù)語“可操縱連接”如本文所用是指核苷酸序列的連接方式是能指導給定基因的轉(zhuǎn)錄和/或希望的蛋白質(zhì)分子的合成的核酸分子被產(chǎn)生。該術(shù)語還指編碼氨基酸的序列的連接方式是有功能的(例如酶學活性的,能結(jié)合結(jié)合配偶體的，能抑制的,等等)蛋白質(zhì)或多肽或其前體，例如蛋白質(zhì)或多肽的前(pre-)或前原(prepro-)形式被產(chǎn)生。本文鑒別的所有氨基酸殘基是天然L-構(gòu)型。與標準多肽命名一致，氨基酸殘基縮寫示于如下對應表。對應表1-字母3-字母氨基酸YTyrL-酪氨酸GGlyL-甘氨酸FPheL-苯丙氨酸MMetL-甲硫氨酸AAlaL-丙氨酸SSerL-絲氨酸IlieL-異亮氨酸LLeuL-亮氨酸TThrL-蘇氨酸VValL-纈氨酸PProL-脯氨酸KLysL-賴氨酸HHisL-組氨酸QGlnL-谷氨酰胺EGluL-谷氨撒WTrpL-色氨酸RArgL-精氨酸DAspL-天冬氨酸NAsnL-天冬酰胺CCysL-半胱氨酸術(shù)語“純化的”或“純化”是指從感興趣成分如蛋白質(zhì)或核酸中除去一些污染物的任何方法的結(jié)果。純化成分的百分比因此在樣品中增加。如本文所用,“純的”是指一種目的種類(objectspecies)是存在的主要種類(即基于摩爾，其比組合物中任何其它個體種類更豐富)，優(yōu)選基本上純化的級分是一種組合物，其中目的種類包括存在的所有大分子種類的至少50%(基于摩爾)。通常，“基本....Li純的(substantiallypure)’，組合物包括存在于組合物中的所有大分子種類的大于大約80%，更優(yōu)選大于大約85%、大約90%、大約95%、大約99%。最優(yōu)選地，目的種類純化至基本均質(zhì)(污染物種類不能通過常規(guī)檢測方法在組合物中檢測到)，其中組合物基本上由單--大分子種類組成。用于泡丨備片段的水解酶本發(fā)明范圍內(nèi)的水解酶包括但非限于經(jīng)重組技術(shù)例如定點誘變或遞歸(recursive)誘變制備的那些，并且包含一或多個氨基酸取代，其使得所產(chǎn)生的突變的水解酶能與底物形成穩(wěn)定的例如共價鍵，所述底物如被修飾含有一或多個功能基團的底物，對于相應非突變(野生型)水解酶,所述鍵比相應野生型水解酶和底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。本發(fā)明范圍內(nèi)的水解酶包括但非限于肽酶、酯酶(例如膽固醇酯酶)、糖苷酶(例如葡糖淀粉酶)、磷酸酶(例如堿性磷酸酶)等。例如，水解酶包括但非限于作用于酯鍵的酶如羧基酯水解酶、硫酯(thiolester)水解酶、磷酸一酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸一酯水解酶、磷酸三酯水解酶、產(chǎn)生5'-磷酸一酯的外脫氧核糖核酸酶(exodeoxyribonucleases)、產(chǎn)生3_'-磷酸一酯的外核糖核酸酶(exoribonucleases)、用核糖核酸或脫氧核糖核酸活化的外切核酸酶、用核糖核酸或脫氧核糖核酸活化的外切核酸酶、產(chǎn)生5'“磷酸一酯的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶、產(chǎn)生除5'-磷酸一酯之外的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶、特異于改變的堿基的位點特異性內(nèi)切脫氧核糖核酸酶、產(chǎn)生5'-磷酸一酯的內(nèi)切核糖核酸酶、產(chǎn)生除5'-磷酸一酯之外的內(nèi)切核糖核酸酶、用核糖核酸或脫氧核糖核酸活化的內(nèi)切核糖核酸酶、用核糖核酸或脫氧核糖核酸糖基化酶活化的內(nèi)切核糖核酸酶；糖基化酶，例如水解0-和S-糖基，及水解N糖基化合物的酶；作用于醚鍵的酶如三烷基锍(trialkylsulfonium)水解酶或醚水解酶；作用于肽鍵的酶(肽水解酶)如氨基肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、絲氨酸型羧基肽酶、金屬羧基肽酶、半胱氨酸型羧基肽酶、Ω肽酶、絲氨酸內(nèi)肽酶、半胱氨酸內(nèi)肽酶、天冬氨酸內(nèi)肽酶、金屬內(nèi)肽酶、蘇氨酸內(nèi)肽酶、和未知催化機制的內(nèi)肽酶；作用于除肽鍵之外的碳-氮鍵的酶，如在線性酰胺中、在環(huán)酰胺中、在線性脒中、在環(huán)脒中、在腈中或其它化合物中的那些碳-氮鍵；作用于酸酐如在含磷酐中及在含磺基酐中的那些的酶；作用于酸酐(催化跨膜運動)的酶；作用于酸酐或參與細胞或亞細胞運動的酶；作用于碳_碳鍵(例如在酮物質(zhì)中)的酶；作用于鹵化物鍵(例如在C-鹵化合物中)的酶；作用于磷-氮鍵的酶；作用于硫-氮鍵的酶；作用于碳-磷鍵的酶；及作用于硫-硫鍵的酶。作用于鹵化物鍵舉例的水解酶包括但非限于烷基鹵化酶、2鹵代酸脫鹵素酶、鹵代乙酸脫鹵素酶、甲狀腺素脫碘酶(thyroxinedeiodinase)、鹵代烷脫鹵素酶、4_氯苯甲酸脫鹵素酶、4-氯苯甲酰-CoA脫鹵素酶及阿特拉嗪氯水解酶(chlorohydrolase)。作用于環(huán)酰胺中的碳-氮鍵的舉例水解酶包括但非限于丙二酰脲酶，二氫嘧啶酶、二氫乳清酸酶、羧甲基乙內(nèi)酰脲酶、尿囊素酶、β-內(nèi)酰胺酶、咪唑啉酮丙酸酶(iraidazolonepropionase)、5-羥脯氨酸酶(ATP-水解)、肌酸酐酶、L-賴氨酸內(nèi)酰胺酶、6-氨基己酸-環(huán)-二聚體水解酶、2,5-二氧代哌嗪(dioxopiperazine)水解酶、N-甲基乙內(nèi)酰脲酶(ATP-水解)、氰尿酸酰胺水解酶、密胺水解酶?！唉?內(nèi)酰胺酶”如本文所用包括A類、C類和D類β-內(nèi)酰胺酶以及D-a:[a羧基肽酶/轉(zhuǎn)肽酶、酯酶EstB、青霉素結(jié)合蛋白2X、青霉素結(jié)合蛋白5和D-氨基肽酶。優(yōu)選地，β-內(nèi)酰胺酶是絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶,例如在相應于金黃色葡萄球菌(S.aureus)PCl的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶的殘基70的位置具有催化絲氨酸殘基，以及在相應于金黃色葡萄球菌PCl的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶的殘基166的位置具有谷氨酸殘基，任選在相應于金黃色葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶的殘基73的位置具有賴氨酸殘基，及還任選在相應于金黃色葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶的殘基234的位置具有賴氨酸殘基。在一個實施方案中，突變水解酶片段的序列基本上相應于具有至少一個在一個殘基中酸取代的突變水解酶的序列,所述殘基在野生型水解酶中與活化水分子相關(guān)，例如在催化三聯(lián)體中的殘基或者輔助殘基(auxiliaryresidue),其中活化的水分子裂解野生型水解酶中的催化殘基和水解酶底物之間形成的鍵。如本文所用，“輔助殘基”是改變另一個殘基活性的殘基，例如其增強活化水分子的殘基的活性。本發(fā)明范圍內(nèi)的活化水的殘基包括但非限于參與酸-堿催化中的那些,例如組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一個實施方案中，所述至少一個氨基酸取代是在--個殘基中，該殘基在野生型水解酶中通過水解酶底物的親核攻擊形成酯鍵。在另一個實施方案中，突變水解酶片段的序列包含至少兩個氨基酸取代，一個取代在一個在野生型水解酶中與活化水分子相關(guān)的殘基中，或者在一個在野生型水解酶中通過水解酶底物的親核攻擊形成酯鍵的殘基中，另--個取代在一個在野生型水解酶中位于或鄰近于水解酶底物結(jié)合位點的殘基中，例如所述殘基位于結(jié)合于野生型水解酶的水解酶底物的3-5A內(nèi)，但是不在一個在相應野生型水解酶中與活化水分子相關(guān)或者與底物形成酯中間體的殘基中。在一個實施方案中，第二個取代是在一個在野生型水解酶中排列位點用于底物進入水解酶催化口袋的殘基中，例如位于活性位點腔(cavity)及位于結(jié)合于野生型水解酶的水解酶底物的35A內(nèi)的殘基,如在底物通道中的殘基，其不是在相應野生型水解酶中與活化水分子相關(guān)或者與底物形成酯中間體的殘基。額外取代優(yōu)選增加突變體與相應全長野生型水解酶的底物形成穩(wěn)定共價鍵的速率。在一個實施方案中，一個取代位于一個在野生型水解酶中活化水分子的殘基中，例如組氨酸殘基，以及位于相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272的位置，例如在相應于氨基酸殘基272的位置的取代的氨基酸是苯丙氨酸或甘氨酸。在另一個實施方案中，一個取代位于一個在野生型水解酶中與底物形成酯中間體的殘基中，例如天冬氨酸殘基，以及位于相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106的位置。在一個實施方案中，第二個取代位于在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的位置175、176或273的氨基酸殘基中，例如在相應于氨基酸殘基175的位置的取代的氨基酸是甲硫氨酸、纈氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸或半胱氨酸，在相應于氨基酸殘基176的位置的取代的氨基酸是絲氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或精氨酸,和！或在相應于氨基酸殘基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。在另一個實施方案中，突變水解酶進一步包含第三個和任選第四個取代,其在野生型水解酶中位于活性位點腔及位于結(jié)合于野生型水解酶的水解酶底物的3-5人內(nèi)的殘基，例如第三個取代是在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175、176或273的位置中，第四個取代是在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基175、176或273的位置中。在一個實施方案中，本發(fā)明突變水解酶包含至少兩個氨基酸取代,其中至少一個與穩(wěn)定鍵形成相關(guān)，例如野生型水解酶中活化水分子的殘基,例如組氨酸殘基，以及位于相應于玫瑰色紅球菌脫齒素酶的氨基酸殘基272的位置中，例如,取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸，至少一個其它取代與改良的功能表達、結(jié)合動力學或FP信號相關(guān),例如在相應于SEQIDNO1的位置5，11,20，30，32，47,58，60，65，78，80,87，88，94，109,113，117,118，124,128，134,136，150,151，155,157，160,167，172,175，176,187，195,204,221,224,227,231,250,256，257，263，264，273，277，282，291或292的位置(見圖IB)。突變水解酶可包括其它取代，例如被導入以促進相應基因或其部分的克隆的那些，和/或位于或鄰近N和/或C末端的額外殘基，例如被導入以促進相應基因或其部分的克隆但非必須具有活性的那些,例如不是能獨立檢測到的。例如，野生型脫鹵素酶DhaA裂解鹵代烴(HaloC3-HaloC10)中的碳-鹵素鍵。DhaA的催化中心是經(jīng)典催化三聯(lián)體，包括親核體、酸和組氨酸殘基。三聯(lián)體中的氨基酸位于DhaA催化口袋的深內(nèi)側(cè)(大約10Δ長及大約20Δ2橫截面)。DhaA的鹵代底物的鹵素原子，例如C:[-烷底物中的氯原子,位于DhaA催化中心的緊鄰。DhaA結(jié)合底物,可能形成ES復合物,通過DhaA的AsplOB(編號基于DhaA的蛋白質(zhì)序列)親核攻擊底物形成酯中間體。DhaA的His272任何活化水，活化的水水解中間體，從催化中心釋放產(chǎn)物。突變DhaA,例如DhaA.H272F突變體，基于計算機模型研究及野生型DhaA(DhaA.WT)的基本物理化學特征可能保留3D結(jié)構(gòu),不能水解野生型酶的一或多個底物,例如對于Cl烷,釋放由野生型酶釋放的相應醇。突變的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶,例如BlaZ.E166D突變體、BlaZ.N170Q突變體和BlaZ.E166D:N170Q突變體不能水解野生型絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶的一或多個底物。在一個實施方案中，水解酶片段是突變的鹵代烷脫鹵素酶片段，例如在革蘭氏陰性(Keuningetal.,1985)和革蘭氏陽性利用鹵代烷的細菌(KeuningetaL，1985；Yokotaetal.，1987；Scholtzetal.，1987；Sallisetal.，1990)中發(fā)現(xiàn)的那些。鹵代烷脫鹵素酶，包括來自XanthobacterautotrophicusGJlO的DhlA(Janssenetal.，1988，1989)、來gl^i^iIStM^lDhaARM§SpingomonaspaucimobilisUT26^LinB(Ntigattietal.,1997)是催化相應烴水解脫鹵素的酶。進行轉(zhuǎn)化的鹵代脂族烴包括QrCu,飽和的脂族烴,其具有一或多個附著的鹵素基團，其中至少兩個鹵素位于相鄰碳原子上。這種脂族烴包括揮發(fā)性氯代脂族(VCA)烴。VCA包括例如脂族烴如二氯乙烷、1，2_二氯丙烷、1，2_二氯丁烷和1，2,3三氯丙烷。術(shù)語“鹵代烴”如本文所用是指鹵代脂族烴。如本文所用術(shù)語“鹵素”包括氯、溴、碘、氟、硤等。優(yōu)選鹵素是氯。在一個實施方案中，本發(fā)明的突變水解酶片段飽和至少兩個氨基酸取代,至少其中一個與穩(wěn)定鍵形成相關(guān)，例如在野生型水解酶中活化水分子的殘基，例如組氨酸殘基，并且位于相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272的位置，例如取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸,至少其中另一個與改良的功能表達、結(jié)合動力學或FP信號相關(guān)，例如位于相應于SEQIDNO1的位置5,11,20,30,32,47,58,60,65,78,80,87,88,94,109,113，117，118，124,128，134,136，150，151，155，157，160，167，172，175，176，187，195,204,221,224,227,231,250,256,257,263,264,273,277,282,291或292的位置。用于本發(fā)明片段的融合配偶體編碼水解酶或其它報道蛋白的片段的本發(fā)明的多核苷酸可以與其它核酸序列如天然序列如cDNA或已經(jīng)體外操作的序列一起采用以例如制備N末端、C末端或者N末端和C末端融合蛋白。合適的融合配偶體的許多例子是本領(lǐng)域已知的并且可以用于實踐本發(fā)明。例如,本發(fā)明提供了融合蛋白，其包含報道蛋白片段和感興趣蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列，例如感興趣的酶,例如蛋白酶,核酸結(jié)合蛋白，胞外基質(zhì)蛋白，分泌蛋白，抗體或其部分如Fe，生物發(fā)光蛋白，報道配體，調(diào)節(jié)蛋白，血清蛋白，免疫原性蛋白質(zhì)，熒光蛋白，具有反應性半胱氨酸的蛋白質(zhì)，受體蛋白,例如NMDA受體，通道蛋白,例如離子通道蛋白如鈉、鉀或鈣敏感性通道蛋白包括HERG通道蛋白，膜蛋白，細胞溶膠蛋白，核蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，磷蛋白，激酶,信號蛋白，代謝蛋白，線粒體蛋白，受體相關(guān)蛋白，熒光蛋白，酶底物，例如蛋白酶底物，轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化序列，或者轉(zhuǎn)運蛋白，例如EAAT1-4谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，以及靶向信號，例如質(zhì)體靶向信號，如線粒體定位序列，核定位序列或者十四烷基化序列,其指導融合體到特定位置。融合配偶體可包括具有酶活性的那些。例如，功能蛋白序列可以編碼激酶催化結(jié)構(gòu)域(HanksandHunter，1995),產(chǎn)生可以將磷酸部分酶學添加到特定氨基酸的融合蛋白，或者可以編碼SrcHomology2(SH2)結(jié)構(gòu)域(Sadowskietal.,1986；MayerandBaltimore,1993),產(chǎn)生特異結(jié)合磷酸化酪氨酸的融合蛋白。融合體也可以包括親和性結(jié)構(gòu)域，包括可以與結(jié)合配偶體相互作用的肽序列，例如固定化在固體支持物上，用于鑒別或純化。舉例的親和性結(jié)構(gòu)域包括IiiSV5(HHIIHlD(SEQIDNO62),HisX6(HHHHHH)(SEQIDN0:63),C-myc(EQKLISEEDL)(SEQIDNO64),Flag(DYKDDDDK)(SEQIDNO:65),SteptTag(WSHPQFEK)(SEQIDNO66),血凝素，例如HATag(YPYDVPDYA)(SEQIDNO:67)，GST，硫氧還蛋白，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，RYIRS(SEQIDNO:68),Phe-His-His-Thr(SEQIDNO:69)，幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，S-肽，T7肽，SH2結(jié)構(gòu)域，WEAAAREACCRECCARA(SEQIDN070)，金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域,或鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域如來自鈣結(jié)合蛋白的那些,例如鈣調(diào)蛋白，肌鈣蛋白C,鈣調(diào)磷酸酶B,肌球蛋白輕鏈,恢復蛋白，S-modulin，視錐蛋白，VILIP，神經(jīng)鈣蛋白，hippocalcin,frequenin，鈣牽蛋白，鈣蛋白酶大亞基，S100蛋白，小白蛋白，鈣結(jié)合蛋白D9K，鈣結(jié)合蛋白D28K，和鈣視網(wǎng)膜蛋白，inteins,生物素,鏈霉抗生物素蛋白，MyoD,Id,亮氨酸拉鏈序列,和麥芽糖結(jié)合蛋白。例如，異源序列可包括具有磷酸化酪氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如在Src,Abl和EGFR中)，其檢測ErbB2的磷酸化，Src、Abl和EGFR中的酪氨酸的磷酸化，MKA2的活化(例如使用MK2),PKA的活化，例如使用CREG的KID，Crkll的磷酸化，例如使用SH2結(jié)構(gòu)域pTyr肽，bZIP轉(zhuǎn)錄因子和REL蛋白的結(jié)合,例如bFos和bjunATF2和jun,或者p65NFkappaB,或者微管結(jié)合,例如使用kinesin。在--個實施方案中,異源序列可以包括蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如結(jié)合IL-17RA的結(jié)構(gòu)域，例如IL-17A，或者IL-17RA的IL-17A結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Erg的Jun結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者Jun的EG結(jié)合結(jié)構(gòu)域；鉀離子通道電壓感應結(jié)構(gòu)域，例如用于檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的該結(jié)構(gòu)域，Cdc42或rac靶的GTPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域,或者其它GTPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域,與激酶或磷酸酶活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域,例如調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈，PKCS,含普列克底物蛋白的PH和DEP結(jié)構(gòu)域(pleckstrincontainingPHandDEPdomains)，其它磷酸化識別結(jié)構(gòu)域和底物；葡萄糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，谷氨酸/天冬氨酸結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，PKA或cAMP-依賴性結(jié)合底物，InsPS受體,GKI,PDE,雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,apoKl-er，或鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，異源序列包括但非限于這樣的序列，如FRB和FKBP中的那些，蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基(PKa-R)和蛋白激酶的催化亞基(PKa-C)’src同源性區(qū)域(SH2)及能被磷酸化的序列，例如含有酪氨酸的序列，14-3-3的同種型，例如14Ht，及能被磷酸化的序列，具有WW區(qū)域(蛋白質(zhì)中結(jié)合富含脯氨酸分子的序列)的蛋白質(zhì)及能被磷酸化的異源序列，例如含有絲氨酸和/或蘇氨酸的序列，以及二氫葉酸還原酶(DHFR)和促旋酶B(GyrB)中的序列，或者雌激素受體(ER)中的序列。優(yōu)化的水解酶序列，編碼水解酶的載體及宿主細胞還提供了分離的核酸分子(多核苷酸),其包含編碼水解酶片段或其融合體的核酸序列。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子包含被優(yōu)化用于在至少一種選擇的宿主中表達的核酸序列。優(yōu)化的序列包括被密碼子優(yōu)化的序列，即相對于另一個生物體例如遠緣相關(guān)的生物體在--個生物體中更經(jīng)常被采用的密碼子，以及增加或修飾Kozak序列和/或內(nèi)含子的修飾，和/或除去不希望序列例如潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的修飾。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括編碼脫鹵素酶的核酸序列，所述核酸序列被優(yōu)化用于在選擇的宿主細胞中表達。在一個實施方案中，優(yōu)化的多核苷酸不再與相應的非優(yōu)化的序列雜交，例如不與非優(yōu)化序列在中等或高嚴格性條件下雜交。在另一個實施方案中，所述多核苷酸與相應非優(yōu)化序列具有小于90%、例如小于80%的核酸序列相同性，并且任選編碼與由非優(yōu)化序列編碼的多肽具有至少80%、例如至少85%、90%或更高的氨基酸序列相同性的多肽。還提供了包含所述分離的核酸分子的構(gòu)建體,例如表達盒,及載體，以及包含所述分離的核酸分子、構(gòu)建體或載體的試劑盒。包含編碼水解酶片段或與水解酶片段的融合體的核酸序列的核酸分子任選被優(yōu)化以用于在特定宿主細胞中表達，及還任選與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操縱連接以形成表達盒，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列例如為一或多個增強子、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止信號或其組合。在一個實施方案中，編碼水解酶片段或其融合體的核酸序列通過用在特定(選擇的)細胞中優(yōu)先采用的密碼子置換野生型或突變水解酶序列中的密碼子而優(yōu)化。優(yōu)先的密碼子在選擇的細胞中具有相對較高的密碼子使用頻率,優(yōu)選地它們的導入導致導入相對較少的針對選擇的宿主細胞中存在的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，及相對較少的其它不希望的結(jié)構(gòu)屬性。因此,優(yōu)化的核酸產(chǎn)物具有改良的密碼子使用頻率所致的改良的表達水平及由不希望的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列數(shù)目降低所致的降低的不合適轉(zhuǎn)錄行為的風險。本發(fā)明的分離的和優(yōu)化的核酸分子可具有與相應野生型核酸序列有大于30%、35%、40%或者大于45%、例如50%、55%、60%或更多的不同的密碼子的密碼子組成。用于本發(fā)明的優(yōu)選的密碼子是在特定生物體中比相同氨基酸的至少--種其它密碼子更經(jīng)常被采用的那些，以及不是該生物體中的低使用密碼子，及不是在用于克隆或篩選核酸分子表達的生物體中的低使用密碼子。另外，一定氨基酸(即具有三個或更多個密碼子的那些氨基酸)的優(yōu)選密碼子可以包括比其它(非優(yōu)選)密碼子更經(jīng)常被采用的兩個或多個密碼子。在--個生物體中比在另一個生物體中更經(jīng)常被采用的核酸分子中密碼子的存在導致核酸分子當被引入更經(jīng)常采用那些密碼子的生物體的細胞中時在該細胞中表達水平高于野生型或親本核酸序列在那些細胞中的表達。在本發(fā)明的一個實施方案中，不同的密碼子是在哺乳動物中更經(jīng)常被采用的那些，而在另一個實施方案中，不同的密碼子是在植物中更經(jīng)常被采用的密碼子。不同生物體優(yōu)選的密碼子是本領(lǐng)域已知的，例如見www,kazusa.or.jp./codon/0特定類型的哺乳動物例如人類可以具有不同于另一類型哺乳動物的優(yōu)選密碼子集合。相似地,一特定類型的植物可具有不同于另一類型植物的優(yōu)選密碼子集合。在本發(fā)明的一個實施方案中，大部分不同的密碼子是在希望的宿主細胞中的優(yōu)選的密碼子。包括哺乳動物(例如人類)和植物在內(nèi)的生物體優(yōu)選的密碼子是本領(lǐng)域已知的(例如，Wadaetal.,1990；Ausubeletal.，1997)。例如,優(yōu)選的人類密碼子包括但非限于CGC(Arg)，CTG(Leu)，TCT(Ser),AGC(Ser)，ACC(Thr),CCA(Pro),CCT(Pro),GCC(AIa),GGC(GIy),GTG(Val),ATC(Ile),ATT(Ile),AAG(Lys)，AAC(Asn)，CAG(Gln)’CAC(His)，GAG(Glu)，GAC(Asp)，TAC(Tyr)，TGC(Cys)禾口TTC(Phe)(Wadaetal.，1990)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的合成核酸分子具有不同于野生型核酸序列的密碼子組成，其具有增加數(shù)目的優(yōu)選的人密碼子，例如CGC,CTG,TCT,AGC，ACC，CCA，CCT，GCC，GGC，GTG，ATC，ATT，AAG，AAC，CAG，CAC，GAG，GAC，TAC，TGC，TTC,或其任何組合。例如，本發(fā)明的核酸分子相對于野生型核酸序列可以具有增加數(shù)目的CTG或TTG亮氨酸編碼密碼子、GTG或GTC纈氨酸編碼密碼子、GGC或GGT甘氨酸編碼密碼子、ATC或ATT異亮氨酸編碼密碼子、CCA或CCT脯氨酸編碼密碼子、CGC或CGT精氨酸編碼密碼子、AGC或TCT絲氨酸編碼密碼子、ACC或ACT蘇氨酸編碼密碼子、GCC或GCT丙氨酸編碼密碼子，或其任意組合。在另一個實施方案中，優(yōu)選的C.elegans密碼子包括但非限于UUC(Phe)，UUU(Phe)，CUU(Leu)，UUG(Leu)，AUU(Ile)，GUU(Val)，GUG(Val)，UCA(Ser)，UCU(Ser),CCA(Pro),ACA(Thr),ACU(Thr),GCU(Ala),GCA(Ala),UAU(Tyr),CAU(His)，CAA(Gln),AAU(Asn)’AAA(Lys)’GAU(Asp)’GAA(Glu)’UGU(Cys)’AGA(Arg)’CGA(Arg)’CGU(Arg),GGA(Gly)，或其任意組合。在另一個實施方案中，優(yōu)選的果蠅密碼子包括但非限于UUC(Phe)，CUG(Leu)，CUC(Leu)，AUC(Ile)，AUU(Ile)，GUG(Val),GUC(Val),AGC(Ser),UCC(Ser)，CCC(Pro)，CCG(Pro)，ACC(Thr),ACG(Thr),GCC(Ala),GCU(AIa),UAC(Tyr),CAC(His)，CAG(Gln)，AAC(Asn)，AAG(Lys)，GAU(Asp)’GAG(Glu)’UGC(Cys)’CGC(Arg)’GGC(Gly)，GGA(gly)，或其任意組合。優(yōu)選酵母密碼子包括但非限于UUU(Phe)，UUG(Leu)，UUA(Leu)，CCU(Leu)，AUU(Ile)，GUU(Val)，UCU(Ser)，UCA(Ser)，CCA(Pro)，CCU(Pro)，ACU(Thr),ACA(Thr),GCU(Ala),GCA(Ala),UAU(Tyr),UAC(Tyr),CAU(His),CAA(Gln),AAU(Asn),AAC(Asn),AAA(Lys),AAG(Lys)’GAU(Asp)’GAA(Glu)’GAG(Glu)’UGU(Cys)’CGU(Trp)，AGA(Arg)，CGU(Arg)，GGU(Gly)，GGA(Gly)，或其任意組合。類似地，具有增加數(shù)目的在植物中更被經(jīng)常采用的密碼子的核酸分子具有不同于野生型或親本核酸序列的密碼子組成,其具有增加數(shù)目的植物密碼子,包括但非限于CGC(Arg)，CTT(Leu),TCT(Ser),TCC(Ser),ACC(Thr),CCA(Pro),CCT(Pro),GCT(Ser),GGA(Glv),GTG(Val),ATC(Ile),ATT(Ile)，AAG(Lys)，AAC(Asn)，CAA(Gln)，CAC(His)，GAG(Glu)，GAC(Asp)，TAC(Tyr)，TGC(Cys)，TTC(Phe)，或其任意組合(Murrayetal.,1989)。不同類型植物的優(yōu)選的密碼子可以不同(Wadaetal.,1.990)。在--個實施方案中，編碼水解酶片段或其融合體的優(yōu)化的核酸序列相對于編碼相應水解酶片段或其融合體的非優(yōu)化核酸序列具有小于100%、例如小于90%或小于80%的核酸序列相同性。例如,編碼DhaA的優(yōu)化的核酸序列相對于編碼相應DhaA的非優(yōu)化(野生型)核酸序列具有小于大約80%的核酸序列相同性，所述優(yōu)化的核酸序列編碼的DhaA任選與相應野生型DhaA具有至少85%氨基酸序列相同性。在一個實施方案中，由所述優(yōu)化的核酸序列編碼的DhaA的活性至少是由非優(yōu)化序列編碼的DhaA活性的至少10%、例如50%或更多，例如，由所述優(yōu)化的核酸序列編碼的突變DhaA結(jié)合底物的效率與由非優(yōu)化核酸序列編碼的突變DhaA結(jié)合相同底物基本上相同，即至少50%、80%、100%或更高。舉例的優(yōu)化的DhaA基因具有下述序列hDhaA.v2.1_6F(FINAL,具有側(cè)翼序列)NNNNGCTAGCCAGCTGGCgcgGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTcCCTTTTGATCCTCAcTATGTtGAa(n’GCTGGGgGAaAGAATGCAcTAc(n’GGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACcCCaGTGCTGTTcCTcCAcGGGMcCCTACATCTagcTAcCTGTGGAGaMtATTATaCCTCATGTtGCTCCTagtCATAGgTGcATTGCTCCTGATCTGATcGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGActtaGAcTAcTTTTTTGATGAtCATGTtcGATActTGGATGCTTTcATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATaCAcGAcTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCAcTGGGCTAAaAGgAATCCgGAGAGAGTGAAGGGGATTGCTTGcATGGAgTTTATTcGACCTATTCCTACtTGGGAtGAaTGGCCaGAGTTTGCcAGAGAGACATTTCAaGCcTTTAGAACtGCcGATGTGGGcAGgGAGCTGATTATaGAcCAGAATGCTTTcATcGA(X;GGGCTCTGCCTAAaT(n’GTaGTcAGACCTCTcACtGAaGTaGAGAT(X;AcCATTATAGAGAGCCcTTTCTGAAGCCTGTGGATcGcGAGCCTCTGTGGAGgTTtCCaAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAaGCcTATATGAAcTGGCTGCATCAGagTCCaGTGCCcAAGCTaCTcTTTTGGGGGACtCCgGGaGTtCTGATTCCTCCTGCcGAGGCTGCTAGACTGGCTGAaTCcCTGCCcAAtTGTAAGACcGT(X;AcATcGGcCCtGGgCTGTTTTAcCTcCAaGAGGAcAAcCCTGATCTcATcGGGTCTGAGATcGCacGgTGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAgGCGGCCGCNNNN(SEQIDNO:1).核酸或表達盒可以導入載體中,例如質(zhì)?；虿《据d體，其任選包括選擇標記基因，所述載體導入感興趣細胞中,例如原核細胞如大腸桿菌、鏈霉菌、芽孢桿菌、葡萄球菌等，以及真核細胞包括植物(雙子葉或單子葉)、真菌、酵母例如畢赤氏酵母、糖酵母或裂殖酵母、或者哺乳動物細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞包括牛、山羊、綿羊、犬、貓、非人靈長類例如猴、及人細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞系包括但非限于CHO，COS,293，Hela,CV-1，SH-SY5Y(如成神經(jīng)細胞瘤細胞)、HEK293和NIH8T3細胞。編碼的水解酶片段的表達可以通過能在原核細胞或真核細胞中表達的任何啟動子控制。優(yōu)選的原核啟動子包括但非限于SP6，T7，T5，tac,bla,trp，gal,Iac或麥芽糖啟動子。優(yōu)選的真核啟動子包括但非限于組成型啟動子，例如病毒啟動子如CMV、SV40和RSV啟動子，以及調(diào)節(jié)型啟動子，例如誘導型或阻遏型啟動子如tet啟動子、hsp70啟動子和由CRE調(diào)節(jié)的合成啟動子。用于細菌表達的優(yōu)選載體包括PGEX-5X-3,用于真核表達的包括pCIneo-CMV。本發(fā)明的核酸分子、表達盒和/或載體可以經(jīng)任何方法導入細胞,包括但非限于鈣介導的轉(zhuǎn)化、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、顆粒轟擊等。用于酶底#；的官能切用于本發(fā)明底物和方法中的官能團是可檢測的或能檢測的分子。本發(fā)明范圍內(nèi)的官能團能被共價連接于雙官能接頭的一個反應取代基或水解酶的底物，以及作為本發(fā)明底物的部分，具有不與天然發(fā)現(xiàn)的底物連接的官能團基本上相同的活性并且能與突變水解酶形成穩(wěn)定復合物。官能團因此具有促進具有該官能團的底物與突變水解酶之間的穩(wěn)定復合物的檢測和任選分離的一或多種性質(zhì)。例如，官能團包括具有特征性電磁譜性質(zhì)的那些，如發(fā)射或吸收、磁性、電子自旋共振、電容、介電常數(shù)或電導率，以及是鐵磁性、順磁性、反磁性、發(fā)光、電化學發(fā)光、熒光、磷光、有色、抗原性或具有獨特質(zhì)量的官能團。官能團包括但非限于核酸分子即DNA或RNA,例如寡核苷酸或核苷酸,如具有核苷酸類似物的--個,能結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA，相應于感興趣基因的單鏈DNA，相應于感興趣基因的RNA，缺乏終止密碼子的mRNA，氨酰起始tRNA，氨酰琥珀抑制子tRNA，或者用于RNAi的雙鏈RNA，蛋白質(zhì)，例如發(fā)光蛋白,肽，肽核酸，由配體識別的表位，例如生物素或鏈霉抗生物素蛋白，半抗原,氨基酸，脂質(zhì)，脂質(zhì)雙層，固體支持物,熒光團，生色團，報道分子，放射核素,如用于例如放射活性測量的放射性同位素或用于如同位素編碼的親和性標記(ICAT)方法中的穩(wěn)定同位素，不透電子的分子(electronopaquemolecule)，X射線對比試劑，MRI造影劑,例如鎂、釓或鐵氧化物顆粒等。在--個實施方案中，官能團是氨基酸，蛋白質(zhì)，糖蛋白，多糖，三聯(lián)體敏化劑(tripletsensitizer)例如CALI，核酸分子，藥物，毒素，脂質(zhì)，生物素或固體支持物如自組裝單層(參見例如Kwonetal.,2004)，結(jié)合Ca2+，結(jié)合K'，結(jié)合Na+,pH敏感,是不透電子(electronopaque)的，是生色團，是MRI造影劑，在存在NO時發(fā)熒光或者對活性氧敏感，納米顆粒，酶,酶底物，酶抑制劑,例如自殺底物(參見例如Krnrnetal.,2004),輔因子,例如NADP，輔酶，琥珀酰亞胺基酯或醛，螢光素，谷胱甘肽，NTA，生物素，cAMP，磷脂酰肌醇，cAMP配體，金屬,用作自旋捕獲的硝基氧或nitrone(由電子自旋共振(ESR)檢測),金屬螯合劑，例如用于造影劑,在時間分辨熒光中或捕獲金屬,Photocaged化合物,例如其中照射時釋放caged化合物如熒光團，嵌入劑,例如補骨脂素或用于結(jié)合DNA或作為可光活化分子的另一種嵌入劑，三磷酸酯或亞磷酰胺，例如允許底物摻入DNA或RNA中，抗體，或者異雙功能交聯(lián)劑如用于綴合蛋白質(zhì)或其它分子的那些,交聯(lián)劑，包括但非限于酰胼(hydxazide)，芳基疊氮化物(arylazide)，馬來酰亞胺,碘乙酰胺/溴乙酰胺，[羥基琥珀酰亞胺基酯，混合的二硫化物如吡啶基二硫化物，乙二醛！苯基乙二醛，乙烯基砜/乙烯基磺酰胺,丙烯酰胺,硼酸酯，氧肟酸，酰亞胺酯，異氰酸酯/異硫氰酸酯，或者氯三嗪/二氯三嗪。例如，官能團包括但非限于一或多個氨基酸，例如天然發(fā)生的氨基酸或非天然氨基酸，肽或多肽(蛋白質(zhì))，包括抗體或其片段，His標記，F(xiàn)LAG標記，Strep標記，酶，輔因子，輔酶，酶的肽或蛋白質(zhì)底物，例如分支肽底物(例如Z-氨基芐氧基(Abz)-Gly-Pro-Ala-Leu-Ala-4-硝基芐基酰胺(NBA))，自殺底物，或者受體，一或多個核苷酸(例如ATP，ADP,AMP,GTP或GDP)包括其類似物，例如寡核苷酸，相應于基因或其部分的雙鏈或單鏈DNA,例如能結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA如轉(zhuǎn)錄因子,相應于基因的RNA,例如缺乏終止密碼子的mRNA,或其一部分,用于RNAi或其載體的雙鏈RNA,糖蛋白，多糖,肽核酸(PNA),脂質(zhì)包括脂質(zhì)雙層；或者是固體支持物，例如沉降顆粒如磁性顆粒，瓊脂糖或纖維素珠，膜，玻璃，例如玻片，纖維素，藻酸鹽，塑料或其它合成制備的聚合物，例如^pendorf管或多孔板的孔，自組裝單層,表面等離子體共振芯片，或者具有導電表面的固體支持物，以及包括藥物,例如化療劑如阿霉素,5-氟尿嘧啶,或camptosar(CPT-11；Irinotecan),氨酰tRNA如氨酰起始tRNA或氨酰琥珀抑制子tRNA，結(jié)合Ca2+的分子，結(jié)合K+的分子，結(jié)合Na+的分子，PH敏感的分子，放射核素，不透電子(electron叩ague)的分子，造影劑，例如鋇、碘或其它MRI或X射線造影劑,在存在NO時發(fā)熒光或者對活性氧敏感的分子,納米顆粒例如免疫金顆粒、順磁性納米顆粒、上轉(zhuǎn)化納米顆?；蛘吡孔狱c,酶的非蛋白質(zhì)底物,酶抑制劑,可逆或不可逆抑制劑，螯合劑，交聯(lián)基團，例如琥珀酰亞胺基酯或醛，谷胱甘肽，生物素或其它抗生物素蛋白結(jié)合分子,抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白，cAMP,磷脂酰肌醇，血紅素，cAMP配體,金屬，NTA,以及在一個實施方案中，包括一或多種染料,例如夾氧雜蒽染料,鈣敏感性染料,例如1-[2-氨基-5-(2,7-二氯-6-羥基-3-氧基-9-咕噸基)-苯氧基]-2-(2‘-氨基-5'-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸(Fluo-3)，鈉敏感性染料，例如1，3-苯二羧酸，4，4'-[1,4，10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環(huán)十八烷-7,16-二基雙(diylbis)(5-甲氧基-6,2-苯并呋喃二基)]雙(PBFI),NO敏感性染料，例如4-氨基-5-甲基氨基-2',7'-二熒光素,或者其它熒光團。在一個實施方案中，官能團是半抗原或者免疫原性分子，即由特異于該分子的抗體結(jié)合的分子。在一個實施方案中，官能團不是放射核素。在另一個實施方案中，官能團是放射核素，例如3H,14C,35S,125I，1311，包括用于診斷方法中的分子。檢測特定官能團的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，核酸分子可以用雜交、擴增、與特異于該核酸分子的核酸結(jié)合蛋白結(jié)合、酶測定(例如如果核酸分子是核酶)檢測，或者如果核酸分子本身包含可檢測或能檢測的分子例如放射性標記或生物素,其可以通過適合于該分子的測定檢測。舉例的官能團包括半抗原，例如用于增強免疫原性的分子，如匙孔嘁血藍蛋白(KLH),可裂解標記，例如光裂解生物素,及熒光標記，例如N羥基琥珀酰亞胺(NSH)修飾的香豆素和琥珀酰亞胺或磺基琥珀酰亞胺修飾的BODIPY(其可以用UV和/或可見光激發(fā)的熒光檢測而檢測)，羅丹明，例如Rl10,rhodols,CRG6,TexasMethylRed(羧基四甲基羅丹明)，5-羧基-X-羅丹明，或者熒光素，香豆素衍生物，例如7氨基香豆素，和7-羥基香豆素，2_氨基-4-甲氧基萘，1-羥基芘，resorufin,芴酮或苯并芴酮(美國專利號4，812，409)，吖啶酮(美國專利號4，810，636),蒽,和α-和β-萘醇的衍生物，氟代夾氧雜蒽衍生物包括氟代熒光素和rhodols(例如美國專利號6，162，931),生物發(fā)光分子，例如螢光素，coelenterazine，螢光素酶，化學發(fā)光分子，例如穩(wěn)定化的二噁二酮(dioxetanes)，以及電化學發(fā)光分子。通過與相應野生型水解酶底物連接而連接于突變水解酶的熒光(或發(fā)光)官能團可以用于實時感應系統(tǒng)中的變化,如磷酸化。另外，熒光分子如金屬離子的化學感應物(chemosensor),例如9-羰基蒽修飾的甘氨酰-組氨酰-賴氨酸(GHK)用于本發(fā)明底物中的Cu2+，可以被用于標記結(jié)合底物的蛋白質(zhì)。發(fā)光或熒光官能團如B0DIPY、羅丹明綠、GFP或紅外染料也用作官能團，可以例如用于相互作用研究，例如使用BRET，F(xiàn)RET,LRET或電泳。另一類官能團是選擇性與含有接納體基團的分子相互作用的分子(“親和性”分子)。因此，包括親和性分子的水解酶底物可以促進具有這種底物和突變水解酶的復合物的分離，因為親和性分子與另一種分子例如可以是生物學或非生物學來源的接納體分子選擇性相互作用。例如,親和性分子相互作用的特異分子(稱為接納體分子)可以是小有機分子,化學基團如巰基基團(-SH)或大生物分子如抗體或親和性分子的其它天然發(fā)生配體。結(jié)合性質(zhì)是正常化學的，并且可涉及共價或非共價鍵的形成或相互作用如離子或氫鍵。接納體分子可以是在溶液中游離的或者本身結(jié)合于固體或半固體表面、聚合酶基質(zhì)，或者位于固體或半固體基質(zhì)表面上。相互作用還可以由外部因素激發(fā),如光、溫度、壓力或添加作為催化劑的化學或生物學分子。復合物從反應混合物的檢測和/或分離由于在親和性分子和接納體分子之間的相互作用、正常是一種類型的結(jié)合、而發(fā)生。親和性分子的例子包括分子如免疫原性分子,例如蛋白質(zhì)的表位,肽,碳水化合物或脂質(zhì)，即用于制備特異于該分子的抗體的任何分子；生物素,抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白，及其衍生物；金屬結(jié)合分子；及這些分子的片段和組合。舉例的親和性分子包括His5(HHHHH)(SEQIDNO72)，HisX6(HHHHHH)(SEQIDNO73)，C-myc(EQKLISEEDL)(SEQIDNO74),Flag(DYKDDDDK)(SEQIDNO75)，SteptTag(WSHPQFEK)(SEQIDNO66),IIA標記(YPYDVPDYA)(SEQIDNO:77)，硫氧還蛋白，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，S-肽，T7肽,鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，C末端RNA標記,金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域,金屬結(jié)合反應基團,氨基酸反應基團，inteins，生物素，鏈霉抗生物素蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白。突變水解酶和底物之間的復合物中生物素的存在允許復合物選擇性結(jié)合抗生物素蛋白分子,例如包被在表面例如珠、微孔、硝基纖維素等上的抗生物素蛋白分子例如鏈霉抗生物素蛋白分子。合適的表面包括用于層析分離的樹脂，塑料如組織培養(yǎng)表面或結(jié)合平板，微滴定板和珠，陶瓷和玻璃，顆粒包括磁性顆粒，聚合物和其它基質(zhì)。處理的表面用例如磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，以除去缺乏生物素的分子，分離含生物素復合物。在一些情況中，這些材料可以是生物分子傳感裝置如光纖、chemfets和等離子體檢測器的部分。親和性分子的另一個例子是丹磺酰賴氨酸。與丹磺酰環(huán)相互作用的抗體是可商業(yè)獲得的(SigmaChemical；St.Louis,MO)或者可以用已知方案制備，如在Antibodies:ALaboratoryManual(HarlowandLane,1988)中所述。例如，抗丹磺?？贵w被固定化在層析柱的填充材料上。這個方法,親和性柱層析，通過導致突變水解酶和本發(fā)明底物之間的復合物由于其與固定化抗體的相互作用而保留在柱上而其它分子通過柱而實現(xiàn)分離。復合物然后可以通過破壞抗體抗原相互作用而釋放。特異的層析柱材料如離子交換或親和性S^harose,Sephacryl,Sephadex和其它層析樹脂是可商業(yè)獲得的(SigraaChemical；St.Louis,MO；PharmaciaBiotech；Piscataway,N.J.)。丹磺酰賴氨酸可以由于其熒光性質(zhì)而方便檢測。當采用抗體作為接納體分子時，可以通過其它生物化學分離方法進行分離，如免疫沉淀和固定化抗體到濾膜或其它表面如珠、平板或樹脂上。例如，本發(fā)明的突變水解酶和底物的復合物可以通過用親和性分子特異性或水解酶特異性抗體包被磁珠而分離。珠經(jīng)常用磁場從混合物中分離。另一類功能分子包括可用電磁輻射檢測的分子，包括但非限于夾氧雜蒽熒光團，丹磺酰熒光團，香豆素和香豆素衍生物，熒光吖啶鐺部分,基于苯并芘的熒光團，以及7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑和3N-(7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基)-2,3-二氨基-丙酸。優(yōu)選地，熒光分子在不同于天然氨基酸的波長具有高量子產(chǎn)額，更優(yōu)選具有可以在光譜的可見光部分或者同時在UV和可見光部分激發(fā)的熒光的量子產(chǎn)額。在預選波長激發(fā)后，分子可以肉眼或用常規(guī)熒光檢測方法在低濃度檢測到。電化學發(fā)光分子如釕螯合物及其衍生物活在硝基氧氨基酸及其衍生物可以在飛摩爾范圍和以下檢測到。在一個實施方案中，光學可檢測的官能團包括一或多個熒光團，如夾氧雜蒽，香豆素,色原烯，吲哚,異吲哚，噁唑，B0DIPY,BODIPY衍生物，咪唑，嘧啶，噻吩,芘，苯并芘，苯并呋喃，熒光素，羅丹明，rhodol,芴酮(phenalenone)，吖啶酮(acridinone)，resorufin，萘，蒽，吖啶鐵，α-萘醇，β-萘醇,丹磺酰,花菁,嘆,硝基苯并噁唑(NBD),dap0Xyl,萘酰亞胺，苯乙稀基等。在一個實施方案中，光學可檢測的官能團包括如下之一除了熒光分子之外，可以使用多種具有基于相互作用的物理性質(zhì)及分子對電磁場和放射的應答的分子檢測突變水解酶或其片段與底物之間的復合物。這些性質(zhì)包括UV吸收、電磁譜的可見及紅外區(qū)域、Raman活性的并且可以進一步由共振Raman光譜術(shù)增強的生色團的存在、電子自旋共振活性和核磁共振及分子質(zhì)量，例如經(jīng)質(zhì)譜儀。檢測和/或分離具有親和性分子的復1壓或高壓液相層析、反相層析、親和層析和離子交換層析。蛋白質(zhì)分離丨檢測及隨后分離突變水解酶或其片段與底物之間的復合物，例如電泳、等電聚焦和質(zhì)譜t_〒7議編腫讓列隨I接頭”也由符號>1^=表示，是^-或多個官能團共價附著于包括反應基團的底物或者共價附著于反應基團的基團。如本文所用接頭不是單個共價鍵。接頭的結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵的，只要其產(chǎn)生能被其靶酶結(jié)合的底物即可。在一個實施方案中接頭可以是二價基團，其通過長度大約5埃至大約1000埃(包括端點)將官能團(R)與反應基團分開。其它合適接頭包括通過大約5埃至大約100埃將:R與反應基團分開的接頭，以及通過大約5埃至大約50埃、大約5埃至大約25埃、大約5埃至大約500?；蛘叽蠹s30埃至大約100埃將R與底物分幵的接頭。在一個實施方案中，接頭是氨基酸。在另一個實施方案中,接頭是肽。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈,包含大約2-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代，其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選用非過氧化物()、-S或-NH置換及其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子用芳環(huán)或雜芳環(huán)置換。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含大約2-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代,其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選用非過氧化物-0-、-S-或-NH-置換及其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子用一或多個(例如1、2、3或4個)芳環(huán)或雜芳環(huán)置換。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含大約2-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代,其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選用非過氧化物-0-、-S-或-NH-置換及其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子用一或多個(例如1、2、3或4個)雜芳環(huán)置換。在另一個實施方案中,接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈,包含大約1-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵,及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代，其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選用非過氧化物0、或置換。在另一個實施方案中，接頭是式-W-F-W-的二價基團，其中F是(Q-C3Q)烷基、(c2-c30)鏈烯基、(C2-C30)炔基、(c3-c8)環(huán)烷基或(C6-C1Q),其中W是-N(Q)C(=0)-、_C(=0)N(Q)-、-oc(=0)-、-c(=0)0-、-o-、-s-、-s(0)-、_S(0)2-、_N(Q)-、_C(=0)-或直接鍵；其中每個Q獨立是II或(CrC6)烷基。在另一個實施方案中,接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈,包含大約1-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵,及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含大約2-大約30個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵。在另--個實施方案中,接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈,包含大約2-大約30個碳原子。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含大約2—大約20個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵,及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代。在另一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含大約2-大約20個碳原子，所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵。在另--個實施方案中,接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈,包含大約2-大約20個碳原子。在另一個實施方案中，接頭是-(CII2CII20)-h。。在另一個實施方案中，接頭是-C(=0)NH(CH2)3-「C(=0)nh(ch2)5C(=o)NH(CH2)-；-CH2OC(=O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)-;-c(=0)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-；-CH20C(=0)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-；-(CH2)4C(=0)NH(CIi2)20(CH2)20(CIi2)3-；-C(=0)NH(CIi2)5C(=0)NH(CII2)20(CIi2)20(CII2)3—。在另一個實施方案中，接頭包含一或多個二價雜芳基。特別地，(Ci-Cj烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基；(C3-C8)環(huán)烷基可以環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；(C2-C3Q)鏈烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；(C2-C30)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基或癸炔基；(CfCj芳基可以是苯基、茚基或萘基；雜芳基可以是呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基(oxazoyl)、異噁唑基(isoxazoyl)、噻唑基、異噻唑基(isothiazoyl)、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基(或其N-氧化物)、噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、吲哚基、異喹啉基(或其N氧化物)或喹啉基(或其N氧化物)。術(shù)語芳族包括芳基和雜芳基基團。芳基是指苯基或具有大約9-10個環(huán)原子、其中至少一個環(huán)是芳環(huán)的鄰位稠合的雙5|、碳5|、基(ortho-fusedbicycliccarbocyclicradical)0雜芳基包含通過單環(huán)芳香環(huán)的環(huán)碳連接的基，所述單環(huán)芳香環(huán)包含5或6個環(huán)原子，其由碳和個雜原子組成,所述雜原子的每一個選自非過氧化物氧,硫和N(X)組成的組，其中X不存在或是H,0,(CrC4)烷基,苯基或芐基，以及由此衍生的8-10個環(huán)原子的鄰位稠合的雙環(huán)雜環(huán)，具體是苯衍生物或通過稠合丙烯，三亞甲基，或四亞甲基二基而與其連接。術(shù)語“氨基酸”當用于指接頭時,包含I)或L形式的天然氨基酸殘基(例如Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gin,Glv,His,Hyl,Hyp,lie,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr和Val)，以及非天然氨基酸(例如磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸；馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、statine、1，2，3，4，-四氫異喹啉-3-羧酸、青霉胺、鳥氨酸、瓜氨酸、a-甲基-丙氨酸、對-苯甲酰苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸(propargylglycine)、肌氨酸和叔丁基甘氨酸)。該術(shù)語還包括攜帶常規(guī)氨基保護基(例如乙?；蚱S氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基末端被保護的天然和非天然氨基酸(例如作為(C「C6)烷基、苯基或芐基酯或酰胺)。其它合適的氨基和羧基保護基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見例如Greene,ProtectingGroupsInOrganicSynthesis；Wiley=NewYork，1981，及其引用的參考文獻)。氨基酸可以通過羧基末端、氨基末端或通過任何其它方便的附著點例如通過半胱氨酸的硫與另一個分子連接。術(shù)語“肽”當用于指接頭時,描述了2-25個氨基酸的序列(如上述)或者肽基殘基。序列可以是線性或環(huán)狀的。例如,環(huán)狀肽可以制備或得自在序列中的兩個半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。肽可以通過羧基末端、氨基末端或通過任何其它方便的附著點例如通過半胱氨酸的硫與另一個分子連接。優(yōu)選地肽保護3-25或5-21個氨基酸。肽衍生物可以如美國專利號4，612，302；4,853，371；和4，684，620中所述制備。本文特別描述的肽序列以左側(cè)氨基末端和右側(cè)羧基末端書寫。舉例白_勿在一個實施方案中，水解酶底物具有式(I)的化合物R接頭AX，其中R是一或多個官能團，其中接頭是包括C、N、S或0的多原子直鏈或支鏈,或者包含一或多個環(huán)例如飽和或未飽和環(huán)的基團，如一或多個芳環(huán)、雜芳環(huán)或其任何組合,其中A-X是脫鹵素酶例如鹵代烷脫鹵素酶或者裂解脂族或芳香鹵代底物中的碳_鹵素鍵的脫鹵素酶的底物，如紅球菌(Rhodococcus)，假平胞菌(Sphingomonas),葡萄球菌(Staphylococcus)，假單胞菌(Pseudoraonas),伯霍爾德桿菌(Burkholderia),土壤桿菌(Agrobacteriura)或平胞菌(Xanthobacter)脫鹵素酶的底物,其中X是鹵素。在一個實施方案中，烷基鹵化物共價附著于接頭L，L是共價附著一或多個官能團以形成脫鹵素酶底物的基團。在一個實施方案中，本發(fā)明的具有接頭的脫鹵素酶底物具有式(I)R-接頭-A-X(I)其中R是一或多個官能團(如熒光團、生物素、發(fā)光團或者熒光或發(fā)光分子,或者是固體支持物，包括微球、膜、聚合物平板、玻璃珠、玻片等)，其中接頭是包括C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈，其中A-X是脫鹵素酶底物,其中X是鹵素。在一個實施方案中，A-X是脫鹵素酶的鹵代脂族或鹵代芳族底物。在一個實施方案中，接頭是二價支鏈或非支鏈碳鏈，包含從大約12個到大約30個碳原子,所述鏈任選包括一或多個(例如1、2、3或4個)雙鍵或三鍵，以及所述鏈任選用一或多個(例如2、3或4個)羥基或氧基(=0)基團取代，其中鏈中的一或多個(例如1、2、3或4個)碳原子任選用非過氧化物-O、-S或-NII-置換。在一個實施方案中，接頭包含3-30個原子,例如11-30個原子。在一個實施方案中,接頭包含(CH2CH2O)yγ=2-8。在一個實施方案中,A是(CH2)n且η=2-10,例如4-10。在一個實施方案中，A是CH2CH2或CH2CH2CH20在另一個實施方案中，A包含芳基或雜芳基。在一個實施方案中，脫鹵素酶如紅球菌脫鹵素酶的底物中的接頭是包括C、N、S或O的多原子直鏈或支鏈,優(yōu)選地當官能團R包括芳環(huán)系統(tǒng)或是固體支持物時為11-30個原子。在另一個實施方案中,本發(fā)明的具有接頭的脫鹵素酶底物具有式(II)R-接頭-CH2-CH2-CH2-X(II)其中X是鹵素，優(yōu)選氯。在一個實施方案中，R是一或多個官能團,如熒光團、生物素、發(fā)光團或者熒光或發(fā)光分子,或者是固體支持物,包括微球、膜、玻璃珠等。當R是放射性標記或者小的可檢測原子如光譜活性同位素時,接頭可以是0-30個原子。舉例的脫鹵素酶底物描述于美國公幵申請?zhí)?006/0024808和2005/0272114，其引入本文作參考。_]用于軍酶S!合體Φ的舉例的突變脫,鹵素·酶羧基四甲基羅丹明-CiqH21NO2-CI/羧基熒光素-CwH21NO2-Cl和5_羧基-X-羅丹明-C1()Ii21N02-Cl結(jié)合DhaA.H272F但不結(jié)合DhaA.WT。生物素-C1C1H21N02-Cl結(jié)合DhaA.H272F但不結(jié)合DhaA.WT。底物與DhaA.H272F之間的鍵非常強，因為用SDS煮沸不破壞鍵。DhaA.H272突變體即H272F/G/A/Q結(jié)合羧基四甲基羅丹明-C1QH21N02_C1。DhaA.H272以高特異性方式結(jié)合底物，因為用一種底物預處理完全阻斷另一種底物(羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl)的結(jié)合。DhaA中殘基106的D用I)之外的親核氨基酸殘基取代,例如C、Y和E,其可以與底物形成比野生型DhaA和底物之間形成的鍵更穩(wěn)定的鍵。特別地,半胱氨酸是基于半胱氨酸的酶中的親核體，那些酶已知不活化水。分析了對照突變體DhaA.D106Q、單突變體DhaA.D106C、DhaA.D106Y和DhaA.D106E以及雙突變體DhaA.D106C:H272F,DhaA.D106E:H272F、DhaA.D106Q:H272F和DhaA.D106Y:H272F對羧基四甲基羅丹明-CiqH21NO2-CI的結(jié)合。羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl結(jié)合DhaA.D106C、DhaA.D106C:H272F、DhaA.D106E和DhaA.H272F。因此，羧基四甲基羅丹明-CiciH21NOirCl和突變體DhaA中的殘基106的半胱氨酸或谷氨酸之間形成的鍵相對于羧基四甲基羅丹明-C1QH21N02-Cl和DhaA.WT之間形成的鍵穩(wěn)定。在106位的其它取代單獨或組合在DhaA中其它殘基的取代可以產(chǎn)生相似結(jié)果。另外,在106位的一些取代單獨或組合在DhaA中其它殘基的取代可以產(chǎn)生僅與一些底物形成鍵的突變DhaA。在一個實施方案中，本發(fā)明的突變脫鹵素酶包含至少兩個氨基酸取代,其中至少一個與穩(wěn)定的鍵形成相關(guān),例如在野生型水解酶中的活化水分子的殘基,例如組氨酸殘基，并且位于相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基272的位置,例如,取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸，至少另一個與改良的功能表達、結(jié)合動力學或FP信號相關(guān)，例如在相應于SEQIDNO1的位置5,11，20，30，32,47，58，60，65,78，80，87，88,94，109，1.13，117,118，124,128，134,136，150,151，155,157,160,167,172,175,176,187,195,204,221,224,227,231,250,256,257,263,264,273,277,282,291或292的位置。用于誘變的殘基的鑒別殘基編號基于DhaA的一級序列，其不同于公布的晶體結(jié)構(gòu)的編號(1BN6.pdb)。使用DhaA底物模型，鑒別了在結(jié)合的底物的3A和5A內(nèi)的脫鹵素酶殘基。這些殘基代表第一種用于誘變的潛在靶。從這個列表選擇殘基,當它們被置換時，很可能去除立體位阻或不利的相互作用，或者導入有利的電荷、極性或其它相互作用。例如，在位置175的Lys殘基位于DhaA表面在底物通道入口除去這個大的帶電側(cè)鏈可能改善底物進入通道。在位置176的Cys殘基排在通道中，其大側(cè)鏈導致通道收縮除去這個側(cè)鏈可能打幵通道并改善底物進入。在位置245的Val殘基排在通道中，并與結(jié)合的底物的兩個氧緊密接近用蘇氨酸置換這個殘基可增加氫鍵合機會，可改善底物結(jié)合。最后,Bosmaetal.(2002)報道了分離了具有氨基酸取代Tyr273Phe的DhaA催化高效(proficient)突變體。這個突變當與Cys176Tyr取代重組時，產(chǎn)生在脫鹵素1，2，3_三氯丙烷(TCP)中比野生型脫鹵素酶近乎高8倍有效的酶。基于這些結(jié)構(gòu)分析，除了產(chǎn)生定點V245T突變植物，在位置175、176和273的密碼子被隨機化。篩選所得突變體的改良的與熒光(例如式VI或VIII:的化合物)和生物素偶聯(lián)的DhaA底物形成共價鍵的速率。文庫產(chǎn)生及篩選所有文庫和突變體構(gòu)建的起始材料均是含有編碼DhaA.H272F和DhaA.D106C的基因的基于PGEX5X3的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒攜帶編碼能與鹵代烷配體形成穩(wěn)定共價鍵的親代DhaA突變體的基因。在DhaA.H272F和DhaA.D106C模板中的位置175、176和273的密碼子用NNK位點飽和誘變策略隨機化。除了在這些位置的單位點文庫外,還構(gòu)建了組合175/176NNK文庫。評估了三種測定作為DhaA突變體文庫初級篩選工具。第一個是體內(nèi)標記測定，基于大腸桿菌中的改良的DhaA突變體具有優(yōu)異標記性質(zhì)這個假設(shè)。在用羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl的短暫標記期及細胞洗滌之后,優(yōu)異克隆應具有更高的在575nm的熒光強度。僅篩選一個96孔板DhaA.H272F175/176文庫就成功鑒別了一些潛在改良(即hits)。4個克隆具有比親代克隆高2倍的強度水平。盡管這個測定的潛在用途，但是沒有選擇它作為初級篩選，因為自動化程序遇到困難以及由于活性DhaA突變體的簡單過表達可能給出假陽性這個事實。被考慮作為初級篩選的第二個測定是體外測定，其通過將飽和量的DhaA突變體捕獲在96孔形式的固定化抗FLAG抗體上而有效針對蛋白質(zhì)濃度標準化。與體內(nèi)測定類似，這個測定也能夠清楚從親代活性大背景鑒別潛在的改良的DhaA突變體。一些克隆產(chǎn)生比親代DhaA.H272F高4倍的信號。但是這個測定是昂貴的，因為試劑費用和測定準備時間，以及多個保溫和洗滌步驟的自動化。另外，這個測定不能捕獲先前分離并鑒定為優(yōu)異的一些突變體。自動化基于MagneGST的測定被用于篩選DhaA突變蛋白質(zhì)文庫。篩選基于DhaA.H272F和DhaA.D106C的175單位點文庫未能揭示比親代克隆顯著更好的hits。篩選鑒別了一些具有比親代對照優(yōu)異的標記性質(zhì)的克隆。3個具有顯著更高標記性質(zhì)的克隆可以從包括DhaA.H272F親代的背景明顯區(qū)分。對于具有比DhaA.II272F親代高至少50%的活性的克隆,檢查的文庫的整體命中率在1-3%之間變化。DhaA.D106C文庫獲得類似篩選結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。由最初初級篩選鑒別的hits被置于主平板中，固結(jié)(consolidated),重新生長并用MagneGST測定再次分析。僅那些在再次分析中具有比親代對照高至少2倍的信號的DhaA突變體被選擇用于序列分析。DhaAhits的序列分析圖2A顯示篩選DhaA.H272F文庫后鑒別的DhaA突變體的密碼子這個分析鑒別T7個單176位氨基酸取代(C176G，C176N,C176S,C176D，C176T,C176A，及C176R)。令人感興趣地，分離了三個不同絲氨酸密碼子。還鑒別了在175和176位的許多雙氨基酸取代(K175E/C176S,K175C/C176G,K175M/C176G,K175L/C176G,K175S/C176G,K175V/C176K,K175A/C176S,和K175M/C176N)。盡管在這些雙突變體中在175位發(fā)現(xiàn)7種不同氨基酸,但是在位置176僅鑒別3種不同氨基酸(絲氨酸、甘氨酸和天冬酰胺)。在文庫質(zhì)量評估中鑒別的單K175M突變包括在分析中。另外，還鑒別了一些優(yōu)異的單Y273取代(Y273C，Y273M，Y273L)。圖2B顯示在DhaA.D106C文庫中鑒別的DhaA突變體的突變密碼子。除了單C176G突變之外，大多數(shù)鑒別的克隆含有雙175/176突變。總共11種不同氨基酸在175位被鑒別。相反，僅3種氨基酸(Gly,Ala和Gln)在位置176被鑒別,Gly在幾乎3/4的D106C雙突變體中出現(xiàn)。DhaA突變體的鑒定由篩選程序鑒別的一些基于DhaA.H272F和D106C的突變體在MagneGST測定中產(chǎn)生比親代克隆顯著更高的信號?；贒haA.H272F的突變體A7和Hll以及基于DhaA.D106C的突變體D9用羧基四甲基羅丹明-CJI21NO2-Cl產(chǎn)生比各自親代顯著更高的信號。另外,在273位鑒別的所有基于DhaA.H272F的突變體(Y273L〃YL"，Y273M"YM"和Y273C"YC")使用生物素-PEG4-14-Cl底物看起來比親代克隆顯著改良。這些分析結(jié)果與用SDS-PAGEfluorimage凝膠分析進行的蛋白質(zhì)標記研究一致。在確定DhaA.H272F背景中鑒別的最佳突變的組合釋放是否是加合的努力中，在殘基273的3個突變與DhaA.H272FA7和DhaA.H272FHll突變重組。為了區(qū)分這些重組的蛋白質(zhì)突變體與在第一輪篩選中鑒別的突變體(第一代)，它們被稱為“第二代”DhaA突變體。為促進比較動力學研究，一些改良的DhaA突變體被選擇用GlutathioneSepharose4B樹脂純化。一般地，基于DhaA.H272FandDhaA.D106C的融合體在大腸桿菌中的產(chǎn)生是豐富的，盡管單氨基酸變化可能對DhaA產(chǎn)生具有負面結(jié)果。作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的這一變化，DhaA突變體的整體產(chǎn)率也顯著變化(1-15mg/mL)。初步動力學標記研究用一些DhaA.H272F衍生的突變體進行。許多(如果不是全部)選擇用于分析的突變體具有比H272F親代更快的標記動力學。事實上,更緊密觀察時程時,一些DhaA突變體包括第一代突變體YL和兩個第二代突變體A7YM和HllYL突變體的標記似乎在2分鐘完成。在DhaA.H272FA7和兩個第二代DhaA.H272F突變體A7YM和IIIIYL上進行更擴展的時程分析。兩個第二代克隆的標記反應大部分在第一個時間點(20秒)完成。另一方面，A7突變體看起來僅在最后時間點(7分鐘)達到完成。凝膠上的熒光條帶被定量,確定產(chǎn)物形成的相對速率。為了確定標記速率，HllYL的濃度從50ng降低到10ng，進行更精確的時程。在這些標記條件下可以測量線性初始速率。熒光成像的(fluorimaged)凝膠數(shù)據(jù)的定量允許計算二級速率常數(shù)?；谟^察的斜率，DhaA.H272FHllYL的羧基四甲基羅丹明-CK,H21N()2-C:[標記的二級速率常數(shù)是5.OxlO5M-1sec—1。熒光偏振(FP)對于小熒光配體結(jié)合蛋白質(zhì)的研究是理想的。其在用于分析分子結(jié)合的方法中是獨特的，因為其給出底物結(jié)合/游離比率的直接近乎瞬時測量。因此,FP測定被開發(fā)為純化DhaA突變體的fluorimage凝膠分析的替代途徑。在所用標記條件下，第二代突變體DhaA.H272FHllYL比其A7和H272F對應物顯著更快。為使這個速率比例正確(inperspective)，在反應中分別需要多大約42倍或420倍的A7和親代DhaA.H272F蛋白質(zhì)以獲得可測量速率。在所用標記條件下,很顯然IillYL突變體也比A7和親代DhaA.H272F蛋白質(zhì)與基于熒光素底物更快。但是看起來用羧基熒光素-CiciH21NO2-Cl標記HllYL比用相應羧基四甲基羅丹明-C113H21NO2-Cl底物標記顯著更慢。多4倍的HllYL蛋白用于羧基熒光素_C:i。H2PO2-Cl反應(150nM)，相比于羧基四甲基羅丹明-CmH21NO2-Cl反應(35nM)，觀測到的速率看起來定性上比觀測的羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl速率低。基于這個測定的靈敏性和真同質(zhì)性質(zhì)，使用FP鑒定用熒光偶聯(lián)底物對純化的DhaA突變體的標記性質(zhì)。來自這些研究的數(shù)據(jù)然后用于計算每個DhaA突變體-底物對的二級速率常數(shù)。用于這個研究的兩個親代蛋白質(zhì)DhaA.H272F和DhaA.D106C被發(fā)現(xiàn)用基于羧基四甲基羅丹明和羧基熒光素的底物具有可比的速率。但是在每種情況中，標記比用羧基熒光素-C^H21NO2-Cl底物慢。所有用FP鑒定的第--代DhaA突變體具有比相應親代蛋白質(zhì)快7-3555倍的速率。到目前為止，單氨基酸取代對標記速率的最大影響用DhaA.H272F背景中的273位的3種置換(Y273L,Y273M和Y273C)發(fā)生。然而,在每個測試的第一代DhaA.H272F突變體中，用羧基熒光素-CiaH21NO2-Cl底物標記總是以較慢速率發(fā)生(1.6-46倍)。大多數(shù)第二代DhaA.H272F突變體比甚至最改良的第一代突變體顯著更快。一個突變體特別是HlIYL用羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl的計算二級速率常數(shù)比DhaA.H272F親代高4個數(shù)量級。IIllYL速率常數(shù)2.2x106M1sec1幾乎與羧基四甲基羅丹明偶聯(lián)的生物素/鏈霉抗生物素蛋白相互作用的計算的速率常數(shù)相同。這個值與用表面等離子體共振分析(Qureshietal.,2001)確定的針對生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用的結(jié)合速率SxIO6M4sec—1一致。一些第二代突變體還具有用羧基熒光素-CmH21NO2-Cl底物的改良速率，但是如前所述，這些速率總是比用羧基四甲基羅丹明-CiciH21NO2-Cl底物慢。例如DhaA.H272FHllYL突變體的羧基熒光素-CiciH21NO2-Cl標記速率比羧基四甲基羅丹明-CiaH21NO2-Cl標記速率低100倍。舉仿I丨的方法本發(fā)明提供了監(jiān)測細胞中分子的表達、定位和/或運輸，以及監(jiān)測細胞內(nèi)微環(huán)境中的變化的方法，以例如成像、鑒別、定位、展示或檢測可能存在于樣品例如細胞中的一或多個分子,所述方法采用雜合蛋白質(zhì)系統(tǒng)。本發(fā)明方法中采用的試劑優(yōu)選可溶于水溶液或大多數(shù)水溶液中，包括水及具有大于或等于大約6的pH的水溶液。但是，底物的原液可以在稀釋進水溶液或緩沖液中之前溶解在有機溶劑中。優(yōu)選的有機溶劑是非質(zhì)子極性溶劑如DMSO、DMF、K甲基吡咯烷酮、丙酮、乙腈、二噁烷、四氫呋喃和其它非羥基完全水混溶溶劑。使用的試劑的濃度依賴于實驗條件和希望的結(jié)果,例如在合理時間內(nèi)獲得結(jié)果，具有最低背景或不希望的標記，例如對于PCL反應。例如，水解酶底物的濃度典型從納摩爾到微摩爾。報道蛋白底物和合適融合蛋白的所需濃度可以通過底物和/或融合蛋白量中的系統(tǒng)差異確定直至實現(xiàn)滿意信號,例如標記。起始范圍容易地從本領(lǐng)域已知方法確定。在--個實施方案中，包括具有光學性質(zhì)的官能團的水解酶底物被用于檢測異源序列之間或者分子如細胞分子和一或多個異源序列與包括具有水解酶片段的融合體的融合蛋白之間的相互作用。這種底物與包含融合蛋白的感興趣樣品組合一段足以使異源序列與細胞分子相互作用例如結(jié)合以及水解酶片段/互補功能不同蛋白質(zhì)片段結(jié)合底物的時間，之后在選擇引起官能團的光學應答的波長光照樣品任選地,樣品被洗滌以除去殘余的、過量的或未結(jié)合的底物。在一個實施方案中，使用標記以通過進一步比較該光學應答與標準或預期應答而確定樣品的指定特征。例如，結(jié)合的底物用于監(jiān)測樣品的特異成分在樣品中的空間及時間分布。或者,結(jié)合的底物用于確定或檢測某一分子的存在或數(shù)量。在--個實施方案中，基于生物發(fā)光蛋白的雜合系統(tǒng)被用于檢測異源序列之間或者分子如細胞分子和一或多個異源序列與包括具有生物發(fā)光蛋白片段的融合體的融合蛋白之間的相互作用。生物發(fā)光蛋白的底物與包含融合蛋白的感興趣樣品組合一段足以使異源序列與細胞分子相互作用例如結(jié)合以及生物發(fā)光蛋白片段/互補功能不同蛋白質(zhì)片段結(jié)合底物的時間，之后檢測或測量由生物發(fā)光蛋白產(chǎn)生的信號。任選地，樣品被洗滌以除去殘余的、過量的或未結(jié)合的底物。在一個實施方案中，信號與標準或?qū)φ毡容^?？蓹z測的光學應答是指能通過直接觀察或儀器察覺到的測試系統(tǒng)中的參數(shù)的變化或發(fā)生。這種可檢測應答包括顏色、生物發(fā)光、熒光、反射、化學發(fā)光、光偏振、光散射或X-射線散射中的變化或出現(xiàn)。在一個實施方案中，可檢測應答是熒光中的變化，如熒光強度、激發(fā)或發(fā)射波長分布、熒光壽命、熒光偏振或其組合中的變化?？蓹z測的光學應答可在樣品全部或在樣品局部部分發(fā)生。比較光學應答程度與標準或預期應答可以用于確定樣品是否具有給定特征及到何種程度。包含本發(fā)明融合蛋白的樣品典型用被動手段標記，即與底物保溫。但是，可以使用將底物導入樣品的任何方法如將底物顯微注射進細胞或細胞器，以將底物導入樣品。本發(fā)明的底物在使用濃度內(nèi)通常對于活細胞及其它生物學成分是無毒的。包含本發(fā)明融合蛋白的樣品可以在與本發(fā)明底物接觸后立即觀測。包含本發(fā)明融合蛋白的樣品可以任選與檢測過程中的其它溶液組合，例如標記、包括洗滌溶液、透化和/或固定溶液以及其它含有額外檢測試劑的溶液。與底物接觸后的洗滌可以改善光學應答的檢測，因為洗滌后降低非特異性背景。不洗滌也可以有滿意的觀察,例如對于基于PCL的反應，使用較低的標記濃度。本領(lǐng)域已知許多固定劑和固定條件，包括甲醛、低聚甲醛、福爾馬林、戊二醛、冷甲醇和31甲醇乙酸。固定典型用于保存細胞形態(tài)學及當用病原性樣品工作時降低生物危害。底物的選擇的實施方案，例如具有官能團的水解酶底物，在細胞中良好保持。固定任選后接或者伴隨透化,如用丙酮、乙醇、DMSO或各種去污劑透化，以允許大底物根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法跨過細胞膜。任選地,在包含突變水解酶或其融合蛋白的樣品中，底物的使用可以與額外檢測試劑的使用組合，所述額外檢測試劑產(chǎn)生由特異細胞成分、細胞內(nèi)物質(zhì)或者細胞條件所致的可檢測應答。當額外檢測試劑具有不同于底物的光譜性質(zhì),多顏色應用是可能的。在一個實施方案中,在與具有官能團(該官能團具有光學性質(zhì))的水解酶底物接觸之后或期間的任何時間，包含融合蛋白(其中之一包括水解酶片段)的樣品用導致可檢測光學應答的光波長光照，并且用檢測光學應答的手段觀測。盡管一些底物可用環(huán)境光比色檢測,但是其它底物通過親本熒光團的熒光性質(zhì)檢測。在如用紫外或可見波長發(fā)射燈、弧光燈、激光或者甚至太陽光或者普通室內(nèi)光光照后,底物、包括結(jié)合于互補特異性結(jié)合對成員的底物顯示致密的可見光吸收以及熒光發(fā)射。用于光照本發(fā)明底物的選擇的儀器包括但非限于手持紫外燈、汞弧光燈、氙燈、氬激光器、激光二極管和YAG激光器。這些光源任選集成激光掃描儀、熒光微板讀出器、標準或小熒光計或者色譜檢測器。這個比色吸光度或熒光發(fā)射任選用肉眼觀察，或者使用任何下列裝置=CCD相機、攝像機、照相膠卷、激光掃描裝置、熒光計、光電二極管、量子計數(shù)器、表面熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細胞儀、熒光微板讀出器，或者通過擴增信號的手段如光電倍增管。當包含突變水解酶或其融合蛋白的樣品用流式細胞儀、熒光顯微鏡或熒光計檢查時,所述儀器任選用于區(qū)分和辨認包含是熒光團的官能團的底物和具有可檢測的不同光學性質(zhì)的第二個熒光團，典型地是通過區(qū)分底物的熒光應答及第二個熒光團的熒光應答。當樣品用流式細胞儀檢查時，樣品的檢查任選包括用淘選裝置基于底物的熒光應答分離樣品內(nèi)的顆粒。本發(fā)明通過下述非限制性實施例描述。實施例1對于DhaA.H272FHlIYL(圖4，HT2)的DNA進行如F定點誘變，發(fā)現(xiàn)D78G、F80S、P291A和P291G相對于DhaA.II272FHllYL在大腸桿菌中的功能表達得以改善。應用在DhaA.H272FHllYL中密碼子80,272和273的位點飽和誘變,產(chǎn)生含有在每個這些位置所有可能氨基酸的文庫。將所述文庫在大腸桿菌中過表達，使用含有的脫鹵素酶底物(C31H31ClNO8)的羧基熒光素(FAM)和熒光偏振法(FP)篩選功能性表達/改良的動力學。篩選使得可以鑒別具有改良的表達以及改良的動力學的蛋白質(zhì)。特別地,篩選可以排除具有較低內(nèi)在動力學(intrinsickinetics)的突變體。具有希望的性質(zhì)的取代包括如下取代F80Q、F80N、F80K、F80H、F80T、H272N、H272Y、Y273F、Y273M以及Y273L。在這些取代中，Y273F示出改良的內(nèi)在動力學。HT2中在272位置的Phe缺乏與Glu-130形成氫鍵的能力。據(jù)認為His-272與Glu-130之間的相互作用發(fā)揮結(jié)構(gòu)作用，因此這個鍵的缺少可以使HT2不穩(wěn)定。此外’Phe與在273位置的Tyr->Leu改變的鄰近可以提供這些相鄰殘基的側(cè)鏈之間潛在的協(xié)同相互作用。在273位置是Leu或Phe的情況中，Asn被鑒別是在272位置最佳的殘基。當建模含有Asn-272的HT2結(jié)構(gòu)時,顯然1)Asn充填與His相比具有相似幾何學的空間，以及2)Asn可以與Glu-130形成氫鍵。發(fā)現(xiàn)在272位置具有Asn取代的HT2在大腸桿菌、無細胞系統(tǒng)以及哺乳動物細胞中產(chǎn)生較高水平功能蛋白，很可能是改良該蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性的結(jié).果ο使用兩輪誘變PCR以在HT2整個編碼序列導入突變,頻率是每個序列1-2個氨基酸取代。這種方法使得可以靶向整個序列，且不依賴于OT2結(jié)構(gòu)/功能的任何現(xiàn)有知識。在第一輪誘變中，在HT2的N末端融合于人源化Renilla螢光素酶作為模板的情況中，固定Asn272、Phe-273和Gly-78。鑒別有益于改良針對FAM配體的FP信號的6個突變(S58T、A155T、A1.72T、A224E、P291S、A292T；V2)，且確定除了A172T之外的每個取代均使得大腸桿菌中蛋白質(zhì)產(chǎn)生增加。然而,A172T突變提供改良的內(nèi)在動力學。然后組合這6個取代(包括Leu+/-273)產(chǎn)生合成序列(V3/V2)，當其與多個配偶體及以兩個方向融合時提供明顯改良的蛋白質(zhì)產(chǎn)生以及內(nèi)在標記動力學。在第二輪誘變中，使用6個不同的模板V3或者V2在C末端融合人源化Reni！Ia螢光素酶(RL)、螢火蟲螢光素酶,或者Id。如上述進行誘變PCR,組合經(jīng)鑒別有益于3個配偶體中的至少2個配偶體的突變，產(chǎn)生V6(Leu-273)。在第二輪誘變PCR中，使用升高的溫度(300C)誘導蛋白質(zhì)表達，以嘗試選擇賦予熱穩(wěn)定性的序列。提高突變DhaA融合體的內(nèi)在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以更有效地產(chǎn)生蛋白質(zhì)。與希望的性質(zhì)相關(guān)的隨機突變包括如下突變G5C、G5R、DlIN、E20K、R30S、G32S、L47V、S58T、R60H、D65Y、Y87F、L88M、A94V、S109A、F113L、K117M、R118H、K124I、C128F、P134H、P136T、Q150II、A151T、A155T、V157I、E160K、A167V、A172T、D187G、K195N、R204S、L221M、A224E、N227E、N227S、N227D、Q231.H、A250V、A256D、E257K、K263T、T264A、D277N、I282F、P291S、P291Q、A292T和A292E。除T....述取代之外，鑒別了突變DhaA與下游C末端配偶體Renilla螢光素酶之間連接序列中的取代。所述親本連接序列(殘基294-320)是QYSGGGGSGGGGSGGGGENLYFQAIEL(SEQIDNO79)。在該連接序列中鑒別的與改良的FP信號相關(guān)的取代是Υ295Ν,G298C,G302D,G304D,G308D,G310D,L313P,L313Q和Α317Ε。注意這9個取代中有5個是帶負電荷的。除了Α172Τ和Y273F(在Η272Ν情況中)之外,所有上述取代均提供了作為N末端融合體在大腸桿菌中的改良的功能性表達。然而，A172T和Y273F改良了內(nèi)在動力學用于標記。在具有一般改良性質(zhì)的突變DhaA中舉例的組合取代是DhaA2.3(V3):S58T、D78G、A155T、A172T、A224E、F272N、P291S和A292T。DhaA2.4(V4):S58T、D78G、Y87F、A155T、A172T、A224E、N227D、F272N、Y273F、P291Q和A292E。DhaA2.5(V5):G32S、S58T、D78G、Y87F、A155T、A172T、A224E、N227D、F272N、P291Q和A292E。DhaA2.6(V6):L47V、S58T、D78G、Y87F、L88M、C128F、A155T、E160K、A167V、A172T、K195N、A224E、N227D、E257K、T264A、F272N、P291S和A292T。在DhaA2.6中發(fā)現(xiàn)的取代除了A167V之外均改良在大腸桿菌中的功能性表達，所述A167V改良內(nèi)在動力學。圖5提供了改良在大腸桿菌中功能性表達的額外的取代。V6序列用作模板用于在C-末端誘變。在Id_V6融合情況中(V6是C-末端配偶體)，制備含有隨機的兩個殘基(尾部)延伸的突變體文庫，并且用FAM配體篩選。鑒別具有改良的蛋白質(zhì)產(chǎn)生以及較低非特異性裂解(通過TMR配體標記和凝膠分析確定)的突變體。DhaA2.6(V6)中兩個C-末端殘基由Glu-Ile-Ser-Gly置換,產(chǎn)生V7。作為與Id的N-末端和C-末端融合體，將V7的表達與V6進行對比。融合體在大腸桿菌中過表達，并用10μMTMR配體完成標記，然后通過SDS-PAGE+熒光成像(fluorimaging)分辨。數(shù)據(jù)示出從V7序列中產(chǎn)生更多的功能性融合蛋白。此外，用FAM配體對V7的標記動力學與V6相似，但是當檢測純化的非融合蛋白質(zhì)時，V7比V6具有更快的動力學。為了檢測體內(nèi)標記，在將HeLa細胞用HT2,V3,V7和V7F的載體轉(zhuǎn)染24小時后(V7F相對于V7具有一個不同氨基酸差異；V7F在273位置是Phe而不是Leu)，將細胞在體內(nèi)用0.2μMTMR配體標記5分鐘、15分鐘、30分鐘或者2小時。通過SDS-PAGE/熒光成像分析樣品以及通過ImageQuant量化。V7和V7F導致比HT2和V3更好的功能性表達，V7、V7F和V3在哺乳動物細胞中均具有相對于HT2改良的體內(nèi)動力學。此外，V7作為N或O買末端融合體具有改良的功能性表達，且在PU11down實驗中比其它突變DhaA更有效。結(jié)果示出對于MyoD的數(shù)量V7>V6>V3,可以使用HaloLink-固定的突變體DhaA-Id融合體pulleddown。V7和V7F具有改良的標記動力學。特別地，V7F具有比V7快大約1.5-3倍的標記。此外，對于熱穩(wěn)定性，V7>V6>V7F>V3>HT20例如，在一些條件下(暴露于48°C溫度30分鐘)，純化的V7F喪失其50%活性,而V7仍保持80%活性。當V7和V7F在大腸桿菌中表達以及作為裂解產(chǎn)物分析時，V7和V7F之間熱穩(wěn)定性差異更顯著。注意這些突變體的末端可以適應各種序列，包括尾部和鏈接序列以及取代。例如，突變體DhaA的N末端可以是M/GA/SETG,C末端可包括取代和添加(尾部)，例如P/S/QA/T/ELQ/EY/I,以及任選SG0例如，所述C末端可以是EISG,EI,QY或者Q0對于N-載體,N-末端可以是MAE,而在C-載體中,N-末端序列或者突變體DhaA可以是GSE或者MAE。尾部包括但不限于QY和EISG。實施例2_]Renilla帝光素酶中耐受修飾的位點制備Renilla螢光素酶構(gòu)建體，其具有插入在耐受修飾的位點中的RIIβB，例如在殘基91/92,223/224或者229/230之間。它們是:hRL(l-91)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-4氨基酸肽接頭-hRL(92-31.1),hRL(l-91)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-20氨基酸肽接頭-hRL992-311),hRL(l_91)-10氨基酸肽接頭-RIIBetaB-4氨基酸接頭-hRL(92-311)，hRL(l-91)-42氨基酸肽接頭_hRL(92_311),hRL(l_223)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-4氨基酸接頭-hRL(224-311)，hRL(l-223)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-20氨基酸接頭-hRL(224-31.1),hRL(1-223)-1.0氨基酸肽接頭-RIIBetaB-4氨基酸接頭-hRL(224-311),hRL(1-223)-10氨基酸肽接頭-RIIBetaB-20氨基酸接頭-hRL(224-311)，hRL(1-223)-42氨基酸肽接頭-hRL(224-311)，hRL(1-229)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-4氨基酸接頭-hRL(230-311),hRL(1-229)-4氨基酸肽接頭-RIIBetaB-20氨基酸接頭-hRL(230-311),hRL(l-229)-42氨基酸肽接頭-hRL(230-311)。使用TnTTTCoupledWheatGermLysate系統(tǒng)從所述構(gòu)建體中表達蛋白質(zhì)，將17μL的TNT反應物與補力口3.4μL的ImMcAMP原液或者dH20的17μL的300mMHEPES/200mMThiourea(pH為大約7.5)混合；使反應物在室溫保溫大約10分鐘。將10μL每個樣品一式三份加入96孔平板中，使用100μLReni！Ia螢光素酶分析試劑在Glomax光度計上測量發(fā)光。hRL(l-91)_接頭-RIIBetaB-接頭-hRL(92-311)蛋白被誘導12-23倍，hRL(l-223)_接頭-RIIBetaB-接頭-hRL(224-311)蛋白未被誘導，hRL(1-229)-^頭-RIIBetaB-(230-311)蛋白被誘導大約2-9倍。42個氨基酸接頭構(gòu)建體無一被誘導，全長Renilla螢光素酶構(gòu)建體或者“無DNA”對照物也未被誘導。耐受修飾的這些位點及其它位點在下表中示出。對于除4個之外的所有構(gòu)建體，選擇位點，因為其在溶劑暴露的表面環(huán)中。Renilla螢光素酶在其它水解酶如脫鹵素酶中可以用作耐受修飾的位點模型，例如使用IBN6(紅球菌屬(Rhodococcussp.))和2DHD(自養(yǎng)的茁平胞菌(Xanthobacterautotrophicus))鹵代烷脫鹵素酶晶體結(jié)構(gòu)作為模板。溶劑暴露的表面環(huán)與包埋于蛋白質(zhì)核心中的位點或者包含于α或者β結(jié)構(gòu)中的位點相比可以更適應修飾。因此,脫鹵素酶中相應于Renilla螢光素酶中耐受修飾的那些位點的區(qū)域，例如相應于Renilla螢光素酶的殘基86-97、96-116或者218-235的區(qū)域，可用于制備“分離(split)”脫鹵素酶蛋白用于PCA或者PCL。實施例3雷帕霉素(Rapamycin)-介導的FRB/FKBP蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和突變體DhaA用于PCL中。當雷帕霉素存在時，F(xiàn)RB和FKBP相互作用。因此，如果PCL成功，重建的報道蛋白僅當融合蛋白在存在雷帕霉素條件下保溫時被標記。產(chǎn)生兩個pF9(Kan)載體，其含有FRB或者FKBPORF加上接頭序列(GlyGlyGlyGlySer)2，位于Sgfl/Pmel位點上游。對應可用于制備Renilla螢光素酶片段用于PCS的位置的突變DhaA基因(HT2)(見實施例2和圖7)具有FRB-N-末端和FKBP-C-末端融合。使用PCR引物擴增HT2N-和C-末端部分,并克隆進Sgfl/Pmel位點。使用RiboMax及隨后WheatGermPlus反應(HT2),通過單獨表達每個克隆在體外進行PCL。使用或者不用FluoroTect表達蛋白質(zhì)。HuoroTect標記保證所有蛋白質(zhì)以大約相等量表達(數(shù)據(jù)未示出)。未標記的蛋白質(zhì)單獨或者與合適的配對體在由或無1μM雷帕霉素條件下一起保溫。然后將1()μ丨這些產(chǎn)物與突變體脫鹵素酶的0.1μΜ的TMR標記的配體在黑暗處保溫2小時。然后將所有樣品與lXSDS/50mMDTT加樣緩沖液在70°C保溫5分鐘，隨后進行變性NuPAGE凝膠電泳。圖8B示出預期結(jié)果。對于瞬時轉(zhuǎn)染,將CHO細胞鋪板于6孔平板中，使用TransIT-CHO--式兩份轉(zhuǎn)染。第二天，將細胞在有或無ιμM雷帕霉素條件下保溫2.5小時，隨后與ι.ομMHaloTagTMR配體保溫1小時。將細胞在PBS中洗滌、用胰蛋白酶消化、沉淀，以及在具有蛋白酶抑制劑和RQDNaseI的200μIPBS中機械裂解。將標準化量的蛋白質(zhì)在用微波高火處理30秒,并在變性NuPAGE凝膠上運行。MMFRB-N末端(1-78)+FKBP-C末端(79-294)的共保溫僅當與雷帕霉素一起保溫時才保持TMR標記。正如所期望的,全長HT2也被標記。FluoroTect標記示出所有蛋白質(zhì)均等量表達(數(shù)據(jù)未示出)。此外，CHO細胞中PCL介導的蛋白質(zhì)在存在雷帕霉素的條件下被標記(圖8C)。也存在少量雷帕霉素非依賴性PCL。無論是否加入雷帕霉素，全長OT2均被標記。因此,這個技術(shù)具有提供更高靈敏性的潛力，用以通過隨時間積累標記而檢測弱的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。此外，這個技術(shù)通過使用相同載體構(gòu)建體可易于在體外、體內(nèi)以及原位顯影研究之間轉(zhuǎn)變。實施例4在FRB-N-末端報道蛋白片段+FKBP-C-末端報道蛋白片段方向與HTvT和人源化Renilla帝光素_(hRL)的蛋白質(zhì)互補許多細胞信號是溝通的，并且通過級聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)。最后,許多這些信號導致可以通過使用報告基因測定監(jiān)測的遺傳應答。需要測定與主要事件接近的細胞事件的能力，因為其可以更“實時”分析細胞應答以及降低由于在隨后下游點混淆因素所致假象的可能性。為了監(jiān)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，制備兩個融合蛋白。一個融合蛋白含有一部分報道蛋白和一種感興趣的蛋白質(zhì)(第一個異源序列,相對于報道蛋白異源,與另一(第二個)異源序列相互作用)。另一融合蛋白含有與第一個融合蛋白中的報道蛋白部分功能不同但互補的蛋白質(zhì)的一部分以及第二個異源氨基酸序列。在一個實施方案中，一個感興趣的蛋白質(zhì)融合在Renilla螢光素酶的N末端或C末端部分的N末端或者O末端,另一感興趣的蛋白質(zhì)融合在突變脫鹵素酶例如稱作ΗΥ7的C末端或者N末端部分的N或者C末端。感興趣的蛋白質(zhì)的相互作用重建Renilla螢光素酶和/或HIV7蛋白的活性。哪種活性重建依賴于催化位點位于蛋白質(zhì)的哪部分(或者在HTv7情況中是前面的催化位點)。選擇Renilla螢光素酶和fflV7作為基于結(jié)構(gòu)相似性的雜合互補系統(tǒng)模型。對鹵代烷脫鹵素酶(紅球菌；SwissProt#P59336)和ReniIla螢光素酶同源模型，使用1BN6(紅球菌)和2DHD(自養(yǎng)的茁平胞菌)鹵代烷脫鹵素酶晶體結(jié)構(gòu)作為模板的基于結(jié)構(gòu)分析獲得大約30%相同性。材料和方法這兩個蛋白質(zhì)由HTv7和Renilla螢光素酶分別在兩個位置被分離殘基78/79或者98/99以及91/92或者111/112。Renilla螢光素酶“分離”位置先前已經(jīng)在Renilla螢光素酶蛋白質(zhì)互補分析(PCA)(Kaihara,etal.，2003JDRemyetal.,2005)中成功示出(也見實施例2所述)。此外，成功的蛋白質(zhì)互補標記(PCL)通過使用HT2(相對于fflV7的突變脫鹵素酶,見實施例1)在位置78/79證實(實施例3)。另外,被cAMP成功誘導通過使用循環(huán)改變順序的Renilla螢光素酶-RIIBetaB生物傳感器證實,其中Renilla螢光素酶基因在相應于氨基酸位置91/92和111/112的位置被循環(huán)改變順序(見美國專利申請系列No.11/732,105)。使用雷帕霉素依賴性FRB/FKBP模型系統(tǒng)進行PCA。以如下方向制備融合蛋白=FRB-N-末端報道蛋白片段和FKBP-C-末端報道蛋白片段。定向誘變(StratageneQuickChange)用于將核苷酸“TA”導入pF3A載體(Promega),產(chǎn)生就在SgfI限制位點上游的NheI:限制位點(在下表1中稱作pF3A(TA))。然后將如下兩個表達盒插入NheI與SgfI限制位點之間[FRB-AscI限制位點-GGGGSGGGGS接頭]和[FKBP-AscI限制位點-GGGGSGGGGS接頭]。在FRB構(gòu)建體的SgfI與PmeI限制位點之間，插入如下報道蛋白片段=HTvT(氨基酸1-78)、HTv7(氨基酸1-98)、hRL(氨基酸1-91)和hRL(氨基酸1-111)。在FKBP構(gòu)建體的SgfI與PraeI限制位點之間,插入如下報道蛋白片段HTv7(氨基酸79-297)、HTv7(氨基酸99-297)、hRL(氨基酸92-311)和hRL(氨基酸112-311)。此外，將HTv7(氨基酸1-297)和hRL(氨基酸1-311)的全部編碼區(qū)插入pF3A載體的SgfI與PmeI限制位點之間。表1列出了所述構(gòu)建體。表1使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HT和Reni丨:[a螢光素酶蛋白以及FRB-N-末端或FKBP-C-末端片段對照)。根據(jù)廠商方案使用或使用2μL的FluoroTectGreenLTSinvitroTranslationlabelingSystem(Promega)以及有或無1μM雷帕霉素(BioMol)，將2μg總DNA與50μL主混合物(mastermix)在25°C保溫2小時。將5μL所得非-FluoroTect標記的裂解物與1μMHaloTagTMR配體(Promega)在室溫在黑暗處保溫2.5小時。然后將5μL所有裂解物(有和無FluoroTect,有和無雷帕霉素)與5-10U的RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。將裂解物與IXLDS加樣染料(Invitrogen)、60μMDTT和水混合至總體積為20μL。然后將樣品在4-12%Bis-TrisSDSPAffi凝膠(Invitrogen)上進行大小分級分離。對于Renilhi螢光素酶活性測定，將IOuL裂解物(有和無雷帕霉素)在2XHEPES/硫脲中11稀釋廠-式三份將5μL置于96孔平板孔中。通過用注射器加入100μLRenilla螢光素酶分析試劑(Promega5R-LAR)測量發(fā)光。MS圖9Α和9Β示出HTv7的N-末端和C-末端報道部分在存在雷帕霉素條件下在分離位點H78/H79和H98/H99可重建標記活性。也存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖9A,泳道2和3；圖9B，泳道3)。此外，N-末端hRL片段+C-末端HIV7片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點R91/H79和R111/II99可以重建標記活性(圖9A，泳道7以及圖9B，泳道7)。Reni！Ia螢光素酶分析結(jié)果適于圖IOA和10B。除了FRB-Rl11+FKBP-Rl1.2組合之夕卜，PCA構(gòu)建體+雷帕霉素無--導致明顯的Renilla螢光素酶活性。有雷帕霉素的這個組合與無雷帕霉素相比產(chǎn)生高5.3倍Renilla螢光素酶活性。^MM5在N-末端報道蛋白片段-FRB+FKBP-C-末端報道蛋白片段方向與HTv7和人源化Renilla帝光素_(hRL)的蛋白質(zhì)耳,補材料和方法使用雷帕霉素依賴性FRB/ΠΦΡ模型系統(tǒng)進行PCA。為了檢測“插入樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如下方向制備另一系列融合蛋白N-末端報道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如下表達盒[C-末端報道蛋白片段-GGSSGGGSGG接頭(包括SacI限制位點)-FRB]。插入如下N-末端報道蛋白片段HTV7(氨基酸1-78)、HTv7(氨基酸1-98)、hRL(氨基酸1-91)和hRL(氨基酸1-111)。表2列出所述構(gòu)建體。表2使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HaloTag和Reni11a螢光素酶蛋白)。根據(jù)廠商方案使用或不使用2μL的FluoroTectGreenLvsinvitroTranslationlabelingSystem(Promega),奪2μg,總DNA與50μL主混合物(mastermix)在25°C保溫2小時。將20μL所得裂解物(有或無FluoroTect)在有和無ΙμΜ雷帕霉素(BioMol)條件下在室溫保溫15分鐘。然后將5μL非-FluoroTect標記的裂解物與1μMHaloTagTMR配體(Promega)在冰上在黑暗處保溫大約45分鐘。將5μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5-10U的RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與1XLDS加樣染料(Invitrogen)和水混合至總體積為20μL。然后將樣品在4-20%Bis--HClSDSPAGE凝膠(Bio-Rad)上進行大小分級分離。對于Renilla螢光素酶活性測定，將IOuL裂解物(有和無雷帕霉素)在2XHEPES/硫脲中11稀釋，一式三份將5yL置于96孔平板孔中。通過用注射器加入IOOyLRenilla螢光素酶分析試劑(Promega;R-LAR)測量發(fā)光。盤圖12示出HTv7的N-末端和C-末端片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點H78/H79和H98/H99在“插入樣”方向可重建標記活性。也存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖12，泳道2和3)。此外，N末端hRL報道蛋白片段+C-末端fflV7報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點R91/H79和R111/H99在“插入樣”方向可以重建標記活性(圖12,泳道9和10)。R91/H79組合存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖12,泳道9)。除了R91-FRB+FKBP-R92和R111-FRB+FKBP-R112組合之外，PCA構(gòu)建體+雷帕霉素無一導致明顯的Renilla螢光素酶活性。有雷帕霉素的這些組合與無雷帕霉素相比分別產(chǎn)生高8.6和81倍Reni！Ia螢光素酶活性(圖13)。實施例6C-末端片段-FKBP+FRB-N-末端片段方向與HTv7和人源化Renilla帝光素__幌aJ貢碰材料和方法使用雷帕霉素依賴性FRB/FKBP模型系統(tǒng)進行PCA。為了檢測“CP樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如下方向制備另一系列融合蛋白C_末端報道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如下表達盒[MetC-末端報道蛋白片段-GGSSGGGSGG接頭(包括SacI限制位點)-FKBP]。插入如下C-末端報道蛋白片段HTv7(Met-氨基酸79-297)、HTv7(Met-氨基酸99-297)、hRL(Met-氨基酸92-311)和hRL(Met-氨基酸112-311)。表3列出所述構(gòu)建體。表3使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HaloTag和ReniIla蛋白)。根據(jù)廠商方案使用或不使用2μL的FluoroTectGreenLysinvitroTranslationlabelingSystem(Promega)，>|奪2μg;總DNA與50μL主t昆合■物(mastermix)在25°C保溫2小時。將20μL所得裂解物(有或無FluoroTect)在有和無1μM雷帕霉素(BioMol)條件下在室溫保溫15分鐘。然后將5μL非-FluoroTect標記的裂解物與1μMHaloTagTMR配體(Promega)在冰上在黑暗處保溫大約45分鐘。將5μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5-IOU的RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與1XLDS加樣染料(Invitrogen)和水混合至總體積為20μL。然后將樣品在4-20%Bis-HClSDSPAGE凝膠(Bio-Rad)上進行大小分級分離。對于Renilla螢光素酶活性測定，將ΙΟμ裂解物(有和無雷帕霉素)在2XHEPES/硫脲中11稀釋，一式三份將5μL置于96孔平板孔中。通過用注射器加入100μLRenilla螢光素酶分析試劑(Promega;R-LAR)測量發(fā)光。結(jié)果圖14示出HTv7的N-末端和C-末端報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點II79/H78和Η99/98在“CP樣”方向可重建標記活性。也存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖14,泳道2和3)。此外，N-末端hRL報道蛋白片段+C-末端HTv7報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點H79/R91和H99/R111在“CP樣”方向可以重建標記活性(圖14，泳道7和8)。H79/R91組合存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖14，泳道7)。Reni！Ia螢光素酶活性結(jié)果示于圖15。除了R92-FKBP+FRB-R91和R111-FKBP+FRB-R112組合之外，PCA構(gòu)建體+雷帕霉素無一導致明顯的Renilla螢光素酶活性。有雷帕霉素的這些組合與無雷帕霉素相比分別產(chǎn)生高134和46倍Renilla螢光素酶活性(圖15)。實施例7在N末端報道蛋白片段-FRB+FKBP-C末端報道蛋白片段和C末端報道蛋白片段-FKBP+FRB-N末端報道蛋白片段兩個方向與和穩(wěn)定的Renilla帝光素酶(RlucS)腿補使用雷帕霉素依賴性FRB/FKBP模型系統(tǒng)進行PCA。對于這個實施例，使用穩(wěn)定的Renilla螢光素酶(R!uc8,A55T,C124A,S130A,K136R,A143M,M185V,M253L,和S287L；Loeningetal.，2006)。為了檢測“插入樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如下方向制備兩個融合蛋白N-末端報道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如F表達盒[C末端報道蛋白片段-GGSSGGGSGG接頭(包括SacI限制位點)-FRB]。插入如下N-末端報道蛋白片段:R:[uc8(氨基酸1-91)和R1UC8(氨基酸1-111)。為了檢測“CP樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如下方向制備兩個融合蛋白C末端報道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如下表達盒[Met-C末端報道蛋白片段-GGSSGGGSGG接頭(包括SacI限制位點)FKBP]。插入如下O末端報道蛋白片段Rluc8(Met氨基酸92-311)和RlucS(Met-氨基酸11.2-31.1)。將RlucS的全長氨基酸序列也插入在pF3K載體(Promega)的SgfI與PmeI限制位點之間。表4列出所述構(gòu)建體。表4使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HaloTag和ReniIla蛋白)。根據(jù)廠商方案使用或不使用2μL的FluoroTectGreenLysinvitroTranslationlabelingSystem(Promega)，)|寺2μg,總DNA與50μL主'昆合物(mastermix)在25V保溫2小時。將20μL所得裂解物(有或無FluoroTect)在有和無1μM雷帕霉素(BioMol)條件下在室溫保溫15分鐘。然后將5μL非-FluoroTect標記的裂解物與1μMHaloTagTMR配體(Promega)在冰上在黑暗處保溫大約45分鐘。將5μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5-IOU的RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與1XLDS加樣染料(Invitrogen)和水混合至總體積為20μL。然后將樣品在4-20%Bis-HClSDSPAGE凝膠(Bio-Rad,圖16)上進行大小分級分離。對于Renilla螢光素酶活性測定，將IOyL裂解物(有和無雷帕霉素)在2XHEPES/硫脲中11稀釋，一式三份將5μ置于96孔平板孔中。通過用注射器加入IOOyLRenilla螢光素酶分析試劑(Promega;R-LAR)測量發(fā)光。MS圖16示出HTvT的N-末端和C-末端報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點H78/H79和H98/H99可重建標記活性。也存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖16，泳道2和3)。此外，N末端RlucS報道蛋白片段+C-末端fflV7報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下在分離位點R:[uc8(91)/H79和R:[uc8(11.1)/H99在“插入樣”方向可以重建標記活性(圖16,泳道6和7)。RlucS(91)/H79組合存在少量雷帕霉素非依賴性標記活性(圖16，泳道6)。除了Rluc8(91)-FRB+Rluc8(92)-FKBP和Rluc8(111)-FRB+Rluc8(112)-FKBP組合之外，PCA構(gòu)建體+雷帕霉素無一導致明顯的Renilla螢光素酶活性。有雷帕霉素的這些組合與無雷帕霉素相比分別產(chǎn)生高4.0和17.0倍Renilla螢光素酶活性(圖17)。輔·8存'N末端報i首蛋白片段-FRB+FKBP-C末端報i首蛋白片段和C目的報i旨蛋白片段-FKBP+FRB-N末端報道蛋白片段兩個方向與Renilla螢光素酶/HTv7雜合及人源化Renilla帝光素_的蛋白質(zhì)互補MM^DTffe使用雷帕霉素依賴性FRB/FKBP模型系統(tǒng)進行PCA。對于這個實施例,將Reni1Ia螢光素酶的前13個氨基酸添加于末端片段，然后將該雜合的蛋白質(zhì)與FRB或者FKBP融合，再用于具有C末端融合于FRB或者FKBP的人源化Renilla螢光素酶的FRB/FKBP模型系統(tǒng)中，測量Renilla螢光素酶活性。為了檢測“插入樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如下方向制備兩個融合蛋白N-末端報道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如下表達盒[C末端報道蛋白片段GGSSGGGSGG接頭(包括SacI限制位點)FRB]。插入如下N-末端報道蛋白片段Rluc8(氨基酸1-91)和RlucS(氨基酸1-111)。為了檢測“CP樣”方向，在pF3A載體(Promega)中以如F方向制備兩個融合蛋白=C末端報道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位點之間插入如下表達盒[Met-C末端報道蛋白片段-GGSSGGGSGG接頭(包括SacI:限制位點)-FKBP]。插入如下C-末端報道蛋白片段RlucS(Met-氨基酸92-311)和Rluc8(Met-氨基酸112-311)。將Rluc8的全長氨基酸序列也插入在pF3K載體(Promega)的SgfI與PmeI限制位點之間。表5列出所述構(gòu)建體。表5)使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HaloTag和ReniIla蛋白)。根據(jù)廠商方案使用或不使用2μL的FluoroTectGreenLysinvitroTranslationlabelingSystera(Proraega)，將2μg-總DNA與50μL主混合物(mastermix)在25。C保溫2小時。將20μL所得裂解物在有和無1μM雷帕霉素(BioMol)條件下在室溫保溫15分鐘。將5μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5-10U的RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與1XLDS加樣染料(Invitrogen)和水混合至總體積為20μL。然后將樣品在4-20%Bis-HC:[SDSPAGE凝膠(Bio-Rad,圖18)上進行大小分級分離。對于Renilla螢光素酶活性測定，將ΙΟμ裂解物(有和無雷帕霉素)在2XHEPES/硫脲中11稀釋，一式三份將5μL置于96孔平板孔中。通過用注射器加入100μLRenilla螢光素酶分析試劑(Promega;R-LAR)測量發(fā)光。MM圖18示出N和C末端報道蛋白片段被表達。除了R91-FRB+FKBP-R92、Rill-FRB+FKBP-R112、R92-FKBP+FRB-R91和R112-FKBP+FRB-Rlll組合之外，PCA構(gòu)建體+雷帕霉素無一導致明顯的Renilla螢光素酶活性。有雷帕霉素的這些組合與無雷帕霉素相比分別產(chǎn)生高13.5、114、10.4和51倍Renilla螢光素酶活性(圖19)。實施例9確定在N末端報道蛋白片段-FRB+FKBP-C末端報道蛋白片段和C末端報道蛋白片段-FKBP+FRB-N末端報道蛋白片段兩個方向HaloTag(version7)和人源化Reni1Ia螢光素西毎或者·穩(wěn)定的Renilla帝光素_(RlucS)蛋白質(zhì)互孝卜百4H匕Mnmmi使用雷帕霉素依賴性FRB/FKBP模型系統(tǒng)以及前述構(gòu)建體進行PCA。表6列出這個實施例中使用的構(gòu)建體。表6使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)共表達蛋白質(zhì)(或者單獨表達全長HaloTag蛋白)。根據(jù)廠商方案使用或不使用2μL的FluoroTectfeeen^invitroTranslationlabelingSystem(Promega),將2μg總DNA與50μL主混合物(mastermix)在25°C保溫2小時。將10μL所得裂解物(有和無FluoroTect)在有和無5μL(1μM)雷帕霉素(BioMol)條件下在室溫保溫15分鐘。將11μL非-FluoroTect標記的裂解物與5μL(1μ:M)HaloTagTMR配體(Promega)在室溫在黑暗處保溫15分鐘。將11μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5μL的15稀釋的(5-IOU)RNaseOKERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與5μL的4Χ(最后1X)LDS加樣染料(Invitrogen)混合至總體積為20μL。然后將樣品在4_20%Bis-HClSDSPAGE凝膠(Bio-Rad，圖20)上進行大小分級分離。結(jié)果圖20示出所有N和C末端報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下均可以重建標記活性。大多數(shù)還具有少量雷帕霉素非依賴性標記活性。使用ImageQuant(MolecularDynamics)量化SDS-PAGE圖像上TMR標記的產(chǎn)物的量，體積減去背景(無DNA樣品)并根據(jù)FLHTvT標準化(見圖21)。實施例10基于圖21所示結(jié)果，選擇最佳的四個Renilla螢光素酶N-末端+HTv7C-末端對以及FLfflV7和兩個fflV7N末端+HIV7C-末端對照物。使用如下偏差重復實驗。使用TnTSp6高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(Promega)單獨表達蛋白質(zhì)，以降低雷帕霉素非依賴性標記。豐艮據(jù)廠商方案{吏用或I^i吏用2μIi7IuoroTectGreenLysinvitroTranslationlabelingSystem(Promega)，將2μg總DNA與50μL主混合物(mastermix)在25°C保溫2小時。將10μL所得裂解物(有和無FluoroTect)在有或無5μL(IyM)雷帕霉素(BioMol)的條件下在室溫保溫15分鐘。然后將IluL非-FluoroTect標記的裂解物與5μL(1μM)HaloTagTMR配體(Promega)在室溫在黑暗處保溫15分鐘。將11μLFluoroTect標記的裂解物(有和無雷帕霉素)與5μ]:..的15稀釋的(5-10U)RNaseONERibonuclease(Promega)在室溫保溫15分鐘。然后將裂解物與5uL的4X(最后1X)LDS加樣染料(Invitrogen)混合，總體積為20μL。然后將樣品在4-20%Bis-HClSDSPAGE凝膠上進行大小分級分離(Bio-Rad；圖22)。MM圖22示出所有N和C末端報道蛋白片段在存在雷帕霉素條件下均可以重建標記活性。大多數(shù)未示出雷帕霉素非依賴性標記活性。使用ImageQuant(MolecularDynamics)量化SDS-PAGE圖像上TMR標記的產(chǎn)物的量，體積減去背景(無DNA樣品)并根據(jù)FLHTv7標準化。數(shù)據(jù)示于圖23。對于Renilla螢光素酶N-末端+HIV7C末端對,在加入雷帕霉素的樣品中標記的產(chǎn)物的量為FLHTv7的大約20-30%。HTv7N-末端+HTv7C-末端對在加入雷帕霉素的樣品中具有明顯更多的標記的產(chǎn)物,是FLHTv7的大約75-85%。然而,雷帕霉素非依賴性背景也明顯較高(大約16%，F(xiàn)LHTvT為大約1-8%)。背景增加在Renilla螢光素酶N末端+HTv7C末端與fflV7N末端+HIV7C末端對之間在有或無雷帕霉素的條件下導致相似的倍數(shù)差異，只有一個例外。因此,在非特異性蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用是檢測或者動態(tài)范圍的限制因素的情況中，分離Renilla螢光素酶/HaloTag對可能能檢測N-末端(same)報道蛋白與C-末端(same)報道蛋白對可能不能檢測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。參考文獻Cheltsovetal.，T.Biol.Chem.，27827945(2003).Chongetal.’Gene,192271(1997).Einbondetal.,FEBSLett.,384:1(1996).Greene,ProtectingGroupsInOrganicSynthesis；Wiley:NewYork,1981HanksandHunter,FASEB.1,9576~595(1995).HarlowandLane,InAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,p.726(1988)Ilsleyetal.,CelISignaling,1.4:183(2002).Janssenetal.,Eur.J.Biochem.,17167(1988).Janssenetal.,J.BacterioL，1716791(1989).Jougardetal.，ActaCrystalloRr.P.Biol.CrystalIogr.,58:2018(2002).Keuningetal.，J.Bacteriol.,1.63635(1985).Kwonetal.,Anal.Chem.,76；5713(2004).MayerandBaltimore,TrendsCell.Biol.，38(1993).Milsetal.,Oncogene,191257(2000).Murrayetal.,NucleicAcidsRes.,17:477(1989).Nagaietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:3197(2001).Nagataetal.,App1.Environ.Microbiol.,633707(1997).Ozawaetal,AnalyticalChemistry,732516(2001).Paulmuruganetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,993105(2002).Qureshietal.，J.Biol.Chem.,27646422(2001).Sadowski,etal.，Mol.Cell.Bio.，64396(1986).Sala—Newbyetal.’BiochemJ.,279:727(1991).Sallisetal.，Τ.Gen.Microbiol.,136115(1990).Scholtzetal.,Τ.Bacteriol.，1695016(1987).Wadaetal.,NucleicAcidsRes.,18Suppl:2367(1990).Waudetal,BBA,1292:89(1996).Yokotaetal.，Τ.Bacteriol.,1694049(1987).所有出版物、專利和專利申請書均并入本文作參考。在前面的說明書中，已經(jīng)關(guān)于某些優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明，且舉例說明了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然意識到在不偏離本發(fā)明基本原理的前提下可以對本發(fā)明加以改變。權(quán)利要求多個表達載體，包括第一個表達載體，其包含第一個多核苷酸，該多核苷酸包含與第一個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的啟動子，所述第一個融合蛋白包含i)報道蛋白的片段，所述片段具有相應全長報道蛋白的至少50個連續(xù)氨基酸殘基但是比其少至少50個氨基酸殘基；以及ii)第一個異源氨基酸序列；第二個表達載體，其包含第二個多核苷酸，該多核苷酸包含與第二個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的啟動子，所述第二個融合蛋白包含iii)相對于報道蛋白功能不同的蛋白質(zhì)的片段，所述片段具有相應全長功能不同的蛋白質(zhì)的至少50個連續(xù)氨基酸殘基但是比其少至少50個氨基酸殘基，以及iv)第二個異源氨基酸序列，其中報道蛋白片段的報道活性在功能不同的蛋白質(zhì)片段的存在下增加，并且依賴于第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用。2.權(quán)利要求1的多個載體，其中報道蛋白是突變鹵代烷脫鹵素酶，其穩(wěn)定結(jié)合相應非突變鹵代烷脫鹵素酶的底物,其中突變鹵代烷脫鹵素酶在相應于紅球菌鹵代烷脫鹵素酶的第106或者272位殘基的氨基酸殘基包含至少一個氨基酸取代。3.權(quán)利要求2的多個載體，其中所述功能不同的蛋白質(zhì)是珊瑚蟲螢光素酶或者單加氧酶。4.權(quán)利要求2的多個載體,其中突變鹵代烷脫鹵素酶的片段包含相應全長突變鹵代烷脫鹵素酶的C末端部分的至少50個直至250個連續(xù)氨基酸。5.權(quán)利要求2的多個載體，其中所述突變鹵代烷脫鹵素酶片段的N末端相應于紅球菌脫鹵素酶中第73-103位殘基區(qū)域中的殘基。6.權(quán)利要求1的多個載體,其中所述報道蛋白是生物發(fā)光酶或者水解酶。7.權(quán)利要求1的多個載體,其中所述報道蛋白是甲蟲螢光素酶,所述功能不同的蛋白質(zhì)不是生物發(fā)光蛋白。8.權(quán)利要求7的多個載體，其中所述功能不同的蛋白質(zhì)是?；鵆oA連接酶,?；?硫醇連接酶或者脂酰基-Cok合成酶。9.權(quán)利要求1的多個載體,其中所述報道蛋白質(zhì)是Oplophorus螢光素酶,所述功能不同的蛋白質(zhì)不是生物發(fā)光蛋白質(zhì)。10.測試分子相互作用的測定或者可以改變分子相互作用的物質(zhì)或條件，包括單獨融合于分子結(jié)構(gòu)域的功能不同的蛋白質(zhì)的片段，其中分子結(jié)構(gòu)域的相互作用通過重建至少一個所述獨立的蛋白質(zhì)的活性而檢測。11.權(quán)利要求10的測定，其中所述功能不同的蛋白質(zhì)是珊瑚蟲螢光素酶和突變鹵代烷脫鹵素酶,或者甲蟲螢光素酶和?；鵆oA連接酶、?；?硫醇連接酶，或者脂酰基-Cc、k-合成酶,或者Oplophorus螢光素酶和親脂轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、視黃醇結(jié)合蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白，或者FABP-樣蛋白質(zhì)家族中非生物發(fā)光蛋白質(zhì)。12.測試分子相互作用的方法，包括a)提供第一個融合蛋白，其包含第一個蛋白質(zhì)的片段與第一個異源氨基酸序列；b)提供第二個融合蛋白，其包含相對于第一個蛋白質(zhì)功能不同的蛋白質(zhì)的片段及選擇的第二個異源氨基酸序列，所述第二個異源氨基酸序列與第一個異源氨基酸序列相互作用或可疑與其相互作用；c)使第一個和第二個異源氨基酸序列互相接觸；d)檢測得自第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用的第一個蛋白質(zhì)或第二個蛋白質(zhì)的活性。13.權(quán)利要求12的方法,其中第一個蛋白質(zhì)是突變鹵代烷脫鹵素酶,其穩(wěn)定結(jié)合相應非突變脫鹵素酶的底物或者是生物發(fā)光酶。14.組合物，其包含第一個多核苷酸，該多核苷酸包含編碼第一個融合蛋白的開放讀框，所述第一個融合蛋白具有來自相應全長脫鹵素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列，所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用，其中所述脫鹵素酶片段在相對于脫鹵素酶功能不同蛋白質(zhì)的片段的存在F能穩(wěn)定結(jié)合相應全長野生型脫鹵素酶的脫鹵素酶底物，所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應全長功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基,其中所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的殘基或區(qū)域中，所述脫鹵素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段，其包含在相應于玫瑰色紅球菌脫商素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基包含至少一個氨基酸取代，所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成鍵，該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。15.權(quán)利要求14的組合物,其進一步包含第二個多核苷酸,該多核苷酸包含編碼第二個融合蛋白的幵放讀框，所述第二個融合蛋白包含功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段的結(jié)合增加，其中功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的殘基或區(qū)域中。16.組合物，其包含第一個融合蛋白，所述第一個融合蛋白包含具有來自相應全長脫鹵素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列,所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用，其中所述脫鹵素酶片段在相對于脫鹵素酶的功能不同蛋白質(zhì)的片段的存在下能穩(wěn)定結(jié)合相應全長野生型脫鹵素酶的脫鹵素酶底物，所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應全長功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基，其中所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的殘基或區(qū)域中，所述脫鹵素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段,其包含在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基的至少一個氨基酸取代，所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成鍵，該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定。17.權(quán)利要求16的組合物,其進一步包含第二個融合蛋白，所述第二個融合蛋白包含功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段的結(jié)合增加，其中功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的殘基或區(qū)域中。18.權(quán)利要求15或17的組合物,其中功能不同的蛋白質(zhì)中耐受修飾的區(qū)域相應于Renilla螢光素酶的第64_74、86_116或者146-156位殘基。19.權(quán)利要求14或16的組合物，其中脫鹵素酶中耐受修飾的區(qū)域相應于Rhodococcus脫鹵素酶的第73-83,93-103或者204-214位殘基。20.載體，其包含權(quán)利要求14的組合物中的第一個多核苷酸。21.載體，其包含權(quán)利要求15的組合物中的第二個多核苷酸。22.宿主細胞，其包含權(quán)利要求14-1.6的組合物。23.多個表達載體,包含第一個表達載體，其包含與第一個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的第一個啟動子，所述第一個融合蛋白包含具有來自相應全長脫鹵素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的第一個片段和第一個異源氨基酸序列，所述第一個異源氨基酸序列與第二個異源氨基酸序列直接或間接相互作用，其中所述脫鹵素酶片段的N末端是在耐受修飾的全長野生型脫鹵素酶序列的殘基或區(qū)域中，所述脫鹵素酶片段在序列上相應于全長突變的脫鹵素酶的片段，其包含在相應于玫瑰色紅球菌脫鹵素酶的氨基酸殘基106或272的氨基酸殘基的至少一個氨基酸取代，所述取代允許全長突變的脫鹵素酶與脫鹵素酶底物形成鍵,該鍵比相應全長野生型脫鹵素酶與脫鹵素酶底物之間形成的鍵更穩(wěn)定；第二個表達載體，其包含與第二個融合蛋白的開放讀框可操縱連接的第二個啟動子，所述第二個融合蛋白包含相對于脫鹵素酶的功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，所述功能不同蛋白質(zhì)的片段包含來自相應全長功能不同蛋白質(zhì)的N末端部分的至少50個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基,其中所述功能不同蛋白質(zhì)片段的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的殘基或區(qū)域中；其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能夠檢測并且導致脫鹵素酶底物被脫鹵素酶片段的結(jié)合增加。24.權(quán)利要求23的多個載體,其中突變脫鹵素酶包含相對于相應全長野生型脫鹵素酶的至少兩個氨基酸取代，其中第二個取代在全長野生型脫鹵素酶活性位點腔內(nèi)的氨基酸殘基。25.檢測樣品中兩個蛋白質(zhì)之間相互作用的方法,包括a)在有效允許第--個和第二個異源氨基酸序列締合的條件下提供樣品,該樣品具有表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的融合蛋白的細胞，該細胞裂解物，或者表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應，以及具有至少一個官能團的脫鹵素酶底物；b)檢測樣品中與所述脫鹵素酶片段結(jié)合的至少一個官能團的存在、量或者位置,從而檢測這兩個異源序列是否相互作用。26.檢測改變兩個蛋白質(zhì)的相互作用的物質(zhì)的方法，包括a)在有效允許第一個和第二個異源序列締合的條件下提供樣品,該樣品具有表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的融合蛋白的細胞,該細胞裂解物,或者表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應，以及提供具有至少一個官能團的脫鹵素酶底物和可疑改變第一個和第二個異源氨基酸序列的相互作用的物質(zhì)；b)檢測樣品中相對于無該物質(zhì)的樣品時結(jié)合所述脫鹵素酶片段的至少一個官能團的存在或者量。27.檢測改變兩個蛋白質(zhì)的相互作用的條件的方法，包括a)提供樣品置于一種條件，其中所述樣品包含表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的的融合蛋白的細胞、該細胞裂解物,或者表達由權(quán)利要求23的多個載體編碼的融合蛋白的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應；b)將具有至少一個官能團的脫鹵素酶的底物加入樣品；c)相對于不在該條件下的樣品，檢測樣品中結(jié)合脫鹵素酶片段的至少一個官能團的存在或量。28.權(quán)利要求25的方法，進一步包括將樣品與改變第一個和/或第二個異源氨基酸序列構(gòu)象的物質(zhì)接觸，或者將樣品置于該條件下。29.組合物,其包含第一個多核苷酸,該第一個多核苷酸包含編碼第一個融合蛋白的開放讀框,所述第一個融合蛋白包含i)包含來自相應全長珊瑚蟲螢光素酶的C末端部分的至少50個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基的珊瑚蟲螢光素酶的第一個片段，包含來自相應全長甲蟲螢光素酶的C末端部分的至少50個及直至450個連續(xù)氨基酸殘基的甲蟲螢光素酶的第一個片段，或者包含來自相應全長十足類螢光素酶的C末端部分的至少40個及直至150個連續(xù)氨基酸殘基的十足類螢光素酶的第一個片段，其中珊瑚蟲螢光素酶、甲蟲螢光素酶或者十足類螢光素酶片段的N末端在耐受修飾的全長野生型珊瑚蟲螢光素酶、甲蟲螢光素酶或者十足類螢光素酶序列的殘基或區(qū)域中，以及ii)第一個異源氨基酸序列，其與第二個異源氨基酸序列直接或者間接相互作用；第二個多核苷酸，其包含編碼第二個融合蛋白的開放讀框，所述第二個融合蛋白包含相對于螢光素酶的功能不同蛋白質(zhì)的片段及第二個異源氨基酸序列，所述功能不同的蛋白質(zhì)片段包含相應全長功能不同的蛋白質(zhì)的N末端部分的至少40個及直至250個連續(xù)氨基酸殘基,其中功能不同蛋白質(zhì)的C末端是在耐受修飾的全長功能不同蛋白質(zhì)的殘基或區(qū)域中；其中第一個和第二個異源氨基酸序列之間的相互作用能被檢測且導致螢光素酶活性增加。30.權(quán)利要求29的組合物，其中甲蟲螢光素酶中耐受修飾的區(qū)域是在相應于螢火蟲螢光素酶的殘基102-126、殘基139-165、殘基203-193、殘基220-247、殘基262-273、殘基303-313、殘基353-408或者殘基485-495的區(qū)域。31.權(quán)利要求30的組合物,其中第一個片段是螢火蟲螢光素酶片段。32.權(quán)利要求31的組合物,其中所述功能不同蛋白質(zhì)不是生物發(fā)光蛋白質(zhì)。33.權(quán)利要求32的組合物，其中功能不同蛋白質(zhì)是脂?；?CoA合成酶。34.權(quán)利要求29的組合物，其中珊瑚蟲螢光素酶中耐受修飾的區(qū)域相應于Renilla螢光素酶的殘基64-74、殘基86-116或者殘基146-156，或者十足類螢光素酶中耐受修飾的區(qū)域相應于Oplophorus螢光素酶的殘基45-55或者殘基79-89。35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述第一個片段是Renilla螢光素酶片段或者Oplophorus螢光素酶片段。36.權(quán)利要求35的組合物，其中功能不同蛋白質(zhì)不是生物發(fā)光蛋白質(zhì)。37.權(quán)利要求36的組合物,其中所述功能不同蛋白質(zhì)是脫鹵素酶。38.權(quán)利要求36的組合物，其中所述功能不同蛋白質(zhì)是親脂性轉(zhuǎn)運蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白或者脂肪酸結(jié)合蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了編碼可用于例如蛋白質(zhì)互補測定中的雜合融合蛋白的載體以及編碼不同雜合融合蛋白的一系列載體。文檔編號C12N15/09GK101849005SQ200880115199公開日2010年9月29日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者K·V·伍德,S·威格達爾申請人:普羅梅加公司